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APOSTILA

CURSO DE MICOLOGIA MÉDICA


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1.- Introdução

Identificação dos fungos

Generalidades

Os fungos são organismos eucarióticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uni


ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imóveis na sua maioria. Cada célula
pode gerar, por si só, um novo organismo da mesma espécie. São considerados os
principais biodegradradores de matéria orgânica de nosso planeta.

As células fúngicas apresentam morfologia variável, mostrando grande diferença em


tamanho, estrutura e atividade metabólica, formando diferentes tipos de colônias quando
cultivados em meios apropriados, estruturas de frutificação complexas e/ou elaborados
mecanismos de propagação e dispersão.

REINO EUMYCOTA
(De Hoog et al 2000)

Divisões

Zygomycota Chytridiomycota Ascomycota Basidiomycota

REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberi

REINO CHROMISTA: Pythium insidiosum


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Os fungos são organismos distintos das bactérias em tamanho, estrutura celular e


composição química. Os fungos são eucariontes isto é possuem núcleos envolvidos por
membrana própria, heterotróficos, com nutrição de absorção, uni ou pluricelulares, com
parede formada de polissacarídeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem como
glicoproteínas, sem celulose. A composição desses compostos é variável e depende da
posição sistemática dos fungos, ergosterol é o principal componente da membrana fúngica.
A célula fúngica é constituída pelos componentes encontrados em outros
organismos eucarióticos.
As organelas citoplasmáticas e inclusões são: mitocôndrias, vacúolos, vesículas,
retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Os típicos
aparelhos de Golgi irão estar sempre presentes. Quase todos os fungos são aeróbios e todos
necessitam matéria elaborada para sua alimentação (heterotróficos).
Os fungos não ingerem seu alimento, mas possuem nutrição de absorção e parasitam
seres vivos ou atacando matéria morta como sapróbios, parasitas, simbiontes ou patógenos.
Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colônias que são
classificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam
pela macromorfologia e micromorfologia.
As colônias de leveduras são, em geral, de consistência cremosa de cor branca a
creme, brilhantes ou opacas podendo apresentar às vezes coloração escura ou alaranjada.
As leveduras produzem células simples, arredondadas, ovais ou alongadas que se
reproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na posição polar chamadas de
blastoconídio. Algumas leveduras podem produzir, brotos simultaneamente em vários
pontos.
Os brotamentos ou células filhas são liberados da célula mãe, formando células
independentes ou continuar unidos formando células alongadas chamadas de pseudohifas
que se diferenciam das hifas verdadeiras por apresentarem constrição nos septos. Além dos
blastoconídios as leveduras podem apresentar artroconídios, pseudohifas e
clamidoconídios típicos.
As colônias de fungos filamentosos podem ser granulares, cotonosas, aveludadas,
pulverulentas, membranosas. O seu talo consiste de hifas que podem ser contínuas ou
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interrompidas em intervalos irregulares por septos (septada) que dividem as hifas em


células.
Um conjunto de hifas forma o micélio que pode ser vegetativo ou reprodutivo. O
micélio vegetativo penetra no meio de cultivo, para absorver substâncias nutritivas para o
fungo. O micélio vegetativo é o que fica na parte superior do meio e produz as estruturas de
reprodução típicas para cada grupo de fungos.
Os fungos sexuados se reproduzem por esporos que podem ser formados internamente
(ascoporas) ou externamente (basidiosporas).
Os fungos sexuados também se reproduzem assexuadamente.
Na reprodução assexuada, as estruturas de reprodução tomam nomes variados de
acordo com o grupo a que pertencem os fungos.
Conídios são estruturas assexuadas de reprodução encontradas entre os fungos
filamentosos. Podem apresentar tamanhos, formação, cores e septos diferentes
(macroconídios, microconídios, ameroconídios, didimoconídios, fragmoconídios,
dictioconídios, etc.). As hifas que sustentam os conídios são denominadas de conidióforos
e as células que dão origem aos conídios conidiogênicas.
Os conídios podem ser claros ou hialinos – hialoconídios ou pigmentados e escuros
- feoconídios.
Entre os fungos de hifas não septadas, as hifas aéreas produzem esporos assexuados
(esporangiosporos) dentro de estruturas chamadas esporângios. As hifas que sustentam os
esporângios são conhecidas como esporangióforos.
Columela é uma invaginação estéril do esporangióforo na área fértil do esporângio.
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2.- Coleta de Material Biológico

A coleta de material biológico é a primeira etapa no processo de identificação dos


fungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observação, isolamento e identificação
do agente causal da doença.
O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG,
procedência, endereço, telefone para contato, entre outros; dados epidemiológicos:
profissão, contato com animais, doença associada, estado imunológico, etc; informações
clínicas: local anatômico acometido, aspecto da lesão, suspeita clínica, antibioticoterapia
prévia, evolução e dados do médico responsável.
O procedimento de coleta varia segundo a região acometida, suspeita clínica e tipo
de material biológico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir o
procedimento de identificação laboratorial do fungo: como exame microscópico direto e
cultivos em vários meios, com eventuais repetições desses exames para confirmação dos
achados laboratoriais.

Procedimento da coleta

Para efeitos práticos, a coleta de material biológico, depende da localização e do


tipo da micose.

• Amostras de micoses superficiais e cutâneas

Também denominadas dermatomicoses acometem: pele, pêlo, unhas, provocando


algumas delas alterações somente de importância estética.

A.- Amostras de pele.


A prévia desinfecção da lesão com algodão embebido em álcool 70% diminui a
biota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micológico.
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Raspar a lesão com bisturi, cureta esterilizada ou com lâminas de vidro previamente
flambadas. Nas lesões sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas da
lesão, já que este é o sitio ativo da infecção.
Quando o raspado da lesão não pode ser realizado, pode-se optar por métodos tais
como o de Porto (só para pitiríase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesiva
transparente (Durex) que é pressionada sobre a lesão, removida e fixada sobre uma lâmina
ou a utilização de um tapetinho estéril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre a
lesão, embrulhado e transportado ao laboratório (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagens
são a falta do cultivo ao empregar a técnica de Porto e do exame direto, quando se usa o
tapetinho.

B.- Amostras de unha.


A lesão pode-se localizar na região subungueal distal, proximal ou lâmina
superficial da unha. A tomada amostra dependerá do tipo de lesão.
Deve-se remover a presença de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficial
branca, raspa-se as áreas esbranquiçadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estéril.
No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a área infectada desde a
porção distal à proximal.
Os primeiros detritos coletados da porção distal deverão ser eliminados já que são
ricos em contaminantes. As escamas obtidas da porção profunda da lesão poderão ser
usadas para o exame micológico. Quando as unhas são distróficas, pode-se auxiliar a coleta
com tesouras limpas e desinfetadas.

