Diminuição do nível sérico de esfingosina-1-fosfato: um novo

preditor de gravidade clínica em COVID-19

ABSTRACT

A gravidade da doença coronavírus 2019 (COVID-19) é um

problema crucial no tratamento e no resultado do paciente. O objetivo deste

estudo é avaliar o nível circulante de esfingosina-1-fosfato (S1P)

juntamente com marcadores de gravidade, em pacientes com COVID-19.

Cento e onze pacientes COVID-19 e 47 indivíduos saudáveis foram

incluídos. A gravidade de COVID-19 foi encontrada significativamente

associada com anemia, linfocitopenia e aumento significativo da proporção

de neutrófilos para linfócitos, ferritina, fibrinogênio, aminotransferases,

lactato desidrogenase (LDH), proteína C reativa (CRP) e D-dímero . O

nível sérico de S1P foi inversamente associado à gravidade do COVID-19,

sendo significativamente correlacionado com CRP, LDH, ferritina e

dímero-D. A diminuição na S1P foi fortemente associada ao número de

eritrócitos, a principal fonte de S1P plasmática, e tanto a apolipoproteína M

quanto a albumina, os principais transportadores de S1P no sangue. Não

por último, S1P foi considerado um preditor relevante de admissão em uma

unidade de terapia intensiva e o resultado do paciente. S1P circulante

emergiu como biomarcador negativo de gravidade / mortalidade de

pacientes com COVID-19. Restaurar os níveis anormais de S1P para uma

faixa normal pode ter o potencial de ser um alvo terapêutico em pacientes

com COVID-19.

Palavras-chave Coronavirus; COVID-19; unidade de Tratamento

Intensivo; biomarcador prognóstico; esfingosina-1-fosfato

Biomarcadores de categorias de assunto; Microbiologia,

virologia e interação com patógenos hospedeiros

DOI 10.15252 / emmm.202013424 | Recebido em 15 de

setembro de 2020 | Revisado em 9 de novembro de 2020 | Aceito em 12 de

novembro de 2020 | Publicado online em 9 de dezembro de 2020

Introdução

Em dezembro de 2019, um novo betacoronavírus de RNA

envelopado, denominado coronavírus da síndrome respiratória aguda grave

2 (SARS-CoV-2), se espalhou rapidamente da China para todo o mundo,

causando a doença respiratória pandêmica COVID-19. Lombardia foi a

região italiana mais afetada pelo COVID-19 (Sotgiu et al, 2020) com>

175.000 casos e 17.414 mortes apuradas (em 29 de outubro de 2020, fonte:

Ministério da Saúde Italiano).

O espectro clínico do COVID-19 varia de formas

assintomáticas / paucissintomáticas a condições críticas que requerem

suporte em unidade de terapia intensiva (UTI), e são caracterizadas por

falência respiratória e de múltiplos órgãos, manifestações sistêmicas como

choque séptico e até morte ( Guan et al, 2020; Gattinoni et al, 2020). O

manejo dos pacientes com COVID-19 está em constante evolução e, até o

momento, diversos medicamentos estão disponíveis, embora sem

confirmação de eficácia por ensaios clínicos na maioria dos casos.

Acredita-se que a tempestade de citocinas causada pela

superprodução sistêmica de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a

interleucina-6 (IL-6), seja uma causa relevante de gravidade da doença,

progressão e morte em pacientes com COVID-19 (Song et al. , 2020b). No

entanto, embora as características clínicas estejam diretamente relacionadas

à inflamação rápida e intensa, a falta de evidências diretas não deixa claro

como o processo inflamatório exuberante e a falência de órgãos terminam.

Apesar da importância de a idade avançada e as comorbidades subjacentes

como fatores prognósticos associados à gravidade / morte de pacientes com

COVID-19, a evolução da infecção por SARS-CoV-2 é frequentemente

muito heterogênea e imprevisível, e biomarcadores prognósticos robustos e

potenciais alvos terapêuticos ainda estão faltando . Assim, o conhecimento

atual e em rápida expansão sobre COVID-19 destaca a necessidade de um

melhor entendimento de sua fisiopatologia e do desenvolvimento de novos

biomarcadores com valor prognóstico eficaz e potenciais aplicações

terapêuticas.

Entre vários mediadores de inflamação, esfingosina-1-fosfato

(S1P) emergiu como um sinal chave (Obinata & Hla, 2019), envolvido na
regulação de vários processos fisiopatológicos, incluindo fisiologia

vascular e imunidade (Yanagida & Hla, 2017 ; Bryan e Del Poeta, 2018).

