Gesta Oi Nova Cao Agro Industrial

GESTÃO DA
INOVAÇÃO
AGROINDUSTRIAL
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
Reitor Luiz Alberto Pilatti

Vice-Reitora Vanessa Ishikawa Rasoto
EDITORA DA UTFPR
Coordenadora-Geral Camila Lopes Ferreira

Coordenadora-Adjunta Emanuelle Torino
CONSELHO EDITORIAL
Titulares Anna Luiza Metidierl Cruz Malthez
Awdry Feisser Miquelin
Douglas Sampaio Henrique
Eduardo Leite kruger
Francis Kanashiro Meneghetti
Ligia Patrícia Torino Guassu
Marcos Antonio Florczak
Rogério Caetano de Almeida
Thomaz Aurélio Pagioro
Suplentes Adriane de Lima Penteado
Alberto Yoshihiro Nakano
Alessandra Dutra
Anderson Catapan
Cintia de Lourdes Nahhas Rodacki
Ricardo Luders
Ricardo Yuji Sado
Rodrigo Alexandre de Carvalho Xavier
Sara Tatiana Moreira
Alcione Lino de Araújo
Renata Louize Samulak Marinho
Juliana Vitória Messias Bittencourt
(organizadoras)

GESTÃO DA
INOVAÇÃO
AGROINDUSTRIAL
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Curitiba | EDUTFPR | 2017

© 2017 Editora da Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Esta licença pemite o download e o compartilhamento da obra
4.0 Internacional desde que sejam atribuídos créditos ao(s) autor(es), sem a
possibilidade de alterá-la ou utilizá-la para fins comerciais.
Disponível em: <http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/>.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
G393g Gestão da inovação agroindustrial : diagnóstico molecular [Recurso eletrônico]

/ Alcione Lino de Araújo, Renata Louize Samulak Marinho e Juliana Vitória Messias
Bittencourt, organizadoras.
Curitiba: EDUTFPR, 2017.
154 p.: il. ; 23 cm.
ISBN: 978-85-7014-200-9 (E-book)

E-book disponível em: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/
1. Biotecnologia. 2. Agroindústria. 3. Inovações tecnológicas. 4. Diagnóstico

molecular. I. Araújo, Alcione Lino de, org. II. Marinho, Renata Louize Samulak, org. III.
Bittencourt, Juliana Vitoria Messias, org. IV. Título.
CDD (22. ed.) 660.6
Bibliotecária: Rosana da Silva CRB: 9/1745
Coordenação Editorial Camila Lopes Ferreira

Emanuelle Torino
Projeto Gráfico Marco Tulio Braga de Moraes
Normalização Laudicena de Fátima Ribeiro
Camila Lopes Ferreira
Revisão Adão de Araújo
EDUTFPR
Editora da Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Av. Sete de Setembro, 3165
80230-901 Curitiba PR
www.utfpr.edu.br/editora
4
SUMÁRIO
7 PREFÁCIO
11 REAÇÃO DE POLIMERASE (PCR) EM CADEIA

Jullie Angel Ruths, Luciano Medina Macedo e Mariana Machado Fidelis do
Nascimento
23 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ORGANISMOS GENETICAMENTE

MODIFICADOS (OGMs): LEVANTAMENTO DE TECNOLOGIAS E
LABORATÓRIOS APTOS A ANÁLISES DE OGMs NO BRASIL
Nathalie Hamine Panzarini e Amanda Rocha Pietrochinski
43 BIOPROSPECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS APLICADA À

BIORREMEDIAÇÃO
Mariana Machado Fidelis do Nascimento, Germana Davila dos Santos e Vania
Aparecida Vicente
67 DIAGNÓSTICO MOLECULAR VIA PCR E A INOVAÇÃO TECNÓLOGICA NA

AGROINDÚSTRIA
Marjory Xavier Rodrigues
83 APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR NA INDÚSTRIA

DE ALIMENTOS
Francielli Casanova Monteiro, Larissa Aparecida de Castro e Juliana Vitória Messias
Bittencourt
99 SEQUENCIAMENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO E TAXONOMIA

DE PROCARIOTOS
Germana Davila dos Santos, Mariana Machado Fidelis do Nascimento e Vania
Aparecida Vicente
123 SENSIBILIDADE DA PCR EM DERIVADOS DE ORIGEM ANIMAL

Gabriela Sartori Felkl, Andiara Gonçalves Tenório, Renata Samulak Marinho, Sabrina
Ávila Rodrigues, Luciano Medina Macedo e Juliana Vitoria Messias Bittencourt
143 SOBRE AS ORGANIZADORAS

147 SOBRE OS AUTORES
6
PREFÁCIO
7
8
Este livro tem como objetivo divulgar os trabalhos e as linhas
de pesquisa na área biotecnológica conduzidas pelo grupo Gestão da
Inovação Agroindustrial, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia
de Produção da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) –
Câmpus Ponta Grossa. Este grupo de pesquisa, através de seus alunos de
mestrado e de doutorado, emprega ferramentas de biologia molecular
embasadas na Polymerase Chain Reaction (PCR) para realizar o diagnóstico
molecular de uma série de produtos e de processos.
A biologia molecular investiga as interações entre os diversos
sistemas celulares, com especial foco no estudo da estrutura e da função do
material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. A constante
evolução tecnológica apresenta alto rendimento e vêm melhorando
rapidamente em termos de qualidade, precisão, velocidade e custo
do diagnóstico molecular, possibilitando avaliações taxonômicas mais
criteriosas dos sistemas biológicos.
Na indústria de alimentos, a inovação tem tomado espaço cada
vez maior, pois estas novas tecnologias além de favorecerem a produção
de produtos que o mercado deseja, objetivam garantir a segurança do
alimento ao longo da cadeia produtiva. Os métodos clássicos para detectar
micro-organismos de origem alimentar estão sujeitos ao crescimento
delongado em meios de cultura, seguidos de isolamento, identificação
bioquímica e, em alguns casos, sorologia. Pode-se afirmar que os grandes
avanços na biologia molecular nos últimos tempos e a geração de técnicas
inovadoras têm permitido aprimoramentos, além de uma nova visão para
abordar problemas básicos desta área.
A coletânea de trabalhos aqui agrupados corroboram para o
entendimento de como, nos últimos anos, o diagnóstico molecular assumiu
um papel extremamente importante na produção e melhoria do controle
de contaminação de patógenos na indústria de alimentos, representando
um avanço na segurança alimentar do produto final. Os capítulos, em
linhas gerais, enfatizam teorias e práticas relativas ao sequenciamento
de ácido desoxirribonucleico (DNA), à taxonomia de micro-organismos,
à identificação de organismos geneticamente modificados (OGMs) em
9
alimentos processados, ao diagnóstico molecular via PCR de patógenos
alimentares na gestão de qualidade agroindustrial e à bioprospecção de
micro-organismos aplicada à biorremediação ambiental.
Maria Helene Giovanetti Canteri
10
REAÇÃO DE POLIMERASE (PCR) EM CADEIA
Jullie Angel Ruths
Luciano Medina Macedo
Mariana Machado Fidelis do Nascimento
11
12
CONTEXTUALIZAÇÃO, HISTÓRICO E APLICAÇÕES
Este capítulo tem como objetivo descrever sucintamente o
histórico da ciência do ácido desoxirribonucleico (DNA) recombinante
até a grande difusão de diversas metodologias baseadas na técnica de
reação de polimerase em cadeia (polymerase chain reaction – PCR). Nos
dias de hoje a PCR é uma técnica básica, que dá suporte para muitos
estudos desenvolvidos pelo Grupo de Inovação Agroindustrial dentro do
Laboratório de Bioengenharia da Universidade Tecnológica Federal do
Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa, cuja presente obra inclui algumas
aplicações nos próximos capítulos.
A PCR é uma técnica que permite a amplificação de regiões do
genoma a partir de pequenas quantidades de DNA in vitro (BAREA; PARDINI;
GUSHIKEN, 2004). Esta técnica foi idealizada em 1983 por Kary Mullins, para
realizar a amplificação de grandes quantidades de segmentos de DNA,
empregando sucessivos ciclos de desnaturação, anelamento e extensão
(MULLIS et al., 1986). Apesar de esta técnica ser a base de muitas técnicas da
biologia molecular moderna, vários outros estudos iniciados mais de 100
anos antes por diversos pesquisadores deram o suporte necessário para
que ela fosse desenvolvida.
A primeira visualização da molécula de DNA foi realizada em 1848
pelo botânico alemão Wilhelm Hofmeister, que descreveu os cromossomos
como pequenos corpos nos quais o núcleo celular se organizara durante a
mitose, mas seu isolamento só foi realizado anos mais tarde, enquanto o
médico suíço Friedrich Miescher estudava a composição química dos leu-
cócitos humanos no ano de 1868 (DAHM, 2008). Durante mais de cinquen-
ta anos vários estudos foram realizados visando identificar a composição
desta fração ácida, obtida principalmente a partir de amostras de glândulas
timo de bezerros devido a estas células possuírem grande tamanho e pos-
sibilitarem o isolamento desta fração ácida com maior abundância. No ano
de 1919, o bioquímico russo naturalizado americano Phoebus Aaron Theo-
dore Levene conseguiu identificar os grandes blocos que compunham o
DNA e o RNA, descrevendo as bases nitrogenadas, a presença de um açúcar
na forma de desoxirribose e o grupo fosfato (LEVENE, 1919).
13
Em 1934 o médico biofísico Torbjorn Oskar Caspersson conseguiu
demonstrar que o DNA era uma molécula polimérica longa, e não uma mo-
lécula de pequeno tamanho como até então se pensava. Juntamente com
o biólogo William Thomas Astbury, eles iniciaram na Suécia os primeiros es-
tudos utilizando difração de raios-X com o objetivo de verificar a estrutura
e função desta fração ácida. No entanto, foi somente cerca de quinze anos
mais tarde que a estrutura helicoidal do DNA foi compreendida de maneira
satisfatória, sendo descrita em 1953 pelos cientistas James Watson e Francis
Crick, na Universidade de Cambridge – Inglaterra (WATSON; CRICK, 1953).
De acordo com Borém, Giúdice e Sediyama (2003), essa descoberta foi um
marco para o desenvolvimento da biologia molecular moderna, pois so-
mente após esta fase foi possível dar início ao processo de compreensão da
estrutura e função do código genético.
Poucos anos depois (1956), o bioquímico americano Arthur Kor-
nberg descobriu que a enzima DNA polimerase era a responsável pela repli-
cação do DNA. Cerca de dez anos depois, os microbiologistas americanos
Werner Arber, Hamilton Smith e Daniel Nathans iniciaram experimentos
utilizando enzimas de restrição para cortar o DNA em fragmentos menores.
Essa técnica serviu como base para que, em 1972, o químico americano
Paul Berg conseguisse desenvolver o primeiro micro-organismo recombi-
nante criado em laboratório, ao inserir uma sequência isolada de um vírus
em uma bactéria (JACKSON; SYMONS. BERG, 1972).
A partir deste ponto estavam definidas as bases da biologia molecular
que seriam utilizadas até a concepção da técnica PCR. Até então, para se ob-
ter quantidades de DNA suficientes para realizar análises, era necessário isolar
e cortar o DNA-alvo com enzimas de restrição, para posteriormente clonar os
fragmentos obtidos em bactérias E. coli e, então, fazê-las crescer em ambiente
controlado. No entanto, todo este processo era muito trabalhoso e demorado,
chegando a levar cerca de um mês de trabalho em laboratório quando tudo
corria conforme planejado. Apesar de a técnica da PCR idealizada por Kary Mul-
lis no início dos anos 80 ter reduzido o tempo necessário para se obter grandes
quantidades de uma região genômica de um mês para cerca de um dia de tra-
balho em laboratório, esta técnica ainda era extremamente laborosa. As etapas
de desnaturação, anelamento e extensão eram conduzidas em banhos-maria
14
com diferentes temperaturas, enquanto a enzima DNA polimerase isolada a
partir de colônias de E. coli precisava ser adicionada a cada novo ciclo, devido a
esta não possuir propriedades termoestáveis e ser degradada quando expos-
ta à temperatura elevada na etapa de desnaturação. Anos depois, a patente
de sua invenção foi vendida para a fabricante de equipamento de laboratórios
Roche, mas foi somente em 1988, após o pesquisador americano Randall Saiki
conseguir isolar a DNA polimerase a partir do micro-organismo Thermus aqua-
ticus (SAIKI et al., 1988), uma bactéria encontrada em fontes hidrotermais, que
a PCR pôde ser concebida tal como a conhecemos hoje em dia.
Em 1989 surgiu no mercado o primeiro termociclador automático,
que possuía fontes de aquecimento, resistências elétricas e sistema de
refrigeração num único bloco de reação. Para realizar a reação, é necessário
utilizar um primer complementar à região genômica que se deseja
amplificar e analisar, após, sucessivos ciclos de desnaturação das fitas de
DNA, anelamento dos primers às sequências de DNA e extensão realizada
pela enzima DNA polimerase. Desta forma, a técnica PCR contemporânea
utiliza uma série de reagentes cujas funções são:
a) água: diluir e aumentar o volume da reação;
b) primes: pequenas sequências complementares à sequência-alvo
do DNA de interesse;
c) taq DNA polimerase: enzima termoestável utilizada na amplifica-
ção de DNA;
d) DNA: contém a sequência-alvo de interesse, que serve de molde
para o pareamento dos primes;
e) cloreto de magnésio (MgCl2): cofator enzimático essencial para o
funcionamento da taq polimerase;
f ) DNTPs: são os quatro desoxirribonucleotídeos (adenina, citosina,
guanina e timina) que, durante o processo de replicação da se-
quência-alvo, são incorporados pela Taq DNA polimerase na nova
fita sintetizada;
g) tampão (buffer): sua função é manter o pH da reação constante
para assegurar a atividade da Taq DNA polimerase.
15
Poucos anos mais tarde foi desenvolvida uma variante da PCR
convencional, a PCR quantitativa ou PCR em tempo real. Desenvolvida
em 1992, por Higuchi et al. (1992; 1993), a principal característica dessa
técnica é que a amplificação, a detecção e a quantificação da sequência-
alvo ocorrem de forma simultânea e podem ser monitorados em tempo
real durante cada ciclo da PCR. Para tanto, a PCR em tempo real requer um
termociclador que possua um sistema óptico e um computador para
monitorar a evolução da reação de PCR.
A PCR em tempo real é uma das técnicas mais precisas para quantifi-
car níveis de expressão de um determinado gene e também possibilita obter
resultados rápidos e reprodutíveis (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004). A PCR quan-
titativa, assim como a convencional, também apresenta três fases distintas:
a) 1ª fase – lag: com flutuação, não há a liberação do corante para
que seja possível realizar a detecção da fluorescência;
b) 2ª fase – log ou exponencial: nesta fase já ocorre o aumento do si-
nal fluorescente, e a quantidade de produtos de amplificação do-
bra a cada ciclo. É nessa fase que se realiza a quantificação da PCR
devido ao grande número de cópias da região alvo amplificadas;
c) 3ª fase – estabilização: é a fase final, onde já não se tem mais o au-
mento exponencial do número de produtos da região alvo devido
ao consumo total de algum dos reagentes da reação.
A PCR em tempo real ainda pode ser incrementada com a utilização
de sondas de DNA que se ligam à região central da sequência-alvo,
aumentando a especificidade do método. Em uma das suas extremidades,
essas sondas possuem fluoróforo e, na outra, uma molécula que dissipa a
energia do fluoróforo na forma de luz ou calor. Segundo Novais e Pires-Alves
(2004), existem três principais tipos de sondas que podem ser introduzidas
na PCR em tempo real, cada qual com características diferentes:
a) sondas lineares ou em alça: são oligonucleótidos que necessitam
de um fluorocromo e detectam exclusivamente a sequência-alvo
nos produtos da PCR;
b) sondas TaqMan®: há a utilização de dois primers, e as sondas de-
tectam as sequências especificas no fragmento do DNA-alvo, sen-
16
do o método que melhor resultado apresenta em relação à análi-
se de sequências específicas;
c) sondas de hibridização FRET: são formadas por um par de
oligonucleótidos marcados com um composto fluorescente, de
modo que uma molécula transfere energia para a outra, sendo
necessário que as sondas tenham uma extremidade marcada
com um fluoróforo.
Recentemente, sondas cadeados (do inglês, padlock probes) têm sido
associadas com a técnica de PCR em tempo real em diferentes trabalhos
(NILSSON et al., 2002; ERICKSSON et al., 2009; TSUI et al., 2010; XIONG, FRASCH,
2011), e são altamente específicas, uma vez que permitem identificar com
precisão as sequências de ácido nucleico-alvo, sendo possível, ainda, verificar
polimorfismo de nucleotídeo único (NILSSON, 2006).
As sondas cadeados foram desenvolvidas e aplicadas pela primeira
vez em 1994 por Nilsson e colaboradores na detecção de DNA específico
em associação com a técnica de Amplificação em Círculo Rolante (do inglês,
Rolling Circle Amplification, RCA). As sondas cadeados são oligonucleotídeos
lineares contendo as sequências complementares nas extremidades 5› e 3›
que se hibridizam com o DNA-alvo por meio de uma reação de ligação com
a formação de um DNA circularizado (ERICKSSON et al., 2009). Quando as
extremidades da sonda reconhecem a sequência de DNA-alvo, esta pode
ser ligada por meio de uma DNA ligase, com o intuito de formar a molécula
de DNA circularizado que será posteriormente amplificada por RCA
(NILSSON et al., 1994). O resultado da amplificação por RCA é normalmente
visualizado através de eletroforese em gel de agarose com formação de
bandas em padrão de escadas (NAJAFZADEH et al., 2011).
Com o objetivo de melhorar a técnica e diminuir o tempo gasto na
detecção dos resultados, as sondas cadeados têm sido associadas com
a PCR em tempo real (NILSSON et al., 2002, ERICKSSON et al., 2009). Esta
associação de técnicas possibilitou o estudo da cinética da reação de
polimerização e amplificação em uma reação de RCA (NILSSON et al., 2002).
A combinação de técnicas (Figura 1) permite uma quantificação
precisa do DNA circularizado em uma ampla faixa de concentração, sendo
17
possível relacionar o sinal do DNA circularizado em teste com o DNA de
referência interno com cores de fluorescência distintas (NILSSON et al.,
2002, TSUI et al. 2010). O uso da técnica tem se mostrado bastante sensível
e eficiente, principalmente na identificação rápida de microrganismos e
distinção entre espécies (TSUI et al., 2010).
Figura 1 – Representação das etapas de amplificação da sonda cadeado em associação RT-PCR