C.- Amostras de cabelo e pêlo.


Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou pêlos apresentando
nódulos fúngicos (observados com auxilio de lupa).
Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pele
e os pêlos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados são facilmente
arrancados, a partir das bordas das placas alopécicas com ajuda de uma pinça limpa e
flambada.
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Os pêlos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entre


duas lâminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placas
esterilizadas, sempre com a identificação da amostra.

D.- Amostras oculares.


Material de conjuntiva é colhida da mucosa, desde a porção proximal em direção a
borda, com "swab" estéril, embebido em solução salina. O "swab" pode ser colocado num
tubo estéril, contendo meio semi-sólido de transporte ou 0,5ml de solução salina.
Material ocular (córnea) colhido só por oftalmologistas, raspando as áreas
necróticas, ulceradas e supurativas da lesão com espátula esterilizada. Esta amostra será
processada em lâmina (exame microscópico direto) e semeada imediatamente nos meios de
cultivo apropriados ou tubo estéril contendo solução salina.

E.- Amostras óticas.


Geralmente o material biológico é obtido a partir do conduto auditivo externo, com
“swab” esterilizado umedecido previamente em solução salina.

E.- Mucosas.

i- Mucosa oral.
As amostras devem ser obtidas por raspado da superfície epitelial acometida,
empregando espátula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidíase oral em que se verificam
placas esbranquiçadas, o material pode ser colhido com “swab” estéril, ou alça de platina,
colocar em tubo esterilizado contendo solução salina.

ii- Mucosa nasal.


O material nasal pode ser colhido com espátula, bisturi, alça ou ¨swab¨. Nos casos
de suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-se
coleta do material com procedimento cirúrgico, como biópsia, etc.
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iii- Mucosa vaginal.


As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prévio da paciente, com “swab”,
colocar em um tubo com solução salina esterilizada.

iv- Mucosa genital Masculina.


A amostra pode ser colhida com swab da área da glande que apresenta pontos
esbranquiçados ou pseudomembranas, ou do prepúcio em onde podem ser encontradas,
vesículas.

v- Mucosa perianal.
Pode apresentar lesões esbranquiçadas ou ulceradas de aspecto granulomatosos. As
amostras são obtidas por raspado com bisturi rombo estéril ou “swab”

• Micoses subcutanêas

A.- Lesões sugestivas de Esporotricose.


No caso de abscessos fechados a obtenção de material purulento é feita por punção,
com seringa esterilizada ou por drenagem com prévia limpeza da zona implicada. Quando o
abscesso drena espontaneamente, o material purulento deve ser colhido com espátula, alça
ou “swab” e transferido a um tubo estéril de tampa de rosca, com solução salina.

B.- Lesões sugestivas de Micetoma.


O material compreende pus que deve conter grãos que podem ser visíveis a olho nu.
Quando é difícil a coleta da amostra, recomenda-se colocar gaze sobre a superfície lesada
por 18 a 24 h o que permitirá recuperar os grãos para o estudo micológico completo.

C.- Lesões sugestivas de Cromoblastomicose.


Na superfície cutânea lesada, observam-se geralmente pontos negros devido à
eliminação trans-epitelial do fungo. O material biológico deve ser coletado a partir dos
pontos enegrecidos da lesão. Escamas e crostas com auxilio de bisturi e agulhas estéreis,
biópsias podem também ser obtidas.
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D.- Lesões sugestivas de Lobomicose ( Doença de Jorge Lobo).


A amostra compreende material biológico coletado por biopsia ou secreção das
lesões ulceradas colhidas com espátula, bisturi rombo, alça ou ´swab¨ e transferido a um
tubo estéril contendo solução salina. O exame microscópico direto e/ou anatomopatológico
confirmam o diagnóstico de lobomicose. Cultura não obtida, até o presente.

E.- Lesões sugestivas de Rinosporídiose


O material biológico deve ser colhido da superfície de crescimento polipóide.
Exame microscópico direto e cortes de tecido corados confirmam o diagnóstico.

F.- Feohifomicose subcutânea


Colher o material dos abscessos subcutâneos por punção ou biópsia. Fazer exame
microscópico direto, cultura e cortes sem coloração.

G.- Zigomicose subcutânea


Colher uma pequena porção do material por biópsia. Fazer preparações, exame
microscópico direto com KOH, anátomo patológico e cultura.

• Amostras de micoses sistêmicas

A.- Trato respiratório.

i- Escarro.
Amostras de escarro são coletadas após prévia lavagem bucal preferentemente em
jejum. O material deverá conter escarro profundo, livre de saliva e será colhido em frasco
estéril de boca larga. No caso dos pacientes que não expectoram facilmente, podem ser
usadas nebulização, com solução salina hipertônica.
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ii- Lavado brônquico.


Procedimento realizado pelo médico com broncoscópio. O material clínico é
colocado em frasco estéril e enviado ao laboratório.
Aproximadamente 1 ml de escarro ou lavado brônquico, é levado a um tubo cônico
de centrifuga contendo 250 ul aproximadamente de KOH 20% mais tinta, sendo incubada
por 12 h a 37ºC. O material biológico é centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. A
preparação microscópica é realizada a partir do sedimento.

B.- Biópsia.
Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deve
ser dividido em dois frascos estéreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outro
contendo solução salina, destinados ao exame histopatológico e micológico,
respectivamente.

C.- Medula óssea.


É um procedimento médico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 ml
do material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente ao
laboratório micológico.

D.- Líquido cefalorraquídiano (LCR)


Para o estudo micológico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por punção
lombar, em condições de rigorosa assepsia. O LCR é normalmente, livre de
microrganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patógeno
potencial.

E.- Sangue
Realizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5
segundos e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso
(adultos) e de 1 a 3 ml (crianças), para cada frasco coletado. Terminada a punção retirar a
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agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato ao
laboratório.
Número e intervalo das amostras:
-Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalo
de uma hora.
-Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se forem
negativos, após 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora.

F.-Urina
A assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa pudendo após lavar
com povidine, enxugar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair o
prepúcio e lavar a zona do glande e meato urinário)
Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandes
lábios) em frasco esterilizado.
Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão,
colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o
coletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso a
criança não tenha urinado)
Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente na
sonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cm
de distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70 %,
coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e
depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório. (no
caso da sonda urinária não apresentar dispositivo para coleta de urina é recomendável
desligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota a
gota diretamente no frasco estéril. Todo o procedimento deverá ser realizado respeitando as
normas de assepsia).
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G.- Fezes.
Aproximadamente 20g de fezes recém emitidas devem ser coletadas em frasco
esterilizado e enviadas rapidamente ao laboratório. Para cultivo de vigilância, utiliza-se
“swab” anal.

