FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ENGENHARIA BIOQUÍMICA
PROF. DR. JORGE ALBERTO VIEIRA COSTA

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

ELIANE COLLA – 25612

GLÊNIO MAGAGNIN – 25616
LUCIELEN OLIVEIRA – 25627
MAURÍCIO VENDRUSCOLO – 25630

RIO GRANDE – RS
NOVEMBRO – 2000
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SUMÁRIO
1 Introdução.......................................................................................................... 5
2 Objetivos............................................................................................................ 6
3 Revisão Bibliográfica.........................................................................................6
3.1 Matérias Primas da Fermentação Alcoólica................................................6
3.2 Agentes da Fermentação Alcoólica............................................................7
3.3 Preparo do Inóculo.....................................................................................9
3.4 Preparo e ajuste do mosto- Estequiometria do processo..........................11
3.4.1 Teor de açúcares fermentáveis............................................................11
3.4.2 Acidez e pH do mosto..........................................................................13
3.4.3 Temperatura.........................................................................................13
3.4.4 Nutrientes.............................................................................................13
3.5 Adição de Antissépticos e Esterilização....................................................14
3.6 Cinética de Fermentação Alcoólica..........................................................15
3.7 Condução da Fermentação Alcoólica.......................................................16
3.7.1 Processo Descontínuo.........................................................................16
3.8 Acidentes na fermentação alcoólica.........................................................17
3.9 Controle da fermentação..........................................................................18
3.10 Subprodutos da Fermentação Alcoólica...................................................19
4 Metodologia.....................................................................................................20
4.1 Composição do Substrato........................................................................20
4.2 Microrganismo e Concentração de Inóculo...............................................20
4.3 Sistema de Fermentação..........................................................................20
4.4 Acompanhamento da Fermentação..........................................................21
4.4.1 Controle de pH.....................................................................................21
4.4.2 Concentração de Biomassa..................................................................21
4.4.3 Concentração de Açúcares no meio.....................................................22
4.4.4 Concentração e perfil de álcoois..........................................................23
5 Resultados.......................................................................................................24
5.1 Curva Padrão de Glicose..........................................................................24
5.2 Curva Padrão de Biomassa......................................................................25
5.3 Acompanhamento da Fermentação..........................................................27
5.4 Determinação das Velocidades Específicas e Fatores de Conversão......36
6 Discussão........................................................................................................41
7 Conclusão........................................................................................................43
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8 Bibliografia.......................................................................................................44

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - RELAÇÕES ESTEQUIOMÉTRICAS E RENDIMENTO TEÓRICO DE ETANOL...............................12

TABELA 2- PROCEDIMENTO PARA OBTENÇÃO DA CURVA PADRÃO DE GLICOSE...................................22
TABELA 3: RESULTADOS PARA A CURVA PADRÃO DE GLICOSE............................................................24
TABELA 4: RESULTADOS PARA CURVA PADRÃO DE BIOMASSA............................................................25
TABELA 5- RESULTADOS PARA O FERMENTADOR 1 – INÓCULO FLEISHMAN........................................27
TABELA 6- RESULTADOS PARA O FERMENTADOR 2 – INÓCULO SAFT-INSTANT...................................29
TABELA 7- RESULTADOS PARA O FERMENTADOR 3 – INÓCULO FERMIX..............................................30
TABELA 8- RESULTADOS PARA O FERMENTADOR 4 – INÓCULO UVA FERM.........................................32
TABELA 9 - VELOCIDADES INSTANTÂNEAS E ESPECÍFICAS PARA O FERMENTADOR 1...........................36
TABELA 10 - VELOCIDADES INSTANTÂNEAS E ESPECÍFICAS PARA O FERMENTADOR 2.........................37
TABELA 11 - VELOCIDADES INSTANTÂNEAS E ESPECÍFICAS PARA O FERMENTADOR 3.........................37
TABELA 12 - VELOCIDADES INSTANTÂNEAS E ESPECÍFICAS PARA O FERMENTADOR 4.........................38
Tabela 13 - Fatores de conversão de Substrato em Célula, em g CÉLULA/gSUBSTRATO para as quatro
fermentações em função do tempo (h)..........................................................................................40
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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- CINÉTICA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA ................................................ 15

FIGURA 2: CURVA PADRÃO DE GLICOSE.............................................................................................25
FIGURA 3: CURVA PADRÃO DE BIOMASSA..........................................................................................26
FIGURA 4: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 1......................................................28
FIGURA 5 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO
TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 1.............................................................................................28
FIGURA 6: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 2......................................................29
FIGURA 7 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO
TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 2.............................................................................................30
FIGURA 8: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 3......................................................31
FIGURA 9 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO
TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 3.............................................................................................31
FIGURA 10: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 4....................................................32
FIGURA 11 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO
TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 4.............................................................................................33
FIGURA 12 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO CELULAR (G/L) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4
FERMENTADORES..........................................................................................................................34

FIGURA 13 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO (G/L) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4

FERMENTADORES..........................................................................................................................34

FIGURA 14 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES (ºB) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4

FERMENTADORES..........................................................................................................................35

FIGURA 15 – VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CRESCIMENTO CELULAR (H-1) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H)

PARA OS QUATRO FERMENTADORES..............................................................................................38

Figura 16 – Velocidades específicas de consumo de substrato (g SUBSTRATO/gCÉLULA) em função do tempo

(h) para os quatro fermentadores..................................................................................................39
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1 INTRODUÇÃO

A obtenção do etanol por via fermentativa sempre acompanhou a produção de

açúcar no Brasil, denominando-se as usinas, que se dedicam à produção de ambos, usinas
ou destilarias anexas, eis que nela a matéria-prima submetida à fermentação é o melaço,
subproduto da fabricação do açúcar.
A importância do etanol não reside somente no seu uso como combustível líquido,
uso que, em termos econômicos, interdepende do preço dos combustíveis derivados do
petróleo no mercado nacional e mundial, onde também se relaciona fortemente à economia
açucareira, que é de abrangência agroindustrial; também não reside apenas no seu uso
como bebidas alcoólicas, mas também no seu uso como produto básico da indústria
química, pois é a partir do etanol que se abre todo um leque de insumos químicos, cuja
produção é integrante do que se conhece como alcoolquímica.
A fermentação alcoólica é a via mais importante para a obtenção do álcool etílico,
principalmente devido ao grande número de matérias primas naturais existentes em todo o
país.
Na obtenção do álcool por via fermentativa distinguem-se três fases distintas: o
preparo do substrato, a fermentação e a destilação. O preparo do substrato é o tratamento
da matéria prima para dela se extraírem os açúcares fermentescíveis. Difere para as
distintas matérias primas. A fermentação é o processo comum a todos os substratos, cujo
princípio é a transformação dos açúcares em etanol e dióxido de carbono. Na destilação,
recupera-se o etanol, geralmente em duas operações. Uma para separar do substrato
fermentado, uma mistura hidroalcoólica impurificada com aldeídos, ésteres, álcoois
superiores, ácidos orgânicos e outra para separar as impurezas do etanol.
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2 OBJETIVOS

Através da aula prática realizada buscou-se atingir os seguintes objetivos:

- Verificar a influência da utilização de diferentes inóculos da levedura
Saccharomyces cerevisiae sobre a fermentação alcoólica, no que se refere à sua
influência sobre a concentração de biomassa e álcoois formados.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 MATÉRIAS PRIMAS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

