UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ARTES, CIÊNCIAS E HUMANIDADES (EACH)

BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA

ACH5534 -Fisiologia Humana II (2021)

Biogel conjugado com enzima anti-biofilme e

antibiótico para o tratamento alternativo de
infecção por Mycoplasma genitalium

Alunos: nº USP:
Aulus Machado 11369364
Daniel Schwanke 9895951
Gabriel Amaral 11204363
Gustavo Rocha 11204370
Ismael Elvis 11204662
Pedro Baptista 10822103

São Paulo, 2021

 1. INTRODUÇÃO

Mycoplasma genitalium é uma bactéria da família Mycoplasmataceae, dentro da

classe dos Mollicutes: bactérias sem parede celular, que parasitam animais e plantas, e que
são os menores microorganismos vivos. A M. genitalium foi primeiramente isolada em 1980,
em um estudo envolvendo homens com uretrite não gonocócica (TULLY, 1981). Por ser um
parasita obrigatório, é muito difícil cultivar este microrganismo in vitro, sendo que somente
na década de 90 foram possíveis estudos mais aprofundados sobre a fisiopatologia causada
por este microrganismo, devido ao desenvolvimento de um kit diagnóstico de PCR (JENSEN,
1991). Até os dias atuais, a presença desta bactéria já foi notificada nos sistemas respiratório,
digestório e urogenital, sendo que a maioria das doenças causadas por esta bactéria são
crônicas e acometem o sistema urogenital (BENEDETTI; CURRELI; ZELLA, 2020)
Em termos numéricos, a M. genitalium é detectada entre 1 e 3,3% da população geral
de homens e mulheres (SONNENBERG, 2015). Em homens a bactéria é altamente
relacionada com casos de uretrite não gonocócica, intensificando os problemas causados por
essa doença. A uretrite não gonocócica tem como sintoma o desconforto no momento de
urinar e de se relacionar sexualmente, além do corrimento uretral claro ou esbranquiçado
(MARQUES, et al, 2015). Em mulheres, comprovou-se conexão entre M. genitalium e
uretrite, cervicite, endometrite e doenças de inflamação pélvica, além de uma alta relação
com problemas de infertilidade. Todos estes quadros, quando não devidamente diagnosticados
e tratados, podem ser de grande desconforto para a mulher, pois levam a dores para urinar e
ter relações sexuais, além de corrimentos, sangramentos, febre, mal-estar, entre outros, e em
piores casos, o impedimento de gestação (COHEN, et al., 2002; REKHA et al., 2019). Todos
esses sintomas, tanto em homens quanto mulheres, levam a uma grande diminuição da
qualidade de vida, uma vez que criam barreiras para um dia a dia normal através dos
frequentes incômodos.
Os tratamentos existentes para a infecção de M. genitalium, além de prevenir a
transmissão sexual, são capazes de reduzir o risco de diversas complicações (OAKESHOTT,
et al, 2010). Vários antibióticos são utilizados, porém a bactéria tem se provado
extraordinária em criar resistência. A doxiciclina geralmente é o primeiro medicamento
utilizado, porém testes demonstraram que sua eficácia em erradicar a M. genitalium é baixa,
entre 30 e 40% (SCHWEBKE, et al, 2011). Já em um estudo realizado entre 2007 e 2011,
constatou-se que a eficácia da azitromicina, outro medicamento comumente utilizado para