H.- Outros líquidos corporais.


Todos os líquidos corpóreos são obtidos por aspirações percutânea ou drenagem,
empregando procedimentos invasivos praticados pelo médico. Deve ser coletado tanto
líquido quanto seja possível 2 a 10 ml ou mais, pois as concentrações dos microrganismos
podem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina
1:1000.

Todas as amostras de material clínico devem ser colhidas adequadamente, em


condições ideais e transportadas rapidamente ao laboratório, com a solicitação do tipo de
exame, suspeita clínica, dados clínicos e epidemiológicos do paciente, para processamento
micológico imediato.

3.- Exame Microscópico Direto e Cultura

O exame microscópico direto de material clínico é um dos procedimentos mais


simples e úteis para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas. Vários clarificadores
podem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado.
A observação de elementos fúngicos em escamas de pele, pêlos ou unhas pode
proporcionar uma clara indicação do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidíase
ou pitiríase versicolor.
O exame microscópico direto de fluidos, biópsia ou outro material clínico pode
também estabelecer o diagnóstico de uma micose sistêmica, orientando a etiologia da
infecção como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose,
feohifomicose entre outras.
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Técnica:
Colocar parte do material biológico a ser estudado sobre lâmina limpa, adicionar
uma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamínula e flambar ligeiramente.
As lâminas previamente marcadas serão colocadas em câmara úmida, “overnight” a
4 °C e posteriormente se realizará a segunda observação microscópica.
Nunca se deve pressionar a lamínula com os dedos, uma vez que os ácidos graxos
naturais da pele dificultam a observação. Quando a amostra é muito espessa é aconselhável
pressionar a lamínula com uma pinça ou outro objeto. O fungo pode ser então liberado do
material biológico, o que permite sua visualização.
A adição de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH,
permite melhor visualização e contraste dos fungos em especial das células de Malassezia
furfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fúngicas.
Outras substâncias tais como goma de Berlesse, DMSO e Chloroblack E podem ser
empregadas na visualização do fungo a partir do material biológico.
Para verificação da presença de cápsula, devem-se fazer preparações do material
clínico com tinta da China, diluída 1:1 em água destilada ou salina esterilizada.

Cultura dos Fungos:


Os fungos preferencialmente se desenvolvem à temperatura de 25°C, sendo seu
crescimento mais lento que o das bactérias. Por isto há necessidade de acrescentar
inibidores bacterianos aos meios de cultura ao trabalhar com material biológico
contaminado. Entre os antibióticos cloranfenicol 50 a 300 mg/l é empregado para inibir o
desenvolvimento de bactérias. Para inibir o crescimento de determinados fungos
contaminantes do ar que têm desenvolvimento rápido deve-se usar cicloheximida.
Fungos filamentosos crescem melhor entre 24 e 28°C e os leveduriformes entre 24 e 37°C,
em pH de 6,6 a 7,2.
Existe um grupo de fungos que apresenta dimorfismo térmico: uma fase saprofítica ou
filamentosa à temperatura (24-28°C) e uma fase parasitária ou leveduriforme a 37°C.
São os fungos dimórficos: S. schenckii, H. capsulatum, P. brasiliensis, B.
dermatitidis.
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Técnica:
A semeadura está na dependência do tipo de amostra e da suspeita clínica. Pêlos,
escamas de pele ou de unhas, serão semeadas em 6 a 8 picadas com alça em L sobre ágar
inclinado em tubo. Fluidos biológicos como LCR, lavado brônquico, etc., serão
centrifugados a 3000 rpm. por 5 minutos e semeados com pipeta Pasteur estéril ou pipeta
graduada sobre ágar inclinado. Material de biopsia deve ser fragmentado e semeado
fazendo picadas na superfície do ágar. Amostras de hemoculturas serão semeadas
acrescentando 0,5 ml do caldo na superfície do meio.
A adequada coleta e transporte de material biológico são essenciais para se obter o
diagnóstico micológico preciso.
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LISTA DE MATERIAL BIOLÓGICO, EXAMENS MICROSCÓPICOS DIRETOS E MEIOS DE CULTURA PARA O


DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOSES

Micoses Amostra clínica Exame Microscópico Direto Meio de CulturaAgentes T°e tempo de
etiológicos incubação
Pitiriase Escamas de Pele Células leveduriformes esféricas Ágar bile de boi Malassezia furfur 37°C durante
Versicolor ovaladas com ou sem brotamento adicionado de azeite de 7 dias
e filamentos curtos septados. oliva

Tinha negra Escamas de Pele Hifas escuras septadas, Sabouraud-dextrose Hortae werneckii 25°C durante
irregulares. ágar**; Lactrimel ágar** 20 dias
Piedra negra Cabelo Nódulos marron - escuros, Sabouraud-dextrose Piedraia hortae 25°C durante
formados por artroconídios ágar**. 30 dias.
escuros; ascos com 2 a 8
ascosporos típicos
Piedra branca Pêlos região Nódulos claros, formados por Sabouraud-dextrose Trichosporon spp 25°C durante
genitais, axilares, artroconidós claros e blastocon. ágar**; Lactrimel ágar** 7 dias
etc.
Dermatofitose Cabelo com raíz Artroconídios refringentes Sabouraud-dextrose Microsporum spp, 25°C durante
do couro ectothrix, endothrix ou ágar**; Lactrimel Trichophyton spp. 15 a 30 dias
cabeludo ectoendothrix. Parasitismo fávico ágar**. Mycosel

Dermatofitose Escamas e pêlos Hifas septadas, ramificadas.