As matérias primas mais importantes que são utilizadas no Brasil, por serem
diretamente fermentáveis, são o melaço e o caldo de cana-de-açúcar, sendo ambas
sacarídicas.
Dependendo da maturação e da variedade da cana, esta fornece em média 70-75%
de caldo, diretamente fermentável ou industrializável para açúcar.
O teor em açúcares do caldo costuma ser controlado no Brasil, pela medida do
ºBrix, em cuja escala, cada grau representa g de Sacarose por 100g de solução ou caldo,
indicando, portanto, % peso/peso. Entretanto, pela presença de outros sólidos que não os
açúcares, a leitura fornece o teor de sólidos totais, muito aproximado, embora, ao teor de
açúcares fermentáveis.
No Brasil, a cana é considerada madura quando o caldo tem as seguintes
características: Brix mínimo de 18º (expressa em sólidos totais ou matéria seca, %),
polarização de 15,3% (sacarose aparente), açúcares redutores máximo de 1% (glicose e
frutose, ou seja, açúcar invertido), pureza de 85% (relação sacarose, da polarização: sólidos
totais ou ºBrix).
A cana-de-açúcar cortada preferencialmente a não mais de 48 a 72 horas, chega à
usina, onde é pesada, lavada e encaminhada às moendas, para extração do caldo. A
moagem é auxiliada por embebição de água, o que favorece a extração, não devendo a
água ultrapassar a diluição que se pretende dar ao caldo de cana para a fermentação
alcoólica posterior, quando deve situar-se entre 12 e 18ºBrix.
O caldo obtido é filtrado ou peneirado por peneiras vibratórias, separando-se o
bagacilho, o qual pode ser retornado às moendas e dali às caldeiras, onde é queimado
juntamente com o bagaço sobre grelhas especiais, dado o seu teor de umidade (50%).
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Nas usinas mais modernas, o caldo reunido de todas moendas é bombeado para
um sistema de aquecimento em contracorrente, elevando-se a sua temperatura até 105ºC,
com a finalidade de clarificá-lo, pela precipitação de proteínas, de natureza coloidal, que
formariam espuma durante a fermentação, obrigando a baixar o volume útil das dornas. O
pH da cana madura se situa entre 5,2 e 5,8, inferior ao ponto isoelétrico das citadas
proteínas. Por isso, eleva-se o pH para cerca de 6,5 por adição de leite de cal, decantando-
se o precipitado, por repouso. A separação se faz por filtração a vácuo.
O caldo também pode ser concentrado até um xarope de cana, com 70 a 75% de
açúcar fermentável, em evaporadores de três estágios, sob vácuo, podendo assim ser
estocado para uso na entre-safra. Além de possuírem maior concentração de açúcares
fermentáveis, os xaropes têm a vantagem de terem menos sólidos não fermentáveis do que
os melaços.
O melaço é o subproduto da fabricação do açúcar, sendo um xarope consistente e
grosso, de cor pardo-negra, decorrente da caramelização por efeito da temperatura de
cozimento e concentração do caldo de cana. É resultante da centrifugação dos cristais de
açúcar provenientes dos cristalizadores, sendo o resíduo não cristalizável dos mesmos.
Para usá-lo na fermentação alcoólica, basta promover sua diluição ao grau
apropriado, a qual pode ser feita com o vinhaço (resíduo da destilação) de partida anterior,
podendo o mosto comportar de 30 a 70% de vinhaço. Este fornece os nutrientes
necessários às leveduras, agentes da fermentação.
Outra matéria prima sacarídica com potencial no Brasil e que também é
diretamente fermentável é o caldo de variedades de sorgo, cujo cultivo visa à sacarose e
não ao grão. Trata-se de sorgos chamados sacaríneos, ou sorgos doces.

3.2 AGENTES DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Apesar de as leveduras serem os únicos microrganismos usados na fermentação

alcoólica industrial, bactérias têm sido investigadas, seja porque algumas podem fermentar
as pentoses, além da sacarose, seja porque também são boas produtoras de álcool, como é
o caso da bactéria Zymomonas mobilis.
As leveduras são microrganismos unicelulares, imóveis e a absoluta maioria se
caracteriza por uma mesma forma de reprodução vegetativa, assexuada, conhecida por
gemulação ou brotação. Esta reprodução se dá em algum momento do seu ciclo vital,
quando a célula apresenta uma protuberância, a qual vai se alongando e aumentando, com
migração de material constituinte celular para a mesma, destacando-se o alongamento sob
forma de novo indivíduo.
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Em condições ótimas, uma levedura pode originar uma célula filha após 45 minutos,
contudo, o tempo é, em geral, de 90 a 120 minutos.
Para a fermentação alcoólica, as espécies de maior interesse industrial são
Saccharomyces cerevisiae, S.pombae e S.fragilis, usadas na produção do álcool e de
bebidas alcoólicas em geral: S.ellipsoideus, usadas na produção de vinhos e S.uvarum e
S.cerevisiae, na produção de cervejas.
Designam-se como Leveduras Cultivadas aquelas que têm maior poder
fermentativo, o qual foi adquirido através de inúmeras mutações ou por hibridação por
mutações induzidas ou por engenharia genética. As leveduras cultivadas fermentam muito
bem as hexoses, D-glicose, D-frutose e D-manose. Depois de alguma adaptação, também
fermentam a D-galactose. Todas dispõe de invertase, e por isso fermentam a sacarose.
Quanto à fisiologia, as leveduras utilizam o carbono, preferentemente o dos
carboidratos, mas também o de ácidos orgânicos, de álcoois e de aminoácidos; o nitrogênio,
preferentemente de sais amoniacais, mas também o de aminoácidos, peptonas e peptídeos
de baixo peso molecular. Apenas alguns elementos inorgânicos devem ser supridos às
células, para crescimento apropriado: P, K, Mg, Na, S, Fe, Cu e Zn, os últimos três como
elementos-traço.
As leveduras são mesófilas, crescendo e metabolizando bem entre 28 e 38ºC. A
temperatura letal se encontra em torno de 50-60ºC para a maioria das leveduras
esporógenas. Leveduras prensadas, com 25% de água, podem tolerar secagem ao ar
quente entre 35-40ºC, até atingir 10 a 12% de água. As temperaturas baixas são bem
toleradas pelas leveduras.
A tolerância ao álcool está limitada a um máximo de 110g ou 137mL por litro de
mosto.
Quanto ao pH, as leveduras apresentam uma faixa larga de otimização, entre 4-6.
O limite inferior é mais baixo do que aquele de bactérias típicas, o que muitas vezes limita a
concorrência pelo substrato.
As leveduras sintetizam suas vitaminas, pelo que se prescinde delas no meio de
cultivo. Suas células são ricas em vitaminas do complexo B.
Em relação ao oxigênio, são anaeróbias facultativas, quando fermentam
carboidratos. Pela aeração, contudo, seu metabolismo é oxidativo e elas consomem o
açúcar para se reproduzir intensamente, não formando álcool. É chamado Efeito Pasteur: as
células realizam o processo de respiração e não o de fermentação.
Bioquimicamente, se explica o efeito Pasteur como o resultado de maior
disponibilidade de oxigênio e ativação das enzimas oxidases, passando a glicólise à fase
aeróbia (Ciclo de Krebs), com maior liberação de energia, sob a forma de ATP, do que na
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fase anaeróbia. Isto possibilita crescimento e reprodução celular, não havendo acúmulo de
ácido lático ou álcool.
A reprodução celular em condições aeróbias, depende no entanto, da
disponibilidade de glicose. Em concentração acima de 3,0%, a glicose atua como repressora
da síntese das enzimas respiratórias, havendo crescente atividade fermentativa, uma vez
que o oxigênio é consumido muito lentamente, até que a glicose tenha sido utilizada. Isto foi
chamado de contra efeito Pasteur, e é tido atualmente como um caso de repressão
catabólica/enzimática. A glicose, cuja oxidação fornece energia para a reprodução celular,
se existente em maior concentração, comanda a paralisação da síntese de enzimas
respiratórias e, com ela, a do consumo de oxigênio.
O aumento da concentração de glicose conduz à maior velocidade específica de
crescimento celular, mas reduz o rendimento em células; contrariamente ao que ocorre com
o aumento do fornecimento de oxigênio, justamente devido à formação de álcool, pelo
contra efeito Pasteur.
Na prática industrial das cervejarias e destilarias de bebidas alcoólicas, distinguem-
se dois tipos de leveduras, em decorrência da predominância de seu metabolismo em
relação ao oxigênio: as leveduras altas, as quais sobem à superfície, lá permanecendo em
forma de camada ou película uniforme, em formato de anel, preso às paredes do recipiente
e as leveduras baixas, que se desenvolvem no fundo e lá processam a transformação dos
açúcares em álcool. Por ação do CO2, sobem à superfície, sedimentando novamente no
final.

3.3 PREPARO DO INÓCULO

As linhagens de levedura, apropriadas para uma fermentação alcoólica eficiente,

devem responder aos seguintes requisitos ou critérios:
- crescimento rápido e eficiência fermentativa;
- alto rendimento em álcool;
- boa tolerância ao álcool formado e ao açúcar;
- tolerância a pressão osmótica do meio;
- boa tolerância a temperaturas mais altas;
- baixo ótimo de ph durante a fermentação;
- estabilidade genética.

As primeiras três condições possibilitam economia em tempo e no equipamento.