Fonte: Adaptado de Tsui et al. (2010).
Nota: A: Ligação da sonda cadeado na sequência complementar e posterior circularização por DNA
ligase; B: Não houve ligação da sonda e, dessa forma, a ligação da sonda não ocorre; *: Sonda não ligada é
removida na etapa de digestão pela exonuclease.
18
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A técnica da PCR tem demonstrado aplicações em diversas áreas
que necessitam de diagnósticos rápidos e confiáveis, e ainda possibilita
que resultados confiáveis sejam obtidos a partir de pequenas quantidades
de DNA. Por sua rapidez, especificidade e sensibilidade, a PCR é uma técnica
que pode ser aplicada em diversas áreas como: biotecnologia, investigação
médica ou forense, detecção de micro-organismos, genotipagem,
biossegurança, diagnóstico de doenças infecciosas graves ou de origem
genética, mapeamento genético, clonagem de genes, elaboração de
árvores filogenéticas e detecção de organismos geneticamente modificados
(OGMs). Sua aplicação em diversos segmentos se dá pela existência de
diferentes tipos de polimorfismo do DNA, que são classificados de acordo
com a sua natureza molecular e localização no genoma, permitindo assim
que estudos sejam realizados para as mais diversas finalidades.
Desta forma, a PCR está cada vez mais presente em laboratórios de
análise, pois as tecnologias moleculares oferecem rapidez na emissão de
resultados, o que a torna ainda mais desejada pelos setores produtivos. A
implantação de ferramentas de qualidade é uma alternativa no ciclo de
produção agroindustrial; no entanto, existem dificuldades de seleção dos
pontos críticos de controle (PCC) para um número de perigos biológicos,
onde há a impossibilidade de controlar a maior parte dos patógenos,
especialmente aqueles que causam problemas clínicos em animais e
danos à saúde humana. Assim, métodos baseados em DNA estão surgindo
como vias confiáveis, simples e acessíveis, para identificar e classificar
micro-organismos. O método referido como REP-PCR (impressão digital)
do genoma, uma técnica baseada na amplificação do DNA, é considerado
extremamente confiável, reprodutível, rápido e altamente discriminativo.
REFERÊNCIAS
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arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em
cadeia (PCR). Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, São José
do Rio Preto, v. 26, n. 4, p. 274-284, 2004.
19
BORÉM, A.; GIÚDICE, M.; SEDIYAMA, T. (Coord.). Melhoramento genômico.
Viçosa: UFV, 2003.
DAHM, R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of
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ERIKSSON, R. et al. Multiplex and quantifiable detection of nucleic acid
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HIGUCHI, R. et al.Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA
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JACKSON, D. A.; SYMONS, R. H.; BERG, P. A Biochemical method for
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E. coli. Proceedings Natural Sciences of USA, v. 69, p. 2904, 1972.
LEVENE, P. T. A. The structure of yeast nucleic acid: ammonia hydrolysis.
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MULLIS, K. et al. Specific enzymatic amplification of DNA In vitro:
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NILSSON, M. et al. Padlock probes: circularizing oligonucleotides for
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NILSSON, M. et al. Real‐time monitoring of rolling‐circle amplification
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NILSSON, M. Lock and roll: single-molecule genotyping in situ using
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NOVAIS, C. M.; PIRES-ALVES, M. P. PCR em tempo real: uma inovação
tecnológica na reação em cadeia da polimerase (PCR). Revista
Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, jul./dez. 2004.
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SAIKI, R.K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science, n. 239, v. 4839, p. 487-491, 1988.
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WATSON, J. D.; CRICK, F. H. C. A structure for deoxyribose nucleic acid.
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XIONG, F.; FRASCH W, D. Padlock probe-mediated qRT-PCR for DNA computing
answer determination. Natural Computing, v. 10, n. 2, p. 947-959, 2011.
21
22
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE
ORGANISMOS GENETICAMENTE
MODIFICADOS (OGMs): LEVANTAMENTO
DE TECNOLOGIAS E LABORATÓRIOS APTOS
A ANÁLISES DE OGMs NO BRASIL
Nathalie Hamine Panzarini
Amanda Rocha Pietrochinski
23
24
INTRODUÇÃO
Os organismos transgênicos são produtos da tecnologia do ácido
desoxirribonucleico (DNA) recombinante, criada em 1973, que possibilita
a transferência de material genético intra e interespécies, ou seja, são
organismos geneticamente modificados (OGMs). Seu objetivo é atribuir
nova característica, ou alterar alguma característica já existente, mediante
a inserção ou eliminação de um ou mais genes por técnicas de engenharia
genética (CAMARA, 2012).
Os OGMs oferecem vários benefícios para a prática da agricultura,
qualidade alimentar, nutrição e saúde. O advento dessa inovação
biotecnológica acarretou muitos benefícios para a agricultura, e muitas
culturas foram estudadas, tendo sido introduzidos genes de resistência
a insetos e herbicidas em várias delas, como, por exemplo, soja, milho e
canola resistentes ao glifosato e o milho e algodão Bt resistentes à lagarta
(DEISINGH; BADRIE, 2005; LUDWIG et al., 2010).
Dentre as principais vantagens do OGM, destacam-se: o aumento
do rendimento com melhoria da produtividade e da resistência a pragas, a
doenças e a condições ambientais adversas; a melhoria das características
agronômicas, permitindo melhor adaptação às exigências de mecanização;
o aperfeiçoamento da qualidade; a maior adaptabilidade a condições
climáticas desfavoráveis, assim como a domesticação de novas espécies,
conferindo-lhes utilidade e rentabilidade para o homem (CAMARA, 2009).
Grandes avanços ocorreram na biologia molecular e na genética
na década de 1970, propiciando o atual progresso e o desenvolvimento
biotecnológico. Segundo relatório da Food and Agriculture Organization
(FAO), as primeiras experiências na biologia molecular e na genética foram
desenvolvidas nos Estados Unidos e na França em 1986. Já a China foi o
primeiro país a comercializar plantas transgênicas no início da década
de 90, com a introdução do fumo resistente a vírus, seguido do tomate
também resistente a vírus (RIBEIRO; MARIN, 2012).
Dentre os 51 países que concederam aprovações para o plantio de
lavouras biotecnológicas, os EUA encabeçam a lista, seguidos pelo Japão,
Canadá, Coreia do Sul, Austrália, Filipinas, México, Nova Zelândia, União
25
Europeia e China. Uma cultivar pode ser comercializada com várias versões
transgênicas, os chamados eventos. O milho tem a maioria dos eventos
aprovados (35 eventos), seguido do algodão (19 eventos), da canola (14
eventos) e da soja (7 eventos) (COSTA; MARIN, 2011).
No Brasil, a liberação da soja transgênica está regularizada desde
1995 pela Lei de Biossegurança no 8.974, revogada pela Lei no 11.105/2005,
que assegura as normas coordenadas pela Comissão Técnica Nacional
de Biossegurança (CTNBio) para uso da técnica de engenharia genética.
Nos últimos anos, diversas variedades de plantas GMs foram aprovadas e
introduzidas para a plantação como, por exemplo, a soja, o milho, a canola
e o algodão (RIBEIRO; MARIN, 2012; COSTA; MARIN, 2011).
Segundo Costa e Marin (2011), embora a produção e venda de
produtos alimentares GM tenham começado há mais de uma década, ainda
há incertezas e controvérsias sobre como estes devem ser regulamentados.
Nos últimos dez anos, mais de 40 países adotaram políticas de rotulagem
para alimentos GM, mas as características das regulamentações e seu grau
de execução variam enormemente.
Segundo os mesmos autores, embora a maioria dos países
pertencentes à Organização para a Cooperação Econômica e
Desenvolvimento (OECD) tenham implementado algum tipo de política de
rotulagem, poucos países em desenvolvimento introduziram, ou mesmo
implementaram, leis para rotulagem. Em todo o mundo existe legislação
para a autorização e rotulagem dos OGMs em produtos alimentares,
e muitos países estabeleceram níveis de limite para a presença não
intencional (BRANQUINHO; FERREIRA; CARDARELLI-LEITE, 2010).
Para disciplinar a rotulagem de alimentos GMs, foi criado o Decreto
nº 3.871/2001 (RIBEIRO; MARIN, 2012), que obriga a publicação de
informações no rótulo desses produtos no Brasil. Segundo esses autores,
o decreto estabelecia a rotulagem para produtos alimentares de consumo
humano, embalados e que contivessem no mínimo 4% de produtos GMs.
No caso de alimentos com mais de um ingrediente GM em sua composição,
o limite era estabelecido para cada um desses ingredientes isoladamente;
além de não exigir a rotulagem dos produtos in natura e produtos nos quais
a presença de OGM não fosse detectada.
26
Em abril de 2003, o governo brasileiro emitiu o Decreto nº 4.680, re-
gulamentando o direito à informação, assegurado pela Lei n° 8.078. O art.
2º deste decreto determina a obrigatoriedade de rotulagem informando ao
consumidor sobre a presença de OGM, caso seja detectada presença acima
do limite estabelecido por lei (1,00%), tanto em produtos embalados quan-
to nos vendidos a granel ou in natura (COSTA; MARIN, 2011). Exige, ainda,
a identificação da espécie doadora do gene, com uma das seguintes indi-
cações: (nome do produto) transgênico, contém (nome do(s) ingredien-
te(s)) transgênico(s) ou produto produzido a partir de (nome do produto)
transgênico. Em 2003, também se criou o símbolo do transgênico que deve
constar nas embalagens de produtos transgênicos ou derivados que se en-
quadrem no que estipula a Portaria nº 2658 (RIBEIRO; MARIN, 2012).
Quando impresso em policromia, o triângulo deve ser equilátero e
obedecer às seguintes proporções: bordas do triângulo e letra T: 100% preto;
fundo interno do triângulo: 100% amarelo, como o apresentado na Figura 1:
Figura 1 – Apresentação gráfica a ser impressa no rótulo de alimentos transgênicos

Fonte: Brasil (2003).
Em 2007, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) abriu a

Consulta Pública nº 63 para definir critérios e procedimentos de avaliação de
segurança deste tipo de alimento pela Comissão Técnica Nacional da Política
Nacional de Biossegurança relativa a OGM. A partir dessa iniciativa da Anvisa,
uma série de normas deverá ser cumprida na avaliação da segurança de
alimentos que contenham OGM e derivados. A Consulta Pública no 63 propôs
119 questões divididas em quatro áreas de análise: modificação genética,
27
organismos receptores, segurança alimentar e qualidade nutricional. Estas
visam avaliar se os dados apresentados pelos interessados em obter liberação
comercial de produtos com OGM comprovam ou não a segurança de uso
para o consumo humano (COSTA; MARIN, 2011).
Segundo os mesmos autores, a despeito de estar em vigor, não há
fiscalização alguma sobre a aplicação da legislação específica atinente aos
produtos comercializados aqui. A defasagem entre o estabelecimento da
lei (2003) e os primeiros produtos rotulados no mercado (2008) é de cinco
anos. Para isso, métodos analíticos são necessários para atender os limites
da utilização, comercialização de OGMs e a verificação da conformidade
da rotulagem com os requisitos impostos pelas leis. Estudos apresentam
dificuldades e/ou o não cumprimento da lei de rotulagem de alimentos
derivados de OGM no Brasil (RIBEIRO; MARIN, 2012; PINTO et al., 2007).
Diante desse contexto, considerando-se existir atualmente um
mercado para esse tipo de análise, este estudo se propôs a efetuar o
levantamento, em território nacional, de quais laboratórios realizam
análises de OGMs e dos principais métodos empregados na detecção e
quantificação dessa tecnologia em produtos alimentícios. O levantamento
foi realizado a partir de dados secundários e consulta ao Ministério da
Agricultura. Quando não foi possível obter as informações dos laboratórios
por meio eletrônico, utilizou-se o serviço de atendimento.
PRINCIPAIS DADOS DOS LABORATÓRIOS QUE REALIZAM ANÁLISE

DE OGMs EM ALIMENTOS
No Brasil, existe um esforço conjunto do Ministério da Agricultura e
do Ministério da Saúde, por intermédio da Anvisa, para o estabelecimento
de uma rede de laboratórios credenciados para a condução das análises
de detecção/quantificação dos OGMs que circulam no mercado (BARROS;
OLIVEIRA; MARIN, 2008).
Através do levantamento realizado, verificaram-se os laboratórios
credenciados pelo Ministério da Agricultura que realizam análises e emissão
de autorizações e registros de produtos e atividades que contenham OGMs
e seus derivados destinados ao uso animal, na agricultura, na pecuária,
na agroindústria e áreas afins. Os principais dados coletados foram:
28
nome, localidade, contato, tipo de tecnologia aplicada, espécie e produto
analisado e tempo de realização e custo das análises.
Cidade
Laboratório Contato
(Estado)
E-mail: rodrigo.graziani@agricultura.gov.br
Laboratório Nacional Goiânia
Fone: (62) 3232 7205
Agropecuário em Goiás (Goiás)
Fax: (62) 3232 7211
E-mail: lanagro-mg@agricultura.gov.br
Laboratório Oficial Pedro Leopoldo
Fone: (31) 3660 9642
Lanagro/MG (Minas Gerais)
Fax: (31) 3661 2383
Laboratórios
Viçosa E-mail: agrogenetica@agrogenetica.com.br
Credenciados
(Minas Gerais) Fone: (31) 3891 0817
Agrogenética
E-mail: mmalaghini@dasa.com.br
Frischmann Aisengart São José dos Pinhais
Fone: (41) 3299 9231
Medicina Diagnóstica (Paraná)
Fax: (41) 3299 9350
E-mail: tamiris.correia@dasa.com.br
Garibaldi
Laboratório Alac Fone: (54) 3388 3232
(Rio Grande do Sul)
Fax: (54) 3388 3200
E-mail: nadiaandrade@eurofins.com.br
Indaiatuba pedrosuguita@eurofins.com.br
Eurofins do Brasil
(São Paulo) Fone: (19) 2107 5517
Fax: (19) 2107 5505
E-mail: labgmo.sts@superinspect.com.br
Escopo do Laboratório
Santos labfq.sts@superinspect.com.br
Eurofins do Brasil
(São Paulo) Fone: (13) 3219 4000
Superinspect
Fax: (13) 3219 1108
E-mail: gerencia.tecnica@tecam.com.br
Escopo do Laboratório
São Paulo biomol@tecam.com.br
SGS do Brasil Tecam
(São Paulo) Fone: (11) 3677-2553
Tecnologia Ambiental
Fax: (11) 3862 8954
Quadro 1 – Nome, localização e contato dos laboratórios de análise de OGMs em alimentos no

território nacional
Fonte: Autoria própria (2013).
Conforme mostrado no Quadro 1, 62,50% dos laboratórios estão

localizados na Região Sudeste (São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais),
25% na Região Sul (Paraná e Rio Grande Sul) e 12,50% na Região Centro-
Oeste, em Goiás.
29
Segundo a Céleres (2012), regionalmente, o Centro-Oeste já ocupa
a liderança nacional no uso da soja GM, com 9,10 milhões de hectares
(42,70% da área total), seguido pela região Sul, com 8,70 milhões de
hectares (40,40%). Em terceiro lugar, o Nordeste responde por 8% da área
semeada com soja GM (1,70 milhão de hectares).
Já em relação ao milho GM, o Sul apresenta a maior concentração, isto
é, 2,20 milhões de hectares ou 43,90% da área total, seguido pelo Sudeste,
com 1,47 milhão de hectares (29,90%).
Por outro lado, a baixa adoção de transgênicos no Norte e Nordeste
também evidencia a disparidade tecnológica entre os diferentes produtores
no Brasil, visto que os transgênicos são adotados essencialmente por
produtores altamente tecnificados (CÉLERES, 2012).
PRINCIPAIS TECNOLOGIAS UTILIZADAS PARA ANÁLISE DE OGMs

Os principais métodos utilizados para detecção e quantificação de
OGMs em alimentos são bioensaio; imunoensaio, como eliza, fluxo lateral e
western blot; e, polymerase chain reaction (PCR). A maioria das plantas GM
utilizadas para a produção de alimentos apresentam resistência a herbici-
das ou vírus, fungos e insetos. O método de bioensaio é simples e prático,
no qual as sementes a serem analisadas são depositadas em meio de ger-
minação com uma solução dissolvida de herbicida (TORRES et al., 2003).
Se a semente apresentar resistência ao herbicida, sua germinação
e seu desenvolvimento ocorrerão normalmente. As principais restrições
desse método são: elevado tempo para conseguir o resultado (em média
uma semana) e a restrição dos OGMs que possuem resistência a herbicidas
(TORRES et al., 2003).
Os métodos de Imunoensaio são eficientes em misturas complexas
para determinação qualitativa e quantitativa de proteínas. Fundamentado
no agrupamento de proteína OGM nos tecidos vegetais (> 10µg g-1 de
tecido), seu limite de detecção é aproximadamente 1%. Existem imunoen-
saios comerciais para a detecção e quantificação das proteínas da família
Cry (resistência contra insetos), proteína EPSPS-CP4 (tolerância ao herbi-
cida glifosato) e da proteína PAT (tolerância ao herbicida glufosinato). As
30
principais limitações dos métodos são: o grau de expressão da proteína nas
partes das plantas que são utilizadas para a produção de alimentos é muito
baixo; devido a sua idade, há a variação da concentração da proteína nos
tecidos da planta, diversidade e condições ambientais ou o processamento
do alimento pode remover ou desnaturar as proteínas (CONCEIÇÃO; MO-
REIRA; BINSFELD, 2006).
Conceição, Moreira e Binsfeld (2006) distinguem três principais
métodos de imunoensaios:
a) Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): método rápido, sen-
sível, seguro, específico e robusto e não requer treinamento es-
pecífico. Seu princípio é fundamentado no ensaio de duplo anti-
corpo ou sanduíche, que utiliza dois anticorpos particulares para
a proteína transgênica (antígeno Ag – Aglutinogênio). O primeiro
é aplicado na sensibilização da microplaca, objetivando a captura
do Ag existente na amostra do alimento; o segundo em geral está
combinado a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que
evidencia a reação (produção de cor). Outra variação do elisa, que
também é adotada na detecção e quantificação de OGMs, é o en-
saio competitivo, onde o Ag presente na amostra e um padrão (Ag
conjugado com uma enzima) competem pela ligação do anticor-
po de captura. Neste ensaio, a concentração de Ag é inversamen-
te proporcional à intensidade colorimétrica produzida;
b) fluxo lateral: teste qualitativo, prático e rápido, não dispendioso
e seus resultados podem ser obtidos entre 5 e 15 minutos. Não
requer treinamento e equipamentos especiais. A sensibilidade
deste método é de aproximadamente 0,10%. As fitas foram de-
senvolvidas para identificar endotoxina Cry (Ab) ou a proteína
EPSPS-CP4 encontradas em plantas GM tais como soja, milho, ca-
nola e beterraba açucareira;
c) western blot: método altamente específico, semiquantitativo, in-
dicado na análise de proteínas insolúveis particularmente. Onde
essa proteína é extraída e imobilizada em membrana. As proteí-
nas ligadas à membrana são mergulhadas em uma solução com o
anticorpo que identifica a proteína-alvo. Por ser mais trabalhoso, é
31
pouco utilizado para análises rotineiras de OGMs, em geral aplica-
do para confirmar amostras que foram positivas no IFL ou no elisa.
Por sua vez, os métodos fundamentados na detecção do DNA re-
combinante destacam-se quando existe a necessidade da quantificação
do OGM nos alimentos ou quando a amostra é um alimento processado.
Em geral, existe uma relação linear entre a quantidade de OGM e DNA
exógeno quando a alteração genética é nuclear (CONCEIÇÃO; MOREIRA;
BINSFELD, 2006).
Para atender à demanda regulatória e de consumo, vários métodos
baseados na PCR ou reação em cadeia da polimerase foram desenvolvidos
para detectar e quantificar os OGMs na alimentação humana e animal
(DEISINGH; BADRIE, 2005). A PCR é o método mais usado na detecção
e quantificação de alimentos contendo OGMs e a que menos sofre
interferências dos níveis de degradação e processamento da amostra
(CONCEIÇÃO; MOREIRA; BINSFELD, 2006; QUERCI et al., 2010).
Baseia-se em ciclos sucessivos de desnaturação do DNA dupla
fita para DNA fita simples pela elevação da temperatura, anelamento de
dois iniciadores (primers) no DNA-alvo e extensão da cadeia de DNA pelo
acréscimo de nucleotídeos em razão da ação da enzima DNA polimerase
com a presença de íons magnésio. Isso permite a duplicação do fragmento
de interesse a cada ciclo e o aumento exponencial do número de fragmentos
amplificados de acordo com o número total de ciclos da reação. Traços de
DNA são suficientes para detecção de OGMs em alimentos, uma vez que
o mais importante na detecção é a qualidade, a quantidade e a pureza do
DNA extraído (DINON, 2011).
O DNA normalmente é desnaturado a 95-97°C, a hibridização dos
primers acontece entre 30 e 60°C, e a síntese do DNA ocorre a 72°C. Essas
etapas podem ser repetidas por 20 a 30 ciclos, permitindo a amplificação
do segmento de DNA (PASSAGLIA; ZAHA, 2001).
Após a reação de PCR, os fragmentos dos genes são amplificados
pela eletroforese com géis de agarose ou géis de poliacrilamida com
concentrações diferentes diluídos em TBE. Em seguida, o gel é corado com
brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta (UV) (BAREA; PARDINI;
GUSHIKEN, 2004).
32
Não existe um protocolo único para a aplicação da PCR, para cada
caso é necessária a otimização do protocolo, conhecendo as melhores
temperaturas para o processo (DE ROBERTIS; HIB, 2006).
Conceição, Moreira e Binsfeld (2006) resumem, no Quadro 2,
as características dos principais métodos utilizados na detecção e
quantificação de OGMs em alimentos.
Baseado na proteína Baseado no DNA

Parâmetros PCR
Western ELIZA IFL PCR-QC PCR-TR
quantitativo
Facilidade de
Difícil Moderado Simples Difícil Difícil Difícil
uso
Equipamentos
Sim Sim Não Sim Sim Sim
especiais
Sensibilidade Alta Alta Moderada Alta Alta Alta
10
Duração 2 dias 8 horas 1 dia 2 dias 1 dia
minutos
Resultados
Não Sim Não Não Sim Sim
quantitativos
Prático para
testes em Não Não Sim Não Não Não
campo
Empregado Labora-
Academia Laboratório Campo Laboratório Laboratório
principalmente tório
Quadro 2 – Resumo das características dos principais métodos utilizados na detecção e quantificação
de OGMs em alimentos
Fonte: Adaptado de Conceição, Moreira e Binsfeld (2006).
O Quadro 3 apresenta as principais técnicas utilizadas, determinação

ou ensaio, matriz/espécie, tempo e valor de análise pelos laboratórios.
33
Laboratório Técnicas utilizadas
Técnicas utilizadas Análise qualitativa e diferenciação de espécies de
animais e vegetais: técnica de PCR
Quantitativa: Técnica de PCR em Tempo Real (taqman®)
Determinação ou ensaio Identificação espécie específica milho e soja
Identificação evento específico Promotor 35S
Identificação evento específico terminador NOS
Identificação soja roundup ready
Identificação milho Bt11, BT176, MON 810, T25, GA21
Agrogenética Matriz/Espécie Produtos de origem vegetal, grãos, farelos, vegetais in
natura
Produtos processados de origem animal e vegetal,
ingredientes alimentares e rações
Grãos, sementes, folhas e DNA de milho; produtos in
natura e processados, de origem animal e vegetal,
destinados à alimentação humana e animal
Tempo de análise 5 dias
Valor (amostra unitária) Qualitativa: R$ 490,00
Quantitativa: R$ 750,00
Técnicas utilizadas PCR Qualitativo
PCR Qualitativo + RFLP PCR Quantitativo
Determinação ou ensaio Identificação espécie específica CaMV, milho, soja
Identificação elemento específico Promotor 35S,
Terminador NOS, bar, bar/pat (syn), cryIIIa, cryIa (C),
evento T14, Promotor FMV, nptII, pat(syn), 35S/bar,
35S/nptII;
Identificação soja
Eurofins do
Brasil Roundup Ready ™, milho Bt11, Bt176, Bt10, BtXtra,
Herculex™, LibertyLink™, MaxGard™, Mon810, milho
NK603, Roundup Ready™
Matriz/Espécie Produtos de origem vegetal, grãos, farelos, vegetais
in natura; produtos processados de origem animal e
vegetal, ingredientes alimentares e rações
Valor (amostra unitária) Extração de DNA: R$ 287.50 PCR
Qualitativo: R$ 478,50
34
Técnica utilizada PCR real time
Determinação ou ensaio GA21
35S Quantitativa Roundup Ready
35S + NOS Quantitativa NK 603, GA 21, BT 11, BT 176,
MON 810, MON 863
35S + NOS Quantitativa Roundup Ready Bolgard I
35S + NOS Qualitativa
SGS do Brasil Matriz/Espécie Soja em grãos e farelo de soja; milho in natura; canola
in natura; trigo in natura; arroz; produto processado
à base de soja; lecitina; produto processado à base
de milho; algodão in natura de milho; farinha de
mandioca; farinha de rosca; polvilho; canjica; ervilha;
lentilha; grão de bico; sorgo; farinha de trigo; farinha
de cevada; farinha de aveia; amido de mandioca;
produto processado à base de algodão
Valor (amostra unitária) PCR Quantitativa R$ 1.020,00
Técnica utilizada Real Time PCR TaqMan Technology
Determinação ou ensaio Triagem genética P35S
Detecção e quantificação de soja linhagem GTS 40-3-2
Detecção e quantificação de milho MON810
Frischmann
Aisengart Detecção e quantificação de milho
Medicina Matriz/Espécie Grãos e sementes de milho e de soja
Diagnostica
Tempo de análise 1 dia
Valor (amostra unitária) Qualitativo: R$ 460,00
Quantitativo negativo: R$ 570,00
Quantitativo positivo: R$ 750,00
35
PCR Quantitativo
Determinação ou ensaio Evento 176
Detecção e quantificação de milho Bt11
Detecção e quantificação de milho GA21
Identificação espécie milho, identificação evento
promotor e terminador 35S em milho, terminador NOS
em milho
Identificação evento monsanto NK603 e GA21
Laboratório (roundap ready)
Alac
Identificação espécie, evento promotor 35S,
terminador NOS em soja
Identificação espécie beterraba, abobrinha, mamão,
arroz tomate, batata, canola
Matriz/Espécie Produtos de origem vegetal, grãos, farelos, vegetais
in natura, produtos processados de origem animal e
vegetal, ingredientes alimentares e ração.
Valor (amostra unitária) Extração de DNA: R$ 287,50 PCR
Qualitativo: R$ 478,50
PCR Quantitativo
Determinação ou ensaio Detecção de espécie específica de milho e soja (gene
endógeno)
Detecção de OGM* (Promotor 35S)
Detecção de OGM (Terminador NOS)
Identificação de evento específico 176(NaturGard™),
Bt11 (Yieldgard®), GA21 (Roundup Ready®), MON 810
TECAM
(Yieldgard®), NK603 (Roundup Ready®), RR (Roundup
Ready®)
Detecção e quantificação de OGM em soja e milho
(Promotor 35S)
Detecção e quantificação de evento específico RR em
soja (Roundup Ready®)
Matriz/Espécie Produtos de origem vegetal; grãos, farelos, vegetais
in natura; produtos processados de origem animal e
vegetal, ingredientes alimentares e rações
36
Valor (amostra unitária) Detecção de OGM: R$ 700,00
Quantificação OGM: R$ 400,00
PCR Quantitativo
Determinação ou ensaio Promotor 35S em milho
Promotor 35S em soja
Promotor 35S em algodão
Terminador NOS em milho
LANAGRO
Terminador NOS em soja; Terminador NOS em
algodão; RR em soja; Soja RR em embutidos; Bt11 em
milho; Soja RR em rações; Milho Bt11 em rações.
Matriz/Espécie Produtos agropecuários e de origem vegetal
Valor (amostra unitária) Não cobra pela realização de análises pois realiza
apenas analise para o MAPA.
Quadro 3 – Lista de técnicas utilizadas nos laboratórios
Nota: RFLP: Restriction fragment length polymorphism.
Observa-se que a PCR é o método mais usado pelos laboratórios