Sabouraud-dextrose Epidermophyton 25°C durante
da pele. ágar*; Lactrimel ágar**. spp, Microsporum 15 a 30 dias
Mycosel spp, Trichophyton
spp.
Onicomicose Escamas lâmina Hifas septadas com artroconídios Sabouraud-dextrose Trichophyton spp. 25°C durante
borda livre interna da unha retangulares ou esféricos. ágar*; Lactrimel ágar**. 15 a 30 dias
espessa. (raramente lâmina Mycosel
externa)
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Onicomicose borda Escamas lâmina Células leveduriformes e/ou Sabouraud-dextrose Candida albicans, 25°C durante
livre fina e de borda interna da unha e pseudohifas ágar**; Lactrimel Candida spp. 7 a 15 dias
periungueal do arco ágar**
(candidíase) periungueal
Cromomicose Crostas, secreção Estruturas globosas de cor Sabouraud-dextrose Phialophora spp, 25°C durante
ou pus. marrom, de parede grossa, ágar**; Lactrimel Cladosporium spp, 20 dias
septada em dois planos ágar** Rhinocladiella spp.
(corpos escleróticos) ou talo Fonsecaea spp.
moriforme.
Esporotricose Secreção ou pus Leveduras alongadas como Sabouraud-dextrose Sporothrix schenckii 25°C e 37 °C
charuto, o observadas ágar**; Lactrimel durante 20
raramente. ágar**. dias
Eumicetoma Secreção ou pus Grânulos parasitários Sabouraud-dextrose Madurella spp (grãos 25°C durante
formados por aglomeração ágar**; Lactrimel escuros), 20 dias
de hifas claras ou escuras ágar**. Pseudallescheria
boydii (grãos claros),
Acremonium spp, P.
romeroi
Rinosporidiose Descarga nasal Esférulas até 350 paredes Rhinosporidium
ou tecido do espessas em diversos graus seeberi
pólipo de maturação
Lobomicose Material de lesão Células leveduriformes Glenosporella loboi,
queloides e tamanho uniforme 9-10 um. Loboa loboi, P. loboi
tumores Uma ponte tubular une uma
célula a outra
Feohifomicose Secreção ou pus Hifas escuras septadas, Sabouraud-dextrose Phialophora spp, 25°C durante
elementos leveduriformes, ágar**; Lactrimel Cladosporium spp., 20 dias
sem corpos escleróticos ágar** Fonsecaea spp.,
Wangiella spp.
Zigomicose Nódulos Hifas largas não septadas Sabouraud-dextrose Conidiobolus
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subcutânea subcutâneos com reação eosinofílica ágar*; coronatus,


(corte) Basidiobolus
haptosporus
Paracoccidioido Escarro, pus, Células esféricas de tamanho Sabouraud-dextrose Paracoccidioides 25°C e 37°C
micose raspado de variável de membranas ágar*; Lactrimel brasiliensis durante 30
mucosa, etc. duplas com um ou muitos ágar** dias
brotamentos, células
esfericas isoladas, células
caten., Células caliciformes.
Histoplasmose Escarro, raspado Células leveduriformes Sabourad-dextrose Histoplasma 25°C e 37°C
das lesões. pequenas 2-3 m, esféricas ágar*;Lactrimel capsulatum durante 30
ou ovaladas no interior de ágar, dias
macrófagos ou
mononucleares (coloração
com Giemsa).
Criptococose L.C.R., escarro, Células leveduriformes Sabouraud-dextrose Cryptococcus 37°C durante
pus, etc esféricas com cápsula grande ágar*; Lactrimel neoformans 15 dias
(em observação com tinta da ágar**.
China)

Candidíase Raspado mucosa, Células leveduriformes ou Sabouraud-dextrose Candida albicans, 37°C durante
biopsia, escarro, pseudohifas ágar*; Lactrimel Candida spp. 15 dias
etc. ágar**.
Otomicose Pseudomembran Filamentos com ou sem Sabouraud-dextrose Aspergillus niger, A. 25°C durante
a com pontos de cabeças aspergilares ou ágar**; Lactrimel Fumigatus, Aspergillus 15 dias
cores ou massa células leveduriformes e ágar**. spp, Candida albicans,
em migalha de pseudohifas etc..
pão
* Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol
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Micologia médica, micoses e seus agentes

Em micologia médica, as micoses são divididas para seu estudo em:

MICOSES MICOSES MICOSES MICOSES SISTÊMICAS:


SUPERFICIAIS: CUTÂNEAS: SUBCUTÂNEAS: PARACOCCIDIOIDOMICOSE
PITIRIASES VERSICOLOR DERMATOFITOSES ESPOROTRICOSE BLASTOMICOSE
TINHA NEGRA CANDIDIASES CROMOBLASTOMICOSE HISTOPLASMOSE
PIEDRA NEGRA COCCIDIOIDOMICOSE
MICETOMAS
PIEDRA BRANCA
RINOSPORIDIOSE
ENTOMOFTOROMICOSE
MICOSE DO JORGE LOBO

MICOSES
OPORTUNÍSTICAS:
ZIGOMICOSES
HIALOHIFOMICOSE
FEOHIFOMICOSE
CANDIDIASE
CRIPTOCOCOSE
ASPERGILOSE
PNEUMOCISTOSE
LEVEDUROSES

Micoses superficiais
Os agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogêneo de fungos que
não sensibilizam o indivíduo, não provocam reações alérgicas a distancia como os agentes
de micoses cutâneas.
Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae são os
fungos envolvidos nessas micoses.
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Malassezia furfur - Agente da pitíriase versicolor, afecção cutânea assintomática


que se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas,
marrons ou brancas. O papel do fungo em doenças de natureza seborreica como psoríase,
dermatite seborreica, foliculite é discutível.

M. furfur tem sido isolada também de infecções sistêmicas, principalmente em


neonatos.

Hortae werneckii - agente da tinha negra, lesão que se caracteriza pela formação de
mancha pouca descamativas de coloração castanha a preta, principalmente nas palmas das
mãos. Essas lesões vão aumentando de tamanho, durante meses ou anos.

Trichosporon spp - causa piedra branca, que consiste em nódulos castanho-claros


e macios em torno de pêlos da região genital, axilar e do couro cabeludo. Os nódulos são
menos aderentes que os da piedra negra. Nos pacientes com imunodeficiência, pode ocorrer
invasão do sangue, dos rins, dos pulmões e da pele.

Piedraia hortae - produz piedra negra, que consiste em nódulos duros, pretos e
firmes em torno dos cabelos.

Micoses cutâneas
Agrupam as dermatofitoses e as candidíase cutâneas. Os agentes das micoses
cutâneas atacam a epidermes e as camadas mais profundas da córnea, chegando a produzir
granulomas, se localizando na pele, pêlos, unhas e mucosas.
Os dermatófitos são fungos relacionados entre si que invadem a queratina morta.
Pertencem aos gêneros Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton. As espécies
geofílicas vivem principalmente no solo; as zoofílicas, em animais; as antropofílicas, nos
seres humanos.
Esses fungos infectam locais específicos do corpo, que servem de base para o
diagnóstico clínico. A localização da dermatofitose pode ajudar na identificação preliminar
do fungo.
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AGENTE PELE UNHAS PÊLO INVASÃO PÊLO INVASÃO


ECTÓTRICA ENDÓTRICA
Microsporum + +(raro) + -
Epidermophyton + - - -
T.mentagrophytes + + + -
T.rubrum + + + (raro) -
T. verrucosum + + + -
T.tonsurans + + - +
T.shoenleinii + + - +
T.violaceum + + - +

Microsporum canis - causa dermatofitose do corpo e do couro cabeludo, geralmente


encontrado em crianças adquirido de animais infectados como cães e gatos.