Quanto maior a tolerância ao álcool, tanto mais concentrados podem ser os mostos, o que
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reduz custos de destilação, por economia energética. Se houver resistência à pressão

osmótica, é possível usar mostos com maior teor de compostos que não são açúcares. Há
menor perigo de contaminações em pH baixo, o qual inibe crescimento bacteriano.
Temperaturas mais altas (superiores a 28ºC) durante a fermentação permitem economia no
arrefecimento prévio dos mostos cozidos ou esterilizados.
O atendimento dos requisitos acima faz com que, nas fermentações industriais, se
parta preferencialmente de cultivos puros, de cepas ou linhagens de leveduras
selecionadas, a fim de constituir o inóculo inicial, também conhecido como starter, o qual é
preparado em laboratório, constando de um cultivo puro de células, isoladas, de levedura ou
de seus esporos.
Sendo o volume de mosto a fermentar geralmente muito grande, os fermentadores
ou dornas industriais podem ter a capacidade de até 50000 litros, é preciso escalonar o
inóculo inicial, aumentando-o, até atingir determinado volume, proporcional ao volume do
mosto e contendo um número de células próximo da concentração ótima, constituindo o
inóculo final. Se este possuir uma concentração de células pequena, resultará uma demora
excessiva do início da fermentação, estendendo muito o período de adaptação a levedura,
com perigo de contaminações, além da possível inativação por osmo-repressão.
O volume ideal de inóculo em relação ao volume do mosto e o conseqüente número
ideal de células por mL de mosto, não é o mesmo para diferentes fermentações industriais,
podendo variar desde 0,5% até 50% do volume do mosto ou capacidade útil do fermentador.
Partir de um cultivo selecionado para o preparo do inóculo final da fermentação
consiste no preparo do chamado pé de cuba individual.
O escalonamento do inóculo inicial ou starter compreende duas fases: a de
laboratório e a industrial, conforme o local em que se executa.
Na fase de laboratório, a cultura pura é sucessivamente escalonada para volumes
maiores de mosto esterilizado, na proporção aproximada de 1:5, aumentando-se também, o
teor de açúcar fermentável, a fim de adaptar a levedura a pressões osmóticas crescentes.
Cada fase é incubada durante 12 a 24 horas, na temperatura ótima ara a cepa em uso,
processando-se cada transferência, quando o crescimento está na fase logarítmica.
A fase industrial de preparo do inóculo final se processa na planta e compreende,
geralmente, um ou dois escalonamentos nos chamados aparelhos de cultura pura ou
propagadores. Há também, um estágio final no pré-fermentador, este último localizado
acima das dornas de fermentação.
Na propagação do inóculo, a aeração se faz necessária para haver rápida
multiplicação celular. Injeta-se ar até que os ºBrix se reduzam a zero. Todavia, um inóculo
multiplicado por aeração tem a desvantagem de requerer maior tempo de adaptação às
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condições anaeróbias do fermentador principal, aumentando a duração da fase lag o

preliminar da fermentação.
No pré-fermentador, de tamanho proporcional à dorna de fermentação, prepara-se
o último estágio do inóculo final. Ele perfaz, em geral, 2 a 5% do volume do mosto a
fermentar e deve ter composição e concentração de açúcares fermentáveis similares ao
mosto principal, a fim de que o tempo de adaptação na dorna seja mínimo.
Para expressar corretamente o tamanho de um inóculo, isto é, de sua população
microbiana, costuma-se expressar numericamente a densidade celular no meio. No caso
das leveduras, esta pode ser determinada:
- por contagem de células, expressando-se o resultado em número de células por mL de
meio ou mosto;
- por determinação da massa celular, expressando-se o resultado em g de matéria celular
seca por mL de meio o mosto;
- por medida da densidade ótica ou turbidez do meio ou mosto.

3.4 PREPARO E AJUSTE DO MOSTO- ESTEQUIOMETRIA DO PROCESSO

Quer se trate de mosto amiláceo sacarificado, quer de caldo de cano ou outra

matéria-prima sacarídica, antes de submete-los à a cão das leveduras, os mostos devem
ser ajustados, para fornecer às leveduras um substrato otimizado, que elas possam
transformar rapidamente em álcool.
As exigência das leveduras quanto às condições do mosto podem ser descritas
como segue, dependendo sempre da espécie e até mesmo da linhagem a ser utilizada no
processo.

3.4.1 TEOR DE AÇÚCARES FERMENTÁVEIS

A concentração de açúcares no mosto deve ser tal que origine fermentados com
teores alcoólicos maiores que 8 a 9% em volume. Apenas linhagens selecionadas toleram
concentrações alcoólicas maiores. Além disso , concentrações superiores a 10%, em
volume, acarreta perda de etanol por evaporação, durante a centrifugação do mosto ou na
transferência deste, com a finalidade de encaminha-lo a destilação. Nesta concentração
alcoólica, a reprodução da levedura usada em destilarias cessa, e entra em diauxia a partir
de 11 a 12ºGL.
Para o ajuste dos açúcares fermentáveis no mosto e o cálculo do álcool
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correspondente, parte-se das relações estequiométricas estabelecidas pela equação de

Gay-Lussac. Através destes relações, chega-se aos seguintes dados:

Tabela 1 - Relações estequiométricas e rendimento teórico de etanol

m. Equivalência em Rendimento Rendimento Rendimento
carboidrato glicose Teórico (g) Teórico (mL) Prático (mL)
100g glicose 95,00 51,11 64,31 61,07
100g glicose 105,26 53,80 67,69 64,31
100g glicose 111,11 56,79 71,46 67,88
Fonte: Reguly, 1998

O rendimento de 95% é tomado como referência nos cálculos do rendimento

industrial em álcool, conforme foi demonstrado por Pasteur. No início da fermentação há um
consumo de carboidratos pelas leveduras, com produção de gliceróis e ácido succínico,
durante a sua face de adaptação. Isso sempre ocorre, mesmo que as condições no
fermentador sejam anaeróbicas no início. Em condições aeróbicas, entretanto, não há
formação de álcool, mas apenas de CO2, água e massa celular, além de subprodutos de
carboidratos.
Na prática, são usados os densímetros com escala Brix para avaliar a
concentração de sacarose no mosto. Como estes são graduados em soluções de sacarose
de concentração conhecida, ocorre, em virtude de outros sólidos presentes no mosto, uma
leitura sempre maior; porém a aproximação é muito boa em caldos de cana com menor teor
de sólidos do que, por exemplo, em melaços ou mostos amiláceos sacarificados.
A determinação mais precisa de açúcares fermentáveis é feita através da análise
dos açúcares redutores, empregando-se os seguintes métodos:
a) Volumétricos: Eynon-Lane, com o reativo de Fehling-Soxhlet;
b) Gravimétricos: Munson-Walker;
c) Colorimétricos: são mais rápidos, além de permitirem micro-dosagens;
c1) Somogyi, com o reativo de Somogyi-Nelson;
c2) Método de determinação por ácido di-nitrosalicílico.

Os mostos com baixas concentrações de açúcares, apresentam as seguintes

características:
 tem fermentação mais rápida e mais fácil, pois as leveduras têm um menor
período de adaptação;
 produzem álcool em menor concentração, acarretando em maiores gastos
para destilação;
 acarretam perda de espaço (volume inútil) nas dornas;
 13

 produzem maior volume de resíduos de destilação;

 são mais facilmente contaminados, pelo menor teor alcoólico;

Os mostos com maior concentração produzem:

 fermentações mais demoradas, podendo ser incompletas;
 maiores concentrações de álcool, com menores gastos de destilação;
 apresentam maior rendimento na destilação, menor volume de vinhaça e maior
incrustação nas colunas;
 maior resistência a contaminações;

3.4.2 ACIDEZ E pH DO MOSTO

O pH ótimo de fermentação deve estar em torno de 4,5 e 5,5 sendo, entretanto,

ainda viável entre 4,0 e 6,0. A acidez não deve se elevar e o pH não deve cair muito
durante a fermentação, pois seriam evidências da contaminação por bactérias acéticas e
láticas. Entretanto, o pH normalmente decresce vagarosamente, pela própria presença de
ácidos durante a glicólise anaeróbica, geralmente estacionando entre os valores 4,0 a 4,4.

3.4.3 TEMPERATURA

A faixa de temperatura recomendada para a fermentação alcoólica é de 26 a 35ºC,

podendo ser estabelecida a média em torno dos 30ºC. As leveduras têm uma maior
tolerância ao álcool a baixas temperaturas.

3.4.4 NUTRIENTES

Os mostos devem conter os nutrientes necessários para se obter processos

fermentativos rápidos, homogêneos e com bom rendimento.
O carbono é o nutriente principal e provém de carboidratos fermentáveis. O
nitrogênio é indispensável à síntese protéica e de ácidos nucléicos e deve ser fornecido a
mostos de todas as matérias-primas, como suplemento, podendo ser adicionados nas
formas de NH4Cl, (NH4)2Co3, NH4hco3, além de uréia. O fósforo, contido nas substâncias
celulares responsáveis pelas trocas energéticas, é elemento que deve ser sempre
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suplementado, sob a forma de fosfatos ou como superfosfatos, simples ou triplos. A

absorção do ion fosfato está relacionada com a presença de K1+ no meio.
O enxofre é necessário à síntese do aminoácido metionina. Dos cátions e dos
micronutrientes, tem importância o K, além de Mg, Mn, Na, Fe, Zn, Cu, Bo, e I, elementos
associados aos processos enzimáticos, onde ou fazem parte das conzimas ou funcionam
como ativadores. Vitaminas do complexo B também são importantes para um bom processo
fermentativo.
Em muitos processos fermentativos, se observa a prática da adição de vinhaça,
proveniente da de4stilação de fermentados anteriores. Observou-0se que, principalmente
em melaços, em que a vinhaça pode substituir até 15 a 20% do volume do mosto, que este
se torna bem tamponado contra variações de pH e se enriquece com os nutrientes e fatores
de crescimento liberados pelas leveduras por ocasião da autólise.
Todavia, a constante reciclagem da vinhaça pode causar problemas por acúmulo
de matéria mineral ou de toxinas. A vinhaça adicionada deve ser sempre nova a fim de se
evitar contaminações bacterianas.