analisados para a detecção e quantificação de alimentos contendo OGMs.
O método baseia-se em ciclos sucessivos de desnaturação do DNA dupla
fita para DNA fita simples pela elevação da temperatura, anelamento de
dois iniciadores (primers) no DNA-alvo e extensão da cadeia de DNA pelo
acréscimo de nucleotídeos em razão da ação da enzima DNA polimerase
com a presença de íons magnésio (DINON, 2011).
Segundo o mesmo autor, isso permite a duplicação do fragmento de
interesse a cada ciclo e o aumento exponencial do número de fragmentos
amplificados de acordo com o número total de ciclos da reação. Traços de
DNA são suficientes para detecção de OGM em alimentos, uma vez que o
mais importante na detecção é a qualidade, a quantidade e a pureza do
DNA extraído. A técnica da PCR possibilita obter grandes quantidades de
genes em poucas horas, a partir de uma pequena quantidade de DNA, que
passa por um sistema de amplificação in vitro (DE ROBERTIS; HIB, 2006).
37
A PCR é um método sensível, seguro e específico, que permite de-
tectar uma ampla série de eventos e identificar as variedades GMs que con-
têm diferentes construções gênicas, porém apresentam a mesma proteína.
Essa sensibilidade continua alta em amostras degradadas fisicamente, qui-
micamente ou enzimaticamente por etapas do processamento. Apresenta
limite de detecção entre 20 pg e 10 ng de DNA-alvo, o que corresponde
a 0,0001 a 1% de OGM (CONCEIÇÃO; MOREIRA; BINSFELD, 2006; BARROS;
OLIVEIRA; MARIN, 2008).
Entre as principais técnicas de detecção qualitativa e de rastreamento
estão a PCR screening, a PCR nested e a PCR multiplex. Porém o método mais
utilizado atualmente para quantificação de OGMs em produtos alimentícios
é a PCR em tempo real.
O método de PCR screening não é utilizado para identificar, mas para
quantificar o OGM, uma vez que a presença de um dos alvos de rastreio
não implica necessariamente a presença de DNA derivado de OGM. A
PCR nested conceitua-se em uma amplificação interna de um fragmento
anteriormente amplificado (LIMA et al., 2007; SMITH; MAXWELL, 2007).
Basicamente, os componentes utilizados para a reação de
PCR em tempo real são água esterilizada; tampão, também chamado
buffer, que colabora em manter o pH constante para a atividade da taq
polimerase; dNTP, que são nucleotídeos livres que são incorporados
pela taq polimerase durante o processo de replicação da sequência; taq
polimerase, que possui capacidade de resistir a altas temperaturas sem
perder sua função; MgCl2, que é um cofator da taq polimerase; os primers,
que são pequenas sequências de DNA e o DNA, que contém a sequência-
alvo de interesse (ANTONINI; MENEGHIN; URASHIMA, 2004).
É necessário que todos os componentes da reação estejam na
quantidade certa para que esta ocorra da maneira correta. O uso adequado
da combinação de primers, com adequado controle durante a reação, é
imprescindível para o seu funcionamento ideal (CUNHA et al., 2005).
As principais dificuldades para executar essa técnica são o
elevado custo de materiais e equipamentos, o treinamento de pessoal
e a construção dos iniciadores (CONCEIÇÃO; MOREIRA; BINSFELD, 2006).
Conforme a pesquisa, o custo das análises varia de 200 reais até mais de
38
1000 reais por amostra, sendo que um laboratório realiza apenas análises
de amostras do MAPA. É provavelmente o método mais preciso e eficaz
para determinar as exigências da legislação (alimento não deve conter
mais de 1% de OGMs). Esse método permite monitorar a PCR durante
a sua condução, em tempo real (ciclo a ciclo), em sistema fechado, sem
intervenções externas no decorrer da reação (DEISINGH; BADRIE, 2005;
DINON, 2011).
A atualidade é marcada por tecnologias como as biotecnologias,
que, mormente serem conquistas científicas para a humanidade, não estão
isentas de riscos.
A informação é um direito do consumidor, possibilitando-lhe decidir
entre consumir ou não os alimentos transgênicos. Para isso é importante
que a sociedade tenha acesso à composição dos alimentos que consome.
Para uma rotulagem eficiente, vários métodos analíticos podem
ser aplicados. Porém, a PCR é o método mais usado pelos laboratórios
analisados para a detecção e quantificação de alimentos contendo OGMs.
Observou-se que os laboratórios credenciados pelo Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento que realizam análises e emissão de
autorizações e registros de produtos e atividades que contenham OGMs e
seus derivados se concentram basicamente no Sudeste, apesar de haver
produção desse tipo de cultivo em todo o país.
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41
42
BIOPROSPECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS
APLICADA À BIORREMEDIAÇÃO
Germana Davila dos Santos
Vania Aparecida Vicente
43
44
INTRODUÇÃO
O processo de industrialização, o descarte inadequado de resíduos,
bem como o uso de compostos xenobióticos sintéticos e compostos
orgânicos têm resultado, nos últimos anos, no aumento da contaminação
do ambiente em todo o mundo (RAYU; KARPOUZAS; SINGH, 2012).
Dentre os tratamentos para remoção de contaminantes do ambiente, os
processos biológicos têm se destacado por terem como base métodos
naturais e relativamente simples, menos agressivos e mais adequados
para a manutenção do equilíbrio ecológico (BORÉM; SANTOS, 2004;
BENTO et al., 2005). Em meio aos processos biológicos, destaca-se a
biorremediação, método que se baseia na utilização de micro-organismos,
os quais propiciam um aumento na biodegradação de compostos em
áreas contaminadas (NAKAGAWA; ANDRÉA, 2006). Diante desse contexto,
estudos de bioprospecção vêm sendo realizados visando encontrar
espécies microbianas capazes de degradar os mais diversos tipos de
resíduos e poluentes (CLEMENTE, 2002).
A vida se originou em ambientes com condições adversas, e os micro-
organismos se utilizaram de estratégias adaptativas para sobreviver a essas
condições, o que lhes confere potencial para exploração biotecnológica.
Tais fatos norteiam as pesquisas que buscam recuperar áreas danificadas,
sendo os micro-organismos os agentes preferenciais para desempenhar a
função de restauradores da qualidade ambiental (SPROCATI et al., 2012).
O advento das tecnologias moleculares levou microbiologistas ambientais
a reconhecer as comunidades microbianas como parâmetro ecológico
no monitoramento de locais poluídos (DESAI et al., 2009). Análises
independentes de cultivo em locais contaminados, utilizando técnicas
moleculares, têm sido fundamentais para a compreensão da dinâmica dos
micro-organismos envolvidos na biorremediação (MARTIN et al., 2006).
Nesse contexto, o presente capítulo apresenta uma breve revisão
sobre a bioprospecção de micro-organismos voltados para fins de
biorremediação, assim como as principais técnicas que vêm sendo utilizadas
na busca por agentes biorremediadores.
45
BIOPROSPECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS
A bioprospecção pode ser definida pela busca na natureza de
recursos genéticos e bioquímicos para a obtenção de novos produtos ou
processos com interesses econômicos e ambientais (CARDOSO, 2013). Os
estudos sobre prospecção biológica têm aumentado devido aos avanços
biotecnológicos, o que tem feito crescer o interesse das indústrias por
substâncias bioquímicas e levado ao aumento de empreendimentos em
matéria de bioprospecção (LOOSE, 2011).
Nas últimas décadas tem-se buscado aumentar o conhecimento sobre
a biodiversidade, sendo que a bioprospecção tem auxiliado na descoberta
de novos micro-organismos e moléculas de interesse biotecnológico
(OLIVEIRA; SETTE; FANTINATTI-GARBOGGINI, 2006). Segundo Jabour-Green
e Nicol (2003), o processo de bioprospecção (Figura 1) desenvolve-se nas
seguintes etapas:
a) coleta de amostras do ambiente de interesse;
b) isolamento, caracterização e cultivo de micro-organismos das amos-
tras coletadas;
c) triagem dos micro-organismos em busca de propriedades ou com-
ponentes de interesse (enzimas e biomoléculas);
d) o desenvolvimento de produto sintético baseado no composto natural
encontrado.
A bioprospecção de micro-organismos pode ser realizada a partir
de amostras do meio ambiente, através de métodos tradicionais de cultivo,
mas poucos micro-organismos adaptam-se às condições de cultivo em
laboratório (AKONDI; LAKSHMI, 2013; HANDELSMAN, 2004). Devido a essas
limitações, atualmente tem-se utilizado abordagens independentemente
de cultivo, como a metagenômica, a qual baseia-se no isolamento de ácido
desoxirribonucleico (DNA) e de geração de bibliotecas metagenômicas
com a finalidade de explorar e conhecer a diversidade de micro-organismos
cultiváveis e não cultiváveis. Essas bibliotecas podem ser utilizadas para o
rastreamento de moléculas bioativas e características funcionais (OLIVEIRA;
SETTE; FANTINATTI-GARBOGGINI, 2006).
46
Figura 1 – Esquema geral da bioprospecção de micro-organismos de interesse biotecnológico
Fonte: Adaptado de Akondi e Lakshmi (2013).
Ambientes que não foram explorados pelo homem apresentam

diversidade microbiana maior que a de áreas impactadas (CAO; JIANG;
HUA, 2009). Além disso, os micro-organismos possuem grande variedade
metabólica, o que lhes permite habitar os mais diversos ambientes, mesmo
os mais extremos (AKONDI; LAKSHMI, 2013).
Condições como temperaturas extremas, pressão, pH, pouca
disponibilidade de nutrientes e ambientes competitivos são favoráveis
47
para a produção de moléculas de interesse (ZHU et al., 2009; STIERLE;
STIERLE; KELLY, 2006; BULL; STACH, 2007; WAGNER; MALIN; ILLMER, 2009).
Segundo Davis (2011), ambientes com condições especiais, como florestas
tropicais, bancos de corais e regiões polares (como a Antártida) também
são favoráveis à bioprospecção. Os micro-organismos estão entre os
organismos escolhidos para esse tipo de estudo, devido à sua capacidade
de produzir grande variedade de moléculas bioativas com potencial
biotecnológico (SINGH et al., 2011).
Historicamente, micro-organismos vêm sendo considerados fontes
para a maioria dos antibióticos utilizados (DEMAIN; SANCHEZ, 2009).
Estratégias convencionais de isolamento e seleção de micro-organismos
têm garantido o desenvolvimento de novos fármacos e aplicações nas
áreas de saúde, agricultura, indústria e meio ambiente (OLIVEIRA; SETTE;
FANTINATTI-GARBOGGINI, 2006).
A diversidade total de micro-organismos do planeta permanece
desconhecida, sendo que a existência de micro-organismos não
cultiváveis tem incentivado o desenvolvimento de novas metodologias
para conhecimento e exploração dessa diversidade. Acredita-se que 1g
de solo possua aproximadamente 1.000 diferentes gêneros bacterianos,
mas somente cerca de 1% dessa população seria cultivável em condições
laboratoriais (MALIK et al., 2008). Com os avanços tecnológicos, foi possível
superar essas limitações, e técnicas vinculadas à análise molecular da
microbiota ambiental vêm sendo incorporadas a grande parte dos trabalhos
de diversidade de comunidade, assim como estudos de recuperação de
ambientes impactados (OLIVEIRA; MANFIO, 2006; COUTINHO et al., 2001;
HANDELSMAN, 2004; STEELE; STREIT, 2005).
A descoberta e prospecção de novos genes para a pesquisa, aplicada
através de metagenômica, têm recebido maior evidência (WOOLEY;
GODZIK; FRIEDBERG, 2010). Além disso, trabalhos sobre biodiversidade
genética têm proporcionado esclarecimentos sobre a composição das
comunidades, suas interações e funções ecológicas, trabalhos esses
fundamentais para a compreensão do funcionamento dos mais variados
ecossistemas (CARDOSO et al., 2011). As tecnologias de bioinformática
tornaram possível a identificação rápida de genes que codificam compostos
48
bioativos e o desenvolvimento de modelos da estrutura química desses
compostos, baseados em informações de sequência genética, por meio de
programas computacionais (FARNET; ZAZOPOULOS, 2005).
BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR: METAGENÔMICA

O desenvolvimento das técnicas de biologia molecular tem
possibilitado estudar dezenas de milhares de genes ao mesmo tempo
(GOULART; OMORI; SOUZA, 2013). A aplicação de técnicas de genômica
e metagenômica tem contribuído para a caracterização da diversidade
microbiana, assim como tem permitido explorar e conhecer acerca
dos micro-organismos não cultiváveis em condições de laboratório
(AKONDI; LAKSHMI, 2013). Os dados das sequências obtidas diretamente
do ambiente constituem o que se denomina metagenômica, ou seja, o
conjunto de genomas de um dado ambiente (HANDELSMAN et al., 1998).
A metagenômica compreende muitas abordagens e métodos relacionados
à genômica, como o sequenciamento, e caracteriza-se por ser uma técnica
que não depende de cultivo (RODRIGUES, 2011).
A metagenômica surgiu como um novo campo de pesquisa.
Desenvolvida para elucidar as informações contidas nos genomas dos
micro-organismos não cultiváveis, seu objetivo é compreender melhor a
ecologia microbiana. Essa técnica tem sido impulsionada pela crescente
demanda biotecnológica de novas enzimas e biomoléculas (SCHMEISSER;
STEELE; STREIT, 2007).
A metagenômica consiste em estudar todo o material genético
contido em um dado ambiente (Figura 2). Para tanto, após a coleta, o DNA
total é extraído, e sua informação biológica é revelada por sequenciamento
e analisada por técnicas computacionais (WOOLEY; GODZIK; FRIEDBERG,
2010). Desse modo, é possível obter informações genéticas diretamente das
comunidades microbianas em seus habitats, sem a necessidade de isolar e
cultivar os micro-organismos (HANDELSMAN, 2004). Essa técnica oferece a
possibilidade de localizar e caracterizar uma ampla variedade de enzimas
a partir de amostras ambientais. A detecção dessas moléculas requer uma
triagem funcional que necessita da expressão heteróloga dos genes, seguida
do sequenciamento dos fragmentos isolados (AKONDI; LAKSHMI, 2013).
49
Figura 2 – Modelo esquemático da abordagem metagenômica
Fonte: Adaptado de Handelsman (2004) e Schmeisser, Steele e Streit (2007).
A partir das análises de metagenômica, tem sido possível correlacionar

os micro-organismos de comunidades microbianas às sequências de genes
obtidos por diferentes técnicas de sequenciamento (WARD et al., 2009).
50
Cumpre ressaltar que a metagenômica é uma abordagem multidisciplinar
e envolve a coleta de informações do ambiente em estudo, tais como
química e física do solo e vegetação da área, e não se sustenta apenas em
dados de sequenciamento genômico (PESSOA FILHO, 2010).
A descoberta e prospecção de novos genes para a pesquisa, aplicada
através de metagenômica, têm recebido maior evidência (WOOLEY;
GODZIK; FRIEDBERG, 2010). Além disso, trabalhos sobre biodiversidade
genética têm proporcionado esclarecimentos sobre a composição das
comunidades, suas interações e funções ecológicas, trabalhos esses
fundamentais para a compreensão do funcionamento dos mais variados
ecossistemas (CARDOSO et al., 2011). As tecnologias de bioinformática
tornaram possível a identificação rápida de genes que codificam compostos
bioativos e o desenvolvimento de modelos da estrutura química desses
compostos, baseados em informações de sequência genética, por meio de
programas computacionais (FARNET; ZAZOPOULOS, 2005).
BIORREMEDIAÇÃO
A biorremediação é um processo que explora as propriedades
metabólicas dos organismos de degradar agentes contaminantes,
habilidade essa que pode ser natural ou adquirida mediante a inserção de
genes codificantes para funções específicas (ILYINA et al., 2003). A técnica
surgiu como ferramenta de remediação de locais impactados com poluentes
orgânicos e se baseia na utilização de populações microbianas que possuem
a habilidade de modificar ou decompor rapidamente poluentes orgânicos
perigosos para níveis ambientalmente seguros em solos, sedimentos,
materiais e águas subterrâneas (NEWMAN; REYNOLDS, 2005; SINGH; SINGH;
SHARMA, 2014).
Do ponto de vista prático, a biorremediação é fundamentada em
três aspectos principais:
a) existência de micro-organismos com capacidade catabólica para
degradar o composto contaminante;
b) no composto contaminante, deve estar disponível ou acessível ao
ataque microbiano ou enzimático;
51
c) nas condições ambientais adequadas para o crescimento e ativi-
dade do agente biorremediador (SILVA et al., 2012).
Duas classes principais de remediação (COLLA, 2012) podem ser
distinguidas:
a) remediação in situ: que envolve tratamentos como a lavagem, a
ventilação, a extração de vapores e a biodegradação, realizados
sem o deslocamento do material contaminado do local de origem;
b) remediação ex situ: que promove a descontaminação de um com-
partimento após a escavação e remoção do material impactado
para um ambiente de condições controladas.
O processo de biorremediação consiste basicamente em duas etapas:
biotransformação e biodegradação, transformando contaminantes para pro-
dutos químicos não perigosos ao meio ambiente. Muitas vezes, os micro-or-
ganismos metabolizam os produtos químicos para produzir dióxido de car-
bono ou metano, água e biomassa (Figura 3). A biotransformação é qualquer
alteração da molécula ou estrutura de um composto causada por micro-or-
ganismos. Biodegradação pode ser definida como a quebra de compostos
orgânicos em compostos mais simples (SINGH; SINGH; SHARMA, 2014).
Figura 3 – Esquema simplificado da ação dos micro-organismos em processos de remediação