Microsporum gypseum - causa dermatofitose inflamatória do corpo ou do couro


cabeludo, contraído por contato com solo contaminado.

Epidermophyton floccosum - dermatofitose epidêmica (pé de atleta) em locais de


veraneio, bem como dematofitose inguinal.

Trichophyton rubrum - dermatofitose do corpo, dos pés, da virilha e das unhas. Em


paciente imunodeprimidos, pode causar nódulos ou abscessos subcutâneos.

Trichophyton mentagrophytes - dermatofitose inflamatória nos pés, no corpo, nas


unhas, na barba e no couro cabeludo. É causa comum de pé de atleta, apresenta as
variedades granular e cotonosa.

Trichophyton tonsurans - causa tinha do couro cabeludo, tinha capilar com pontos
pretos e às vezes dermatofitose do corpo, dos pés e das unhas.
21

Trichophyton verrucosum - dermatofitose do couro cabeludo, da barba ou do corpo,


geralmente adquirida por contato com o gado infectado.

Trichophyton shoenleinii: dermatofitose do couro cabeludo chamado FAVO (tinha


favosa) com alopécia definitiva, raramente, dermatofitose do corpo ou das unhas.

Candidíases
São causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espécies de Candida
estejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiológicos. A C. albicans
existe como normal no trato gastrointestinal, na área vulvovaginal, na pele e fezes. Em
casos de comprometimento imunológico e conseqüente queda da resistência causados por
AIDS, neoplasias, lúpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esteróides ou agentes
citotóxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infecções.
As candidíases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidíase oral.
broncopulmonar, vulvovaginal; candidíase mucocutânea crônica, cutânea, ungueal, etc. são
algumas das manifestações que podem ocorrer.

Micoses subcutâneas
Os agentes de micoses subcutâneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micoses
subcutâneas quando há traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetação ou materiais
contaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infecção
localizada na pele e no tecido subcutâneo e às vezes nos linfonodos da região. Raramente a
infecção se se dissemina. As lesões subcutâneas caracterizam-se pela cronicidade de áreas
duras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que não cicatrizam e periodicamente produzem
exsudação. Os membros inferiores, sobretudo os pés, são muitas vezes comprometidos,
visto que seu contato com espinhos e outros vegetais é mais freqüente.

Esporotricose – Esta infecção decorre de ferimentos cutâneos provocados por


materiais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz lesões
ulcerativas subcutâneas, nos membros, que podem avançar ao longo dos vasos linfáticos. A
22

esporotricose pulmonar está sendo observada com mais freqüência, deve ser distinguida da
tuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose.
O agente etiológico é Sporothrix schenckii, fungo dimórfico.

Cromoblastomicose – As lesões produzidas evoluem com grande lentidão torna-se,


vão-se formando muitas protuberâncias sobrepostas, o que cria a aparência de couve-flor.
Geralmente, a erupção é seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas,
encontram-se corpos escleróticos.

Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C.


carrionii, Rhinocadiella aquaspersa.

Micetomas – O micetoma geralmente se restringe aos pés, mas pode ser visto em
outras regiões como mãos e nádegas.
Os nódulos, que periodicamente exsudam um líquido oleoso contem grãos que podem ser
brancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as lesões comprometem toda a perna.
A infecção causada pelos fungos superiores (micetoma eumicótico) produz lesões
fistulosas, com pouca dor ou destruição óssea, enquanto a causada por bactérias
fungiformes (micetoma actinomicótico) apresenta lesões tumorosas cônicas semelhantes às
erupções de acne, com grande exsudação e comprometimento ósseo com dor.
Principais agentes de micetoma eumicótico: Scedosporium apiospermum,
Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurella
mycetomatis, Madurella grisea.
Principais agentes de micetoma actinomicótico: Nocardia asteroides, Nocardia
brasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii,
Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis.

Rinosporidiose – doença que se caracteriza pela formação de granuloma vegetante,


poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntiva
bulbar e saco lacrimal). Já foram verificados casos de localização vaginal, retal e peniana,
assim como no conduto auditivo externo.
23

Agente etiológico Rhinosporidium seeberi que não tem sido cultivado.

Entomoftoromicose ou zigomicose subcutânea – Granuloma eosinofilico causados


por zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutâneo. É
comum em crianças, traduzindo-se pelo aparecimento de um nódulo subcutâneo que
aumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento.
Geralmente o paciente não apresenta imunodepressão
Agentes envolvidos pertencentes aos gêneros Conidiobolus e Basidiobolus.

Doença de Jorge Lobo – dermatose que provoca lesões tipo quelóides com ausência
de comprometimento visceral, ausência de adenopatia satélite, longa evolução do processo.
Nem sempre as lesões cutâneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e lesões
papulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer.
Agente etiológico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda não cultivado.

Micoses sistêmicas
Os fungos que causam micoses sistêmicas vivem em forma sapróbia no solo.
Alguns animais de vida silvestre são reservatórios importantes. Os indivíduos podem
desenvolver a doença principalmente por inalação de propágulos.
Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo térmico. Na
natureza e nos cultivos a 25°C, formam colônias filamentosas com reprodução assexuada.
Nos tecidos e cultivos a 37°C eles apresentam sua forma leveduriforme.
Estes fungos são taxonomicamente heterogêneos: Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis.

Histoplasma capsulatum – é agente de infecção relacionada a indivíduos que


visitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos são assintomáticos ou sub-
clínicos e os sintomas respiratórios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamente
algum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doença, com suores
noturnos, tosse, febre e emagrecimento. É fulminante em pacientes com imunodeficiência.
24

Paracococcidioides brasiliensis – a infecção geralmente se caracteriza por lesões


pulmonares semelhantes às da tuberculose e de outras micoses. Lesões nas mucosas nasais,
oral, pele e outros órgãos podem ocorrer.

Blastomyces dermatitidis – O microrganismo ao ser inalado, produz infecção


respiratória crônica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses.
Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratória da doença tem semelhanças
com tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Pode
provocar lesões subcutâneas, ósseas, etc.

Coccidioides immitis – Por inalação dos conídios após 14 dias, 60% dos pacientes
apresentam infecção respiratória assintomática. O restante 40% apresenta sintomas da
doença respiratória gripal leve ou raramente grave. Complicações pulmonares, na forma de
cavidades ou de pneumonia ocorrem em 5%. Pode ocorrer disseminação por via
hematogênica dos pulmões para os ossos, as articulações, a pele, os tecidos subcutâneos,
etc.