Este esfingóide bioativo é produzido intracelularmente por esfingosina

quinases e, após a liberação extracelular, exerce efeitos pleiotrópicos por

meio da ligação a receptores acoplados à proteína G específicos (S1P1–5;

Liu et al, 2012). Em condições fisiológicas, a S1P está presente em altas

concentrações no sangue, pela contribuição de eritrócitos (H € anel et al,

2007), células endoteliais (Venkataraman et al, 2008) e plaquetas (Yatomi

et al, 2000). Ao contrário, seus níveis em outros tecidos são baixos, criando

um gradiente vascular de S1P, crucial para que S1P exerça seus papéis

regulatórios (Yana- gida & Hla, 2017). Na circulação sistêmica, cerca de

60% da S1P plasmática é transportada por lipoproteínas de alta densidade

(HDL), ligadas à apolipoproteína M (apoM), e cerca de 30% pela

albumina, e as propriedades biológicas de S1P ligadas a ApoM e albumina

são diferentes - ferent (Kurano & Yatomi, 2018). Nessas premissas e

considerando que a S1P está envolvida em infecções virais (Wolf et al,

2019) e na sepse (Winkler et al, 2019), o objetivo deste estudo foi

determinar os níveis séricos de S1P e seus transportadores apoM e

albumina, para avaliar sua importância clínica como biomarcadores

prognósticos / preditivos em COVID-19.

 Resultados

Características da população de estudo

As características demográficas e clínicas dos dois grupos são

apresentadas na Tabela EV1. Os grupos HLT e COV foram muito

semelhantes para sexo e idade, bem como para hipertensão ou incidência

de diabetes.

A população HLT apresentou todos os parâmetros bioquímicos

dentro da normalidade, enquanto os pacientes com COV exibiram um

padrão de alterações hematológicas e bioquímicas. Em particular,

encontramos diferenças significativas nos valores de RBC, HGB, HCT,

RDW, WBC, neutrófilos, linfócitos e monócitos (Tabela EV2). Além disso,

a razão neutrófilos-linfócitos calculada (NLR) foi responsável por 1,78

(IQR: 1,47–2,09) em indivíduos HLT e 7,05 (IQR: 5,34–8,85) em pacientes

COV, com uma forte diferença estatisticamente significativa (P < 0,0001)

entre os dois grupos.

Entre os analitos bioquímicos, encontramos várias diferenças

estatisticamente significativas entre COV e HLT (Tabela EV3), incluindo

diminuição significativa nas proteínas totais, albumina, colesterol total,

HDL-C, vitamina 25-OH e aumento significativo no fibrinogênio, uréia,

ferritina , GGT, AST, ALT, CRP, LDH, NT-proBNP e IL-6. A bilirrubina

total, embora dentro da faixa normal, foi significativamente menor em

pacientes com COV do que em HLT. Além disso, o perfil de coagulação

foi alterado em pacientes com COV com um aumento significativo do nível

de dímero D e fibrinogênio. Ao contrário, os parâmetros de coagulação PT

e aPTT e eletrólitos, incluindo cálcio, sódio, potássio e cloreto foram

semelhantes nas coortes HLT e COV.

Os ensaios ELISA forneceram um valor médio de concentração

sérica de S1P no grupo HLT de 0,87 µM, que é muito semelhante ao

relatado por um estudo recente em 174 doadores de sangue saudáveis e

obtido por LC / MS / MS (Daum et al, 2020) . A medição dos níveis séricos

de S1P e seu transportador apoM revelou uma diminuição altamente

significativa em ambas as moléculas em pacientes COV, em comparação

com indivíduos HLT (Fig. 1A e B). Em particular, os valores médios de

S1P foram 0,87 e

0,69 µM (Fig 1A), e os valores medianos de apoM foram 39,0 e

24,3 µg / ml (Fig. 1B), em HLT e COV, respectivamente. Esses

resultados sugerem um envolvimento sistêmico do complexo S1P / apoM

em COVID-19. No entanto, a correlação de Pearson entre S1P e apoM não

apresentou significância estatística, embora uma tendência positiva

modesta estivesse presente (Fig. 1C). Curiosamente, os níveis séricos de

S1P se correlacionaram significativamente com os valores de RBC, HGB e

HCT (Fig. 1D-F).