Fonte: Adaptado de Andrade, Augusto e Jardim (2010).
Nota: 1: Micro-organismo; 2: Contaminante; A: Micro-organismo metaboliza o contaminante; B: Micro-
organismo digere o contaminante e o converte em gases inócuos (CO2, H2O); C: Micro-organismo
libera CO2 e H2O no local do tratamento.
Além disso, a biodisponibilidade do poluente é outro fator que deve

ser considerado, durante os processos de biorremediação, a qual deve ser
monitorada pela sua hidrofobicidade e dessorção da fase sólida do solo para
a solução aquosa (SEMPLE; MORRIS; PATON, 2003). A estrutura molecular,
52
a concentração e as características físico-químicas também são fatores
limitantes (VOLKERING; BREURE; RULKENS, 1998; ALEXANDER, 2000). Neste
contexto, várias pesquisas demonstraram que a adição de um surfactante a
um solo contaminado aumenta a dessorção de um poluente (ARONSTEIN;
CALVILLO; ALEXANDER, 1991; BUSTAMANTE; DURÁN; DIEZ, 2012), uma vez
que diminui a tensão superficial deste ao solo (MULLIGAN; YONG; GIBBS,
2001; GAO et al., 2007; FRANZETTI et al., 2008). Os surfactantes são moléculas
orgânicas com uma parte hidrofóbica e uma parte hidrofílica. A parte
hidrofílica torna o surfactante solúvel em água, enquanto a parte hidrofóbica
faz com que se ligue às interfaces (VOLKERING; BREURE; RULKENS, 1998).
Os surfactantes podem ser naturais, podendo ser produzidos por micro-
organismos (também chamados biossurfactantes) ou sintéticos, originados a
partir de compostos químicos (BUSTAMANTE; DURÁN; DIEZ, 2012).
Existem várias técnicas que auxiliam no processo de biorremediação
e, para decidir o método a ser empregado, é necessário realizar uma análise
da área a ser tratada (ANDRADE; AUGUSTO; JARDIM, 2010). Entre as técnicas
mais utilizadas encontra-se a biorremediação passiva, que é um processo
de atenuação natural de um contaminante, sem que seja necessário o
acréscimo de nutrientes ou adequação de qualquer condição natural
(CARNEIRO; GARIGLIO, 2010); a bioestimulação, que é um processo em que
ocorre acréscimo de nutrientes orgânicos e inorgânicos que visam estimular
a atividade microbiana (JACQUES et al., 2006) e a bioventilação, que se
caracteriza pela adição de oxigênio no solo contaminado para estimular o
crescimento dos organismos naturais ou introduzidos (CARNEIRO; GARIGLIO,
2010). Além dessas, a bioaumentação é outra técnica bastante utilizada, a qual
consiste na introdução de micro-organismos que aceleram o processo de
degradação da matéria orgânica; além disso, condições mínimas devem ser
fornecidas aos micro-organismos introduzidos no local, como manutenção
do pH, da temperatura e fornecimento de nutrientes (LAZZARETTI, 1998).
Os micro-organismos são os agentes preferenciais para desempenhar
a função de remediação em ambientes afetados devido a características
fundamentais como sua natureza ubíqua, sua ampla diversidade genética
e catalítica e sua capacidade de atuação sob condições ambientais
extremas (MEGHARAJ et al., 2011). Além disso, podem apresentar
estratégias de adaptação à presença dos contaminantes, como alteração
53
da permeabilidade celular (CARVALHO; WICK; HEIPIEPER, 2009), produção
de biossurfactantes (CHRZANOWSKI; LAWNICZAK; CZACZYK, 2012) e
ativação de bombas de efluxo, para reduzir a concentração intracelular de
compostos tóxicos (VAN HAMME; SINGH; WARD, 2003).
Os micro-organismos podem ser indígenas (fazem parte da
microbiota normal de determinado ambiente) para uma área contaminada
ou podem ser isolados a partir de outro lugar e levados ao local contaminado.
Os compostos contaminantes podem ser originados de fontes poluidoras,
como dejetos oriundos da indústria e de outras atividades urbanas, ou ser
produzidos por organismos vivos mediante reações decorrentes de seus
processos metabólicos (FULEKAR, 2009). A parede celular de organismos
procariontes e eucariontes possui diferentes polissacarídeos e estruturas
aniônicas contendo grupos ionizáveis tais como carboxilas, hidroxilas
e fosfatos; e, dessa forma, apresentam grande potencial para captação
de metais pesados. De maneira especial, as bactérias apresentam uma
versatilidade de processos metabólicos, sendo capazes de sobreviver nas
mais variadas condições e demonstrando capacidade de utilizar outros
compostos além do oxigênio para o processo de respiração (WARREN;
HAAK, 2001), possibilitando o metabolismo de moléculas orgânicas e
até mesmo de metais. Assim, devido ao seu alto potencial metabólico e
grande capacidade de adaptação, esses micro-organismos podem ser
considerados como agentes primários das mudanças geoquímicas, o que
lhes confere larga e abundante distribuição (WARREN; HAAK, 2001).
Em áreas contaminadas com petróleo, por exemplo, foi detectada
grande população de vários gêneros microbianos que, individualmente,
metabolizam um limitado número de hidrocarbonetos. Sendo assim, para
processos de biodegradação de hidrocarbonetos complexos, é necessária
a cooperação sinérgica entre diferentes espécies de micro-organismos,
denominados consórcios microbianos, a fim de que ocorra a completa
mineralização dos compostos do petróleo em gás carbônico e água ou
gás metano e água (URURAHY; PEREIRA JR; MARINS, 1998). Os consórcios
de micro-organismos apresentam atividades enzimáticas relacionadas à
degradação de substâncias xenobióticas. Estes micro-organismos incluem:
Acinethobacter, Actinobacter, Acaligenes, Arthrobacter, Bacillins, Berijerinckia,
Flavobacterium, Methylosinus, Mycrobacterium, Mycococcus, Nitrosomonas,
54
Nocardia, Penicillium, Phanerochaete, Pseudomonas, Rhizoctomia, Serratio,
Trametes e Xanthofacter (SINGH; SINGH; SHARMA, 2014).
Vários micro-organismos são capazes de imobilizar metais pesados,
por simples adsorção em sua superfície celular, levando à sua precipitação,
ou por processos de formação de complexos intracelulares (LEE; LEE, 2013).
Considerável variedade de fungos, algas e bactérias tem sido estudada e
utilizada como biosorvente para biorremediação de efluentes contendo
metais pesados (GADD, 1992; MACASKIE; DEAN, 1990).
Dentre os micro-organismos, os fungos têm demonstrado grande
potencial em degradar os mais diversos tipos de resíduos, podendo-se
ressaltar as leveduras negras, que crescem em diversos nichos, bem como
na presença de hidrocarbonetos (PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE
HOOG, 2006). As leveduras negras são definidas como fungos caracterizados
pela presença de melanina na parede celular das células vegetativas e
reprodutivas (Figura 4) (DE HOOG et al., 2000, DIXON; POLAK-WISS, 1991).
Figura 4 – Macro e micromorfologia das leveduras negras

Nota: A a C: aspecto visual da colônia de diferentes isolados de leveduras negras; D a F: aspecto microscópico
das células vegetativas e reprodutivas de diferentes isolados de leveduras negras. Barras=10µm.
55
Esses micro-organismos são ascomicetos e pertencem quase
que exclusivamente às ordens Dothideales e Chaetothyriales (DE HOOG,
MCGINNIS, 1987). As leveduras negras pertencentes à ordem Dothideales
exibem habilidade adaptativa para sobrevivência em condições ambientais
hostis (STERFLINGER; DE HOOG; HAASE, 1999). Já a ordem Chaetothyriales
abriga os patógenos e oportunistas de humanos e animais, causadores, por
exemplo, da cromoblastomicose, micetoma e feohifomicose (MCGINNIS,
1992). Além disso, tem-se relatado a sua presença em ambientes tóxicos
e extremos, e isso se deve à sua capacidade de adaptação (PRENAFETA-
BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG, 2006; DÖGEN et al., 2013).
As leveduras negras podem habitar diversos ambientes, mas todos
apresentam algumas condições especiais, como pouca disponibilidade de
nutrientes, presença de compostos aromáticos, temperaturas elevadas, radiação
ultravioleta (UV), estresse osmótico ou combinações desses fatores (STERFLINGER,
2006; DÖGEN et al., 2013), sendo comumente isoladas de substratos vegetais,
madeira, solo e matéria orgânica em decomposição (VICENTE et al., 2008), bem
como solo contaminado com hidrocarbonetos (SATOW et al., 2008).
A capacidade desses micro-organismos de assimilar alquilbenzenos
(poluentes ambientais tóxicos) aumenta o seu crescimento em condições
adversas (PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG, 2006; DÖGEN et al.,
2013). Recentemente, várias espécies de leveduras negras foram isoladas
de ambientes não muito comuns, como instalações de banho a vapor e
banheiros (SUDHADHAM et al., 2008), máquinas de lavar louça (ZALAR et
al., 2011), máquinas de lavar roupas, tanques de gasolina (ISOLA et al., 2013)
e ferrovias tratadas com cresoto (DÖGEN et al., 2013). Estudos recentes têm
apontado que as leveduras negras têm grande potencial de produção de
enzimas oxidativas e hidrolíticas, sendo interessante a sua aplicação na
biodegradação de diversos compostos e resíduos (PRENAFETA-BOLDÚ;
SUMMERBELL; DE HOOG, 2006; FENG et al., 2012).
Algumas das limitações dos processos de biorremediação,
principalmente as relacionadas à taxa da degradação do poluente, podem
ser contornadas mediante a utilização de organismos geneticamente
modificados (OGMs) (CHEN; ZHU; ROSEN, 2012). A manipulação genética
de um micro-organismo pode permitir o aumento da taxa de degradação
através de diferentes estratégias, como inserção de genes que codificam
56
enzimas catabólicas específicas para a molécula-alvo; inserção de genes que
conferem resistência a compostos inibitórios no ambiente ou aos produtos
de degradação da molécula-alvo e inserção de genes ou alterações genéticas
que auxiliam na solução de problemas ligados à baixa concentração do
poluente, como, por exemplo, aumento da captação do composto pela
célula ou da expressão da enzima (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005).
Sendo assim, pode-se observar que a biorremediação é um
processo eficiente para a remediação dos locais impactados. Entretanto,
para otimização do processo é preciso fazer uma avaliação minuciosa da
área, levando em consideração as condições ambientais, condições do solo,
estudo dos micro-organismos e da forma a serem utilizados (Figura 5).
Figura 5 – Resumo geral da biorremediação

Fonte: Adaptado de Gaylarde, Bellinaso e Manfio (2005).
57
Neste capítulo foi demonstrada a importância de estudos de
bioprospecção de micro-organismos direcionados a biorremediação de
poluentes. Os micro-organismos são os maiores responsáveis por atividades
metabólicas e fluxo de energia em ambientes, assim como produzem grande
variedade de metabólitos de interesse biotecnológico. Tais características
os tornam candidatos com potencial para fins de biorremediação.
Foram apresentadas tanto técnicas clássicas de bioprospecção de
micro-organismos como isolamento e seleção dos micro-organismos poten-
ciais, quanto técnicas moleculares, como a metagenômica independente de
isolamento que visa à bioprospecção molecular de micro-organismos, genes
e enzimas de interesse. A metagenômica proporciona o conhecimento dos
micro-organismos não cultiváveis, bem como a descoberta de genes e enzi-
mas de interesse, os quais podem ser utilizados para fins de biorremediação.
Novos estudos de análises funcionais utilizando técnicas como trans-
criptômica, proteômica e metabolômica estão elucidando rotas metabóli-
cas e perfis de biodegradação dos mais diversos micro-organismos, o que
vêm possibilitando avanços significativos em trabalhos de biorremediação.
Em suma, o conhecimento da biodiversidade, a bioprospecção de
micro-organismos, a elucidação das diversas rotas metabólicas e a utili-
zação de tecnologias baseadas em biologia molecular podem auxiliar na
seleção de micro-organismos com potencial e específicos para fins de pro-
cessos de biorremediação.
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR VIA PCR
E A INOVAÇÃO TECNÓLOGICA NA
AGROINDÚSTRIA
67
68
INTRODUÇÃO
A reconhecida importância da tecnologia para o desenvolvimento
econômico tem levado as empresas à permanente busca de recursos
tecnológicos necessários para vencer os desafios impostos pela
competição internacional (CRIBB, 2009); consequentemente: inovar torna-
se imprescindível.
Segundo o Manual de Oslo, inovação é a implementação de um
produto, bem ou serviço, ou um processo novo ou significativamente
melhorado ou, ainda, um novo método de marketing ou novo método
organizacional (ORGANIZAÇÃO PARA COOPERAÇÃO E DESENVOLVIMENTO
ECONÔMICO, 2005). De acordo com o mesmo manual, as inovações
podem ser divididas em tipos (ORGANIZAÇÃO PARA COOPERAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO, 2005). Quanto aos tipos de inovações,
as frequentemente observadas no setor agroalimentar são as inovações de
produto e processo (ABREU, 2007). Estas e outras inovações são adotadas
com o objetivo de obter vantagem competitiva (LÓPEZ-MIELGO; MONTES-
PEÓN; VAZQUEZ-ORDÁS, 2009).
Na indústria de alimentos, a inovação tem assumido importância
cada vez maior, pois novas tecnologias, além de favorecerem a produção
de itens que o mercado deseja, objetivam garantir a segurança do alimento
durante a cadeia produtiva (ABREU, 2007).
No controle de qualidade de alimentos, a inserção de novos
métodos e/ou tecnologias que otimizam diagnósticos vem sendo discutida
(RODRIGUES, 2013). No controle microbiológico das indústrias alimentícias,
por exemplo, há muitas exigências, e os métodos convencionais de
diagnóstico são, geralmente, morosos, caros, apresentam elevado risco de
interpretação errônea, entre outras características (GANDRA et al., 2008).
O diagnóstico molecular via polymerase chain reaction (PCR)
representa uma inovação tecnológica importante neste contexto
(RODRIGUES, 2013). A PCR foi idealizada por Kary Mullis e Randall
Saiki na década de 1980, e a partir de então houve uma revolução na
genética molecular devido à nova abordagem dada à pesquisa dos genes
(CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2001). Pode-se afirmar, portanto, que os
69
grandes avanços na biologia molecular nos últimos tempos e a geração
de técnicas inovadoras têm permitido aprimoramentos, além de uma nova
visão para abordar problemas básicos desta área (PASSAGLIA; ZAHA, 2012).
Portanto, o objetivo deste capítulo é expor o diagnóstico molecular
via PCR como inovação no setor agroindustrial, especificamente na
indústria de alimentos, bem como sua importância, algumas técnicas
fundamentadas em PCR e a aplicabilidade das tecnologias moleculares.
IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Gandra et al. (2008, p. 116) destacam a importância do diagnóstico
molecular na microbiologia de alimentos: “[...] em um futuro próximo, as
técnicas moleculares estarão presentes em todos os laboratórios de análises,
complementando e sendo alternativas viáveis as técnicas tradicionais para
o controle de microrganismos em alimentos e em processos alimentícios”.
Sua relevância se deve, entre outros aspectos, ao custo, à especificidade, à
sensibilidade e à rapidez.
Qualquer região em genomas altamente complexos pode ser
especificamente amplificada em horas, por meio desta técnica (MULLIS;
FERRÉ; GIBBS, 1994; KLANCNIK et al., 2012). A PCR é mais rápida que os
métodos de cultura empregados nas análises microbiológicas; quando se
trata de real-time PCR os resultados podem ser obtidos em poucas horas
(LAZCKA; CAMPOS; MUÑOZ, 2007).
O tempo de análise depende da técnica empregada e se haverá
etapas de enriquecimento quando se deseja detectar micro-organismos.
Adicionalmente, o tempo gasto numa análise considerando extração de ácido
desoxirribonucleico (DNA) de matriz alimentícia (método de lise térmica) e
amplificação pode ser de aproximadamente 6 horas (RODRIGUES, 2013).
Quanto ao custo, Teodoro et al. (2006) concluíram que a PCR foi mais
econômica, após a análise dos custos do material de consumo da análise
convencional e da PCR para a detecção de um micro-organismo na mesma
matriz alimentar. Por outro lado, o custo da implantação constitui entrave à
adoção da tecnologia, embora o custo de manutenção não seja caro, o que
deve ser considerado (RODRIGUES, 2013).
70
Já a especificidade se deve aos oligonucleotídeos iniciadores (pri-
mers), o desenho dos primers é uma etapa fundamental para garantir a
eficiência e especificidade da reação de amplificação, ou seja, a chave para
o sucesso de qualquer tipo de PCR encontra-se no desenho do primer, es-
tes cuidadosamente desenhados são necessários para evitar a amplificação
de sequências indesejáveis; na reação há a necessidade de uma perfeita
ligação entre primer-template, cada membro do par anela-se de maneira es-
tável à sua sequência-alvo (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994; BORÉM; CAIXETA,
2009). Em regra, quanto maior um oligonucleotídeo, mais alta é sua espe-
cificidade para determinado fragmento-alvo (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994;
BORÉM; CAIXETA, 2009).
Quanto à sensibilidade, pesquisas apontam a maior sensibilidade da
PCR em comparação com métodos de cultura ao detectar um patógeno
(VON RÜCKERT, 2006; TEODORO et al., 2006; MALDONADO, 2008).
Como toda técnica, a PCR também apresenta desvantagens,
aos poucos solucionadas por meio de aperfeiçoamentos. Por exemplo,
nenhum protocolo individual será ótimo para todas as reações desejadas,
um conjunto de variáveis deve ser observado para o funcionamento de um
protocolo. A fim de otimizar uma PCR, o pesquisador deve ter em mente
o processo subjacente e ser capaz de compreender os diversos aspectos
de um protocolo em relação às reações químicas (KIDD; RUANO, 1995).
Outra desvantagem é a detecção de células mortas, problema evitado
ao empregar reverse transcriptase – PCR (RT-PCR), que será brevemente
explanada entre outras técnicas na seção a seguir.
TÉCNICAS FUNDAMENTADAS EM PCR

As técnicas baseadas na PCR representam a segunda geração de
técnicas moleculares, largamente empregadas (SETTANNI; CORSETTI, 2007;
GANDRA et al., 2008). A seguir são expostas algumas destas técnicas.
MULTIPLEX PCR
Muitas abordagens experimentais requerem a análise de várias

sequências de DNA, exigindo que múltiplas PCRs sejam desenvolvidas
71
sobre o mesmo DNA molde. Considerando a redução de tempo, é possível
amplificar simultaneamente múltiplas sequências em uma única reação,
este processo refere-se à Multiplex PCR (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994).
Nesta, vários iniciadores são combinados em um único ensaio de PCR,
apresentando redução de custos, de recursos humanos e materiais (MULLIS;
FERRÉ; GIBBS, 1994; SETTANNI; CORSETTI, 2007; WANG; GUO; ZHANG, 2010).
Considerações teóricas sugerem que a Multiplex PCR deve exibir
o mesmo grau de especificidade e eficiência da reação com uma única
sequência-alvo; a especificidade da amplificação resulta da proximidade e
relativa orientação de sequências dentro do molde que hibridiza com o par
de oligonucleotídeos iniciadores (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994).
Segundo esses mesmos autores, estabelecer as condições que
permitem a amplificação de múltiplas sequências-alvo usando uma mistura
de iniciadores pode requerer esforço proporcionalmente maior, pois o
aumento do número de pares de oligonucleotídeos iniciadores aumenta
a chance de obter produtos de amplificação indesejáveis. No entanto, não
há um limite para o número de sequências que podem ser amplificadas
simultaneamente; o estabelecimento das condições da reação geralmente
limita o número de sequências-alvo. O desenvolvimento de uma eficiente
Multiplex PCR requer planejamento e muitas tentativas para otimizar as
condições da reação.
Na identificação de bactérias, estirpes de referência são utilizadas para
desenvolver um padrão. Na forma ideal, inclui as sequências de DNA que
devem ser específicas para cada espécie ou para cada característica em estudo,
a fim de obter uma banda única para cada alvo (SETTANNI; CORSETTI, 2007).
REAL TIME PCR
Um importante avanço da PCR foi o desenvolvimento de uma

metodologia que permite observar a amplificação em todo o processo e não
somente no seu fim, como na PCR convencional (PASSAGLIA; ZAHA, 2012).
A PCR em tempo real ou real time PCR é uma inovação que vem ganhando
destaque nos últimos anos em diagnósticos clínicos e de pesquisa devido
a sua capacidade de gerar resultados quantitativos (NOVAIS; PIRES-ALVES,
2004; REBRIKOV; TROFIMOV, 2006).
72
A PCR em tempo real quantitativa (qPCR) é um método de detecção
e quantificação de produtos gerados durante cada ciclo de amplificação;
num sistema fechado sem interferências externas, estes produtos são
proporcionais à quantidade de molde disponível inicialmente, portanto,
é indispensável uma metodologia de detecção da acumulação destes
produtos de PCR e um equipamento de termociclagem que seja capaz de
registrar acumulação dos produtos de PCR durante a amplificação (KUBISTA
et al., 2006; REBRIKOV; TROFIMOV, 2006; BARROS; OLIVEIRA; MARIN, 2008;
PASSAGLIA; ZAHA, 2012).
Realiza-se a quantificação de ácidos nucleicos durante a fase
exponencial da reação. Há a coleta de dados durante o processo de
PCR, combinando amplificação e detecção numa única etapa. Aplica-se
composto fluorescente (sondas ou iniciadores marcados com fluoróforos
específicos), com isso correlaciona-se concentração do produto de PCR e
intensidade de fluorescência (WONG; MEDRANO, 2005; KUBISTA et al., 2006).
A emissão de compostos fluorescentes aumenta numa proporção direta
com a quantidade de produtos da amplificação, a fluorescência é emitida
por compostos que podem estar ligados a sondas ou intercalados no DNA
amplificado (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004; BARROS; OLIVEIRA; MARIN, 2008).
Nos ciclos iniciais, o aumento dos produtos é pouco significativo, mas
quando o aumento da emissão de sinais é significativo estatisticamente,
alcança-se o nível threshold, sendo o ciclo da PCR correspondente
denominado ciclo threshold (Ct) (BARROS; OLIVEIRA; MARIN, 2008). A
quantificação pode ser realizada por comparação direta de valores de
fluorescência detectada no Ct (método ΔCt) ou por comparação do número
de cópias empregando curva padrão e, quando o tempo da reação acaba,
gráficos de acumulação de DNA são obtidos (BARROS; OLIVEIRA; MARIN,
2008; REBRIKOV; TROFIMOV, 2006).
Independentemente do método exato de análise, a PCR quantitativa
requer que os gráficos de acumulação de DNA obtidos de diversas amostras
sejam comparados, gráfico de uma amostra teste com o gráfico de uma
amostra padrão. A precisão do estudo irá depender da comparação,
portanto, deverá ser desenvolvida corretamente (REBRIKOV; TROFIMOV,
2006). Os métodos de comparação de curvas fornecidos pelos fabricantes
73
dos equipamentos e softwares diferem na precisão e estabilidade
(REBRIKOV; TROFIMOV, 2006).
A principal desvantagem da técnica é que requer equipamento e
reagentes caros e, além disso, devido à sua sensibilidade extremamente
alta, um delineamento experimental e uma compreensão aprofundada
de técnicas de normalização são indispensáveis para conclusões precisas
(WONG; MEDRANO, 2005).
Vale mencionar que uma variante importante da técnica é a PCR
com transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR). As aplicações incluem
quantificação de níveis de expressão de mRNA (RNA mensageiro), a
análise do número de cópias e expressão de um transgene, entre outras
(POSTOLLEC et al., 2011; PASSAGLIA; ZAHA, 2012).
Nas indústrias, observa-se o emprego do BAX® System automatizado,
no qual ensaios de PCR em tempo real que detectam a sequência do DNA-
alvo são desenvolvidos. Estudos de comparação de métodos realizados em
amostras com inóculos de baixa população mostraram que o BAX® System
possui sensibilidade igual ou superior à dos métodos de cultura, mas com
um tempo mais curto de análise (BURNS et al., 2011).
RT-PCR
Na microbiologia, a principal desvantagem da utilização da PCR