Micoses oportunísticas
A maioria dos fungos que produzem micoses oportunísticas são saprófitos do meio
ambiente, de crescimento rápido, normalmente inalado. Esses organismos geralmente não
são patogênicos, mais atuam como patógenos oportunistas. O indivíduo que apresenta
algum tipo de depressão imunitária em decorrência de doença ou em especial, do uso de
medicamentos imunossupressores, antibioticoterapia por longo tempo, pode ser alvo de
infecções oportunísticas.

Zigomicose – infecção fúngica aguda causada por fungos da divisão Zigomycota, os


esporos desses fungos podem infectar os seios paranasais e a área peri-orbital. A infecção
rapidamente se dissemina para os vasos sanguíneos vizinhos, causando necrose e trombose,
vascular (CID). A partir daí se difunde para o encéfalo e para as meninges, produzindo
25

meningoencefalíte, rapidamente fatal. Essa doença pode se disseminar para os pulmões e


para o tubo digestivo.
Principais agentes envolvidos: Absidia sp., Apophysomyces sp., Mucor sp., Rhizopus
sp., Saksenaea sp., Cunninghamella sp..

Feohifomicoses – Infecções causadas por fungos demáceos que apresentam hifas


escuras nos tecidos. O número de agentes envolvidas é, em geral, muito grande e tende a
aumentar.

Alternaria spp. – produz quadros como ceratomicose, infecções cutâneas,


osteomielite, doenças pulmonares e infecção do septo nasal.

Bipolaris spp. – causam ceratomicose e sinusite fúngica, abscessos subcutâneos,


meningite, alergias e peritonite.

Cladosporium spp., Epicoccum spp. e Nigrospora spp. – causa ceratomicose e


alergias.

Curvularia spp. – causam ceratomicoses, micetoma, endocardite, infecção


pulmonar, alergias e infecção do septo nasal.

Exserohilum spp. – sinusite fúngica, embolia aórtica, úlcera de córnea e meningite.

Hialohifomicoses – Infecção causada por fungos hialinos (hifas hialinas)

Acremonium sp. - pode causar ceratomicose, lesões do palato duro, meningite,


artrite e doenças sistêmicas.

Aspergillus sp. - o Aspergillus fumigatus é o patógeno oportunista mais comum do


gênero. Aspergilose disseminada, doenças pulmonares, broncopneumonia alérgica,
ceratomicose, otomicose e infecção dos seios paranasais.
26

Fusarium spp. - causa mais comum de ceratomicoses, onicomicoses, otomicoses,


úlceras varicosas, micetoma, osteomielite. Tem sido identificado também em lesões
sistêmicas em transplantados de medula óssea.

Paecilomyces spp. – implicados em casos de peniciliose, endoftalmite, endocardite,


derrame pleural e lesões cutâneas.

Penicillium spp. – causam ceratomicose, peniciliose, otomicose, onicomicose e,


raramente, infecções profundas. Penicillium marnefei produz uma forma disseminada de
peniciliose, é o único agente dimórfico do grupo.

Scopulariopsis sp. – ceratomicose, otomicose e onicomicose.

Criptococose – Em geral produz infecções pulmonares brandas muitas vezes


subclínicas. Em pacientes sintomáticos manifesta-se como tosse e febre, radiografias
demonstra nódulos isolados ou múltiplos nos campos pulmonares médio e inferior que
podem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Na
disseminação ocorre infecção hepato-esplênica, osteomelite, comprometimento subcutâneo
e nódulos cutâneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites é a forma grave da
doença foi atinge grande parte de indivíduos com AIDS.
Agente etiológico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus
neoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D.

Candidíse, Trichosporonose e Malasseziose – descritos anteriormente.

Leveduroses por:

Geotrichum candidum – Produz infecções orais com placas brancas semelhantes às


de candidíase, ao passo que a forma intestinal da doença provoca colite e fezes
sanguinolentas. As manifestações bronquiais são as mais comuns; tosse crônica e o escarro
27

mucóide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. Já foram documentadas


infecções vaginais.

Toluropsis glabrata – patógeno oportunista que geralmente provoca doenças em


pacientes debilitados. Os pulmões e os rins são os órgãos mais afetados, embora esse fungo
possa disseminar-se para o restante do corpo através do sangue, causando fungemia e
choque séptico.

Pneumocystis carinii – Pneumocystis se adere às células epiteliais e penetram ao


citoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvéolo, produzido danos na
membrana basal do alvéolo formando exudado alveolar eosinofílico. O agente não tem sido
cultivado.
28

4.- Identificação dos Fungos

PRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS

4.a- Identificação dos Fungos


Os caracteres macromorfológicos da colônia fúngica podem variar
consideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituição
nutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubação. Conseqüentemente
é fundamental em que meio e condições foi incubado o agente.
A análise macroscópica dos cultivos visa caracterizar.

1- Textura: serosa, cremosa, mucóide, membranosa, pulverulenta, granular, camurça,


cotonosa.
2- Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme.
3- Aspecto: brilhante, opaco, seco, úmido.
4- Superfície: lisa, fissurada, rugosa.
5- Bordas: regulares, irregulares, radiadas.
6- Cor da colônia: branco, preto, verde, vermelho, etc.
7- Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia.
8- Tempo de crescimento.
9- Diâmetro da colônia.

Técnica de esgarçamento:
Utilizada para identificação micromorfológica de fungos filamentosos. Com alça de
platina em L, retirar um fragmento da colônia, colocar em lâmina com una gota de
lactofenol azul de algodão e com auxilio de agulhas esgarçar bem. Cobrir com lamínula,
comprimir levemente e observar ao microscópio com aumento 10X ou 40X.
29

Cultivo em lâmina.
Nesta técnica as estruturas permanecem devem permanecer íntegras e o meio
utilizado pode ser Sabouraud dextrose ágar, batata ágar, lactrimel ágar ou V8.
Esterilizar placas de Petri com uma lâmina no interior, papel de filtro e lamínula.
Colocar o meio de ágar em placa. Deixar solidificar.

Lamínula

Com a alça em L, destacar porções bem pequenas da colônia do bolor, crescida no ágar e
colocar nos quatro lados do pedaço de ágar.

Cobrir com lamínula esterilizada, pressionando levemente.

Lâmina suporte

Umedecer com 4 ml
de água esterilizada

Àgar batata

Lâmina para
microcultivo
30

Colocar um pouco de água destilada esterilizada no fundo da placa esterilizada,


repor a água esterilizada, sempre que necessário. Deixar por 10-15 dias, dependendo da
velocidade de crescimento do fungo.
Para montar, retirar a lamínula com pinça estéril. Fixar o fungo na lamínula
colocando 1 a 2 gotas de álcool e esperar secar. Montar essa lamínula em uma lâmina
limpa, com uma gota de lactofenol azul-algodão.
A lamínula pode ser vedada com esmalte de unha ou Etellan para conservar por
mais tempo.
Pode, também, ser montada a lâmina do microcultivo, retirando-se o pedaço de
ágar, fixando com álcool e colocando uma lamínula limpa, com uma gota de Lactofenol
azul-algodão.