3.5 ADIÇÃO DE ANTISSÉPTICOS E ESTERILIZAÇÃO

A esterilização dos mostos preparados com caldo de cana ou melaços é

recomendável. Entretanto, por razões econômicas, isso não é praticado no Brasil,
contornando-se a possibilidade de contaminação através da semeadura de um grande
volume de inóculo, diminuindo-se, desta forma, ao máximo a fase de adaptação.
Os antissépticos são largamente utilizados para controlar contaminantes. Exemplos
destes são o hexaclorofeno (4 mg.L-1), pentaclorofenol (0,01 a 0,05 g.L-1), antibióticos, como
penicilina (500 a 1000 unidades.L-10, tetraciclina, cloro-tetraciclina e clorafenicol.
A desinfecção de dornas, aparelhos de propagação, bombas, condutos e linhas de
alimentação é de suma importância. Dornas e condutos devem ser vem esvaziados e
lavados. Os drenos ou registros de esvaziamento devem estar colocados no nível mais
baixo e instalados em linhas com declive; os fundos de dorna devem, se possível ser
inclinados. Soluções antissépticas devem ser passadas em dornas, equipamentos e se
possível nas instalações para diminuir a possibilidade de contaminações.
 15

3.6 CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

A cinética da fermentação alcoólica, é caracterizada pela produção de álcool com

paralelo desenvolvimento de leveduras. A cinética pode ser visualizada na figura 1. Desta
forma, se deduz que mesmo sendo anaeróbio o processo de geração de etanol, à levedura
devem ser dadas condições de se reproduzir, embora isso implique na necessidade de
suprimento de oxigênio.

FIGURA 1- CINÉTICA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

De acordo com a cinética apresentada na curva da figura 1, a fermentação

descontínua, para a produção de etanol, apresenta três fases características, descritas a
seguir:
a) Fase preliminar: tem duração variável (máximo de 5 horas), podendo variar
conforme o processo de inoculação. È caracterizada por intensa reprodução das leveduras,
a qual convém fornecer aeração do mosto com ar filtrado ou esterilizado, mas apenas
inicialmente, já que a reprodução celular consome açúcares. Este processo é aeróbico e
extremamente exotérmico, porém ocasiona uma pequena variação da temperatura do
mosto.
 16

b) Fase principal ou tumultuosa: inicia-se com o desprendimento de gás

carbônico e se caracteriza pelo aumento exponencial de etanol e pela correspondeste
diminuição da concentração de açúcares. Há uma elevação bastante rápida da temperatura
do mosto, que deve ser evitada por resfriamento. Há tendência elevação da acidez, causada
pela glicólise anaeróbica. Devido a presença de proteínas no mosto ocorre nesta fase, a
formação de espuma. Esta fase dura de 12 a 16 horas, em mostos de caldo de cana ou
melaço, e de 30 a 36 horas em mostos amiláceos.
c) Fase complementar: nesta cessa o desprendimento de CO2, mas a densidade
ainda diminui, embora lentamente, diminuição da espuma até seu desaparecimento
completo, diminuição brusca da temperatura e elevação da acidez. Esta fase não deve ser
prolongada afim de se evitar acidez (duração de 4 a 6 horas).
O tempo total de fermentações industriais é de 20 a 24 horas, dependendo do
processo ode inoculação adotado, linhagens de leveduras, condições do processo, e
substrato adotado.
Quando duas ou mais leituras sucessivas de densidade não divergem, se pode dar
a fermentação por encerrada.

3.7 CONDUÇÃO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

3.7.1 PROCESSO DESCONTÍNUO

Em fermentações alcoólicas, quando se fala de sistemas ou processos de

condução da fermentação, excluindo-se os processos contínuos e descontínuos,
referenciam-se nos processos ou modalidades de inoculação final, ou seja, os distintos
processos de que se faz uso para colocar um eficiente pé de cuba no mosto principal, capaz
de iniciar a fermentação tumultuosa, preferentemente no menor prazo possível. Os
processos utilizados em fermentação alcoólica são:
O processo de reutilização de leveduras - é o mais simples e barato, é apenas
aplicável às pequenas instalações fabris. Neste processo, terminada a fermentação, as
leveduras decantam durante três a quatro horas, retirando-se o fermentado e restando de 20
a 25% do mesmo na dorna, que servirá como pé de cuba para próxima fermentação. Pode-
se fazer tratamento com ácido a pH de 2,2 a 2,6 para eliminação de contaminantes e células
velhas.
Neste processo, a fase de adaptação das leveduras é muito curto, e deve-se cuidar
o número de fermentações com que se utiliza o mesmo inóculo, para evitar ocorrência de
contaminações.
 17

O processo de pés ou fermentos individuais- no qual se utiliza um inóculo novo,

para cada dorna ou batelada. È um processo mais seguro, dispendioso e requer muito
controle.
O processo de cortes- onde se utiliza como inóculo de uma dorna parte do mosto
em fermentação - em geral a metade - da batelada precedente. Assim, corta-se a
fermentação de uma dorna quando, por exemplo, os seus graus Brix se reduzirem à
metade. O método pode ocasionar sérias quedas de rendimento, principalmente se os
mostos não são esterilizados. Desta forma, quando se percebe uma diminuição brusca da
produção de álcool, deve-se cessar este processo.
O processo de recirculação de leveduras ou Melle-Boinot- onde todo o
fermentado e centrifugado, para separação das células de levedura, para reaproveitá-las no
processo seguinte. Neste processo o interesse está em conseguir-se desde o início da
fermentação uma alta concentração microbiana para diminuir ou eliminar a fase de
adaptação e economizar açúcar que seria necessário para reprodução celular.
A suspensão concentrada de leveduras pode ser lavada com ácido em pH 2,2 a
2,6, em proporção de 1:1 ou 1:2, para eliminar células velhas e de contaminantes.
As vantagens deste processo são:
 a já citada economia de açúcar;
 menor tempo de fermentação;
 aumento do rendimento em álcool (entre 2 a 7 %);
 a não necessidade de esterilização do mosto;
 menor sujeira nas colunas de destilação pela retirada das leveduras;
 economia no número de fermentadores necessários;
 menor risco de contaminações pela lavagem das leveduras com ácido;
No entanto este processo apresenta um alto custo.

3.8 ACIDENTES NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

As principais anomalias da fermentação alcoólica são as de origem infecciosa, pela

ocorrência de contaminações bacterianas, as quais podem acontecer em qualquer fase do
processo fermentativo, de preparo do mosto ou mesmo de conservação da matéria-prima.
Entre os microorganismos, os seguintes são a causa mais freqüente de
contaminação:
 Bactérias da fermentação lática, a maioria pertencente à família Lactobacteriaceae,
bastonetes curtos, além de alguns Streptococcus, promovem a glicólise anaeróbia, não até
o etanol, mas ao ácido lático. Pelo que haverá, no mosto, constante aumento da acidez,
 18

pouca formação de CO2 e, em conseqüência, espumas fracas. O pH mantido abaixo de 5,0

no mosto, consegue evitar esta contaminação durante a fermentação.
 Bactérias da fermentação butírica, geralmente do gênero Clostridium, estritamente
anaeróbias, que produzem ácido butírico, mas também acético e fórmico entre outros
produtos. Há menor desenvolvimento de acidez, mas o cheiro é desagradável, de ranço; e
as espumas são pesadas e escuras. O mesmo pH abaixo de 5,0 inibe o seu crescimento;
 Bactérias da fermentação acética, do gênero Acetobacter, principalmente (bastonetes
alongados). Elas incidem antes nos vinhos, isto é, nos mostos fermentados, pois, por
oxidação, transformam o etanol em ácido acético, aumentando assim a acidez volátil. A
simples presença do álcool, em fermentação normal, atua como inibidora de infecções
bacterianas; mas as causadas pelas bactérias acéticas, que são capazes de consumir o
álcool, em presença de ar, são exceção, por isso, podem ocorrer principalmente após o
término da fermentação, se a destilação não é promovida em seguida.
 Bactérias da fermentação dos dextranos, da espécie Leuconostoc mesenteroides. Elas
sintetizam o polímero dextrano, a partir da sacarose, o que ocorre geralmente em cana-de-
açúcar queimada ou danificada; e em caldos de cana, onde pode causar problemas na
clarificação e concentração dos caldos por aumento de viscosidade deste, e aparecem
aglomerados gelatinosos, chamados “cangica”, que dificultam o desprendimento de CO2;
 Bactérias que fermentam os mostos e formam o levano, outro polímero sintetizado a
partir da sacarose, e que são de vários gêneros: Aerobacter, Streptococcus e Bacilius.
Depois do controle e acerto do pH dos mostos, o uso de um eficiente pé de cuba ou
inóculo, o qual possibilite uma ativa população de leveduras e curta fase preliminar (que
pode ser resumida a 15 ou 20 minutos), é o meio mais eficiente de controlar as infecções.