convencional é a não diferenciação de células viáveis e não viáveis, este
fato chamou a atenção proporcionando o desenvolvimento de uma
técnica que apresenta o mRNA como marcador da viabilidade, por ser uma
molécula lábil (SETTANNI; CORSETTI, 2007). A análise de RNA é importante
para estudos de expressão de genes e é fundamental para o entendimento
dos mecanismos que regulam a atividade dos genes, a literatura se refere
de vários modos à aplicação da PCR para estudar a expressão dos genes,
sendo mais conhecida como RT-PCR (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994).
Técnica de rápida execução, pode ser empregada para a quantificação
relativa e absoluta de mRNA. É eficaz na detecção de transcritos em um
baixo número de cópias (por seu curto período de semivida ou baixa taxa
de transcrição) e na detecção de transcritos para um pequeno número de
74
células ou a pequena quantidade de tecidos (MULLIS; FERRÉ; GIBBS, 1994).
É também adequada para distinguir entre as transcrições estreitamente
relacionadas, independentemente da sua abundância (MULLIS; FERRÉ;
GIBBS, 1994).
A amplificação se adapta a moldes de RNA a partir da conversão
destes em DNA complementares usando transcriptase reversa (KARP, 2005;
HARTL; JONES, 2009; SCHAEFER, 2006).
NESTED E SEMI-NESTED PCR
Nested-PCR é utilizada devido à sua maior sensibilidade e

especificidade. O processo envolve duas PCRs consecutivas (JACKSON;
HAYDEN; QUIRKE, 1991).
Inicialmente, uma reação é desenvolvida para amplificar uma região
de interesse. Em seguida, uma alíquota desta reação (fragmentos produzidos
na primeira reação) é submetida a uma segunda amplificação; utilizando
um par de primers complementares, a sequência interna é amplificada pelo
primeiro par, enquanto na Semi-Nested um primer é interno somente a uma
extremidade da sequência-alvo (SCHAEFER, 2006).
APLICAÇÕES
Por apresentarem várias vantagens, atualmente, há a tendência de
usar métodos moleculares em diversas áreas, como: pesquisas médicas e
biológicas, ciência forense, análises de alimentos e bebidas, biotecnologia,
entre outras (SETTANNI; CORSETTI, 2007; VALONES et al., 2009; KLANCNIK
et al., 2012).
Em função da ampla abrangência das aplicações da PCR, neste
capítulo são destacadas aplicações na análise de alimentos.
DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS EM ALIMENTOS
A RT-PCR em tempo real merece destaque, pois pode ser empregada

para a quantificação de micro-organismos, sendo útil na detecção de
75
bactérias toxigênicas (SETTANNI; CORSETTI, 2007; POSTOLLEC et al.,
2011). A PCR em tempo real também pode ser empregada para detecção
de micro-organismos desejáveis, por exemplo, para a quantificação de
bactérias láticas utilizadas na preparação de queijos (Lactobacillus paracasei
e Lactococcus lactis) (ACHILLEOS; BERTHIER, 2013).
A Multiplex PCR é amplamente empregada em diversos campos
da microbiologia para a rápida diferenciação de espécies de micro-
organismos sem comprometer a precisão dos resultados. É utilizada na
identificação microbiana e diferenciação devido a sua capacidade de
fornecer um fingerprinting de certas populações bacterianas, permitindo
a detecção simultânea de diversos patógenos e micro-organismos
não patogênicos importantes para a indústria de alimentos como
deteriorantes, fermentadores e probióticos; além disso, a rapidez do teste
também torna a PCR uma ferramenta útil para a indústria (SETTANNI;
CORSETTI, 2007).
Técnicas de PCR têm sido utilizadas e aprimoradas em estudos
para a detecção de espécies microbianas. Ryu et al. (2013), avaliando a
presença de espécies de Listeria em alimentos processados de carne por
meio da Multiplex PCR, concluíram que a técnica de PCR é um processo
rápido e eficaz para a detecção deste micro-organismo. Buscando também
o aprimoramento de técnicas de PCR, diversos estudos realizam testes com
micro-organismos simultaneamente, incluindo Listeria monocytogenes,
Salmonella spp. e Escherichia coli (OMICCIOLI et al., 2009; GARRIDO et al.,
2013a; GARRIDO et al., 2013b).
As técnicas podem ser utilizadas para ampliar o conhecimento da
dinâmica de micro-organismos. Desse modo, Durand et al. (2013) utilizaram
uma técnica derivada de PCR para caracterizar a microbiota fúngica do café
durante os tratamentos de pós-colheita.
Em resumo, as aplicações na microbiologia se distribuem, em
geral, na determinação da diversidade e/ou modificações em grupos de
micro-organismos, verificando a capacidade das populações de funções
específicas, e na detecção e quantificação de patógenos (SETTANNI;
CORSETTI, 2007).
76
DETECÇÃO DE FRAUDES, ELEMENTOS TRAÇO E ORGANISMOS
GENETICAMENTE MODIFICADOS
Para a detecção de fraudes em alimentos, a PCR apresenta grande

aplicabilidade. Em seu estudo, Kitpipit, Sittichan e Thanakiatkrai (2013) em-
pregaram a técnica para a detecção de contaminantes em carne de porco,
carneiro e galinha em associação à conformidade do rótulo do alimento.
De igual modo, tem se observado a aplicação para detectar
substâncias alergênicas em alimentos processados, principalmente as
substâncias provenientes de oleaginosas, como amendoim, pistache, avelã,
amêndoas e castanhas (INIESTO et al., 2013; COSTA; OLIVEIRA; MAFRA, 2013;
CRUZ et al., 2013; LÓPEZ-CALLEJA et al., 2014).
Para a detecção de traço destas oleaginosas, tem-se utilizado, entre
outras, a técnica de PCR em tempo real, pois esta detecta substâncias
escondidas nos produtos processados. Dessa forma, esta técnica poderia
ser utilizada em programas de inspeção de alimentos, já que muitos
rótulos estão inadequados, e grande número de indivíduos é sensível a
determinados alimentos (INIESTO et al., 2013; COSTA; OLIVEIRA; MAFRA,
2013; LÓPEZ-CALLEJA et al., 2014).
Com o aumento do uso de OGMs nos alimentos, muitos países
estão exigindo que se notifique nos rótulos a utilização de OGM na for-
mulação do produto. A PCR tem-se revelado técnica importante para a
detecção de OGM em alimentos, o que é fundamental para a fiscaliza-
ção frente a essas novas exigências que vêm surgindo (ARUN; YILMAZ;
MURATOGLU, 2013).
Nesse sentido, Pinto et al. (2008) propuseram a identificação de deter-
minadas espécies de milho geneticamente modificados (GMs) em empanados
prontos para o cozimento por meio da PCR. Detectou-se nas amostras a pre-
sença de pelo menos uma espécie de milho GM; a quantidade existente sendo
maior que a permitida, deve estar discriminada nas embalagens.
Verifica-se que, estando o diagnóstico molecular em crescimento, as ino-
vações relacionadas são e serão notáveis, com a valorização do limiar de detec-
ção e tempo de análise. Ressalte-se que a indústria precisa estar atenta a esta
tendência, pois isso poderá aumentar a credibilidade de suas análises devido às
características das técnicas fundamentadas na PCR (RODRIGUES, 2013).
77
As informações apresentadas corroboram a importância do diag-
nóstico molecular na produção e no controle de qualidade de alimentos.
O aprimoramento e o desenvolvimento de técnicas derivadas foram
fundamentais para preencher lacunas deixadas pelas metodologias con-
vencionais de análise comumente utilizadas. Atualmente, técnicas como
multiplex PCR e real time PCR têm se destacado na análise de alimentos.
Assim, a PCR está cada vez mais presente e, como mencionado, em breve
estará na maioria dos laboratórios de análise, pois as tecnologias molecu-
lares oferecem rapidez na emissão de resultados, o que as torna ainda mais
desejadas pelos setores produtivos.
Há limitantes em relação ao uso, como a necessidade de otimização,
porém as barreiras estão sendo vencidas e as técnicas estão ganhando
espaço em diversas áreas.
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82
APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA
MOLECULAR NA INDÚSTRIA DE
ALIMENTOS
Francielli Casanova Monteiro
Larissa Aparecida de Castro
83
84
INTRODUÇÃO
As técnicas hoje utilizadas na genética molecular têm sido
desenvolvidas a partir da pesquisa acadêmica básica, em diferentes campos
da atividade científica. O trabalho de Watson e Crick, em 1953, que propôs
a estrutura de dupla-fita do ácido desoxirribonucleico (DNA), marcou
a revolução molecular. Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas
de restrição, ferramentas essenciais para a manipulação in vitro do DNA.
Estas foram de fundamental importância para o isolamento e amplificação
de fragmentos específicos de DNA para a clonagem in vitro, tecnologia
desenvolvida a partir das técnicas de DNA recombinante descritas por Berg
em 1972 (ATKINS; CLARK, 2004).
Também em 1975 uma nova metodologia, denominada Southern
blotting, começou a ser usada para investigar a localização de genes e
marcou o início da aplicação destas tecnologias no estudo das doenças
genéticas. Em 1977, técnicas de sequenciamento permitiram a identificação
de alterações específicas na sequência de DNA e a associação destas com
diferentes doenças genéticas (MOLINA; TOBO, 2004).
Depois disso, o principal marco no desenvolvimento das técnicas de
diagnóstico molecular foi a técnica da polymerase chain reaction (PCR) ou
reação em cadeia da polimerase, um método de clonagem in vitro proposto
por Kary Mullis em 1987 (COTTON, 1997).
Os estudos genéticos moleculares utilizam uma variedade de
técnicas para analisar os ácidos nucleicos deoxyribonucleic acid (DNA)
e ribonucleic acid (RNA). Dentre estas técnicas, destacam-se: técnica de
hibridização do tipo dot ou blot, Southern e Northern, e hibridização in situ;
técnicas de amplificação de alvos específicos como a PCR, PCR competitiva,
PCR-transcriptase reversa (RT-PCR) e a PCR em tempo real; métodos de
amplificação de sinal, como por exemplo branched DNA (bDNA); tecnologia
de arrays (MOLINA; TOBO, 2004).
Objetivou-se neste capítulo demonstrar a utilidade da aplicação da
técnica em vários setores da indústria alimentícia.
85
ADULTERAÇÃO DE QUEIJO COM LEITE DE VACA
A identificação da espécie animal na área de alimentos tem sido
aplicada principalmente para detecção de fraude comercial, envolvendo
substituição de matéria-prima por outras de baixo valor. A qualidade
dos produtos alimentícios inclui a autenticidade do alimento, sendo
um importante conceito para os consumidores modernos, resultando
em crescente pressão nas políticas governamentais e diferentes áreas
de proteção da cadeia de produção de alimentos, por exemplo, a
verificação da exatidão dos rótulos dos produtos alimentícios, por
razões econômicas, religiosas ou de saúde (LOPEZ-CALLEJA et al., 2005;
ZHANG et al., 2007).
Para a detecção de ingredientes animais nos alimentos e a
identificação da espécie animal, são necessárias ferramentas adequadas
(LOPEZ-ANDREO et al., 2005). Métodos baseados em DNA são amplamente
aceitos por serem menos afetados pelos processos industriais, como
aquecimento e fermentação (PASCOAL et al., 2005; LOPPARELLI et al.,
2007; CORONA et al., 2007). O DNA mitocondrial tem bons resultados
nas análises em alimentos submetidos a tratamentos com pressão e
temperatura elevados, em que o DNA é parcialmente degradado (ZHANG
et al., 2007).
A PCR oferece a possibilidade de detectar ingredientes animais em
alimentos e de identificar quais espécies são originárias (PARTIS et al., 2000;
HERMAN, 2001; VERKAAR et al., 2002; LOPEZ-CALLEJA et al., 2005).
Em relação à carne, este método é eficaz tanto em matéria crua
quanto em produtos fermentados, cozidos ou autoclavados (PASCOAL et
al., 2005; LOPPARELLI et al., 2007; CORONA et al., 2007). Porém, em relação
a produtos lácteos, a extração de DNA se torna uma etapa crítica dessa
metodologia, pois este é obtido das poucas células somáticas originárias
da parede do úbere presentes no leite de vacas saudáveis (BRANCIARI et al.,
2000; HERMAN, 2001; REA et al., 2001; ZHANG et al., 2007). O aquecimento
e a manipulação do leite ou queijo também prejudicam a obtenção de
fragmentos de DNA em quantidade e com qualidade (ZHANG et al., 2007).
86
No Brasil não há legislação que caracterize produtos de búfalo. Em
relação aos queijos que também poderiam ser fabricados com leite de
búfala, a legislação vigente (Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária
de Produtos de Origem Animal – RIISPOA) apresenta somente os artigos
621 (mussarela), 622 e 627 (provolone), 628 (caccio-cavalo), 610 (ricota), 608
(gorgonzola), este último o único que especifica que o queijo gorgonzola deve
ser confeccionado integralmente com leite de vaca. Visando possibilitar
a diferenciação de produtos feitos a partir de leite de búfala, a Associação
Brasileira de Criadores de Búfalos (ABCB) instituiu o selo de pureza para tais
produtos, que têm uma legislação própria instituída pela Associação. Por
sua vez, em relação à rotulagem de produtos de origem animal compostos,
o RIISPOA (art. 801) estipula que os rótulos devem indicar sua composição
qualitativa e quantitativa (inclusive em relação às espécies animais)
(TEIXEIRA et al., 2012).
ADULTERAÇÃO NO LEITE
Sobre este assunto, a identificação de espécies de origem nos
alimentos como o leite, por exemplo, é um dos pontos predominantes de
aplicação. Pois, no caso do leite de vaca, evitado por alguns consumidores
por diversas razões (por exemplo, intolerância ou alergia, questões
religiosas, éticas ou culturais ou preferência pessoal), osquais,portanto,buscam
o consumo de leite de espécies alternativas, é indispensável a garantia de
que o produto que se consome não foi adulterado com leite de origem
diferente. Uma adulteração comum em produtos lácteos é a substituição do
leite caprino por quantidades superiores não declaradas de leite bovino, de
valor econômico inferior ao de origem caprina.
A fraude em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas
lácteas tem sido um grande problema econômico e de saúde pública. A
adição de leite de vaca em leite de cabra e de ovelha, fraude relativamente
comum entre alguns produtores de queijo, pode ser motivada pelas variações
sazonais na disponibilidade do leite de cabra, pela baixa produtividade
desse leite, pelo menor rendimento na fabricação de produtos lácteos,
como o queijo, e pelo preço mais elevado, comparativamente ao leite de
vaca (BEER et al., 1996).
87
A adição de quantidades não declaradas de leite de vaca em leite
caprino é, frequentemente, realizada devido à variação sazonal na produção
de leite caprino e ao menor valor econômico do leite bovino (LÓPEZ-CALLEJA
et al., 2007). A identificação das espécies de origem em produtos lácteos tem
se tornado cada vez mais importante no que diz respeito ao cumprimento da
legislação sanitária, fidelidade nas informações apresentadas ao consumidor,
do ponto de vista econômico e para a saúde pública (MININNI et al., 2009).
Dentre as metodologias para a detecção da mistura de leite de
diferentes espécies, particularmente a adição deste substrato bovino
ao caprino, a exemplo do sucesso obtido em diversas áreas, vários
pesquisadores estão adotando o método de PCR para auxiliar na identificação
de fraude em leite com misturas de diferentes espécies.
Como o leite cru e pasteurizado de glândulas mamárias saudáveis
contém um grande número de células somáticas (que contêm DNA genômico
e mitocondrial adequado para amplificação por PCR), a persistência destas
células no leite durante processos térmicos ou maturação em produção de
queijos tem permitido o uso de PCR para distinguir as espécies de origem.
Além disso, a PCR é um método baseado em material resistente, ou seja,
não está tão vulnerável a alterações provocadas pelo tempo, local de
armazenamento, variações de temperatura, e assim por diante.
A PCR possibilita identificar diferentes substâncias em um mesmo
ensaio, como por exemplo leite de vaca, cabra e ovelha em produtos
lácteos (BAI et al., 2009; BOTTERO et al., 2003) e também detectar e
quantificar espécies semelhantes como derivados mistos de leite bovino e
bubalino (DALMASSO et al., 2011). Isso contanto que os oligonucleotídeos
iniciadores de PCR, também denominados primers, específicos para cada
espécie, sejam concebidos de modo a resultar em fragmentos de diferentes
tamanhos. Com essa técnica, é possível encontrar limiares de detecção a
partir de 0,10% por amostra (LÓPEZ-CALLEJA et al., 2007).
ADULTERAÇÃO DE CARNE
São conhecidas algumas técnicas para a determinação da autenti-

cidade de produtos cárneos, pela identificação das espécies animais nas
88
matérias-primas. Métodos baseados na análise do DNA são bastante atra-
tivos. Meyer e Candrian, em 1996, afirmaram que a PCR é viável para análise
em alimentos por ser simples e específica; reconhecem-na como ferramen-
ta segura na identificação de espécies em produtos alimentares, oferecen-
do informações mais precisas em relação à pesquisa de proteínas, devido à
maior resistência do DNA aos processos térmicos e por estar presente em
qualquer tecido e célula.
Na área de alimentos, houve maior número de trabalhos científicos
sobre PCR para detecção da espécie animal a partir da BSE. Porém a grande
maioria deles visou à detecção de matéria animal usada para a fabricação
de ração (YOSHIDA et al., 2009; ZENG et al., 2009). A fraude em alimentos ou
derivados apresenta ainda número reduzido de trabalhos científicos.
Um dos trabalhos descrevendo a PCR para amplificação de DNA
mitocondrial específico de bovino em produtos derivados de carne bovina
foi publicado por Tartaglia et al. (1998). O método descrito permitiu a
detecção de material bovino em carne, numa taxa de inclusão de 0,125%.
Citando alguns autores, na Holanda, Janssen et al. (1998) detectaram
em 20 amostras de hambúrguer: carne suína, equina e de frango, em
substituição ou em adição à carne bovina. Em outras amostras de carne
para exportação com destino a países islâmicos, foi encontrada carne suína
em produtos bovinos.
Calvo, Zaragoza e Osta (2001) conseguiram detectar 0,005% de carne
de porco em conservas, produtos curados e patês. Calvo, Osta e Zaragoza
(2002) detectaram 0,01% de carne bovina, aquecida ou não, em produtos de-
rivados de carne, como embutidos, conservas e hambúrgueres; nesse mes-
mo ano Calvo et al. (2002) detectaram fraude em patê de pato comercial, pela
adição de carne de porco, quantificando o grau de contaminação em 1%.
De acordo com Calvo, Osta e Zaragoza (2002), a PCR é um recurso
adequado para identificar espécie específica de DNA em carne, osso e em
misturas destes, havendo boa especificidade no teste.
Rodriguez et al. (2003) utilizaram sequências conservadas de
DNA do gene 12S do RNA ribossomal e diferenciaram com precisão, pela
técnica da PCR: ganso, pato, galinha, peru e suíno. Encontraram o limite
mínimo de detecção de 1% para cada espécie, e o processamento térmico
89
não interferiu negativamente. No ano seguinte, Rodriguez et al. (2004),
utilizando sequência de DNA no gene 12S do RNA ribossomal, também
identificou um limite de detecção de 1% de carne de porco, carne bovina,
ovina e caprina em misturas à base de carne.
O método da PCR também foi utilizado por Gao et al. (2004), para de-
tecção de materiais caninos em alimentos para animais utilizando DNA mi-
tocondrial, obtendo resultado para confirmação da presença de material de
cão em uma concentração reduzida (0,05%). López-Andreo et al. (2005) utili-
zaram PCR em tempo real em alimentos processados comerciais detectando
1% de carne de porco, frango e peru e de 5% para carne bovina e de cordeiro.
Em trabalho realizado na Espanha, as carnes de camurça (espécie
de capríneo da Europa), cabra das montanhas rochosas e carneiro da
montanha foram submetidas à identificação por PCR após pasteurização
experimental de 72°C por 30’ e esterilização a 121°C por 20’, sendo o limite
de detecção para cada espécie-alvo de 0,10% (FAJARDO et al., 2007).
Ainda, Girish et al. (2007) utilizaram a técnica restriction fragment
length polymorphism (PCR-RFLP) para identificar e diferenciar carnes de
aves, como: frango, pato, codorna, galinha d’angola e peru.
Caldwell, Raley e Levine (2007) estudaram a contaminação fecal
em efluentes, utilizando PCR em gene mitocondrial, tendo como base a
sequência de nucleotídeos específicos para a espécie bovina e suína. Esse
estudo constatou uma eficiência, respectivamente, de 95% e 100% do
método. Em relação à especificidade, obteve-se 100% de identidade para
a espécie de origem. Não foi relatado nenhum falso positivo ou reação
cruzada com outra espécie similar.
A substituição de uma espécie animal por outra implica em desvios
por falsidade ideológica, infração da legislação, prejuízos econômicos para
o Estado e desigualdade competitiva entre produtores e comerciantes.
Além do que, na fraude, utilizam-se alternativas de baixo valor nutricional
e qualidade questionável, colocando em risco a saúde pública. Acredita-
se que a identificação e o controle de tais práticas dependerão do
desenvolvimento de recursos eficientes (BRUGNANO, 2010).
Para oferecer o método da PCR como recurso diagnóstico aos
Serviços Oficiais de fiscalização, faz-se necessária uma análise de custo.
90
A contabilidade de custos no laboratório de análises auxilia na gestão e
no planejamento dos recursos, garantindo equilíbrio financeiro para sua
manutenção. De acordo com Lima (2007), os propósitos de um sistema
de custo são: identificar e controlar os custos de suas operações, dar base
para fixação de preços, auxiliar na tomada de decisão alternativas de
investimento de capital e de métodos, favorecer a melhoria contínua de
tecnologia e de métodos.
SUBSTITUIÇÃO DE ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA TRADICIONAL