A classificação e identificação dos fungos estão baseadas principalmente nos caracteres


macro e micromorfológicos, assim como no método de reprodução sexual do organismo
isolado. O processo de identificação de leveduras inclui testes bioquímicos, que serão
discutidos posteriormente. Observamos atualmente em micologia, a participação crescente
das técnicas de biologia molecular, no auxílio taxonômico.

Nosso primeiro grande objetivo é diferenciar colônias leveduriformes e filamentosas.

1.- Observe e descreva as principais características macroscópicas das diversas colônias


fúngicas a serem analisadas:

a) Colônias leveduriformes

b) Colônias filamentosas
31

Micromorfologia dos fungos de interesse em micologia médica

4b. Rotina de Identificação de Leveduras

l - ISOLAMENTO

1 - Princípio:
Freqüentemente as leveduras crescem com bactérias em cultura, ou pode haver o
desenvolvimento de mais de uma espécie de levedura no mesmo cultivo. Para a correta
identificação das leveduras é essencial utilizar culturas puras. O primeiro passo portanto,
consiste na purificação dos cultivos.

2 - Material utilizado:
- água destilada esterilizado
- alça de platina
- cultivo de levedura a ser identificada
- placas de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol

3 - Técnica:
Preparar uma suspensão da colônia em água destilada esterilizada de acordo com o
no 3 da escala de MacFarland. Com o auxílio de uma alça de platina semear em estrias em
placa de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol.
Incubar a 37°C por 48 horas. A cultura isolada será utilizada para as provas de
identificação.
OBS: Quando não houver crescimento ideal nesta temperatura, proceder o
isolamento em outra placa e incubar à temperatura ambiente.
32

ll - Prova do tubo germinativo

1 - Princípio:
Esta é uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo é formado
dentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espécies, como Candida tropicalis podem
produzi-lo após 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans são positivas.
O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por não ser septado, apresentar paredes
paralelas e não possuir constrição na sua extremidade “abaulada”.

2 - Material utilizado:
- 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc.
- pipetas Pasteur
- lâminas
- lamínulas

3 - Técnica:
Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37°C
durante duas horas. Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e
cobrir com lamínula. Examinar ao microscópio com objetivas de 10 x e 40x.

4 - Estruturas observadas ao microscópio:


33

lll - Prova do clamidoconídio (microcultivo)

1 - Princípio:
Observar a existência ou não de filamentação, a produção de clamidoconídios,
blastoconídios e de artroconídios, assim como a disposição destes elementos no micélio. C.
albicans produz clamidoconídios arredondados em posição intercalar ou terminal em
relação à pseudohifa. De modo geral, a maioria das espécies do gênero Candida formam
pseudohifas bem desenvolvidas. Já as leveduras dos gêneros Torulopsis, Rhodotorula e
Cryptococcus não produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentam
pseudohifas rudimentares ou não as formam. A presença de artroconídios é sugestiva de
Geotrichum spp. ou Trichosporon spp, este último associado a blastoconídios.

2 - Material utilizado:
- Cultivos de 24-48 horas
- Ágar fubá
- Placas de Petri (90x15 mm)
- Alça de platina com extremidade retilínea
- Lamínulas esterilizadas

3 - Técnica:
Fundir o meio de ágar fubá e verter sobre placa de Petri. Após a solidificação, com
o auxílio de uma alça de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfície da placa e
cobrir com lamínula esterilizada. Incubar a 25°C, durante 48-96 horas. Examinar ao
microscópio, com objetivas de 10 x e 40x.

4 - Observação ao Microscópio:
34

IV - Prova de assimilação de fontes de C e N (auxanograma)

1- Princípio
O teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar um
composto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de assimilação.
Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras. Estão
condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam a
degradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução do
nitrato.

2- Material utilizado
- Cultivo de 24-48 horas
- Meio C
- Meio N
- Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas
- Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas
- Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose,
melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina,
inositol)
- Fontes de nitrogênio (peptona e KNO3)

3- Técnica
Preparar suspensão da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padrão 5 da
escala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabilizá-los em banho Maria a 50°C
durante a realização da prova. Para verificar a assimilação de fontes de carbono, misturar 2
mL da suspensão com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Para
observar a assimilação de fontes de nitrogênio, misturar 1 ml da suspensão com 20 ml do
meio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Após a solidificação dos meios,
distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrogênio (meio N) sobre o
35

ágar. Incubar a 30°C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo de
crescimento na área correspondente a cada fonte.

4- Leitura

Gli Gal Mal Sac Lac Raf Tre Mel Ram Dul Ino Cel Inu Man Xil KN Pep
O3

V - Prova de fermentação de Açúcares (zimograma)

1- Princípio
A habilidade de uma levedura para fermentar um determinado açúcar dependerá da
presença ou ausência de um sistema de transporte que permitirá a absorção do açúcar a
baixas tensões de O2 e da presença de um sistema enzimático que atuará na degradação
glicolítica do açúcar com a formação de etanol e anidrido carbônico. A fermentação
positiva ou negativa de um determinado açúcar é um dado complementar para diferenciar
as espécies.

2- Material
- Cultivos de 24-48 horas
- Água destilada esterilizada (4ml)
- Meio de cultivo para a fermentação de açúcares: dextrose, maltose, sacarose,
lactose, galactose, e trealose
- Bateria de meios para fermentação (tubos de rosca com tubos de Durhan)
- Pipeta automática calibrada para 200 microlitros
36

3. Técnica
Preparar uma suspensão de leveduras (turbidez de acordo com o padrão 5 da escala
de MacFarland). Inocular 200µl da suspensão em tubos de ensaio contendo os respectivos
carboidratos. Incubar a 37°C por 24-72 horas. Realizar leitura observando a produção de
ácido (mudança de cor do meio) e gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan).
A observação da prova é válida até 20 dias após a realização da mesma.

4- Leitura

Açúcar Dex Malt Sac Lac Galac Treal


Gás
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VI - Produção de Urease

1- Princípio
É prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificação de
algumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp.
O dermatófito T. mentagrophytes são urease positivos.

2- Material
-Cultivo de 24-48 horas
-Meio de uréia de Christensen

3- Técnica
Semear cultivos de 24-48 horas na superfície do meio de uréia de Christensen.
Incubar à temperatura de 30°C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador.