 A correlação de Pearson demonstrou uma correlação significativa

entre S1P e HDL-C (Fig. 2A) e albumina (Fig. 2B). Paralelamente,

correlações significativas foram encontradas entre apoM e HDL-C (Fig.

2C) e albumina (Fig. 2D). Ao contrário, não foi encontrada correlação

significativa entre PLT e S1P, assim como PLT e apoM.

Identificação de marcadores de gravidade da doença

Para investigar o papel de S1P e apoM como biomarcadores

circulantes na gravidade da infecção por COVID-19, estratificamos os

pacientes com base na necessidade ou não de admissão na UTI,

categorizando nossa coorte de pacientes com COV em grupos de UTI e

noICU. Conforme mostrado na Tabela EV4, ambos os grupos eram

homogêneos em relação à idade e ao IMC. Como esperado, os pacientes

internados em UTI apresentaram aumento significativo na taxa de

mortalidade, mesmo que sua frequência de hipertensão e diabetes fosse

significativamente menor do que na UTI. Além disso, a comparação entre

os parâmetros sanguíneos e bioquímicos revelou que os pacientes da UTI,

em comparação com a UTI, têm uma diminuição significativa de RBC,

HGB, HCT e linfócitos, concomitante a um aumento significativo de

leucócitos, neutrófilos, NLR, ureia, AST, ALT, LDH, CRP e dímero D

(Tabela EV5). Curiosamente, os pacientes internados em UTI apresentaram

valores significativamente menores de S1P, apoM e de albumina e HDL-C,

em comparação com o grupo noICU (Fig. 3A-D), sugerindo o papel

potencial de S1P e seus transportadores de sangue apoM, albumina e HDL-

C, como biomarcadores circulantes da gravidade da doença.

Para determinar a possível relação entre os níveis séricos de S1P

e apoM e a gravidade da infecção em pacientes com COVID-19, usamos

PSI, tempo de internação e NLR como parâmetros. Curiosamente, uma

correlação negativa significativa foi encontrada entre S1P e PSI, dias de

internação e NLR (Fig 4A-C). Da mesma forma, correlações negativas

significativas foram encontradas entre apoM, PSI e NLR (Fig. 4D e F), mas

não entre apoM e dias de admissão hospitalar (Fig. 4E).

Na análise de regressão logística univariável, PSI, S1P, apoM,

RBC, HGB, HCT, WBC, NLR, CRP e albumina foram significativamente

associados à admissão na UTI. Os resultados da análise de regressão

multivariável mostraram que NLR e S1P são preditores independentes para

admissão na UTI. Digno de nota, S1P, entre os parâmetros considerados, é

o fator de risco mais importante para admissão na UTI de paciente COVID-

19 (OR: 39,45, [IC 95%: 1,51–1031,60]; P = 0,027; Tabela EV6).

Além disso, para estimar o papel prognóstico potencial de S1P,

COV os pacientes foram estratificados pelo valor de corte de S1P 0,60 µM,

de acordo com o índice de Youden. A análise de regressão de Cox revelou

que S1P é um preditor significativo de admissão na UTI e mortalidade

intra-hospitalar (Fig. 5A e B). De relevância, a taxa de mortalidade em

pacientes com COV com S1P <0,60 lM (13,6%) foi encontrada

significativamente maior (P <0,05) do que com S1P ≥ 0,60 lM (4,5%).

Além disso, e curiosamente, pacientes internados em UTI com soro baixo

S1P mostrou um aumento significativo da taxa de mortalidade de até 33%.

Discussão

Os principais achados deste estudo são que os níveis séricos de

S1P são significativamente mais baixos em pacientes com COVID-19 do

que com HLT e predizem tanto a admissão na UTI quanto a mortalidade

intra-hospitalar. Um estudo lipidômico muito recente, publicado enquanto

nosso artigo estava em preparação, relatou que a S1P é significativamente

reduzida em amostras de plasma de COVID-19, sem indicar concentrações

molares, o que impede a comparação entre estudos independentes e sem

abordar a gravidade da doença e o paciente resultado (Song et al, 2020a).

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que fornece evidências de

associação de S1P sérica com gravidade de COVID-19 e sugere S1P como

um novo biomarcador circulante de gravidade e morbidade de COVID-19.