EM ALIMENTOS
As técnicas tradicionais de microbiologia de alimentos fundamentam-
se na utilização de testes morfológicos e bioquímicos para tipagem,
subtipagem e identificação de gêneros, espécies e subespécies microbianas.
As técnicas microbiológicas mais frequentes são utilizadas em meios de
cultura não-seletivos e seletivos complementadas por testes bioquímicos
diferenciais, na sua maioria, de produção enzimática, usados em conjunto
com testes sorológicos.
Marin et al. (2006) pontuam que os métodos tradicionais de
detecção de micro-organismos em alimentos, embora confiáveis e
eficientes, requerem de vários dias a semanas para obter resultados. Os
mesmos autores ressaltam que as propriedades fenotípicas pelas quais as
bactérias são identificadas podem não ser expressas e, quando são, podem
ser de difícil interpretação e classificação, além da possibilidade de existência
de células viáveis, porém não-cultiváveis.
As técnicas moleculares têm aplicação direta na detecção e
caracterização de bactérias patogênicas em alimentos. Dentre essas,
destacam-se as fundamentadas na amplificação de sequências DNA pela
PCR (BOER; BEUMER, 1999; MALORNY et al., 2003).
Na última década, o PCR tornou-se a técnica genética mais utilizada
em diagnóstico microbiológico (BOER; BEUMER, 1999; MALORNY et al.,
2003). Mesmo com o aumento da utilização das técnicas moleculares, em
estudos de microbiologia de alimentos, escassas são as publicações em
português que relacionem estas técnicas com esta área.
91
A introdução da PCR em diagnóstico microbiano estabeleceu uma al-
ternativa viável aos métodos tradicionais de cultura (MARLONY et al., 2003).
Esta técnica apresenta diversas vantagens em relação aos métodos conven-
cionais: maior poder de tipificação e discriminação, maior rapidez, bom limite
de detecção, maior seletividade, especificidade, potencial para automação e
a possibilidade de trabalhar com bactérias que não são cultiváveis em meios
de cultura normalmente utilizados (BUSH; NITSCHKO, 1999).
Os principais obstáculos à sua implementação na rotina laboratorial
são a incapacidade do método em diferenciar entre células vivas e mortas,
a presença de inibidores de enzima polimerase em alguns alimentos, o
alto investimento em equipamentos e reagentes e a falta de aprovação,
padronização e regulamentação por parte dos órgãos oficiais (MARLONY
et al., 2003). Outra desvantagem está na complexidade do método,
principalmente para ser utilizado em análises de rotina, apesar de que
o recente desenvolvimento de kits básicos em PCR tem facilitado a sua
utilização e difusão (BOER; BEUMER, 1999).
Outros fatores podem influenciar na eficiência do PCR, cabendo
ressaltar a concentração de íons de magnésio, a temperatura de cada ciclo, a
duração de cada uma das etapas de um ciclo, o total de ciclos, a concentração
dos dNTPs e a concentração da polimerase. Contaminantes presentes
na amostra também podem inibir a reação, e enzimas termoestáveis
produzidas por micro-organismos podem degradar os produtos da
amplificação (NAKAJIMA et al., 1994; DESTRO, 1995).
Segundo Rodríguez-Lázaro et al. (2007), a PCR será utilizada como pro-
cedimento rotineiro em laboratórios de análise dentro dos próximos dez anos.
A legislação brasileira que determina os métodos oficiais para análise
microbiológica de alimentos de origem animal e água (Instrução Normativa
no 62 – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, MAPA) (BRASIL,
2003) não apresenta métodos moleculares, porém menciona que, em
determinado caso, método molecular pode ser utilizado para identificação
de Salmonella spp.
A PCR revolucionou as análises moleculares. Entretanto, a legislação
brasileira vigente (BRASIL, 2003) relativa aos métodos oficiais para análises
microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água, ainda
92
indica métodos moleculares quando os testes convencionais apresentam
resultados duvidosos.
Não obstante, instruções normativas regulamentam o uso de
ensaios de PCR e são citadas como parte dos padrões oficiais de análise
microbiológica de alimentos. Aplicam-se também a ensaios Bax® System,
para a detecção de Salmonella spp. e Listeria monocytogenes (BRASIL, 2004;
BRASIL, 2005), fato que pode impulsionar seu uso nos próximos anos
pelas vantagens que apresentam para as empresas do setor. As instruções
indicam os procedimentos descritos pelo United State Department of
Agriculture (USDA) / Food Safety and Inspection Service (FSIS).
A RDC 12 (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2001) in-
dica órgãos internacionais reconhecidos, os quais apresentam PCR e téc-
nicas fundamentadas em PCR com reações já padronizadas, por exemplo,
para Vibrio cholerae no Bacteriological Analytical Manual (BAM) da Food and
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98
SEQUENCIAMENTO DE ÁCIDO
DESOXIRRIBONUCLEICO E TAXONOMIA DE
PROCARIOTOS
99
100
INTRODUÇÃO
Os organismos vivos são classificados em três domínios principais:
Bacteria e Archaea, coletivamente denominados Procariotos, e Eucarya ou
Eucariotos (PROSSER et al., 2007). As células procarióticas e eucarióticas
são organizadas de maneira diferente. Nas células procarióticas, o DNA
está presente na forma de uma grande molécula de fita dupla, a qual se
condensa no interior da célula, formando uma massa visível ao microscópio
eletrônico, denominada nucleoide. Entretanto, nos eucariontes, o DNA
encontra-se sob forma de moléculas lineares, presentes no interior do
núcleo envolto por membrana; as moléculas de DNA são empacotadas com
proteínas e organizadas formando os cromossomos (MADIGAN et al., 2016).
A taxonomia é o ramo da ciência que caracteriza, nomeia e posiciona
os organismos em grupos, buscando reproduzir a ordem evolutiva de
volta para a origem da vida com a célula (KÄMPFER; GLAESER, 2012).
Historicamente, procariotos foram classificados com base no seu fenótipo
(características observáveis). Por conseguinte, a taxonomia procariótica
evoluiu, e características de morfologia e bioquímica foram adotadas como
critérios taxonômicos (a capacidade de crescer em substratos diferentes, a
estrutura da parede celular, a sensibilidade a antibióticos e muitos outros).
Entretanto, a grande revolução ocorreu com a percepção de que as relações
taxonômicas poderiam ser deduzidas a partir de diferenças na sequência
dos genes (PROSSER et al., 2007). Atualmente, a taxonomia se baseia em
uma análise polifásica, empregando três tipos de métodos: fenotípico,
genotípico e filogenético (KÄMPFER; GLAESER, 2012).
O acelerado desenvolvimento de novas tecnologias vem gerando
uma riqueza de dados, importantes para avaliações taxonômicas mais
criteriosas. As tecnologias de sequenciamento de alto rendimento estão
melhorando rapidamente em termos de qualidade, velocidade e custo.
Dessa forma, são amplamente utilizadas para estudar comunidades inteiras
de procariontes em diversos nichos (BELLA et al., 2013). Nesse contexto,
o presente capítulo apresenta uma breve revisão sobre os avanços
das técnicas de sequenciamento e a sua contribuição para estudos de
taxonomia em procariontes.
101
SEQUENCIAMENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
O sequenciamento de ácido desoxirribonucleico (DNA) é um
processo que determina a ordem dos nucleotídeos que constituem a
molécula de DNA, em uma amostra. As duas técnicas mais importantes
para o sequenciamento de DNA são o método químico de degradação
de bases (MAXAM; GILBERT, 1977) e o método didesoxi ou terminação da
cadeia, desenvolvido por Fred Sanger e colaboradores em 1977. Ambos os
métodos se baseiam na produção de um conjunto de fitas simples de DNA
separadas pelo princípio de eletroforese (OKUBO et al., 1992). Entretanto,
o método de terminação da cadeia de Sanger gera dados mais fáceis de
interpretar, razão pela qual tem sido a técnica mais utilizada e a base das
novas tecnologias de sequenciamento de DNA desenvolvidas atualmente
(STRANNEHEIM; LUNDEBERG, 2012).
O método de Sanger é baseado na incorporação de
desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma
cadeia de DNA em desenvolvimento (Figura 1), tendo como molde o DNA
de interesse. Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é
interrompida, pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo
hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo
(dNTP). Como esses dNTPs são marcados, podem ser detectados, e a
sequência dos nucleotídeos, identificada.
Figura 1 – A: Desoxinucleotídeos (dNTPs): presença do grupo hidroxila no carbono 3’;

B: Didesoxinucleotídeos (ddNTPs) ausência do grupo hidroxila no carbono
Fonte: Adaptado de Lodish et al. (1999).
102
A reação de sequenciamento pode ser dividida nas seguintes etapas
(SANGER; NICKLEN; COULSON, 1977):
a) desnaturação: primeira etapa da reação de sequenciamento, na
qual a molécula de DNA é separada em fita simples, apenas com a
elevação da temperatura;
b) anelamento: caracterizada pela utilização de um oligonucleotí-
deo iniciador denominado primer, pequena sequência definida de
DNA, que irá se anelar à fita de DNA na região complementar à sua
sequência. Para ocorrer o anelamento, diminui-se a temperatura;
c) extensão: após o anelamento do primer, ocorre a extensão do
fragmento através da inserção dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP) pela taq DNA polimerase. Como os ddNTPs estão em con-
centrações muito menores que os dNTPs, a sua inserção na cadeia
é menos frequente. Quando um dos ddNTPs é inserido no lugar
dos dNTPs, a extensão é interrompida.
Inicialmente, a leitura da sequência de bases do DNA era feita em
etapas e de forma manual, pela exposição das bases identificadas em
um filme de raios X. Para isso, 4 microtubos de reação eram preparados
separadamente, cada qual contendo o DNA molde, a enzima DNA
polimerase e um oligonucleotídeo iniciador (primer) com uma pequena
quantidade de um dos didesoxinucleotídeos marcados com fósforo
radioativo (P32) denominados ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP)
acrescidos dos desoxinucleotídeos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP) não
marcados utilizados como substratos para a enzima em cada reação. Nos
quatro tubos eram produzidos vários comprimentos de fita única de DNA
(Figura 2A), cada uma correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP
marcado era incorporado e, assim, ocasionando o término do alongamento
da fita. As amostras de cada tubo eram submetidas a uma corrida de
eletroforese (Figura 2B) com posterior exposição em filme de raios X, para
que as posições das bases correspondentes pudessem ser determinadas, a
partir da leitura realizada ao longo das 4 colunas do gel.
103
Figura 2 – Sequenciamento de DNA pelo método de Sanger
Nota: A: componentes da reação de cada amostra de sequenciamento; B: representação do gel de
eletroforese exposto ao raio X.
A primeira máquina de sequenciamento automático (AB370) foi

produzida pela Applied Biosystems em 1987 (LIU et al., 2012). Atualmente,
o sequenciamento automático de DNA utiliza sequenciadores com
eletroforese vertical em placa, onde os próprios ddNTPs possuem marcação
com fluorescência, cada um dos quatro diferentes ddNTPS é marcado com
um fluoróforo de cor distinta, ao contrário do método manual, em que os
mesmos apresentavam marcação radioativa (SMITH et al., 1986). Para a
geração de fragmentos durante a reação de sequenciamento, os dNTPs são
adicionados à nova fita e, no momento da adição de um ddNTP, a extensão
da fita é interrompida e, consequentemente, marcada com o último
didesoxinucleotídeo incorporado.
104
Ao final de vários ciclos, têm-se várias fitas de DNA de diferentes tamanhos
terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente são identificados por
uma leitura realizada por um sequenciador automático. Nesta nova tecnologia,
a sequência é determinada após ser submetida a uma eletroforese de alta
resolução em tubos capilares, onde os produtos são separados de acordo
com o tamanho (SHENDURE; HANLEE, 2008). Os fragmentos marcados com
fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e, à medida que
são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos
de onda, detectados por um fotomultiplicador. Em seguida, essa informação é
transmitida ao computador e processada para que, ao final da corrida, os dados
possam ser recuperados em formato de eletroferograma (Figura 3), seguindo-se
da análise de bioinformática (SMITH et al., 1987).
A técnica de sequenciamento Sanger, denominada de Primeira
Geração, completou o primeiro sequenciamento do genoma bacteriano
em 1995 (FLEISCHMANN et al., 1995) e constituiu parte principal do Projeto
Genoma Humano em 2001 (COLLINS; MORGAN; PATRINOS, 2003) que, por
sua vez, promoveu um maior desenvolvimento de novas tecnologias. Nesse
contexto, foram desenvolvidas as novas gerações de sequenciamento, com
o objetivo de aperfeiçoar, otimizar e reduzir o custo do processo.
No sequenciamento de nova geração (NGS), são gerados moldes indivi-
duais de DNA clonal e sequenciados simultaneamente. As reações de sequencia-
mento são realizadas em ciclos de adição de bases que podem ser feitas com o
uso de polimerização ou ligação de DNA (MORENO, 2013). Apesar de se diferen-
ciarem consideravelmente entre si, todos os sequenciadores de NGS se baseiam
no processamento simultâneo de inúmeras cópias (massivo) de fragmentos de
DNA. Por sua vez, enquanto um sequenciador de primeira geração processava,
no máximo, 96 fragmentos por vez, os sequenciadores de nova geração podem
ler até bilhões de fragmentos ao mesmo tempo, denominados de plataformas
de sequenciamento e representam uma alternativa poderosa para estudos de
genômica. Atualmente, os sequenciadores estão divididos em (PINHEIRO, 2015):
a) 1ª geração: degradação química e Interrupção da cadeia-Sanger;
b) 2ª geração: plataforma 454-Roche, Illumina Genome Analyser-Hi-
Seq/MiSeq e SOLID;
c) 3ª geração: íon Torrent e PacBio.
105
Figura 3 – Esquema do sequenciamento de DNA pelo método de Sanger, usando ddNTPs marcados
com fluorescência
106
A base do sequenciamento de 2ª geração é o uso de vários templa-
tes clonais ao mesmo tempo e determinação da sequência com uso de re-
plicação enzimática (MCGINN; GUT, 2012). Introduzido em 2006, o illumina
genome analyzer baseia-se no mesmo princípio; entretanto, o protocolo de
sequenciamento do Illumina fundamenta-se no fato de que as quatro bases
competem umas com as outras para se ligar ao alvo, competição natural que
garante a alta precisão. Depois de cada ligação, os fluorocromos são excita-
dos por um laser, e a cor obtida identifica a base que foi adicionada. Este fluo-
rocromo é depois retirado, para que a próxima base possa ligar-se à amostra,
e cada base adicionada em cada ciclo é lida (KIRCHER; KELSO, 2010).
Dentre os sequenciadores utilizados na segunda geração, a platafor-
ma Roche 454 (PETROSINO et al., 2009) foi a primeira a ser desenvolvida em
2005. Nesta plataforma, o DNA é desnaturado em fitas simples e fragmenta-
do até um tamanho entre 400 e 800 pares de bases, sendo cada fragmento
imobilizado em uma esfera microscópica e amplificado. No final do processo,
cada esfera possuirá várias cópias idênticas à fita de DNA (BERKA et al., 2010).
As esferas são transferidas para uma placa de fibras óticas, onde existem po-
ços individuais que fornecem um local fixo para as esferas em que cada rea-
ção de sequenciamento pode ser monitorada, enquanto os nucleotídeos e as
soluções dos reagentes são adicionados passo a passo (MARDIS, 2008). Cada
nucleotídeo introduzido pela DNA polimerase resulta na liberação de um
pirofosfato (Figura 4), o qual inicia uma série de reações em cadeia que pro-
duzem luz, pela quebra da oxiluciferina pela luciferase (BERKA et al., 2010).
A quantidade de luz produzida é proporcional ao número de nucleotídeos
incorporados (até o ponto de saturação do detector). Do lado oposto à placa
de fibra ótica, está uma câmera que registra a luz emitida por cada esfera.
A visualização dos flashes de luz da atividade da luciferase registra quais os
poços que estão a adicionar cada nucleotídeo específico, e a luz emitida é
diretamente proporcional à quantidade de um determinado nucleotídeo in-
corporado (MARDIS, 2008).
107
Figura 4 – Esquema do processo de sequenciamento do Roche 454
Fonte: Adaptado de Mardis (2008).
Ainda dentro das tecnologias de segunda geração, foi desenvolvida