1
esse tratamento, foi de 40% dos casos (MANHART, et al, 2013). O antimicrobiano de
segunda linha mais utilizado é o moxifloxacino, o qual apesar de ter apresentado boas taxas
de cura, assim como os outros apresentou uma redução nessas taxas. Tal declínio foi
observado essencialmente em regiões da Ásia, onde os tratamentos falharam em
aproximadamente 30% dos casos (JERNBERG, et al, 2008). Uma enorme quantidade das
cepas de M. genitalium apresentou coincidentes mutações ocasionadores de resistência a
macrolídeos, fazendo com que as variadas opções de tratamento se tornassem escassas
(TERADA, et al, 2012). Quando azitromicina e moxifloxacino falham, é utilizada
pristinamicina, e apenas na dose máxima recomendada, posto que os pacientes estão
enfrentando a última terapia antimicrobiana conhecida (READ, et al, 2018).
Como fora descrito, os diferentes antibióticos utilizados cada vez encontram mais
barreiras para curar os quadros de infecções urogenitais causadas por Mycoplasma
genitalium, em razão do vertiginoso aumento da resistência das cepas dessa bactéria aos
antibióticos. Desta maneira, faz-se necessário a criação de fármacos que contenham outros
componentes, além dos antibióticos.
Uma das possíveis formas de atenuação da patogenicidade da bactéria é através do
enfraquecimento do biofilme formado nas regiões infectadas. Biofilmes são comunidades
organizadas e funcionalmente coordenadas de bactérias que adentram matrizes poliméricas
constituídas por si mesmas. Estes congregados começam necessariamente através da adesão
de um pequeno número de células bacterianas a uma superfície. Cada espécie de bactéria se
movimenta de uma forma específica, e uma vez que “se reconhece” contra uma superfície,
inicia um processo de síntese de material polimérico, o qual possibilitará sua adesão à
superfície e também a outras células. Essas comunidades são altamente funcionais por
diversos fatores: maior acessibilidade de nutrientes; proteção mecânica contra agentes
externos; barreira contra mecanismos e células de defesa dos hospedeiros; maior facilidade de
transferência horizontal de genes (COSTERTON, 1999).
Tal processo foi observado em um estudo realizado com a Mycoplasma genitalium,
onde concluiu-se que grande parte do biofilme formado por esta bactéria permanece
altamente inafetado pelo tratamento antibiótico, como efeito da proteção gerada pelos
componentes do biofilme (DAUBENSPECK, 2020). No mesmo estudo citado, houveram
fortes evidências de que M. genitalium possui material extrapolissacarídico composto de
PNAG (poli-N-acetil-D-glucosamina), muito presente em diversas espécies de bactérias.
Sendo formado por resíduos de GLcNAc (N-acetil-D-glucosamina) conectados por ligações β

2
e parcialmente desacetilado (JOYCE, et al, 2003), a PNAG desempenha um papel essencial
na adesão intercelular e na aderência do biofilme a superfícies abióticas, assim como de
proteção contra as defesas do hospedeiro.
Em paralelo, demonstrou-se que o domínio C-terminal da enzima BpsB (proveniente
da bactéria Bordetella bronchiseptica) possui alta capacidade de hidrolisar glicosídeos,
clivando os dPNAG, componentes dos exopolissacarídeos de biofilmes. Isto coloca essa
enzima como um novo alvo das pesquisas para agentes terapêuticos focados em infecções
bacterianas com biofilme constituído deste polissacarídeo (LITTLE et al., 2015). A estrutura
da BpsB encontra-se abaixo na Figura 1.

Figura 1. Estrutura da proteína BpsB. Adaptado de (LITTLE et al., 2015). SS = sinal de

exportação periplasmática.

Considerando o potencial anti-biofilme da BpsB, tratamentos que aliem sua ação à de

um antibiótico podem incrementar significativamente as chances de cura.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Propor uma solução biotecnológica à doença sexualmente transmissível causada pela

bactéria Mycoplasma genitalium em mulheres. Em outros termos, através da elaboração de
um biogel administrado via intravaginal, composto por antibióticos e enzima recombinante, a
fim de conter e prevenir o desenvolvimento do patógeno.

2.2 Objetivos específicos

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 ● Elaborar um gel bioadesivo que compile o antibiótico azitromicina de efeito
comprovado contra Mycoplasma genitalium e enzimas recombinantes BpsB
com o intuito de conter a proliferação do biofilme bacteriano;
● Realizar testes de segurança para análise de toxicidade e efeitos colaterais;
● Administrar esse biogel via injeção intravaginal.

3. Materiais e métodos

3.1 Produção da Enzima Recombinante BpsB

3.1.1 Cultivo da bactéria Bordetella bronchiseptica e de Mycobacterium genitalium

Cepas isoladas de Bordetella bronchiseptica serão obtidas de REGISTER et al (2015). O

cultivo da bactéria será feito em Brilliant Green Agar, acrescido com 10% de sangue de
ovelha desfibrinado. Em meio líquido, o cultivo foi realizado a 37°C em meio Stainer Scholte
(TAYLOR-MULNEIX et al., 2017). Em seguida, após obter biomassa celular suficiente,
realizou-se protocolo de extração de DNA genômico (ATASHPAZ et al., 2010).