3.9 CONTROLE DA FERMENTAÇÃO

O controle e o acompanhamento, durante e após a fermentação, são realizadas:

 por medidas da densidade do mosto, pelos densímetros graduados em graus Brix ou

Balling. No caso de mostos amiláceos sacarificados, o teor em açúcares é bem menor do
que o que expressa a escala Brix, o que não impede que ela seja usada como referência;
 por medidas da refração de mostos sacaríneos; pois há refratômetros graduados em
escala Brix. Também aqui os demais sólidos existentes nos caldos e mostos, aumentam o
valor lido, mas a aproximação é suficiente para acompanhar o decréscimo do teor de
sacarose na fermentação;
 por análise do teor alcoólico no mosto, principalmente no final da fermentação;
 19

 por medidas do pH durante toda a fermentação, podendo-se complementá-las com

análise da acidez titulável, a fim de melhor acompanhar a tendência de seu aumento,
durante a fermentação;
 por análises dos açúcares totais no mosto;
 por análises do açúcar redutor residual, no mosto terminado de fermentar;
 por verificação microscópica, que pode - desde que haja a suficiente prática - indicar a
presença de microorganismos contaminantes;
 pelo tempo da fermentação.

3.10 SUBPRODUTOS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

O subproduto de maior expressão da fermentação alcoólica, além do CO 2, é o

vinhoto ou vinhaça, que flui, como resíduo, da base das colunas de destilação, onde se
produz o álcool bruto.
O volume produzido é expressivo: 12 a 15 volumes de vinhaça por volume de
álcool produzido nas fermentações descontínuas que usam os processos de reutilização do
pé de cuba, do inóculo individual ou de cortes. E menor no processo de recuperação de
leveduras; e pode ser substancialmente reduzido nos processos contínuos, como é o caso
do processo Biostil.
O vinhoto, dada sua composição química como substrato para crescimento
biológico, não pode ser lançado, como efluente das destiladas, direta- ou indiretamente, nos
cursos d’água ou mananciais hídricos como era praticado até recentemente no Brasil, pois
eleva as demandas química e biológica de oxigênio.
As soluções que existem para o tratamento e aproveitamento deste subproduto,
incluem:
 reciclagem, sob forma de diluente de mostos novos ainda por fermentar, em
fermentações contínuas;
 tratamento biológico, promovendo-se uma digestão anaeróbia com formação de biogás,
composto basicamente por metano e CO2
 uso como fertilizante orgânico, sob determinadas condições.
 20

4 METODOLOGIA

Para a condução do processo de fermentação padronizaram-se as condições de

temperatura, concentração inicial de inóculo e de substrato, e pH do meio, que vêm
colocadas a seguir.

4.1 COMPOSIÇÃO DO SUBSTRATO

Preparou-se o meio de fermentação adicionando-se os nutrientes citados abaixo,
nas respectivas concentrações, em 1800mL de água:
 Glicose: 150g/L
 Sulfato de amônio: 5,0g/L
 Fosfato de amônio: 1,0g/L
 Sulfato de magnésio: 0,2g/L

Após a mistura dos componentes do meio ajustou-se o seu pH para faixa de 4,5-5,0
com Hidróxido de sódio ou Ácido sulfúrico, e em seguida esterilizou-se o meio à frio,
através de filtração em membrana (filtro milipore).

4.2 MICRORGANISMO E CONCENTRAÇÃO DE INÓCULO

Utilizou-se o microrganismo Saccharomyces cerevisiae, obtido a partir de fermento
comercial liofilizado, sendo a concentração inicial de inóculo de 5,0g/L. Uma vez que o
volume de meio a fermentar foi 1800mL, a quantidade de microrganismo necessária em
cada fermentador foi de 9,0 gramas.
Os fermentos comerciais liofilizados empregados foram:
 FLEISHMAN
 SAFT INSTANT
 FERMIX
 UVA FERM

4.3 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO

A fermentação foi conduzida em biorreatores de 2,0L, que corresponderam a
provetas, as quais foram colocadas em estufa com temperatura controlada em 30ºC.
 21

4.4 ACOMPANHAMENTO DA FERMENTAÇÃO

Após a inoculação, que correspondeu ao tempo zero de fermentação e no qual foi
retirada a primeira amostra, realizou-se o acompanhamento do processo a cada 3 horas,
controlando-se:
- pH;
- concentração de biomassa;
- concentração de açúcares no meio;
- concentração e perfil de álcoois (produto).
Os métodos utilizados estão descritos a seguir.

4.4.1 CONTROLE DE pH
Controlou-se o pH do meio de fermentação realizando-se a leitura a cada hora,
devendo esta, situar-se na faixa de 4,5-5,0. Nos casos em que o pH situou-se abaixo de 4,5
realizou-se a correção do mesmo utilizando-se solução de NH4OH 1,0N.

4.4.2 CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA

A concentração de biomassa foi determinada através de leitura da densidade ótica

do mosto fermentado, a cada 3 horas, em espectrofotômetro calibrado a 264,10 nm,
utilizando-se uma curva padrão que foi obtida a partir de um inóculo de levedura. O fermento
comercial liofilizado utilizado para tal foi o fermento FERMIX.

4.4.2.1 Procedimento para curva padrão de biomassa

A partir de uma suspensão de leveduras do Fermento FERMIX, ajustou-se a

concentração até uma leitura de transmitância de 20%. A partir desta realizou-se 6 diluições
sucessivas em balão volumétrico de 100mL e leu-se a absorbância correspondente em
espectrofotômetro calibrado a 264,10 nm. Filtrou-se 50 mL de cada diluição em papel
Milipore 0,45m tarado em estufa a 60ºC, secou-se nas mesmas condições e pesou-se o
papel, obtendo-se a relação entre a absorbância e a massa seca de levedura.
 22

4.4.3 CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES NO MEIO

Realizou-se o acompanhamento da concentração de açúcares no substrato, ao

longo da fermentação, através de dois métodos. O primeiro consistiu na determinação da
concentração de sólidos totais em %p/p, através da leitura dos ºBrix em Brixômetro. O
segundo consistiu na utilização do Método Espectrofotométrico do 3,5 – DNS,
determinando-se, portanto, a concentração de açúcares redutores. O procedimento utilizado
para o segundo método compreendeu os seguintes passos:
- retirou-se 0,5ml de amostra (mosto fermentado) e elevou-se o volume a 250ml em balão
volumétrico, adicionando-se antes disto, 2mL de Carrez I e 2mL de Carrez II para precipitar
proteínas;
- filtrou-se a solução obtida;
- tomou-se uma alíquota de 1,0mL e adicionou-se 1,0mL do reativo de 3,5-DNS, levando-
se a banho-maria fervente (100ºC) por 5 minutos;
- completou-se o volume a 10,0mL com água destilada e leu-se o % T a 546 nm;
- calculou-se a concentração de açúcares redutores através de uma curva padrão de
glicose.

4.4.3.1 Curva padrão de glicose

Foi obtida a partir de uma solução estoque de 0,5mg/mL de glicose padrão seca.
Numerou-se 10 tubos de ensaio e um branco e seguiu-se o procedimento colocado
na tabela 2.

Tabela 2- Procedimento para obtenção da curva padrão de glicose

Tubos Solução Água destilada Reagente 3,5 – DNS B.M 100ºC  volume a 10mL (água
Estoque (mL) (mL) (mL) (min) destilada)
Branco - 1,0 1,0 5 8
1 0,1 0,9 1,0 5 8
2 0,2 0,8 1,0 5 8
3 0,3 0,7 1,0 5 8
4 0,4 0,6 1,0 5 8
5 0,5 0,5 1,0 5 8
6 0,6 0,4 1,0 5 8
7 0,7 0,3 1,0 5 8
8 0,8 0,2 1,0 5 8
9 0,9 0,1 1,0 5 8
10 1,0 0,0 1,0 5 8

Após elevar o volume a 10mL deixou-se os tubos em repouso até atingir a

temperatura ambiente e realizou-se a leitura do %Transmitância em espectrofotômetro
calibrado a 546 nm.
 23

4.4.4 CONCENTRAÇÃO E PERFIL DE ÁLCOOIS

Foi planejado o controle da concentração de produtos ao longo da fermentação,
bem como o perfil de álcoois, através de Cromatografia Gasosa. No entanto, devido a
problemas ocorridos no equipamento de cromatografia (coluna), as corridas não puderam
ser realizadas, não sendo possível a obtenção do parâmetro de controle referente à
concentração de produtos.