Estudos anteriores demonstraram que a tempestade de citocinas

desempenha um papel fundamental no COVID-19, e no aumento de pró-

inflamatórias as citocinas estão associadas à gravidade da doença (Song et

al, 2020b). Digno de nota, S1P foi implicado na produção de citocinas a

montante e a jusante e os níveis intersticiais aumentados de S1P nos locais

inflamatórios induzem a expressão de citocinas pró-inflamatórias (Obinata

& Hla, 2019), sugerindo que S1P local e intersticial pode concorrer com a

citocina tempestade de COVID-19. Levando em consideração a relevância

da tempestade de citocinas em COVID-19, discutimos aqui nossos achados

sobre a S1P sérica em pacientes com COVID-19 por meio de duas seções

principais: (i) os possíveis mecanismos subjacentes à diminuição do nível

de S1P sérica, incluindo contribuintes celulares de S1P circulante e seus

transportadores de sangue; (ii) as consequências funcionais e implicações

clínicas da baixa circulação de S1P. Para facilitar o leitor, a Figura 6

fornece uma visão geral dos mecanismos propostos subjacentes ao

envolvimento de S1P em COVID-19.

Mecanismos subjacentes à redução da S1P sérica

Devido ao seu metabolismo e processamento únicos de S1P, os

eritrócitos são a principal fonte de S1P no plasma sanguíneo, sua contagem

está positivamente associada aos níveis plasmáticos de S1P (H € anel et al,

2007). Descobrimos que os pacientes com COVID-19 têm uma contagem

de eritrócitos significativamente reduzida e que essa contagem, juntamente

com os valores de hemoglobina total e hematócrito, foram diretamente

correlacionados com a S1P sérica. Esses achados, e os relatórios sobre

baixa S1P no sangue em pacientes anêmicos (Ohkawa et al, 2008), sugerem

fortemente que a redução de RBC pode contribuem para a baixa S1P sérica

em pacientes com COVID-19. Embora o mecanismo de anemia subjacente

no COVID-19 seja desconhecido, uma possível explicação reside no

achado de que as citocinas pró-inflamatórias inibem a eritropoiese induzida

pela eritropoietina (Pierce & Larson, 2005). Esse processo foi associado ao

aumento do RDW (Pierce et al, 2005), que encontramos em nossa coorte

COVID-19. Além disso, como uma notificação pré-impressa muito recente

relatou uma diminuição significativa de esfingolipídios em hemácias de

pacientes com COVID-19 (Thomas et al, 2020), não podemos excluir que

uma diminuição na síntese / exportação de S1P pelos eritrócitos também

possa ocorrer. Além dos eritrócitos, o endotélio vascular contribui de forma

eficiente para os níveis plasmáticos de S1P por meio do transportador S1P

da membrana plasmática Spns2 (Nagahashi et al, 2013). Como citocinas

pró-inflamatórias regulam negativamente Spns2 em células endoteliais

(Jeya Paul et al, 2020),

e, portanto, sua exportação de S1P, é possível que a tempestade

de citocinas em pacientes com COVID-19 contribua para uma queda de

S1P induzida pelo endotélio. Em concordância, os pacientes com sepse

diminuíram os níveis séricos de S1P (Winkler et al, 2019).

 Uma outra fonte de S1P no sangue são as plaquetas, que

armazenam S1P de forma eficiente e principalmente a liberam na

circulação durante a coagulação, levando a níveis mais elevados de S1P no

soro do que no plasma (Yatomi et al, 2000). Nossa coorte COVID-19 tinha

números de plaquetas e parâmetros na faixa normal, provavelmente

excluindo as plaquetas como responsáveis por sua baixa S1P sérica.

Além de possíveis alterações na liberação de S1P no sangue,

nossos dados revelam que níveis diminuídos de apoM e albumina, as duas

principais proteínas de transporte de S1P, estão provavelmente envolvidos

na redução de S1P circulante. Nosso estudo desvendou três conclusões

principais sobre S1P portadores em pacientes COVID-19. Em primeiro

lugar, descobrimos que a apoM sérica e a albumina foram

significativamente menores em pacientes com COVID-19 em comparação

com HLT e, particularmente, em UTI do que em pacientes com UTI. Como

essas proteínas, além de atuarem como veículo S1P, são essenciais para a

liberação de S1P dos eritrócitos e modulam a concentração de S1P no

sangue (Christensen et al, 2017), sua diminuição muito provavelmente

concorre com a queda de S1P circulante em pacientes COVID-19. É

importante notar que tanto a apoM quanto a albumina são consideradas

proteínas negativas de fase aguda (Feingold et al, 2008), pois seus níveis

diminuem profundamente durante condições inflamatórias. Aqui,

mostramos que concomitante à redução de albumina e apoM, os níveis

séricos de PCR e ferritina, amplamente reconhecidos como reagentes de

fase aguda positivos que aumentam dramaticamente como parte da resposta

inflamatória mediada por citocinas aumentadas como IL-6 (Streetz et al,

2001), aumentou significativamente em pacientes com COVID-19. Assim,

parece razoável que a apoM e a albumina caiam como parte da resposta

inflamatória mediada pela tempestade de citocinas em pacientes com

COVID-19.