Cepas isoladas de Mycobacterium genitalium serão obtidas por parceria com o laboratório
UAB diagnostic Mycoplasma (EUA). Placas de 96 poços serão mergulhadas em solução
contendo meio SP4. Em seguida, colônias de Mycoplasma genitalium serão inoculadas em
cada um dos poços, sendo que será observada a formação de biofilme nos poços. Será seguido
o protocolo descrito em DAUBENSPECK et al. (2020) para preparação de amostra para
visualização em microscópio eletrônico de varredura.

3.1.2 Clonagem do gene BpsB

A sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína BpsB foi obtida de:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JGWQ01000080.1?from=29356&to=31461. O código
de acesso desta sequência é JGWQ01000080.1. Amplificou-se BpsB por PCR a partir do
DNA genômico de Bordetella bronchiseptica B20-10725633 obtido por cortesia do grupo de
pesquisa do Harvill lab (University of Georgia, EUA). Não se amplificou o gene inteiro,
devido à sequência sinal periplasmática existente entre os aminoácidos 1 e 26. Portanto,
iniciou-se a amplificação a partir do nucleotídeo 81 do gene (LITTLE et al., 2015). Os

4
primers forward e reverse foram criados a partir do software SnapGene 5.3.1, sendo que se
acrescentaram em suas sequências sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. A
sequência do primer forward utilizado foi 5’ TTTGGATCCCTACCTCTGCGTCGGCTC 3’
(Sequência de reconhecimento de BamHI está sublinhada, Tm = 66°C), enquanto que a
sequência do primer reverse foi 5’ TTTCATATGATGTACAAGGTGGACATGCTCCC 3’
(Sequência de reconhecimento de Ndel está sublinhada, Tm= 63°C). Foi necessário inserir
um códon de iniciação (metionina) no primer reverse. As sequências TTT, presentes nos dois
primers, são uma recomendação da SnapGene para melhorar a atividade catalítica das
enzimas de restrição. Após a amplificação do gene, separou-se o fragmento de interesse de
2,1 kb dos outros fragmentos genômicos por eletroforese em gel de agarose. Em seguida, o
produto da PCR foi digerido pelas enzimas de restrição BamHI e NdeI, de forma a conseguir
realizar a inserção no plasmídeo pET-24c(+) (http://www.addgene.org/), que foi digerido de
forma idêntica. Este plasmídeo inclui sequência His-tag, que será usada posteriormente para
purificação da enzima. Para simular a inserção do fragmento no plasmídeo utilizou-se o
software SnapGene 5.3.1. Após a clonagem obteve-se o plasmídeo
pET-24c(+)-BpsB-DA-GH, representado nas figuras 2 e 3. Para confirmar que o plasmídeo
apresenta as sequências de interesse, será feita eletroforese em gel de agarose nas condições
descritas na Figura 4. Em seguida, Escherichia coli eletrocompetentes BL21 (DE3)
receberão o plasmídeo pET-24c(+)-BpsB-DA-GH através de eletrocorporação. Serão
selecionados os clones sobreviventes em ampicilina.

3.1.3 Expressão da enzima recombinante

A cultura submersa para a preparação dos pré-inóculos e inóculos será realizada no meio
líquido Luria-Bertani (LB, triptona 1%, NaCl 1%, extrato de levedura 0,75%) acrescido de
ampicilina 150 µg/mL. Os frascos permanecerão no agitador orbital a 37°C, sob agitação
constante de 200 rpm. Para a indução da proteína recombinante será utilizado isopropil
β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG, Sigma Aldrich, USA). Inicialmente, deverá ser feito um
estudo para otimizar a expressão da proteína recombinante. Para isso, os seguintes parâmetros
serão determinados: melhor momento de indução de acordo com a curva de crescimento da
bactéria, concentração de IPTG ótima, tempo de indução ótimo e temperatura de indução
ideal. Desta forma, será possível já em Erlenmeyer selecionar os parâmetros ideais para a
expressão da proteína recombinante. Estes parâmetros deverão ser escalonados para os

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biorreatores, no qual deverão ocorrer estudos da concentração ótima de oxigênio e
determinação de parâmetros de transferência de massa (KAUR; KUMAR; KAUR, 2018).