5 RESULTADOS

5.1 CURVA PADRÃO DE GLICOSE

 24

Através do procedimento descrito no item 4.4.3.1, obteve-se os resultados

expressos na tabela 3.

Tabela 3: Resultados para a curva padrão de glicose

Tubos %T (546nm) Absorbância Conc. de glicose (mg/mL)
Branco 98,3 0.0077 0.0
1 92,7 0.0330 0.005
2 78,1 0.1072 0.01
3 64,6 0.1898 0.015
4 54,2 0.2664 0.020
5 44,8 0.3492 0.025
6 37,2 0.4300 0.030
7 31,8 0.4976 0.035
8 26,9 0.5703 0.040
9 23,4 0.6299 0.045
10 21,4 0.6706 0.050

Diminuindo-se dos demais tubos de reação, a absorbância correspondente ao

Branco, e realizando-se os cálculos da absortividade molar, encontra-se para a curva
padrão:

Abs  13,614  Concentração

y  ax
Sendo: y=absorbância
X=concentração (mg/mL)
a= absortividade molar
 xy
a
 x2

Plotando-se os dados de absorbância em função da concentração em cada ponto,

obtém-se a figura 2, que representa a curva padrão de glicose para a determinação da
concentração de substrato ao longo do tempo de fermentação.
 25

FIGURA 2: CURVA PADRÃO DE GLICOSE

5.2 CURVA PADRÃO DE BIOMASSA

Através do procedimento descrito no item 4.4.2.1, obteve-se os resultados

expressos na tabela 4:

Tabela 4: Resultados para curva padrão de biomassa

Absorbância (246,10 nm) Concentração (g/L)
5,0191 2,0
2,5037 1,0
1,2662 0,5
0,6284 0,25
0,4569 0,2
0,2183 0,1

Realizando-se o mesmo procedimento descrito para a curva padrão de glicose, a

equação que se obtém para a curva padrão de biomassa pode ser visualizada abaixo:

Abs  2,5075  Concentração

Plotando-se os valores de absorbância em função da concentração, obtém-se a

curva padrão de biomassa, que está demonstrada na figura 3.
 26

FIGURA 3: CURVA PADRÃO DE BIOMASSA.

OBS: A curva padrão foi construída apenas com 4 pontos, devido ao fato de que os
primeiros dois pontos da mesma, correspondentes às concentrações de 2,0 e 1,0g/L,
apresentaram absorbância muito superior a 1,0. Deveriam ter sido realizadas diluições
apropriadas, para estas duas concentrações.

5.3 ACOMPANHAMENTO DA FERMENTAÇÃO

Os resultados obtidos a partir das leituras realizadas no decorrer do processo

fermentativo estão colocados nas tabelas 5 a 8. Uma vez que foram utilizados quatro
inóculos de levedura de marcas diferentes, os fermentadores foram numerados de 1 a 4,
sendo:
 Fermentador 1 – Inóculo Fleischman
 27

 Fermentador 2 – Inóculo Saft-Instant

 Fermentador 3 – Inóculo Fermix
 Fermentador 4 – Inóculo Uva Ferm

Tabela 5- Resultados para o fermentador 1 – Inóculo Fleishman

Tempo (h) Conc. Biomassa Conc. Açúcares redutores ºBrix
(D.O 264,10 nm) (%T 546 nm)
Leitura Diluição Conc. (g/L) Leituras %T Conc.(g/L)
0 1,8920 1:10 7,54 31,45 184,51 14,0
3 2,2877 1:10 9,12 38,30 153,07 13,0
6 0,9737 1:20 7,76 56,75 90,36 12,1
9 1,0703 1:20 8,53 38,00 154,33 9,5
12 0,7521 1:30 8,99 44,35 129,68 7,0
15 1,0548 1:30 12,61 52,1 103,99 5,5
18 1,1283 1:30 13,49 75,2 45,46 3,8
21 0,7511 1:30 8,98 - - 3,8

OBS: A leitura de transmitância para o tempo de 21 horas extrapolou os limites da curva

padrão de glicose.

Os resultados da variação do pH ao longo do tempo de fermentação não foram

colocados nas tabelas 5 a 8, uma vez que as leituras foram realizadas em intervalos de 1
hora, corrigindo-se o pH nos casos em que se situava fora da faixa de 4,5-5,0.
Para melhor visualização da variação do pH com o tempo de fermentação, plotou-
se os gráficos representados pelas figuras 4, 6, 8, e 10, onde estão demonstrados os
valores de pH lidos a cada hora e os respectivos valores corrigidos. Através destas figuras
pode-se verificar que foi possível manter o pH na faixa de 4,5–5,0 durante a fermentação.
As figuras 5, 7, 9, e 11 mostram os gráficos da concentração de substrato,
concentração celular e ºBrix, em função do tempo para os 4 fermentadores,
respectivamente.
 28

FIGURA 4: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 1

200 1 5 .0
1 5 .0

160 1 2 .0
1 2 .0 C o n c e n tra ç ã o d e S u b s tra to (g / L)
C o n c e n t r a ç ã o d e B io m a s s a ( g / L )

9 .0 120 9 .0 G r a u s B r ix

6 .0 80 6 .0

3 .0 40 3 .0

0 .0 0 0 .0
B io m a s s a
0 .0 3 .0 6 .0 9 .0 1 2 .0 1 5 .0 1 8 .0 2 1 .0
te m p o (h ) S u b s tra to
º B r ix

FIGURA 5 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO

TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 1

Tabela 6- Resultados para o fermentador 2 – Inóculo Saft-Instant

Tempo (h) Conc. Biomassa Conc. Açúcares redutores ºBrix
- (D.O 264,10 nm) (%T 546 nm)
Leitura Diluição Conc. (g/L) Leituras %T Conce.(g/L)
0 1,0464 1:10 4,17 29,75 193,37 14,0
3 2,2917 1:10 9,14 37,70 155,59 12,4
 29

6 0,9699 1:20 7,73 62,50 74,97 10,1

9 1,1632 1:20 9,27 44,25 130,04 7,7
12 0,8056 1:30 9,64 52,50 102,77 5,0
15 0,7528 1:30 9,01 54,45 96,96 3,6
18 0,7772 1:30 9,29 75,10 45,67 3,4
21 0,2606 1:30 3,12 - - 3,5

OBS: A leitura de transmitância para o tempo de 21 horas extrapolou os limites da curva

padrão de glicose.

FIGURA 6: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 2

 30

200 1 5 .0
1 5 .0

1 2 .0 160 1 2 .0

C o n c e n tra ç ã o d e S u b s tra to (g / L )
C o n c e n t r a ç ã o d e B io m a s s a ( g / L )

9 .0 120 9 .0

G r a u s B r ix
6 .0 80 6 .0

3 .0 40 3 .0

0 .0 0 0 .0
B io m a s s a
0 .0 3 .0 6 .0 9 .0 1 2 .0 1 5 .0 1 8 .0 2 1 .0
te m p o (h ) S u b s tra to
º B r ix

FIGURA 7 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO

TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 2

Tabela 7- Resultados para o fermentador 3 – Inóculo Fermix

Tempo (h) Conc. Biomassa Conc. Açúcares redutores ºBrix
- (D.O 264,10 nm) (%T 546 nm)
Leitura Diluição Conc. (g/L) Leituras %T Conce.(g/L)
0 1,9589 1:10 7,81 29,95 192,30 14,0
3 2,5124 1:10 10,02 36,15 162,29 12,8
6 0,9348 1:20 7,46 47,90 117,40 10,0
9 1,0801 1:20 8,61 39,75 147,15 9,0
12 0,7073 1:30 8,46 46,40 122,48 7,0
15 0,9530 1:30 11,40 52,10 104,00 5,3
18 0,8406 1:30 10,05 75,15 45,57 4,0
21 0,7707 1:30 9,22 - - 3,5

OBS: A leitura de transmitância para o tempo de 21 horas extrapolou os limites da curva

padrão de glicose.
 31

FIGURA 8: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 3

200 1 5 .0
1 5 .0

160 1 2 .0
1 2 .0 C o n c e n tra ç ã o d e S u b s tra to (g / L )
C o n c e n t r a ç ã o d e B io m a s s a ( g / L )

9 .0 120 9 .0 G r a u s B r ix

6 .0 80 6 .0

3 .0 40 3 .0

0 .0 0 0 .0
B io m a s s a
0 .0 3 .0 6 .0 9 .0 1 2 .0 1 5 .0 1 8 .0 2 1 .0
te m p o (h ) S u b s tra to
º B r ix

FIGURA 9 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO

TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 3
 32

Tabela 8- Resultados para o fermentador 4 – Inóculo Uva Ferm

Tempo (h) Conc. Biomassa Conc. Açúcares redutores ºBrix
- (D.O 264,10 nm) (%T 546 nm)
Leitura Diluição Conc. (g/L) Leituras %T Conce.(g/L)
0 1,5385 1:10 6,13 30,50 189,40 14,0
3 1,7039 1:10 6,79 32,30 180,25 14,0
6 0,6197 1:20 4,94 62,90 73,95 13,5
9 0,6239 1:20 4,97 26,00 214,86 14,0
12 0,6845 1:20 5,45 29,50 194,72 13,5
15 0,5130 1:30 6,14 31,70 183,25 12,8
18 0,4710 1:30 5,63 45,75 124,73 12,5
21 0,3663 1:30 4,38 - - 11,8

OBS: A leitura de transmitância para o tempo de 21 horas extrapolou os limites da curva

padrão de glicose.