Uma segunda observação interessante de nosso estudo é que os

valores séricos de S1P se correlacionam significativamente com HDL-C, e

são mais baixos em UTI do que em pacientes noICU, indicando que os

níveis séricos de S1P são influenciados por

HDL e estão relacionados à gravidade do COVID-19. Isso está

de acordo com relatórios que mostram que: (i) os níveis plasmáticos de S1P

se correlacionam positivamente com os níveis plasmáticos de HDL-C

(Zhang et al, 2005), (ii) as formas graves de sepse resultam em níveis

plasmáticos severamente reduzidos de HDL-C, (iii) HDL-S1P está

relacionado à gravidade da sepse e contribui mais para a queda severa da

S1P plasmática total encontrada em pacientes com choque séptico (Winkler

et al, 2019). Terceiro, os níveis séricos de S1P, embora relacionados ao

HDL-C, não se correlacionaram significativamente com os níveis séricos

de apoM, indicando que os níveis baixos de apoM em pacientes

provavelmente não estão diretamente ligados ao seu nível diminuído de

S1P. A razão desta discrepância pode ser que S1P está ligada também à

albumina e outras HDL-apolipoproteínas, e que apoM pode ligar outros

lipídios além de S1P.

Consequências patológicas e implicações clínicas da S1P sérica

reduzida

As principais características patológicas do COVID-19 são

complexas e sua patogênese permanece obscura.

Aqui, relatamos as evidências atuais sobre os múltiplos efeitos da

S1P no sangue, discutindo-os no contexto da S1P sérica reduzida, em

conjunto com sua implicação clínica no COVID-19. Em concordância com

achados anteriores (Guan et al, 2020), encontramos que os pacientes com

COVID-19 apresentam linfopenia. Os mecanismos subjacentes à linfopenia

permanecem desconhecidos, e hipotetizamos que a diminuição nos níveis

de S1P pode participar. Na verdade, o gradiente S1P entre o sangue e os

tecidos é essencial para a saída de linfócitos dos órgãos linfóides, o que

ocorre

via S1P1 (Baeyens & Schwab, 2020). Em concordância,

FTY720, um antagonista funcional da via de sinalização S1P / S1P1

aprovado como imunossupressor, produz linfopenia periférica (Pelletier &

Hafler, 2012). De interesse, o tráfego e a saída de linfócitos mediados por

S1P1 são limitados à albumina-S1P e não são compartilhados por apoM-

S1P (Baeyens & Schwab, 2020). Nessas bases, nossas descobertas sobre o

a redução de S1P e albumina no soro de pacientes com COVID-19 pode ter

implicações na linfopenia por COVID-19 e características

imunossupressoras relacionadas.

Outro papel fisiológico relevante da S1P circulante consiste em

suas ações protetoras e antiinflamatórias nas células endoteliais

(Christoffersen et al, 2011). ApoM / S1P exerce atividades mais potentes

sobre as células endoteliais do que a albumina / S1P e, particularmente, na

limitação da inflamação endotelial e na manutenção da barreira endotelial

(Christoffersen et al, 2011). Conforme descrito acima, a S1P intersticial

livre aumenta nos locais de inflamação, onde, ao contrário de seus efeitos

antiinflamatórios plasmáticos, está envolvida na propagação da inflamação.

