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Métodos Especiais De Estudos

Definição
São todas as técnicas físicas e químicas, mediante as quais podem se obter, com o emprego do mi-
croscópio óptico ou eletrônico, uma visualização direta das diversas substâncias que compõem as células.
Algumas reações citoquímicas seguem a lei de Lambert-Beer, ou seja, produzem nas células, uma in-
tensidade de cor proporcional à concentração da substância em estudo. Nestes casos, utiliza-se um histofo-
tômetro para as mensurações necessárias.

Princípios Gerais da Histoquímica


01. Preservar e Imobilizar a substância (ou macromolécula) química, por fixação ou processamento apro-
priado
02. É necessário uma específica reação química de identificação que produza um composto (produto de
reação) insolúvel
03. A especificidade do teste histoquímico deve ser definido pelo uso apropriado de preparações-controle
04. A precisa localização do produto de reação deve ser avaliada
05. A sensibilidade do teste histoquímico deve ser considerada quando da avaliação dos resultados.

Introdução ao Reativo de SCHIFF – detecção de grupamentos aldeídos R – C = O


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Nos testes histoquímicos, envolvendo o Reativo de Schiff, podemos considerar três tipos de grupamen-
tos aldeídos:
01. Aldeídos livres – presentes naturalmente nas células ou tecidos
02. Aldeídos Produzidos por Hidrólise Seletiva (reação de Feulgen)
03. Aldeídos Produzidos por Oxidação Seletiva (reação do PAS).

Ácidos Nucleicos
Os métodos citoquímicos para identificação dos ácidos nuclêicos dependem das propriedades dos três
componentes do nucleotídeo:
01. Bases Nitrogenadas – ambos os ácidos, DNA e RNA absorvem luz ultravioleta a 260 nm, devido a pre-
sença de suas bases nitrogenadas cíclicas.
02. Ácido Fosfórico – é o responsável pela basofilia do DNA e do RNA. A Hematoxilina é um corante bási-
co que atribui cor roxa ou lilás aos ácidos nuclêicos.
03. Carboidrato – o DNA é evidenciado citoquimicamente, através da reação de FEULGEN, para a desoxir-
ribose.

Reação de FEULGEN – (Feugen & Rossenbeck, 1924)


A Reação de Feulgen consta de duas etapas:

01. cortes de tecido são submetidos à hidrólise branda, com ácido clorídrico, que remove as purinas, ao
nível da ligação glicosídica purina-desoxirribose. Assim, abre-se o anel de furanose da desoxirribose e
forma-se um grupamento aldeído.
02. os grupamentos aldeídos livres reagem com o Reativo de Schiff, originando um produto de cor ma-
genta.

A reação de Feulgen segue a lei de Lambert-Beer e, por conseqüência, permite a quantificação do DNA.

A ESPECIFICIDADE da reação de Feulgen é controlada pelo uso da enzima DNAase.

Carboidratos
Os açúcares mais simples, os monossacarídeos, são compostos com fórmula geral (CH2O)n, na qual n é
geralmente 3, 4, 5, 6 ou 7. Os açúcares e as moléculas feitas a partir deles também são chamadas carboidra-
tos.
Grandes moléculas lineares ou ramificadas podem ser formadas a partir da simples repetição de uni-
dades. Cadeias curtas são denominadas oligossacarídeos, enquanto que cadeias longas são chamadas polissa-
carídeos.
O glicogênio é um polissacarídeo feito inteiramente de unidades de glicose ligadas entre si. É o polissa-
carídeo que constitui a forma de estoque de carboidrato nas células animais.
O glicogênio ocorre em alguns tipos celulares como uma partícula de 20 a 30 nm, de contorno irregu-
lar, denominada partículas beta. Em outros, formam agregados de maior tamanho, tipo rosetas, variando
grandemente em tamanho, podendo alcançar diâmetros acima de 0,1 µm, denominados de partículas alfa.
Existe uma grande variedade de polissacarídeos aniônicos denominados Glicosaminoglicanos (GAG).
Esses polissacarídeos são constituídos por cadeias longas, não ramificadas, formadas pela repetição de unida-
des contendo um ácido urônico e uma hexosamina, sendo assim, um dissacarídeo aminado. As GAGs pren-
dem-se a proteínas constituindo as Proteoglicanas.
Proteoglicanas são complexos formados por GAG sulfatada, ligada perpendicularmente, e a intervalos
regulares, a uma parte protéica central.
Glicoproteínas é o termo designado para as proteínas que contêm vários hidratos de carbono (monos-
sacarídeos diferentes), e por consequência, NÃO constituem unidades repetitivas, mas, formam cadeias rami-
ficadas. Exemplo – tireoglobulinas.
As Glicoproteínas que NÃO contêm grupamentos ÁCIDOS são denominadas NEUTRAS e aquelas que
possuem radicais CARBOXILA ou SULFATO, são chamadas de ÁCIDAS.
Histoquímica – A parte glicídica das Proteoglicanas e das Glicoproteínas Ácidas reage fortemente com o co-
rante Azul de Alcian.
O glicogênio e as Glicoproteínas NEUTRAS podem ser identificadas pela reação do PAS (Ácido Periódico
– reativo de Schiff).