FIGURA 10: CURVA DA VARIAÇÃO DE PH PARA O FERMENTADOR 4.

 33

240 1 5 .0
1 5 .0

200
1 2 .0
1 2 .0

C o n c e n tra ç ã o d e S u b s tra to (g / L )
C o n c e n t r a ç ã o d e B io m a s s a ( g / L )

160

9 .0 9 .0

G r a u s B r ix
120

6 .0 6 .0

80

3 .0 3 .0
40

0 .0 0 0 .0
B io m a s s a
0 .0 3 .0 6 .0 9 .0 1 2 .0 1 5 .0 1 8 .0 2 1 .0
te m p o (h ) S u b s tra to
º B r ix

FIGURA 11 – CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA (G/L) E DE SUBSTRATO (G/L), E ºBRIX EM FUNÇÃO DO

TEMPO (H) PARA O FERMENTADOR 4.

As figuras 12 e 13 mostram as curvas de concentração de substrato e concentração

de celular em função do tempo para os quatro fermentadores. A figura 14 mostra a variação
da concentração de açúcares em ºBrix, em função do tempo, para os quatro fermentadores.
 34

1 6 .0 0

1 2 .0 0
C o n c e n t r a ç ã o C e lu la r ( g / L )

8 .0 0

4 .0 0

F e rm e n ta d o r 1
F e rm e n ta d o r 2
F e rm e n ta d o r 3
F e rm e n ta d o r 4
0 .0 0

0 .0 0 3 .0 0 6 .0 0 9 .0 0 1 2 .0 0 1 5 .0 0 1 8 .0 0 2 1 .0 0
te m p o (h )

FIGURA 12 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO CELULAR (G/L) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4

FERMENTADORES.

2 4 0 .0 0

2 0 0 .0 0
C o n c e n tra ç ã o d e S u b s tra to (g / L )

1 6 0 .0 0

1 2 0 .0 0

8 0 .0 0
F e rm e n ta d o r 1
F e rm e n ta d o r 2
F e rm e n ta d o r 3
F e rm e n ta d o r 4
4 0 .0 0

0 .0 0 3 .0 0 6 .0 0 9 .0 0 1 2 .0 0 1 5 .0 0 1 8 .0 0
te m p o (h )

FIGURA 13 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO (G/L) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4

FERMENTADORES.
 35

1 5 .0 0

1 2 .0 0

9 .0 0
B r ix

6 .0 0

3 .0 0
F e rm e n ta d o r 1
F e rm e n ta d o r 2
F e rm e n ta d o r 3
F e rm e n ta d o r 4
0 .0 0

0 .0 0 3 .0 0 6 .0 0 9 .0 0 1 2 .0 0 1 5 .0 0 1 8 .0 0
te m p o (h )

FIGURA 14 – CURVAS DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES (ºB) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS 4

FERMENTADORES.
 36

5.4 DETERMINAÇÃO DAS VELOCIDADES ESPECÍFICAS E FATORES DE CONVERSÃO

Uma vez que não foi possível obter os resultados para a concentração de etanol ao
longo do tempo de fermentação, os fatores de conversão de substrato em produto ( YP/S) e
de célula em produto (YP/X) não puderam ser determinados.
A partir dos resultados de concentração de substrato e de células no decorrer do
processo fermentativo, torna-se possível calcular apenas o fator de conversão de substrato
em célula (YX/S).
No que se refere às velocidades específicas, foram calculadas as velocidades
específicas de consumo de substrato (açúcares redutores) e crescimento celular. Isto foi
realizado através da determinação das derivadas em cada ponto (tempo), nas curvas de
concentração celular e concentração de substrato em função do tempo. Estas curvas foram
plotadas com os resultados colocados nas tabelas 5 a 8. Convém lembrar que a
determinação das derivadas foi realizada com o auxílio do software Microcal ORIGIN.
Entretanto, as derivadas em cada ponto nos fornecem as velocidades instantâneas,
sendo que para a determinação das velocidades específicas dividiu-se cada velocidade
instantânea pela respectiva concentração de biomassa, a qual foi determinada
anteriormente.
As tabelas 9 a 12 demonstram os resultados obtidos para as velocidades
instantâneas e específicas de crescimento celular e consumo de substrato (açúcares
redutores), para os quatro fermentadores.

Tabela 9 - Velocidades instantâneas e específicas para o fermentador 1.

Tempo V. instantânea V. específica de V. instantânea de V. específica de
(h) de crescimento crescimento celular consumo de substrato consumo de substrato
-1
celular (g / L.h) (h ) (g/ L. h) (gsubstrato/ gcélula. h)
0 0,03667 0,004863 10,48 1,38992
3 - - 5,135 0,56305
6 0,14667 0,018901 - -
9 0,205 0,024033 4,00333 0,46932
12 0,68 0,07564 8,39 0,93326
15 0,75 0,059477 14,0367 1,11314
18 -0,605 -0,04485 19,51 1,44626
21 1,5033 -0,16741 - -
Obs: Os pontos correspondentes aos tempos de 6 horas para a concentração de substrato
(açúcares redutores) e 3 horas para a concentração de biomassa foram desconsiderados
para o cálculo das velocidades instantâneas e específicas, por se desviarem do
comportamento esperado.
 37

Tabela 10 - Velocidades instantâneas e específicas para o fermentador 2.

Tempo V. instantânea de V. específica de V. instantânea de V. específica de
(h) crescimento crescimento celular consumo de substrato consumo de substrato
-1
celular (g / L.h) (h ) (g/ L. h) (gsubstrato/ gcélula. h)
0 0,59333 0,142285 12,5933 3,01998
3 - - 8,42583 0,92186
6 0,55333 0,071582 - -
9 0,31833 0,03434 6,67417 0,71998
12 -0,04333 -0,00449 5,51333 0,57192
15 -0,05833 -0,00647 9,51667 1,05623
18 -0,98167 -0,10567 17,0967 1,84033
21 -2,05667 -0,65919 - -
Obs: Os pontos correspondentes aos tempos de 6 horas para a concentração de substrato
(açúcares redutores) e 3 horas para a concentração de biomassa foram desconsiderados
para o cálculo das velocidades instantâneas e específicas, por se desviarem do
comportamento esperado.

Tabela 11 - Velocidades instantâneas e específicas para o fermentador 3.

Tempo V. instantânea de V. específica de V. instantânea de V. específica de
(h) crescimento crescimento celular consumo de substrato consumo de substrato
-1
celular (g / L.h) (h ) (g/ L. h) (gsubstrato/ gcélula. h)
0 -0,05833 -0,00747 10,0033 1,28084
3 - - 6,26333 0,62508
6 0,1625 0,021783 - -
9 0,16667 0,019358 5,37333 0,62408
12 0,465 0,054965 7,19167 0,85008
15 0,265 0,023246 12,8183 1,12441
18 -0,36333 -0,03615 19,4767 1,93798
21 -0,27667 -0,03001 - -

Obs: Os pontos correspondentes aos tempos de 6 horas para a concentração de substrato

(açúcares redutores) e 3 horas para a concentração de biomassa foram desconsiderados
para o cálculo das velocidades instantâneas e específicas, por se desviarem do
comportamento esperado.
Tabela 12 - Velocidades instantâneas e específicas para o fermentador 4.
Tempo V. instantânea de V. específica de V. instantânea de V. específica de
(h) crescimento crescimento celular consumo de substrato consumo de substrato
-1
celular (g / L.h) (h ) (g/ L. h) (gsubstrato/ gcélula. h)
0 0,22 0,035889 3,05 0,49755
3 -0,19833 -0,02921 0,72111 0,1062
6 -0,30333 -0,0614 - -
9 0,085 0,017103 - -
12 0,195 0,03578 1,10778 0,20326
15 0,03 0,004886 11,665 1,89984
18 -0,29333 -0,0521 19,5067 3,46477
21 -0,41667 -0,09513 - -
 38

Obs: Os pontos correspondentes aos tempos de 6 e 9 horas para a concentração de

substrato (açúcares redutores), foram desconsiderados para o cálculo das velocidades
instantâneas e específicas, por se desviarem do comportamento esperado.

As figuras 15 e 16 mostram as velocidades específicas de crescimento celular e

consumo de substrato, em função do tempo para os 4 fermentadores, respectivamente.