Considerando as ações eliminadoras de apoM / HDL (Kurano & Yatomi,

2018), que estão envolvidas na resolução da inflamação ao neutralizar o

excesso de S1P nos locais de inflamação, a deficiência de apoM pode

contribuir para exacerbar a inflamação em COVID-19. No geral, apesar de

não podermos excluir que os níveis diminuídos de S1P possam ser um

epifenômeno de dano ao tecido do hospedeiro, com base em suas

propriedades protetoras da barreira endotelial e propriedades

antiinflamatórias de apoM / S1P, a diminuição de S1P e apoM pode

explicar o distúrbio vascular função de barreira e lesões de órgãos de

COVID-19. Em concordância, foi relatado anteriormente que, durante o

desafio séptico, os níveis plasmáticos de S1P caem para níveis muito

baixos, a síntese hepática de apoM diminui severamente e os níveis

plasmáticos de apoM são reduzidos. Assim, a diminuição da S1P circulante

pode contribuir para a gravidade clínica de patologias envolvendo

disfunção da barreira endotelial como sepse (Winkler et al, 2019), doença

arterial periférica (Soltau et al, 2016) e cirrose hepática (Becker et al, 2017)

Outros achados interessantes de nosso estudo referem-se à

relação entre S1P (e apoM) e o marcador de inflamação estabelecido NLR,

bem como a ferramenta de predição clínica PSI, ambos encontrados

correlacionados com a gravidade do COVID-19 (Ciccullo et al, 2020;

Satici et al, 2020). Relatamos aqui que tanto o NLR quanto o PSI não

foram apenas significativamente maiores na UTI do que no grupo noICU,

mas também se correlacionaram com S1P e apoM séricos, e que S1P se

correlaciona negativamente com o tempo de internação. Além disso,

quando os pacientes com COVID-19 foram estratificados usando um ponto

de corte para S1P, os pacientes com baixo nível sérico apresentaram

aumento significativo na probabilidade de admissão na UTI e na taxa de

mortalidade. No geral, essas correlações sugerem fortemente que os níveis

circulantes de S1P podem ser usados clinicamente como biomarcadores

negativos para prever a gravidade / mortalidade de pacientes com COVID-

19.

Finalmente, nosso estudo sugere que restaurar o baixo S1P e seus

transportadores para uma faixa saudável pode ser um alvo terapêutico para

reduzir a gravidade do COVID-19 e a morte. Resultados contrastantes

foram encontrados no Fingolimod, um antagonista funcional de S1P

aprovado pela FDA. De fato, dados anteriores relatando um papel potencial

do Fingolimod para reduzir a tempestade de citocinas induzida por

(Oldstone & Rosen, 2014) H1N1 e infecção pelo vírus da influenza (Walsh

et al, 2011), um ensaio clínico para a administração de Fingolimod em

pacientes com COVID-19 foi iniciado e, em seguida, interrompido em

alguns pacientes por linfopenia acentuada (www.clinicaltrial.gov

NCT04280588). Além disso, os glicocorticoides, amplamente utilizados no

tratamento de COVID-19 com contra

efeitos ditórios (Ledford, 2020), sinalização S1P alvo, inibindo a

secreção de citocinas induzida por S1P (Che et al, 2014). Nossos achados

sugerem fortemente que os níveis circulantes de S1P devem ser medidos

em pacientes com COVID-19 antes da administração de qualquer droga

moduladora de S1P, incluindo glicocorticoides, e que as modalidades

terapêuticas (locais / sistêmicas) devem ser avaliadas antes do tratamento.

 Nosso estudo tem algumas limitações. Primeiro, é um estudo de

centro único, com um tamanho de amostra relativamente pequeno. Isso

poderia ter reduzido o poder do estudo, mas não o novo achado sobre a

redução de S1P e apoM no soro de pacientes com COVID-19. Outros

estudos multicêntricos com uma coorte maior de pacientes são necessários

para avaliar em profundidade a correlação aqui descrita dos níveis de S1P

com os parâmetros circulantes e a gravidade da doença de COVID-19. Em

segundo lugar, como os níveis plasmáticos de S1P devem ser medidos em

amostras coletadas em condições específicas, e as plaquetas podem vazar

S1P durante o armazenamento de sangue, usamos o soro para medir S1P,

com a conseqüente influência de S1P derivado de plaquetas. Mais estudos

são necessários para elucidar a associação entre S1P e COVID-19 usando

plasma e separando S1P ligado a HDL de S1P ligado à albumina. Terceiro,

realizamos a avaliação da S1P sérica por um ensaio ELISA, que pode

apresentar armadilhas. Embora nossos dados tenham sido validados por um

método enzimático e os níveis de S1P no grupo controle fossem

comparáveis aos relatados por HPLC / MS / MS, uma quantificação precisa

dos níveis séricos de S1P por meio dessa técnica fortalecerá achados

futuros. Finalmente, não fomos capazes de coletar amostras de sangue

durante a hospitalização para medir S1P em diferentes pontos de tempo nos

mesmos pacientes. Responder a essas perguntas em estudos futuros ajudará

a determinar se S1P e / ou apoM podem ser marcadores para facilitar o

manejo de COVID-19 na prática clínica e potenciais alvos úteis para

tratamentos com COVID-19.