4- Leitura
Vermelho = positivo
Amarelo = negativo

II - Produção de Cápsula

1- Princípio
A formação de cápsula é observada em espécies de Cryptococcus, embora possa
ocorrer em outras espécies de leveduras. A observação de cápsula no exame direto de uma
levedura necessita complementação posterior da identificação através de outras técnicas
(prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.).
38

2- Material
-Cultivo da levedura-problema
-Lâmina
-Lamínula
-Água destilada esterilizada
-Tinta da China

3- Técnica
Após homogeneizar a levedura com uma gota de água destilada e uma gota de tinta
da China sobre uma lâmina, sobrepor uma lamínula e observar ao microscópio.

4- Leitura
As preparações positivas irão mostrar a presença de uma área clara, a cápsula, em
torno da célula leveduriforme, sobre um fundo negro.

VIII - Produção de pigmento no ágar-niger

1- Princípio
Quando Cryptococcus neoformans é semeado num meio contendo extrato de
semente de niger, girassol ou alpiste, as colônias tornam-se negras ou marrons devido a
atividade de fenol oxidase da levedura. Colônias de outras leveduras, incluindo outras
espécies de Cryptococcus irão manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado na
triagem para isolamento de C. neoformans.

2- Material
-Meio de ágar-niger
-Alça de platina
-Cultivo da levedura-problema
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3- Técnica
Semear a levedura-problema em placa contendo meio de ágar-niger, pelo método do
esgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC.

4- Leitura
A colônia de C. neoformans apresenta coloração marrom ou negra.

IX - Produção de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas)

1- Princípio
Algumas espécies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, as
ascosporas. A observação dessas estruturas é importante para a identificação da levedura.
Para estimular a produção de ascosporas é necessário cultivar o isolado em meios especiais

2- Material
-Cultivo da levedura-problema
-Placa contendo meio de Gesso, ou V-8.
-Alça de platina
-Bateria de Ziehl Nielsen
-Lâmina

3- Técnica
Semear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37°C ou à
temperatura ambiente, de acordo com a exigência do isolado. Após 5-7 dias, realizar
esfregaço em lâmina, corar pela técnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscópio com
objetiva de 100 x.
40

4- Leitura
Examinar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o número de ascosporas em
cada asco.

Principais estruturas microscópicas dos fungos

Hifa: Estruturas tubulares, constituídas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem ser
classificadas como hialina ou demácea)

Septada; dividida em compartimentos


celulares através de septos parciais, completos
ou perfurados.

Cenocítica; filamento contínuo não sendo


“aparentemente” dividida por septos.

2. Blastoconídio: Organismo unicelular globoso,


ovóide ou elipsóide denominado levedura. Se
origina quando a célula mãe gera um ou mais
indivíduos por um processo denominado
brotamento ou gemulação.

3. Pseudohifa: Constituída pela sequência de


brotamentos de leveduras sem separação entre
as células filhas gerando uma estrutura
alongada, de paredes não paralelas, sem septo
mas com ponto de contrição entre uma célula e
outra. Podem existir brotamentos laterais
múltiplos que nascem a partir do ponto de
contricção, formando assim o pseudomicélio.
41

4. Artroconídios: São elementos retangulares de


paredes grossas formados por fragmentação
das formas cilíndricas dos fungos previa
divisão do material genético.

5. Clamidoconídios: Estrutura de resistência


produzida pelo fungo como resposta frente às
condições adversas do meio. Células geralmente
globosas ou ovóides, de volume aumentado,
parede dupla e espessa. A localização no micélio
pode ser intercalar, apical ou terminal. Os conídeos
também podem apresentar esta estrutura.

Os fungos têm ciclos de reprodução assexual e sexual, onde os elementos de frutificação


podem ter uma disposição interna ou externa.

1. Zygomycota: Esporos sexuados-zigosporas. Esporos endógenos assexuados-


esporangiósporos, contidos em esporângios.
3. Ascomycotina: Em algum estágio da vida, produzem esporos endógenos sexuados-
ascosporos dentro de estruturas em forma de saco denominados ascos. Segundo a
morfologia do asco adquire a denominação de peritécio, apotécio ou cleistotécio.
4. Basidiomycotina: Esporos sexuados- basidiósporos situados externamente sobre a
célula mãe-baside.
5. Chytridiomycota:
42

Reprodução Disposição Estruturas


Assexuada Externa Conídios, picnidioconídios
Interna Esporangiósporos

Sexuada Externa Basidiósporos


Interna Ascos simples, ascostroma, peritécio, cleistotécio,
apotécio.

Observe e descreva os caracteres microscópicos dos seguintes exemplos de reprodução dos


fungos.

Reprodução assexuada externa

Reprodução assexuada interna

Reprodução sexuada interna


43

2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscópicas dos seguintes fungos


filamentosos:

Trichophyton rubrum T. mentagrophytes T. tonsurans

Microsporum gypseum Microsporum canis Epidermophyton floccosum

Aspergillus spp Penicillium spp Paecilomyces spp


44

Fusarium spp Rhizopus spp Mucor spp

Phialophora spp Cladosporium spp Fonsecaea pedrosoi

Alternaria spp Curvularia spp Nattrassia mangiferae


45

Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis

25°° 25°° 25°°

37°° 37°° 37°°


46

6.- Referências bibliográficas

Arango M.; Castañeda E. Micosis Humanas Procedimentos Diagnósticos Exámenes


directos. 1995.

Ellis D.H. Clinical Mycology. The human opportunistic Mycoses. P. Fazer Inc. Guillinham
Printers Pty. Ltd. Australia 1994.

Hoog G.S. et al Atlas of clinical fungi. Contraolbureau oor Schimmelcultures,


Netherlands/Universitat Rovira Virgili , Spain. 2000.

Kern M. A. Medical Mycology. A Self-Instructional Text. F. A. Davis Company.


Philadelphia, 3 er ed 1988.

Lacaz C.Z.; Porto E.; Martin J. C. Micología Médica: Fungos, actinomicetos e algas de
interese médico 7 de. São Paulo: Sarvier, 1984.

Richardson M.D. & Warnock D.W. Fungal Infection. Diagnosis and managment.
Blockwell Scientific publication, london. 1er ed 1993.
47

Autores
Agenor Messias Junior
Arnaldo Lopes Colombo
Eugenio Reyes Arenas
Olga Fischman Gompertz
Patrício Godoy Martinez
Victor Silva Vargas

Colaboradores
Cledja Soares deAmorim
Edméa Helena de Oliveira
Fabiane Camargo G. Nunes
Leila Paula de Almeida
Luis Zaror Cornejo
Marly Forjaz
Zelinda Maria Nakagawa