a plataforma Sequencing by Oligo Ligationand Detection (SOLiD), semelhante
108
aos sistemas anteriores; usa uma emulsão de PCR com pequenas
esferas magnéticas para amplificar fragmentos para sequenciamento.
Diferentemente das outras plataformas de sequenciamento de segunda
geração, a SOLiD usa a DNA ligase em vez da DNA polimerase (MARDIS, 2008).
Uma mistura de sondas fluorescentes com 4 cores distintas compete para a
ligação ao primer, cada cor representa 4 das 16 sequências possíveis (cada
uma com 4 nucleotídeos). Nesse processo, um primer de sequenciamento
é hibridizado com as cópias de cadeia simples das moléculas da biblioteca
a serem sequenciadas e ligado pela DNA ligase. Depois de ser medida a
fluorescência, parte da sonda fluorescente é clivada da extremidade 5’
deixando 2 nucleotídeos da sonda e um grupo fosfato livre, disponível para
a próxima reação de ligação (KIRCHER; KELSO, 2010).
Diferentemente das tecnologias de segunda geração, que depen-
dem da PCR para obter as sequências, a Terceira Geração apresenta tecno-
logias que não requerem qualquer amplificação, sendo a leitura feita em
moléculas únicas (MCCARTHY, 2010). Desse modo, a terceira geração con-
seguiu superar as duas anteriores em termos de comprimento de leitura da
sequência (de dezenas para milhares de bases por leitura), rapidez do pro-
cesso (de dias para horas ou minutos), alto rendimento, tempo de resposta
(10.000 a 20.000 vezes mais rápido), quantidades mínimas de amostra ne-
cessárias e baixo custo (PAREEK; SMOCZYNSKI; TRETYN, 2011).
A plataforma Ion Torrent, além de fazer parte da terceira geração,
inaugurou a era dos sequenciadores pós-luz ao utilizar um semicondutor
como sistema de detecção de bases. O método de sequenciamento
baseia-se na detecção de íons de hidrogênio que são liberados durante
o processo de polimerização do DNA (HENSON; TISCHLER; NING, 2012). O
tamanho das leituras pode alcançar até 400 pb, exibindo o comprimento
médio em torno de 200 pb (http://www.lifetechnologies.com). O principal
tipo de erro desta plataforma são as inserções e deleções (INDEL) pois, em
regiões homopoliméricas (sequências constituídas de um único tipo de
oligonucleotideo, por exemplo poli (A) ou (T), não existe linearidade entre
a intensidade do fluxo de íons hidrogênios detectados e o número de
nucleotídeos incorporados, tornando frequentes os erros na determinação
do tamanho de tais regiões (ZENG; JIANG; CHEN, 2013).
109
Em 2010, a Pacific Biosciences of California (2017) lançou a plataforma
de terceira geração baseada na tecnologia SMRT, onde não há necessidade
das etapas de amplificação por PCR (KAUR; MALIK, 2013). A abordagem
de sequenciamento identifica diferentes nucleotídeos marcados com
distintas cores através dos fosfatos. Durante o processo de síntese, o sinal
de fluorescência é detectado assim que um fosfato é liberado na reação de
incorporação do nucleotídeo à fita de DNA (ZHANG et al., 2011). O PacBio RS
System produz um rendimento de 35-45 Mb com uma média de tamanho
de leitura em torno de 1500 pb (HENSON; TISCHLER; NING, 2012).
Devido a essas tecnologias, a quantidade de dados gerados é
incalculável, sendo, portanto, necessário que estejam organizados de
maneira acessível, de modo a evitar redundância na pesquisa científica e
possibilitar a análise por um maior número de cientistas. Isso foi possível
pela construção de bancos de dados para armazenamento de informações
de sequências de DNA e genomas inteiros, proteínas e suas estruturas
tridimensionais, bem como vários outros produtos da era genômica
(ZHANG et al., 2011).
O NCBI, Centro Nacional para Informação Biotecnológica dos EUA,
é considerado o banco de dados central sobre informações genômicas,
embora existam vários outros bancos de dados similares distribuídos
pela Europa e Japão. O GenBank é o principal banco de dados do NCBI
e armazena todas as sequências disponíveis publicamente de DNA
(de sequências pequenas a genomas inteiros), RNA e proteínas. Várias
ferramentas desenvolvidas pela bioinformática permitem o acesso e
análise dos dados no GenBank. O BLAST é a ferramenta mais utilizada
de comparação de sequências de DNA (ALTSCHUL et al., 1997), com os
bancos de dados genômicos. Através deste algoritmo, pode-se comparar
uma sequência de DNA ou proteína qualquer com todas as sequências
genômicas de domínio público (Figura 5).
110
Figura 5 – Forma de consulta no NCBI
Fonte: National Center for Biotechnology Information (2014).
Nota: A: Interface do BLAST no banco de dados do NCBI; B: Comparação da sequência usando o BLAST;
C: Resultado obtido após comparação com o banco de dados do NCBI.
111
O primeiro genoma sequenciamento foi de um vírus, o do fago
ϕX174 em 1975. Em 1995, 20 anos depois, foi sequenciado o primeiro
genoma de um organismo de vida livre, o da bactéria Haemophilus
influenzae (FLEISCHMANN et al., 1995), com 1,8 Mpb. Os cinco anos
seguintes foram marcados pela publicação do sequenciamento do
genoma de mais de 50 outras espécies, destacando-se: as bactérias
Mycobacterium tuberculosis (COLE et al., 1998), por causarem a tuberculose,
e Escherichia coli, que é um dos principais patógenos humanos (BLATTNER
et al., 1997) e vem crescendo de forma exponencial nos últimos anos. As
novas tecnologias de sequenciamento têm melhorado, em produção e
qualidade, e tornaram-se uma ferramenta indispensável em diversos
estudos como filogenia, diagnóstico e ecologia. Além disso, este tipo de
abordagem permite uma visão holística e fornece uma base sólida para
descrição da diversidade biológica e tem o potencial para se tornar a base
mais estável em estudos de taxonomia.
TAXONOMIA DE PROCARIOTOS
O conceito de espécie foi proposto pela primeira vez por Aristóteles
há 2.400 anos (HO; LAU; WOO, 2013). Desde então taxonomistas têm tentado
encontrar formas para circunscrever as unidades biológicas observadas na
natureza (Figura 6).
Embora às vezes os termos sistemática e taxonomia sejam usados
como sinônimos, o certo é considerar a taxonomia como parte da
sistemática (KÄMPFER; GLAESER, 2012), que é o estudo científico de todos
os tipos de diversidade de organismos e de todas as relações entre eles,
e a taxonomia é o estudo teórico da classificação, abrangendo as suas
bases (SNEATH, 2001), sendo considerada a arte de classificação biológica
(SIMPSON, 1961).
A classificação inicial de procariotos foi baseada unicamente em
semelhanças fenotípicas (morfologia e fisiologia), o que resultava na
formação de grupos taxonômicos heterogêneos e muitas vezes artificiais
(ROSSELLÓ-MÓRA, 2005; RICHTER; ROSSELLÓ-MORA, 2009).
112
Figura 6 – Linha do tempo dos acontecimentos na classificação biológica
Fonte: Adaptado de Ho, Lau e Woo (2013).
Nota: O eixo horizontal denota a sequência de tempo de importantes ideologias ou publicações, bem
como mostra introdução das técnicas de biologia molecular.
113
Ferdinand Cohn foi o primeiro a propor um sistema de classificação
bacteriana, baseado na forma e aparência geral das células bacterianas,
uma escolha que tinha as suas raízes na utilidade da morfologia na
classificação de organismos superiores. Cohn, porém, em 1872 percebeu
claramente a limitação dessa abordagem para a definição de gêneros de
bactérias e cautelosamente se refere aos vários grupos morfológicos como
forma de gêneros, sem lhes atribuir qualquer importância filogenética
(PALLERONI, 2003).
Esses sistemas de classificação refletiam as limitações tecnológicas
da época. Baseados em algumas propriedades morfológicas, fisiológicas
e bioquímicas, na prática levaram a erros de classificação em diferentes
grupos de bactérias (BOONE; CASTENHOLZ, 2001).
A taxonomia moderna teve início em 1753, com a publicação da
primeira edição do Systema Naturae, de Carl Linnaeus, que propôs um
sistema binomial de nomenclatura que é uma das bases da classificação
atual dos organismos (PALLERONI, 2003).
Na década de 1960, métodos baseados na análise do genoma foram
usados para avaliar as relações genômicas. Entre estes, a hibridação de DNA-
DNA (DDH), muito utilizada para determinar as semelhanças no genoma, tendia
a reproduzir organismos fenotipicamente semelhantes, que foram considerados
espécies (ROSSELLÓ-MÓRA, 2005; RICHTER; ROSSELLÓ-MORA, 2009).
Um passo importante que revolucionou os estudos taxonômicos
de procariotos foi a análise da subunidade menor do ribossomo (gene 16S
do rRNA), uma região considerada conservada e, ao mesmo tempo, com
regiões de variabilidade e informações suficientes para elucidar as relações
filogenéticas entre as espécies de bactérias (WOESE, 1987; WOESE; FOX,
1977; WEISBURG et al., 1991).
Pela primeira vez, foi possível estabelecer um sistema taxonômico
hierárquico a partir de um marcador molecular prático (WOESE; FOX,
1977), que levou ao reconhecimento do domínio Archaea (WOESE; FOX,
1977) e conduziu a sistemática de procariotos a uma nova era (BOUSSAU;
DAUBIN, 2009). Até hoje, na taxonomia de procariotos, as espécies têm sido
designadas principalmente com base na análise das sequências do gene
16S do rRNA (KONSTANTINIDIS; TIEDJE, 2005).
114
O uso de sequências do gene 16S do RNA para estudar a filogenia
e a taxonomia em procariontes tem sido muito frequente, por inúmeras
razões, conforme Patel (2001):
a) está presente em quase todas as bactérias, geralmente existentes,
como uma família de multigenes, ou operons;
b) a função do gene de 16S do rRNA ao longo do tempo não mudou,
o que sugere que as alterações aleatórias nas sequências são uma
medida mais precisa de tempo (evolução);
c) o gene 16S do RNA é suficientemente grande (1500 pb) para fins
de análise.
O uso de sequências do gene 16S rRNA na taxonomia de bactérias
pertencentes ao domínio Archaea é visto como a espinha dorsal para a
classificação dos procariontes (TINDALL et al., 2010; ZHI et al., 2012). No
entanto, as abordagens atuais para a classificação dos procariotos têm
se apoiado no uso integrado de informações genotípicas e fenotípicas,
sistemática molecular, outros genes sequenciados de efeitos taxonômicos
e procedimentos taxonômicos numéricos (GOODFELLOW; O’DONNELL,
1993; VANDAMME et al., 1996; TINDALL et al., 2010). Essa prática, conhecida
como taxonomia polifásica, foi introduzida por Colwell (1970) e propõe
reunir diferentes tipos de informações para obtenção de identificações e
classificações mais precisas e confiáveis (ZHI et al., 2012).
A aplicação extensiva da taxonomia polifásica levou a melhorias
significativas na classificação dos procariontes, classificação que, por
sua vez, forneceu uma base sólida para a nomenclatura estável e melhor
identificação dos mesmos (DE VOS et al., 2009; GOODFELLOW et al., 2011).
Neste capítulo foram apresentadas as novas tecnologias de
sequenciamento de DNA, bem como os avanços na taxonomia de
procariotos com base em marcadores moleculares. A evolução tecnológica,
a par dos numerosos avanços científicos dos últimos anos, tem transformado
a maneira de abordar os sistemas biológicos e o conceito de espécie. O que
115
inicialmente requeria um grande investimento, atualmente está disponível
de um modo simples e acessível.
A classificação e descrição adequada de organismos procariotos
exigem o conhecimento de características morfológicas, bioquímicas,
fisiológicas e genéticas. Atualmente, por sua rapidez e alto nível de
resolução e diferenciação, as análises baseadas em sequência de DNA têm
sido cada vez mais os métodos escolhidos para caracterizar procariotos. A
introdução do gene 16S do rRNA como marcador molecular possibilitou o
desenvolvimento de um sistema hierárquico taxonômico baseado em um
marcador molecular prático, e atualmente tornou-se o eixo principal da
taxonomia procarionte.
Com os avanços observados nas novas tecnologias de sequencia-
mento, um grande volume de dados tem sido gerado, o que possibilitou
avaliações mais criteriosas na taxonomia de modo geral. As novas tecnolo-
gias de sequenciamento são de alto rendimento e vêm melhorando rapida-
mente em termos de qualidade, velocidade e custo.
A sistemática e taxonomia de procariotos estão entrando na era da
genômica. Esta mudança de paradigma é importante não só para a com-
preensão da filogenia molecular em todo o nível do genoma, mas também
na revelação da base genética ou epigenética, que representa os critérios
fenotípicos usados para classificar e identificar espécies. As novas desco-
bertas muitas vezes exigem mudanças na taxonomia, às vezes resultam em
alterações na classificação existente, na nomenclatura, no critério de iden-
tificação e no reconhecimento de novas espécies, assim como possibilita
elucidar o papel de genes assim como elucidar genes relacionados a uma
determinada via metabólica. Enfim, estes desenvolvimentos constituem
um desafio para os taxonomistas: reanalisar, através dos mecanismos mole-
culares subjacentes, as características taxonômicas de procariontes.
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of Sciences of the United States of America, Washington, v. 74, n. 11, p.
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120
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ZHANG, J. et al. The impact of next-generation sequencing on genomics.
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ZHI, X. Y. et al. Prokaryotic systematic inthegenomicsera. Van
Leeuwenhoek, Wageningen, v. 101, n. 1, p. 21-34, 2012.
121
122
SENSIBILIDADE DA PCR EM DERIVADOS DE
ORIGEM ANIMAL
Gabriela Sartori Felkl
Andiara Gonçalves Tenório
Renata Samulak Marinho
Sabrina Ávila Rodrigues
Juliana Vitoria Messias Bittencourt
123
124
INTRODUÇÃO
A qualidade da carne e seus derivados deve estar de acordo com
requisitos estabelecidos pelos órgãos de normatização e ainda cumprir
as altas reivindicações e exigências do mercado (SANTOS; PALMEIRA,
2006). Demanda seus atributos intrínsecos, como cor, sabor, quantidade
de gordura, proteínas, vitaminas e minerais; como extrínsecos, relativos à
produção e comercialização do produto.
Os derivados cárneos seguem as mesmas exigências da carne in
natura, acrescentando-se aí a autenticidade quanto ao padrão de identidade
do produto processado (ALBINO FILHO, 2006). Dessa forma, o objetivo deste
capítulo é descrever como a técnica da PCR pode auxiliar na autenticação e
no controle de qualidade de produtos cárneos e seus derivados.
PROCESSAMENTO DE CARNES
A fabricação de derivados de carne consiste na transformação da
carne in natura em produtos cárneos, em um ciclo com início na produção de
carnes com qualidade e seu fim em um produto com padrão de identidade. Na
industrialização da carne, empregam-se aditivos, diferentes tratamentos térmicos
(calor e frio) e diferentes formas de armazenamento. Essa ação visa aumentar
a vida útil do produto cárneo processado, utilizar partes do animal de difícil
comercialização in natura e desenvolver diferentes sabores/produtos (elevar o
valor do produto) (VEIGA, 2011). Contudo, as indústrias alimentícias se deparam
com entraves econômicos, sanitários e, ainda, com as diferenças culturais.
Em determinados espaços do mercado, a principal barreira encontrada
por uma empresa são crenças religiosas de determinados países. É, por
exemplo, o caso da Índia, no tocante ao consumo de carne bovina, pois a
vaca, considerada um animal sagrado, não pode ser maltratada nem abatida
(GLAAB, 2011). Nesse sentido, a preocupação desses consumidores por
um produto cárneo adequadamente rotulado quanto ao seu padrão de
identidade é intensificada. Os estudos mais avançados quanto a inovações
em tecnologia nas análises que possam detectar fraudes em produtos cárneos
são desenvolvidos nos países orientais (BAI et al., 2009). Encontram-se nesse
mesmo cenário os muçulmanos, para os quais, segundo preceitos religiosos,
125
consumir carne suína é pecado. Nessas crenças e costumes, o mercado de
produtos destinados a este público-alvo, como o de produtos Halal, está se
tornando cada vez maior. A crescente demanda por este tipo de alimento deve-
se ao fato de o consumidor muçulmano se alimentar apenas com produtos
Halal, seguindo o que determina o Corão Sagrado e a Jurisprudência Islâmica.
No setor de alimentos processados Halal, há um mercado estimado em 400
bilhões de dólares, o qual cresce a uma taxa de 15% ao ano (CIBALHALAL, 2012).
Segundo Cibalhalal (2012), para manter a excelência e credibilidade
perante os consumidores, a produção de alimentos específica deve evoluir
juntamente com a biotecnologia, implantando analises e laudos que eliminem
qualquer hipótese de produtos ilícitos. Nesse contexto, a regularização
adequada de produtos cárneos conforme seu padrão de identidade deve ser
uma exigência intensamente averiguada pelos órgãos vigentes de alimentos. No
entanto, a identificação das espécies animais contida em produtos cárneos ainda
é um desafio considerável para as autoridades (BAI et al., 2009), uma vez que,
após o processamento, não é possível identificar a adulteração sensorialmente
(HAUNSHI et al., 2009). O consumo de carne de diferentes espécies animais varia
de acordo com a cultura e a região de cada país (Quadro 1).
Animal Comestível Restrições ao consumo
Inseto América Latina, Ásia, África Parte da Europa e América do Norte
Europa, América do Norte e América

Cachorro Coréia, China e Oceania
do Sul
Cavalo França, Bélgica, Japão Grã-Bretanha, América do Norte
Coelho França, Itália Grã-Bretanha, América do Norte
Rã França, Ásia Europa, América do Norte
América Latina, América do Norte,

Frango -
Europa, Ásia, África, Oceania

Suíno Judeus e Islâmicos
Europa, Ásia

Bovino Índia e Ásia
Europa, África
Quadro 1 – Consumo de espécie animal segundo a cultura dos países

Fonte: Adaptado de Brugnano (2010).
126
Autenticidade é a certeza de que um produto provém das fontes
divulgadas sem alterações ao longo de seu processo. Geralmente é utilizada
a fim de atender à demanda dos clientes, melhorar a imagem dos produtos
junto ao consumidor e/ou colaborador, ou ainda agregar valor ao produto
ou serviço (PERETTI; ARAÚJO, 2010). Os sistemas de autenticidade de
produtos cárneos exigem uma cadeia transparente de ações para manter
sua credibilidade, devendo conter um mecanismo confiável e que possa ser
verificável, ou seja, onde se possa comprovar aquilo que se diz ser, como,
por exemplo, o padrão de identidade de um embutido, a autenticação deve
ser capaz de assegurar que esse produto contenha apenas os constituintes
cárneos indicados na sua rotulagem (UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS
GERAIS, 2012).
As metodologias analíticas normalmente utilizadas na determinação
da autenticidade de produtos cárneos são: os métodos imunológicos e
enzimáticos, análise sensorial, microscópica, química e instrumental, near
infra-red (NIR) e análise dos constituintes através do ácido desoxirribonucleico
(DNA), como a Polymerase Chain Reaction (PCR) (PERETTI; ARAÚJO, 2010).
A técnica PCR, baseada na análise do DNA, vem se mostrando uma
oportunidade concreta para autenticidade de produtos cárneos; sendo o
DNA único para cada animal, esse é um meio de identificação não invasivo,
à prova de fraude e capaz de ser identificado em produtos processados
(UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, 2012).
A substituição dos constituintes cárneos por substâncias de valor
inferior, como água, amido, gelatina, proteínas não cárneas e, até mesmo,
espécies animais semelhantes é bastante comum. Observam-se na literatura
estudos realizados a fim de desenvolver técnicas mais aptas para detectar
essas adulterações em produtos cárneos industrializados. Ghovvati et al.
(2009) descrevem um ensaio com o método molecular PCR para a detecção
de carne bovina, suína e aves em produtos cárneos industrializados. O DNA
extraído foi usado como molde para amplificação via PCR, e os resultados
demonstraram adulteração da espécie animal na fabricação de salsichas.
A autenticidade do padrão de identidade de produtos cárneos
e seus derivados é de suma importância para detectar fraudes e, assim,
resguardar os consumidores no que diz respeito às questões sanitárias,
127
econômicas e religiosas (SOARES et al., 2010; NAKYINSIGE; CHE MAN; SAZILI,
2012). A fraude por substituição da espécie animal em produtos cárneos é
muito comum por questões econômicas e pelo fato de não serem utilizados
métodos de análise capazes de detectar essa adulteração. A rotulagem
precisa é fundamental para informar ao consumidor e auxiliar na sua
escolha, além de valorizar e dar destaque à empresa que apresente uma
rotulagem de acordo com a legislação (BALLIN, 2010).
Embora os regulamentos da legislação nacional e internacional
sustentem a obrigatoriedade das informações corretas de rotulagem –
Comissão Diretiva 2002/86/CE, onde produtos à base de carne necessitam
ser rotulados em relação às espécies animais usadas como ingrediente,
assim como sua quantidade, com efeitos desde julho de 2003 – esses
regulamentos por si sós não são suficientes para evitar a fraude. A falta
de fiscalização, aliada à utilização de métodos convencionais ineficazes,
favorece a substituição de uma espécie animal por outra sem que isso
seja diagnosticado (LAUBE; ZAGON; BROLL, 2007; BALLIN, 2010; MAYER;
HOCHEGGER, 2011).
Na autenticidade de produtos cárneos, devem ser consideradas
várias questões, como a substituição de ingredientes, normalmente por
um de menor valor econômico; a utilização de constituintes de origem
animal não declarados no rótulo, como, por exemplo, vísceras ou plasma
sanguíneo; a especificação e proporção de ingredientes incompatíveis com
o rótulo; a rotulagem inadequada relativa à origem geográfica do produto,
e, por fim, a substituição de carne de caça por carne de animais domésticos
(SANTOS, 2011).
Segundo Santos (2011), para a autenticidade dos produtos cárneos,
existem métodos convencionais baseados, essencialmente, na análise de
proteínas específicas. Conjuntamente, vêm sendo desenvolvidos estudos
a fim de autenticar os produtos cárneos processados de maneira mais
confiável e eficaz, como as metodologias moleculares baseadas no DNA.
Nesse sentido, o objetivo desta pesquisa foi determinar a presença de
carne suína e de frango em produtos processados a partir do diagnóstico
molecular por PCR.
128
MATERIAL E MÉTODOS
O teste de sensibilidade (limiar de detecção) dos oligonucleotídeos
iniciadores das espécies suína e aviária foi realizado com o intuito de analisar
a correlação entre a temperatura de processamento do produto cárneo e
a sensibilidade da metodologia, além de verificar o limite de detecção de
adulteração da PCR.
AMOSTRAS PARA A UTILIZAÇÃO DE CONTROLE E TESTE DE SENSIBILIDADE
As amostras de controle foram as de músculo para as espécies suína

e aviária. Para o teste de sensibilidade, utilizou-se uma linguiça suína,
produzida no Laboratório de Carnes da Universidade Tecnológica Federal
do Paraná (UTFPR), Câmpus Ponta Grossa, simulando as condições de
industrialização do produto. Para tanto, adicionou-se músculo suíno (pernil)
e gordura suína (toucinho) em amostras de carne de frango e músculo
de frango (coxa e sobrecoxa) e gordura de frango em amostras de carne
suína. As amostras foram trituradas em multiprocessador até apresentarem
aparência de patê. Essa mistura foi preparada em concentrações de 0,01%,
0,10%, 1,00%, 5,00% e 10,00%, além de uma amostra de controle negativo
para cada espécie, totalizando 72 amostras (Tabela 1). Adicionou-se,
também, 2% de sal e 0,10% de pimenta preta em cada amostra.
As amostras foram analisadas nas seguintes condições de
processamento: amostras cruas; amostras cozidas sob pressão atmosférica
em banho-maria, até o centro do alimento atingir 72ºC; e amostras
autoclavadas a 121ºC durante 10 minutos (Tabela 1).
129
Tabela 1 – Concentrações e tratamentos térmicos para o teste de sensibilidade
100% carne de frango 100% carne suína
Carne de frango Gordura de

Carne suína (%) Gordura suína (%)
(%) frango (%)
1 0 (CN)* 19 0 (CN)* 37 0 (CN)* 55 0 (CN)*

2 0,01 20 0,01 38 0,01 56 0,01
3 0,10 21 0,10 39 0,10 57 0,10
Crua
4 1 22 1 40 1 58 1
5 5 23 5 41 5 59 5
6 10 24 10 42 10 60 10
7 0 (CN)* 25 0 (CN)* 43 0 (CN)* 61 0 (CN)*
8 0,01 26 0,01 44 0,01 62 0,01
Cozida sob 9 0,10 27 0,10 45 0,10 63 0,10

pressão 10 1 28 1 46 1 64 1
11 5 29 5 47 5 65 5
12 10 30 10 48 10 66 10
13 0 (CN)* 31 0 (CN)* 49 0 (CN)* 67 0 (CN)*
14 0,01 32 0,01 50 0,01 68 0,01
15 0,10 33 0,10 51 0,10 69 0,10
Pressão ATM
16 1 34 1 52 1 70 1
17 5 35 5 53 5 71 5
18 10 36 10 54 10 72 10
Fonte: Felkl (2014).
Nota: *Controle Negativo.
EXTRAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS
Para a extração do DNA das amostras de controle e para as amostras

de linguiça, adaptou-se o protocolo de extração de DNA total descrito por
Marcelino, Guimarães e Barros (2008), nas seguintes etapas:
a) as amostras foram trituradas em liquidificador com Tampão de
Extração (TE) (EDTA 1 mM e Tris-HCL 10mM), na proporção de 20
gramas de amostra para 80 ml de TE;
b) maceração das amostras com CTAB 2% [50 mM CTAB, 1,40 M NaCl,
100 mM Tris-HCl (pH 8,00), 20 mM EDTA e PVP 1%];
130
c) adição, em um microtubo tipo eppendorf de 1,50 ml, de 500 µL
de tampão CTAB 2% e 100 mg da amostra desejada, para então
homogeneizar em vortex por 5 minutos e incubar em banho-maria
seco a 65ºC durante 30 minutos.
Para a desproteinização, adicionar 520 µL de CIA à amostra,
homogeneizar em vortex por 2 minutos e centrifugar a 12.000 giros por
10 minutos. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo
eppendorf de 1,50 ml e adicionar um volume de isopropanol e 0,50 volume
de Acetato de Amônio 7,50 M e, novamente, centrifugar a 12.000 giros por
10 minutos. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet
com 500 µL de Etanol 70% refrigerado (para eliminar possíveis impurezas
presentes na amostra), homogeneizar por inversão e centrifugar a 12.000
giros por 5 minutos. Logo, descartar o sobrenadante e secar o pellet em
temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos, para então
ressuspender o DNA em 50 µL de TE [1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl] e manter
sob congelamento (-18ºC).
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
A amplificação do DNA extraído foi realizada inicialmente com

a PCR gradiente, seguindo a reação de PCR descrita por Kesmen, Sahin
e Yetim (2007), com adaptações. A PCR gradiente tem por objetivo
padronizar a temperatura de hibridização ideal para cada oligonucleotídeo
iniciador. Esta tem a mesma sequência de ciclos que a PCR normal, sendo
que na fase de hibridização ocorre uma distribuição de temperaturas
pelo bloco do termociclador, baseadas na temperatura média dos
pares de oligonucleotídeos iniciadores (determinada pelo fabricante). A
determinação dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste estudo
foi baseada em aspectos encontrados nos trabalhos de Kesmen, Sahin
e Yetim (2007) e Mane, Mendiratta e Tiwari (2009), assim como, a reação
(concentração de reagentes) e a programação da PCR. Os primers podem
ser visualizados no Quadro 2, assim como suas principais características.
131
Tamanho do
Espécie Sequência 5’-3’ Referência
fragmento
F – CATTCGCCTCACTCACATTAACC Kesmen, Sahin e
Suíno 227 pb
R – AAGAGAGAGTTCTACGGTCTGTAG Yetim (2007)
F – CTCGCCCTACTTGCCTTCC Mane, Mendiratta e

Frango 422 pb
R – TAGGACGCAACGCAGGTGT Tiwari (2009)
Quadro 2 – Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores da espécie suína e aviária