Em conclusão, o presente estudo estabelece a diminuição da S1P

e apoM séricas como novos biomarcadores circulantes associados à

gravidade e morbidade de COVID-19. Especulamos que a S1P pode

desempenhar um papel na disfunção da barreira endotelial, na resposta

imune alterada e na inflamação excessiva persistente em pacientes com

COVID-19. Compreender os mecanismos que levam à diminuição da S1P

sérica em COVID-19 e seus efeitos multissistêmicos deve ser o foco de

trabalhos futuros, para avançar nosso conhecimento sobre essa doença.

Finalmente, a presente investigação sugere que restaurar os níveis anormais

de S1P a uma faixa normal e equilibrar sua ligação à albumina e apoM em

condições saudáveis pode ter o potencial de ser um alvo terapêutico para

reduzir o risco de progressão da doença e morte, e , não por último, para

montar uma resposta imune eficaz após a vacinação em pacientes com

COVID-19.

Materiais e métodos

População do estudo e variáveis clínicas

 Este estudo prospectivo, caso-controle, foi aprovado pelo Comitê

de Ética do Ospedale San Paolo em Milão, Lombardia, Itália (COST Ação

n.2020 / ST / 057). Pacientes com positividade confirmada para SARS-

CoV-2 por teste molecular de swabs nasofaríngeos (COV, n = 111), foram

inscritos consecutivamente durante a hospitalização em março-maio de

2020 em Ospedale San Paolo, epicentro do surto do cluster pandêmico

italiano. Além disso, indivíduos saudáveis (HLT, n = 47) foram testados. O

consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos humanos, e os

experimentos foram conformes aos princípios estabelecidos na Declaração

da WMA de Helsinque e no Relatório de Belmont do Departamento de

Saúde e Serviços Humanos. A coleta de sangue foi realizada no dia da

internação. Durante a internação, um subgrupo desses pacientes com

sintomas graves foi admitido na Unidade de Terapia Intensiva (UTI). Além

disso, o Índice de Gravidade da Pneumonia (PSI) foi calculado no

momento da admissão. Dados eletrônicos sobre demografia, histórico

médico e comorbidades, início da doença e sintomas, sinais vitais e analitos

de base de plasma / soro foram registrados para todos os pacientes

internados.

Medição de S1P sérico

 Para medições de S1P e apoM no soro, uma alíquota (5 ml) de

sangue total foi coletada em vacutainer coberto sem anticoagulante. Os

tubos foram deixados em temperatura ambiente por 30–45 min e, em

seguida, centrifugados (2.000 g, 15 min). O soro obtido, inspecionado para

avaliar a limpidez, foi cuidadosamente transferido para tubos limpos,

aliquotado e armazenado a -80 ° C até o uso, sem ciclos repetidos de

congelamento-descongelamento. Os níveis de S1P foram medidos em

duplicata, em pelo menos duas alíquotas de soro diferentes de cada

paciente, por kit de ensaio de ensaio imunoenzimático (ELISA) (Echelon

Biosciences, Salt Lake City, EUA), de acordo com as instruções do

fabricante. A curva S1P padrão variou de 0,03 a 4 µM, e uma análise semi-

log foi usada para interpolar amostras desconhecidas. Para avaliar a

especificidade do ELISA, diferentes concentrações de S1P exógeno foram

adicionadas aos soros HLT e COV. Foi obtida uma curva sigmoidal, muito

semelhante nas amostras HLT e COV, excluindo interferências séricas. A

linearidade da medição do soro foi inicialmente verificada em 4 amostras

em duas diluições diferentes (1: 5 e 1:10). Em seguida, todas as amostras

foram diluídas 1:10 em soro deslipidizado e padrões S1P baixos e altos

conhecidos foram executados em paralelo com as amostras experimentais,

como controles. Cada medição S1P foi executada em triplicado e realizada

pelo menos duas vezes em ensaios independentes. Para validar os ensaios

ELISA, cinco amostras de soro de ambos os controles e pacientes com

COVID-19 foram submetidas a partição dupla (primeiro em condições

alcalinas e depois em condições ácidas), e a concentração de S1P na fase

orgânica ácida final foi medida por um ensaio enzimático como

anteriormente relatado (Edsall et al, 2000), com pequenas modificações

(Abdel Hadi et al, 2018). Os resultados demonstraram valores muito

semelhantes com os dois métodos, sendo a diferença do coeficiente de

variação (razão do desvio padrão sobre a média das medidas) <14% em

ambos os grupos.