Reação do PAS (Ácido Periódico – reativo de Schiff) (McManus, 1946)


A reação do PAS consta de dois mecanismos; são eles:

01. cortes de tecidos são submetidos ao ácido periódico que oxida os grupos hidroxila livres em dois á-
tomos de carbono adjacentes, como a ligação 1,2-glicol em hexose ou uma hidroxila e um aminogru-
po em dois átomos de carbonos adjacentes, em hexosamina. Os grupos são convertidos em grupa-
mentos aldeídos, sendo que a ligação carbono-carbono é clivada.
02. os grupamentos aldeídos resultantes reagem prontamente com o reativo de Schiff, produzindo um
complexo estável de cor magenta.

A ESPECIFICIDADE da reação do PAS é controlada pelo uso da enzima α-amilase.


Centrifugação fracionada
(Fracionamento Celular)

Definição – Centrifugação Fracionada é o processo físico que aplica a força centrífuga para separar organelas
celulares, de acordo com o coeficiente de sedimentação de cada uma delas.
Coeficiente de Sedimentação de uma partícula depende do tamanho, forma e densidade da mesma e
da densidade e viscosidade do meio.
Submetendo-se uma célula à ação de uma força centrífuga adequada, suas organelas se distribuem em
diferentes camadas. Em cada camada encontra-se um único tipo de organela e sua posição dentro da célula
dependerá do seu coeficiente de sedimentação.

Centrifugação Contragradiente – é um aperfeiçoamento da Centrifugação Fracionada. O gradiente consiste


em uma solução cuja concentração é máxima na parte mais profunda do tubo e mínima na superfície, apre-
sentando assim, um aumento gradual da concentração de cima para baixo.
Sobre este gradiente estabilizado coloca-se o homogeneizado celular e faz-se a centrifugação. As orga-
nelas migram em direção centrífuga e estabilizam (param) onde ocorre um equilíbrio entre a ação da força
centrífuga e a tendência de flutuação da organela.
As frações obtidas por qualquer técnica de Fracionamento devem ser examinadas quanto a sua pureza.
Para tal, podemos empregar os microscópios, óptico e/ou eletrônico ou métodos bioquímicos que demons-
tram na fração examinada, a predominância de um composto ou de uma molécula que lhe é característico.
Por exemplo, a fração lisossômica apresenta uma quantidade muito elevada da enzima fosfatase ácida, en-
quanto que, a fração nuclear é muito rica em DNA.

Com o Fracionamento Celular é possível estudar as organelas e inclusões isoladas, sua composição
química e sua atividade metabólica, fora da célula (método “extra-situm”).
Radioautografia

Definição – É uma técnica que permite detectar uma substância radioativa, relacionando-a às estruturas onde
se incorporou. Baseia-se na propriedade das radiações, emitidas pelos radioisótopos, de sensibilizarem emul-
sões fotográficas, produzindo imagens latentes nos cristais de halogenetos de prata, que aparecem como pon-
tos negros ao microscópio óptico.

Fases
1. Incorporação do radioisótopo
2. Tempo de Incorporação do radioisótopo
3. Aplicação da Película Fotográfica
a) Dipping (pasta)
b) Stripping film (película)
4. Tempo de Exposição
5. Processamento Fotográfico (Revelação e Fixação)

Cultura de Tecidos
Lipídios
1. Fixação
Antes de uma preparação histoquímica ser avaliada é essencial saber que Lipídios estão preservados
no corte. Secções não fixadas, teoricamente, seriam ideais para as reações histoquímicas, revelando um qua-
dro de Lipídios mais próximo da condição “in vivo”.
Entretanto, alguns tipos de Lipídios tendem a serem solúveis nos reagentes-corantes, de modo que al-
gum grau de preservação se faz necessário.

2. Microtomia
Cortes por congelação são necessários para a histoquímica de Lipídios uma vez que o processamento
para inclusão em parafina ou resinas poderá remover parcial ou totalmente, os Lipídios.
Assim, espécimens de tecido fresco devem ser congelados rapidamente, imersos em gases líquidos
(como o nitrogênio) ou com aerosol “Cryospray” e, em seguida, levados ao criostato para obtenção de cortes.
Algumas vezes, pequenos fragmentos de tecidos necessitam proteção de um meio inerte, como por
exemplo, gelatina solúvel em água.

3. Principais Técnicas para Evidenciação de Lipídios nos Tecidos


Sudan Black Β .......................... Gorduras e Fosfolipídios
Sulfato Azul do Nilo ................. Lipídios Ácidos e Gorduras Neutras
Digitonina-PAN ........................ Colesterol livre
Tetróxido de Ósmio .................. Lipídios Insaturados
PAS modificado ........................ Reação Plasmal para Fosfolipídios.
Imunocitoquímica