A mistura da reação de PCR foi preparada em um microtubo tipo

eppendorf de 500 µl, tento um volume total de 25 µl, contendo: 1X PCR
buffer (Invitrogen®), 200 µM de cada dNTP (Fermentae®), 3,00 mM de MgCl2
(Invitrogen®), 0,3 µM de cada iniciador (IDT®), 2,50 unidades de taq DNA
polimerase (Invitrogen®), 1µg do DNA-alvo e o restante de água ultrapura
Mili-Q. As condições de PCR programadas no termociclador (Therm-1000
/ Maxygene Versão nº 1.4) seguem 35 ciclos, com: desnaturação inicial do
DNA a 94ºC durante 3 minutos, desnaturação do DNA a 94ºC durante 50
segundos, hibridização dos iniciadores com temperatura entre 62 a 72ºC
por 30 segundos (para ambas as espécies estudadas), extensão a 72ºC
por 1 minuto, extensão final a 72ºC por 10 minutos e 15ºC até retirada das
amostras do equipamento (KESMEN; SAHIN; YETIM, 2007).
Determinada a temperatura de hibridização ideal para cada
iniciador, seguiu-se para a validação da metodologia, ou seja, foi avaliada a
especificidade de cada primer em estudo. Ressalta-se que, durante as análises,
foram realizados ajustes na metodologia, para melhorar as condições de
amplificação, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.
VISUALIZAÇÃO DOS RESULTADOS
Tanto a verificação da qualidade do DNA extraído quanto a

visualização dos resultados da PCR foram realizadas através do sistema
de eletroforese em cuba horizontal com gel de Agarose 1,50% e tampão
de corrida TBE 1X. O gel foi submetido a uma corrente elétrica de 80 Volts
por 30 minutos (etapa de extração do DNA) e de 110 Volts por 75 minutos
(etapa de amplificação do DNA).
132
Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de 200 ml de TBE 1X
e 40 µL de Brometo de Etídio (1μg/ml) durante 15 minutos, para, então, os
resultados serem ponderados por um transiluminador de luz ultravioleta
(UV), onde a imagem digital foi captada pelo sistema digital L.Pix Image
HE e analisada pelo software Loccus Biotecnologia. Os resultados foram
analisados ante a presença ou não da banda de DNA. Na observação do
produto da PCR, as bandas foram comparadas com um padrão de massa
molar de 100 pares de base (pb).
RESULTADOS
Métodos precisos, autênticos e rápidos para a identificação dos
constituintes proteicos em alimentos de origem animal são indispensáveis
para proteger o consumidor contra práticas de adulteração e também evitar a
concorrência desleal no mercado. Os pares de oligonucleotídeos iniciadores
usados nesta pesquisa foram selecionados com base no gene mitocondrial
D-Loop. O uso do DNA mitocondrial é indicado para obter iniciadores mais
específicos, pois o DNA mitocondrial é herdado maternalmente, ou seja,
há somente um alelo no indivíduo, não havendo, portanto, ambiguidade
na sequência. Além disso, as regiões variáveis do DNA mitocondrial estão
presentes em milhares de cópias por célula, aumentando a probabilidade
de obtenção de um resultado positivo, mesmo em caso de fragmentação
do DNA devido às condições extremas durante o processamento, como,
por exemplo, o uso de alta temperatura, característica que o torna ideal
para a identificação de espécies animais em produtos cárneos processados
(MANE; MENDIRATTA; TIWARI, 2009; KESMEN; SAHIN; YETIM, 2007; ARSLAN;
ÍLHAK; CALICIOGLU, 2006).
As amostras de músculos utilizadas como controle positivo resultaram
na temperatura de hibridização de 68ºC para a espécie suína e 67ºC para
a de frango (Quadro 3). Escolheu-se esta temperatura pela complexidade
da matriz alimentícia, uma vez que alimentos como embutidos são
extremamente complexos e apresentam alto teor lipídico, o que dificulta
a extração de um DNA mais limpo, além de conterem contaminantes e
enzimas ativas que podem inibir a reação de PCR.
133
Tamanho Temperatura
Espécie
do de Reação de PCR Programação da PCR
animal
fragmento hibridização
35 ciclos: desnaturação
Suíno 227 pb 68ºC inicial a 94ºC por 3’’,
Volume final de 25µL,
desnaturação do
com: 1X PCR buffer, 200
DNA a 94ºC por 50’,
µM de dNTP, 3,00 mM de
hibridização dos primers
MgCl2, 0,30 µM de cada
por 30’, extensão a 72ºC
primer (IDT®), 2,50U de taq
Frango 422 pb 67ºC por 1’’, extensão final a
DNA polimerase e 1µg do
72ºC por 10’’ e 15ºC até
DNA-alvo
retirada das amostras do
equipamento
Quadro 3 – Resumo dos resultados finais para o oligonucleotídeo iniciador da espécie suína e de frango
O ensaio de PCR foi avaliado quanto ao seu limite de detecção na

amplificação do DNA extraído a partir de carne de frango intencionalmente
adulterada com carne suína e gordura suína. Além de testar sua eficácia
com diferentes tratamentos térmicos (carne crua, cozida e autoclavada), a
metodologia foi eficiente para amplificar os fragmentos em 442 pb do DNA
extraído da espécie de frango (Figura 1).
Figura 1 – Resultado do teste de sensibilidade para o iniciador da espécie de frango

Nota: M: marcador; CN: controle negativo; 1 ao 6: amostras de carne de frango crua com 0%, 0,01%,
0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; 7 ao 12: amostras de carne de frango cozida sob pressão com 0%,
0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; 13 ao 18: amostras de carne de frango cozida a pressão
atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; F: controle positivo.
Quanto aos diferentes tratamentos térmicos, nenhum efeito

adverso foi observado, pois ocorreu amplificação em todas as amostras
que continham 10% de adulteração com carne suína (227 pb) (Figura 2).
134
Resultado semelhante foi encontrado por Ulca et al. (2013), que avaliaram
a PCR em tempo real, analisando produtos cárneos crus e cozidos durante
20 minutos a 200°C, obtendo amplificação em 0,10% de carne suína
independentemente do processamento utilizado.
Figura 2 – Resultado do teste de sensibilidade para o iniciador da espécie suína

0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; 7 ao 12: amostras de carne de frango cozida sob pressão com 0%,
0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; 13 ao 18: amostras de carne de frango cozida a pressão
atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne suína; S: controle positivo.
Por seu turno, ao analisar o limite de detecção na adulteração da

carne de frango com gordura suína, a metodologia mostrou alto grau de
sensibilidade, uma vez que houve amplificação a partir da concentração de
0,10% nas amostras cruas e, nas amostras com tratamento térmico, obteve
banda em 5 e 10%, mesmo após sofrer processo de esterilização a 121ºC
por 10 minutos (Figuras 3 e 4). Como mencionado anteriormente, este
resultado pode decorrer do grande número de cópias de DNA mitocondrial
no tecido, contribuindo para a sobrevivência de um número suficiente de
cópias de DNA, e ainda a estabilidade ao calor, mesmo quando submetido
a condições extremas (MANE; MENDIRATTA; TIWARI, 2009).
A substituição de uma espécie animal por outra economicamente
mais barata ou, ainda, a rotulagem não condizente com o padrão de
identidade do produto pode afetar milhares de consumidores que confiam
na qualidade e transparência do produto. Estas fraudes vêm tomando
proporções exorbitantes por não serem facilmente mensuráveis, o que
acarretou no aumento de pesquisas com o intuito de, cada vez mais,
aprimorar metodologias capazes de identificar os constituintes cárneos de
um produto processado.
135
0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; 25 ao 30: amostras de carne de frango cozida sob pressão com
0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; 13 ao 18: amostras de carne de frango cozida a
pressão atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; F: controle positivo.

0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; 25 ao 30: amostras de carne de frango cozida sob pressão com
0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; 13 ao 18: amostras de carne de frango cozida a
pressão atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura suína; S: controle positivo.
Neste contexto, a utilização do DNA mitocondrial e os

oligonucleotídeos iniciadores usados nesta etapa da pesquisa foram
satisfatórios, pois resultaram num limiar de detecção de 0,10%, o que
atesta a alta sensibilidade da metodologia (Figura 4). Kesmen, Sahin e Yetim
(2007) também utilizaram com sucesso o ensaio de PCR para identificação
das espécies animais presentes em salsichas de frango cozidas. Quanto
à sensibilidade do ensaio, a amplificação foi detectada em misturas com
menos de 1% de adulteração, sem quaisquer comentários adversos às
condições de processamento (calor) e ingredientes utilizados para a
preparação de salsichas. O ensaio de PCR também foi analisado quanto ao
136
seu limite de detecção na amplificação do DNA extraído a partir de carne
suína intencionalmente adulterada com carne (Figura 5) e gordura de
frango (Figura 6).

Nota: M: marcador; CN: controle negativo; 37 ao 42: amostras de carne suína crua com 0%, 0,01%,
0,10%, 1%, 5% e 10% de carne de frango; 43 ao 48: amostras de carne suína cozida sob pressão com
0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne de frango; 49 ao 54: amostras de carne suína cozida a
pressão atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de carne de frango; F: controle positivo.

Nota: M: marcador; CN: controle negativo; 55 ao 60: amostras de carne suína crua com 0%, 0,01%,
0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura de frango; 61 ao 66: amostras de carne suína cozida sob pressão com
0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura de frango; 67 ao 72: amostras de carne suína cozida a
pressão atm com 0%, 0,01%, 0,10%, 1%, 5% e 10% de gordura de frango; S: controle positivo.
A amplificação apenas na amostra de maior concentração de

adulteração (10%) e no tratamento térmico mais brando (cozimento em
banho-maria até 72ºC) pode ser resultado da dificuldade de extrair o
DNA observado no estudo. Alimentos com alto teor lipídico dificultam a
extração de um DNA mais limpo, além disso, podem conter contaminantes
e enzimas ativas (inibem a reação) e, assim, comprometer os resultados
137
quando comparados à utilização de matéria-prima simples (RODRIGUES,
2013). Na Tabela 2 estão ilustrados os resultados obtidos nos testes de
sensibilidade realizados para ambos os oligonucleotídeos iniciadores.
Tabela 2 – Resultado do teste de sensibilidade da técnica PCR em diferentes concentrações e

tratamentos térmicos
(continua)
100% carne suína 100% carne de frango
Gordura suína Carne de frango Gordura de frango

Carne suína (%)
(%) (%) (%)
1 0 ND* 19 0 ND 37 0 ND 55 0 ND
2 0,01 ND 20 0,01 ND 38 0,01 ND 56 0,01 ND
3 0,10 ND 21 0,10 D 39 0,10 ND 57 0,10 ND

Crua
4 1 ND 22 1 D 40 1 ND 58 1 ND
5 5 D** 23 5 D 41 5 D 59 5 ND
6 10 D 24 10 D 42 10 D 60 10 ND
7 0 ND 25 0 ND 43 0 ND 61 0 ND
8 0,01 ND 26 0,01 ND 44 0,01 ND 62 0,01 ND
9 0,10 ND 27 0,10 ND 45 0,10 ND 63 0,10 ND

Sob pressão
10 1 ND 28 1 ND 46 1 ND 64 1 ND
11 5 ND 29 5 D 47 5 D 65 5 ND
12 10 D 30 10 D 48 10 D 66 10 ND
138
Tabela 2 – Resultado do teste de sensibilidade da técnica PCR em diferentes concentrações e
tratamentos térmicos
(conclusão)
100% carne suína 100% carne de frango
Gordura suína Carne de frango Gordura de frango

Carne suína (%)
(%) (%) (%)
13 0 ND 31 0 ND 49 0 ND 67 0 ND
14 0,01 ND 32 0,01 ND 50 0,01 ND 68 0,01 ND
15 0,10 ND 33 0,10 ND 51 0,10 ND 69 0,10 ND

Pressão ATM
16 1 ND 34 1 ND 52 1 ND 70 1 ND
17 5 ND 35 5 D 53 5 D 71 5 ND
18 10 D 36 10 D 54 10 D 72 10 D

Nota: *ND: Não Detectado; **D: Detectado.
Por fim, a metodologia PCR foi empregada com sucesso para a detecção
da adulteração em produtos de carne suína e de frango, apresentando
sensibilidade semelhante aos testes realizados por Arslan, Ílhak e Calicioglu
(2006), Che Man (2007) e Haunshi et al. (2009). Estes resultados evidenciam que
a PCR é uma técnica sensível, específica, rápida e capaz de detectar adulteração
em produtos cárneos submetidos a diferentes tratamentos térmicos.
O teste de sensibilidade da técnica trouxe como resultado a
capacidade de detecção da PCR trabalhada, ou seja, quanto maior o limiar
de detecção, mais sensível e eficaz será o método, além de responder a
questões como a interferência de calor (processamento) na metodologia.
139
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(Tecnólogo em Tecnologia em Alimentos) – Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, Bento Gonçalves, 2011.
142
SOBRE AS ORGANIZADORAS
143
144
Alcione Lino de Araújo
Professora do Instituto Federal do Maranhão (IFMA) – Câmpus Santa
Inês. Graduada em Administração pela Universidade Estadual da Paraíba
(UEPB). Mestre e Doutora em Engenharia de Produção pela Universidade
Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Atua nas
linhas de pesquisa: Desenvolvimento rural, Agricultura familiar e Gênero.
Membro do Grupo de Pesquisa Gestão da Inovação Agroindustrial.
Renata Louize Samulak Marinho

Graduada em Engenharia de Alimentos pela Universidade Estadual de
Ponta Grossa (UEPG). Mestre em Engenharia de Produção pela Universidade
Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Membro
do Grupo de Pesquisa Gestão da Inovação Agroindustrial.

Professora da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Câm-
pus Ponta Grossa. Graduada em Engenharia Agronômica pela Universidade
Estadual de Ponta Grossa (UEPG). Mestre em Agronomia pela Universidade
Federal do Paraná (UFPR). Doutora em Genética Molecular pela University of
Reading. Atua nas linhas de pesquisa: Estratégias de conservação, Caracter-
ização da biodiversidade molecular, Recursos genéticos, Marcadores molecu-
lares, Biotecnologia, Desenvolvimento rural e Bioprocesso. Coordenadora do
Grupo de Pesquisa Gestão da Inovação Agroindustrial.
145
146
SOBRE OS AUTORES
147
148
Amanda Rocha Pietrochinski
Graduada em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Tecnológica
Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Atua na linha de
pesquisa: Biotecnologia molecular. Membro do Grupo de Pesquisa Gestão de
Inovação Agroindustrial (GIA) na UTFPR.
Andiara Gonçalves Tenório

Graduada em Tecnologia de Alimentos e Mestre em Zootecnica pela
Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta
Grossa. Atua na linha de pesquisa: Ciências agrárias. Membro do Grupo de
Pesquisa Gestão de Inovação Agroindustrial (GIA) na UTFPR.
Francielli Casanova Monteiro

Graduada em Tecnologia de Alimentos e Mestre em Engenharia de Produção
pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta
Grossa. Doutoranda em Química pela Universidade Estadual de Ponta
Grossa (UEPG). Atua na linha de pesquisa: Biotecnologia molecular. Membro
do Grupo de Pesquisa Gestão de Inovação Agroindustrial (GIA) na UTFPR.
Gabriela Sartori Felkl

Grossa. Atua na linha de pesquisa: Biotecnologia molecular. Membro do
Grupo de Pesquisa Gestão de Inovação Agroindustrial (GIA) na UTFPR.

Graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM). Mestre e Doutoranda em Microbiologia, Parasitologia e Patologia
pela Universidade Federal do Paraná (UFPR). Atua nas linhas de pesquisa:
Isolamento, identificação, taxonomia e caracterização molecular de fungos
de interesse clínico e ambiental, Microbiologia e Biotecnologia molecular.
Membro do Grupo de Pesquisa LabMicro na UFPR.
149
Jullie Angel Ruths
Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Atua na linha de
Larissa Aparecida de Castro

Graduanda em Química pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná
(UTFPR). Atua na linha de pesquisa: Biotecnologia molecular. Membro do

Graduado em Engenharia Florestal pela Universidade Federal do Paraná
(UFPR). Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas pela Escola
de Agronomia da Universidade Federal de Goiás (UFGO). Doutor em
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia pela UFPR. Atua na linha de

Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Mestre em
Microbiologia, Parasitologia e Patologia pela Universidade Federal do
Paraná (UFPR). Doutora em Microbiologia, Parasitologia e Patologia pela
UFPR, com doutorado sanduíche no CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre
e no Institut de Recerca I Tecnologia Agroalimentaries. Atua nas linhas de
pesquisa: Isolamento, identificação, taxonomia e caracterização molecular
de fungos de interesse clínico e ambiental, Microbiologia e Biotecnologia
molecular. Membro do Grupo de Pesquisa LabMicro na UFPR.
150
Professora substituta na Universidade Federal da Fronteira Sul (UFSS).
Grossa. Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade
de São Paulo (USP) com doutorado sanduíche na Cornell University. Atua
nas linhas de pesquisa: Microbiologia de alimentos, Análises moleculares e
Qualidade de leite e derivados. Membro do Grupo de Pesquisa Gestão de
Nathalie Hamine Panzarini

Federal do Paraná (UTFPR) – Câmpus Ponta Grossa. Mestre e Doutoranda
em Engenharia de Produção pela UTFPR. Atua na linha de pesquisa:
Biotecnologia molecular. Membro do Grupo de Pesquisa Sustentabilidade
em Sistemas Produtivos (LESP) na UTFPR.
Sabrina Ávila Rodrigues

Professora da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) –
Câmpus Ponta Grossa. Graduada em Química de Alimentos, Mestre e
Doutora em Ciência e Tecnologia Agroindustrial pela Universidade Federal
de Pelotas (UFPE). Atua na linha de pesquisa: Biossegurança. Membro do

Professora da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Docente do Programa
de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
(PPGEBB) e do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia
e Patologia (PPGMPP) da UFPR. Graduada em Ciências Biológicas
pela Universidade Estadual de Londrina (UEL). Mestre e Doutora em
Microbiologia Agrícola pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutora
em Taxonomia Molecular de Fungos no Instituto CBS (Centraal Bureauvoor
Schimmelcultures – Funga l Biodiversity Centre). Atua na linha de pesquisa:
151
Feohifomicose, cromoblastomicose e caracterização molecular de micro-
organismos de interesse clínico e biotecnológico. Coordenadora do Grupo
de Pesquisa LabMicro na UFPR.
152
153
Formato 16 x 23 cm
Tipografia Myriad Pro
Editora filiada a
154

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GESTÃO DA

Reitor Luiz Alberto Pilatti

Coordenadora-Geral Camila Lopes Ferreira

Curitiba | EDUTFPR | 2017

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

G393g Gestão da inovação agroindustrial : diagnóstico molecular [Recurso eletrônico]

ISBN: 978-85-7014-200-9 (E-book)

1. Biotecnologia. 2. Agroindústria. 3. Inovações tecnológicas. 4. Diagnóstico

Bibliotecária: Rosana da Silva CRB: 9/1745

Coordenação Editorial Camila Lopes Ferreira

11 REAÇÃO DE POLIMERASE (PCR) EM CADEIA

23 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ORGANISMOS GENETICAMENTE

43 BIOPROSPECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS APLICADA À

67 DIAGNÓSTICO MOLECULAR VIA PCR E A INOVAÇÃO TECNÓLOGICA NA

83 APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR NA INDÚSTRIA

99 SEQUENCIAMENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO E TAXONOMIA

123 SENSIBILIDADE DA PCR EM DERIVADOS DE ORIGEM ANIMAL

143 SOBRE AS ORGANIZADORAS

Figura 1 – Representação das etapas de amplificação da sonda cadeado em associação RT-PCR

Figura 1 – Apresentação gráfica a ser impressa no rótulo de alimentos transgênicos

Em 2007, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) abriu a

PRINCIPAIS DADOS DOS LABORATÓRIOS QUE REALIZAM ANÁLISE

Quadro 1 – Nome, localização e contato dos laboratórios de análise de OGMs em alimentos no

Conforme mostrado no Quadro 1, 62,50% dos laboratórios estão

PRINCIPAIS TECNOLOGIAS UTILIZADAS PARA ANÁLISE DE OGMs

Baseado na proteína Baseado no DNA

O Quadro 3 apresenta as principais técnicas utilizadas, determinação

Observa-se que a PCR é o método mais usado pelos laboratórios

Ambientes que não foram explorados pelo homem apresentam

BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR: METAGENÔMICA

A partir das análises de metagenômica, tem sido possível correlacionar

Figura 3 – Esquema simplificado da ação dos micro-organismos em processos de remediação

Além disso, a biodisponibilidade do poluente é outro fator que deve

Figura 4 – Macro e micromorfologia das leveduras negras

Figura 5 – Resumo geral da biorremediação

IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

TÉCNICAS FUNDAMENTADAS EM PCR

Muitas abordagens experimentais requerem a análise de várias

REAL TIME PCR

Um importante avanço da PCR foi o desenvolvimento de uma

Na microbiologia, a principal desvantagem da utilização da PCR

NESTED E SEMI-NESTED PCR

Nested-PCR é utilizada devido à sua maior sensibilidade e

DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS EM ALIMENTOS

A RT-PCR em tempo real merece destaque, pois pode ser empregada

Para a detecção de fraudes em alimentos, a PCR apresenta grande

São conhecidas algumas técnicas para a determinação da autenti-

SUBSTITUIÇÃO DE ANÁLISES DE MICROBIOLOGIA TRADICIONAL

Figura 1 – A: Desoxinucleotídeos (dNTPs): presença do grupo hidroxila no carbono 3’;

A primeira máquina de sequenciamento automático (AB370) foi

Ainda dentro das tecnologias de segunda geração, foi desenvolvida

Animal Comestível Restrições ao consumo

Inseto América Latina, Ásia, África Parte da Europa e América do Norte

Europa, América do Norte e América

Cavalo França, Bélgica, Japão Grã-Bretanha, América do Norte

Coelho França, Itália Grã-Bretanha, América do Norte

Rã França, Ásia Europa, América do Norte

América Latina, América do Norte,

América Latina, América do Norte,

América Latina, América do Norte,

Quadro 1 – Consumo de espécie animal segundo a cultura dos países

AMOSTRAS PARA A UTILIZAÇÃO DE CONTROLE E TESTE DE SENSIBILIDADE

As amostras de controle foram as de músculo para as espécies suína

100% carne de frango 100% carne suína