Medição de apoM sérico

Os níveis de ApoM foram medidos no soro (diluído 1: 20.000)

pelo kit Human apoM ELISAPRO (Mabtech, Inc., Cincinnati, EUA). As

amostras com concentrações baixas e altas conhecidas de apoM foram

testadas juntamente com as amostras dos participantes do estudo. O

intervalo da curva padrão apoM foi de 0,03–20 ng / ml, e o ajuste da curva

de 4 parâmetros foi usado para medições de amostras interpólos. Cada

apoM a medição foi executada em triplicado e realizada pelo menos duas

vezes em ensaios independentes.

análise estatística
 O cálculo do tamanho do poder foi realizado considerando um

poder de 80%, uma taxa de erro tipo I de 5% e um tamanho do efeito de

50%. As variáveis contínuas foram expressas em valores medianos e

intervalo interquartil (IQR). Variáveis discretas foram relatadas como

contagens ou porcentagens. Os parâmetros sanguíneos foram testados para

normalidade usando os testes de Kolmogorov – Smirnov e Shapiro – Wilk

e, quando normalmente distribuídos, as duas condições foram comparadas

pelo teste t de Student bicaudal. O teste de correlação de Pearson foi

utilizado para avaliar a associação univariada entre as variáveis.

O desfecho clínico primário de nosso estudo foi a admissão na

UTI. A associação das características basais e dos achados clínicos com a

admissão na UTI foi avaliada inicialmente por meio de regressão logística

univariável. Variáveis com P <0,05 foram consideradas potenciais fatores

de risco e incluídas na análise de regressão logística multivariável com o

método backward stepwise, a fim de explorar variáveis que se associaram

de forma independente à admissão na UTI. O ponto de corte foi calculado

de acordo com o valor máximo do índice de Youden, e a razão de risco

para admissão na UTI e mortalidade foi calculada usando o modelo de

risco proporcional de Cox. A análise estatística dos dados foi feita usando o

software IBM SPSS Statistics 26.0. A aquisição de dados foi realizada às

cegas. Os testes foram todos bilaterais e foram considerados

estatisticamente significativos quando P <0,05. Em todos os casos,

relatamos o valor P exato dos dados analisados, exceto quando P <0,0001,

relatado como tal, pois é amplamente reconhecido como altamente

estatisticamente significativo.

Disponibilidade de dados

Os dados usados para apoiar as conclusões deste estudo estão

disponíveis junto do autor para correspondência, mediante solicitação.

A visualização expandida para este artigo está disponível online.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fondazione IRCCS Ca ’Granda

Ospedale Maggiore Policlinico (RC2020 para GM). O presente estudo

nasceu graças à colaboração entre o sistema de saúde civil e militar, como

o Corpo Médico da Força Aérea Italiana, que participou ativamente da

gestão do surto de COVID-19 durante as fases mais críticas da emergência

na Lombardia e em toda a Itália. . O trabalho também foi organizado graças

ao Acordo-Quadro entre o IRCCS Ca 'Granda Ospedale Maggiore

Policlinico, a Força Aérea Italiana e a Universidade de Milão. Pedimos

desculpas por não citar todos os artigos relevantes e pertinentes ao nosso

estudo, devido ao limite de referências. Agradecemos a todos os pacientes e

seus familiares e a todos os profissionais de saúde da linha de frente por

seus esforços no diagnóstico e tratamento de pacientes durante a pandemia

de COVID-19.

Contribuições do autor

GM, SN, LG e LR tiveram a ideia e elaboraram o estudo. GM,

SN, LG, MMo, RC, ML, AB, LF, FP, EG, GCA, DC, MMi, SC e LR

coletaram os dados epidemiológicos, clínicos e foram envolvidos na

interpretação dos dados. SN e LG realizaram o ensaio ELISA e

processaram dados estatísticos. MG, SN, LG e LR escreveram o

manuscrito. Todos os autores revisaram criticamente o manuscrito quanto

ao conteúdo intelectual.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.