0 .8 0
V e lo c id a d e E s p e c ífic a d e C r e s c im e n t o C e lu la r ( h -1 )

0 .6 0

0 .4 0

0 .2 0

0 .0 0

0 .0 0 3 .0 0 6 .0 0 9 .0 0 1 2 .0 0 1 5 .0 0 1 8 .0 0 2 1 .0 0
-0 .2 0
te m p o (h )

-0 .4 0

F e rm e n ta d o r 1

-0 .6 0 F e rm e n ta d o r 2
F e rm e n ta d o r 3
F e rm e n ta d o r 4

-0 .8 0

FIGURA 15 – VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CRESCIMENTO CELULAR (H-1) EM FUNÇÃO DO TEMPO (H)

PARA OS QUATRO FERMENTADORES.
 39

V e lo c id a d e E s p e c ífic a d e C o n s u m o d e S u b s t r a t o ( g s u b s / g b io m a s s a . h )
4 .0 0

3 .5 0

3 .0 0

2 .5 0

2 .0 0

1 .5 0

1 .0 0

F e rm e n ta d o r 1

0 .5 0 F e rm e n ta d o r 2
F e rm e n ta d o r 3
F e rm e n ta d o r 4

0 .0 0

0 .0 0 3 .0 0 6 .0 0 9 .0 0 1 2 .0 0 1 5 .0 0 1 8 .0 0
te m p o (h )

FIGURA 16 – VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CONSUMO DE SUBSTRATO (GSUBSTRATO/GCÉLULA) EM

FUNÇÃO DO TEMPO (H) PARA OS QUATRO FERMENTADORES.

Através dos resultados obtidos para as velocidades instantâneas de crescimento

celular e consumo de substrato, demonstrados nas tabelas 9, 10, 11 e 12, realizou-se os
cálculos dos fatores de conversão de substrato em célula no decorrer da fermentação, para
os quatro sistemas (inóculos de diferentes marcas).
Para tal, utilizou-se a relação entre as velocidades instantâneas de crescimento
celular e consumo de substrato, expressa pela equação abaixo:
dX / dt
YX / S 
 dS / dt

Os resultados obtidos podem ser visualizados na tabela 13.

Tabela 13 - Fatores de conversão de Substrato em Célula, em gCÉLULA/gSUBSTRATO

para as quatro fermentações em função do tempo (h).
 40

Tempo (h) Fermentador 1 Fermentador 2 Fermentador 3 Fermentador 4

0 0,0035 0,04711 -0,005831 0,07213
3 - - - -0,275034
6 - - - -
9 0,05121 0,0477 0,03102 -
12 0,08105 -0,007859 0,06466 0,17603
15 0,05343 -0,006129 0,02067 0,00257
18 -0,03101 -0,057419 -0,018655 -0,015037
21 - - - -

6 DISCUSSÃO

Devido à problemas ocorridos no equipamento de cromatografia (coluna), não foi

possível realizar o acompanhamento da concentração de produtos ao longo da fermentação.
 41

Desta forma torna-se difícil avaliar a cinética do processo, principalmente no que se refere
ao rendimento do mesmo, ou seja, ao fator de conversão de substrato em produto.
No entanto, observando-se os resultados expressos na tabela 8 e na figura 11, que
se referem ao fermentador 4 (Inóculo Uva Ferm), pode-se verificar que a transformação do
substrato em produto foi bastante lenta se comparada às fermentações realizadas com os
outros inóculos. A formação de produto (álcool) para este inóculo, durante as primeiras 12
horas foi praticamente nula, havendo no entanto, um aumento do consumo de substrato e
consequentemente de formação de produtos, a partir deste tempo de fermentação.
Observando-se a figura 14, que mostra a variação do ºBrix em função do tempo
para os quatro inóculos, podemos verificar que o comportamento dos inóculos 1 (Fleishman)
e 3 (Fermix) é muito semelhante no que se refere a diminuição do ºBrix e
consequentemente, transformação de substrato em produto. O inóculo 2 diferencia-se dos
inóculos 1 e 3, apresentando uma diminuição mais intensa do ºBrix. Porém, no tempo de 18
horas de fermentação, a concentração de substrato ficou em torno de 3,8 ºBrix para os 3
inóculos.
Observando-se a figura 13, que mostra as curvas da concentração de substrato
medidas através do método do 3,5 – DNS, pode-se verificar o mesmo comportamento
observado quando determinou-se a concentração de açúcares por medida do ºBrix.
Novamente, os inóculos 1, 2 e 3 apresentaram comportamento semelhante.
Torna-se importante comentar acerca dos resultados obtidos para a concentração
de substrato através dos dois métodos, uma vez que se observa uma diferença marcante
entre os mesmos. No tempo zero de fermentação a concentração de açúcares determinada
através do método de DNS para os quatro fermentadores, ficou em torno de 190 g/L,
enquanto que o ºBrix foi de 14º . A partir disto pode-se dizer que um dos métodos forneceu
resultados falhos. Considerando-se que o meio de fermentação foi preparado com glicose e
que o método do 3,5 –DNS quantifica açúcares redutores, sendo utilizada uma curva padrão
de glicose, admite-se este método como sendo o mais preciso.
No que se refere às concentrações de biomassa, verifica-se através da figura 12
que para a fermentação 2, na qual utilizou-se o inóculo Saft Instant, a fase Log de
crescimento celular foi verificada desde o início da fermentação. Desta forma pode-se
justificar o motivo pelo qual o consumo de substrato (decaimento do ºBrix) foi mais intenso
para esta fermentação. Convém ressaltar que podem ter ocorrido erros na determinação da
concentração inicial de biomassa, uma vez que se inoculou o meio de fermentação com
5,0g/L e as concentrações iniciais determinadas para os fermentadores 1, 3 e 4 foram
maiores que 5,0g/L. Isto pode ter ocorrido devido a erros na leitura da absorbância das
amostras retiradas, já que os valores lidos foram maiores que 1,0, não se ajustando a Lei de
Beer. Deveriam ter sido feitas diluições apropriadas antes da realização das leituras. Outra
 42

fonte de erros é que a curva padrão de biomassa foi construída a partir do fermento Fermix,
tendo sido utilizada para os demais inóculos para a determinação da concentração de
biomassa.
Ainda em relação a figura 12, observa-se uma queda brusca da concentração de
biomassa a partir das 18h de fermentação, principalmente para os inóculos 1 e 2. Uma
queda da concentração celular no final da fermentação pode ser justificada em função do
aumento da concentração de etanol no meio, que pode causar a inibição das leveduras e
até mesmo a morte celular. No entanto, como a concentração celular no tempo de 21h foi
inferior à do tempo inicial, somente um erro de análise ou de má homogeneização do meio,
justificariam uma queda tão brusca.
Em relação às velocidades específicas de crescimento celular, através da figura 15
verifica-se que para a fermentação 2 (inóculo Saft Instant), esta velocidade específica foi
maior no início da fermentação, apresentando uma diminuição no decorrer do processo.
Para os inóculos 1, 3 e 4, a velocidade específica de crescimento celular é menor no início
do processo, apresentando uma pequena elevação no tempo de 10 – 15 horas e decaindo
em seguida. Provavelmente o inóculo 2 adaptou-se com maior facilidade ao substrato,
enquanto a adaptação dos demais ocorreu de forma mais lenta.
No que se refere às velocidades específicas de consumo de substrato, a figura 16
mostra um comportamento semelhante para os quatro inóculos. Verifica-se que no início,
esta velocidade específica é elevada, especialmente para o inóculo 2, provavelmente devido
ao fato de o meio apresentar uma maior concentração de oxigênio dissolvido, propiciando
uma reprodução celular elevada, que é acompanhada por um rápido consumo de açúcares
do meio. A partir do tempo de 9h a velocidade específica de consumo de substrato começou
a aumentar novamente, o que pode ser justificado pela maior concentração celular.

7 CONCLUSÃO
 43

 O inóculo 2 apresentou as maiores velocidades específicas de consumo de

substrato no início da fermentação, propiciando um decaimento mais rápido da
concentração de açúcares, se comparado aos demais inóculos;
 Os inóculos 1, 2, e 3 consumiram semelhantes concentrações de substrato,
considerando-se o tempo de 18 horas, no qual atingiu-se ao final da fermentação,
concentrações de 45,46, 45,67 e 45,57g/L, respectivamente;
 O inóculo 4 – Uva Ferm – foi o que apresentou o menor consumo de substrato,
ao longo do período de fermentação.

8 BIBLIOGRAFIA
 44

 G. Jagnow; W. David. Biotecnología – Introducción com experimentos modelo – Editorial

Acribia, S.A., Zaragoza (España);

 R. Julio Carlos – Biotecnologia dos Processos Fermentativos –Vol 2, Editora e Gráfica

Universitária – UFPeL, 1999.

 R. Julio Carlos – Biotecnologia dos Processos Fermentativos –Vol 3, Editora e Gráfica

Universitária – UFPeL, 2000.