3.1.4 Purificação da enzima

A centrifugação das células para separação do meio de cultura será realizada a 5000 g por 15
min a 4°C. Em seguida, as células serão ressuspendidas em tampão de lise fosfato de sódio
50mM e lisadas por sonicação. O debris celular será separado por centrifugação e espera-se
que a proteína esteja na fração solúvel (sobrenadante). O processo de purificação da enzima
será realizado baseado na cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados
utilizando a coluna HisTrap.

Figura 2. Representação do plasmídeo pET-24c(+)-BpsB-DA-GH gerada pelo software SnapGene.

BamHI e NdeI foram as enzimas de restrição utilizadas. Baseado em (TAN et al., 2015).

6
Figura 3. Simulação da criação do plasmídeo pET-24c(+)-BpsB-DA-GH através do software
SnapGene. O genoma de Bordetella bronchiseptica está omitido na figura, sendo visível somente o
gene BpsB.

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Figura 4. Simulação de eletroforese em 1,2% de agarose gerada pelo software SnapGene 5.3.1,
supondo utilização do tampão de corrida Tris/Borato/EDTA (TBE) e coração com brometo de etídio.
MW = marcador de peso molecular de DNA (1 kb DNA Ladder, New England Biolabs); 1 =
Plasmídeo pET-24c(+); 2 = Plasmídeo pET-24c(+) cortado pelas enzimas de restrição NdeI e BamHI ;
3 = Plasmídeo pET-24c(+)-Bps-DA-GH ; 4 = Plasmídeo pET-24c(+)-Bps-DA-GH cortado pelas
enzimas NdeI e BamHI; 5 = Produto da PCR de Bps-DA-GH. Baseado em (ISHIDO; ISHIKAWA;
HIRANO, 2010).

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3.2 Antibiótico

Como dito anteriormente, os tratamentos mais comuns para o Mycoplasma genitalium

recomendado são com os antibióticos doxiciclina ou azitromicina. Mesmo com algumas
contradições de resultados em pesquisas sobre azitromicina, alguns estudos sugerem que uma
dose única de 1g do fármaco é mais efetiva do que múltiplas doses de doxiciclina para este
tratamento (MENA, 2009).
O nome químico da azitromicina é “9-deoxi-9a-aza-9a-metil-9a-homoeritromicina A”,
e é produzido pela inserção de um átomo de nitrogênio no anel lactônico da eritromicina A.
Seu mecanismo de ação se inicia por sua ligação ao 23S rRNA da subunidade ribossômica
50S na bactéria. Desta forma, a síntese proteica bacteriana é bloqueada através da inibição da
transpeptidação/translocação, que por sua vez inibe a montagem da subunidade ribossômica
50S (WYETH, 2019), bloqueando a síntese de RNAm da bactéria e levando à sua morte
(GAREY, 1999).
A azitromicina é um fármaco aprovado para uso no Brasil, segundo a Anvisa. Sua
detentora no país é a “MEDQUIMICA INDUSTRIA FARMACEUTICA LTDA”, e sua
comercialização é realizada por diversas farmácias (ANVISA, 2021). O medicamento pode
ser encontrado em farmácias comuns com o preço de R$12,00 a grama. Por conta da sua
eficácia e viabilidade econômica, a azitromicina será o fármaco escolhido para atuar na ação
antibiótica do bioproduto contra a Mycoplasma genitalium.

3.3 Gel Bioadesivo Termossensível

Novos tratamentos propostos e aplicados para doenças que afetam os aparelhos

genitálio e excretor humano utilizam estratégias alternativas a “fármacos clássicos”
administrados por via oral, os quais correm risco de sofrer metabolismo de primeira passagem
no fígado, e, assim, perderem efeito (SHERIF et al., 2018). Uma dessas estratégias é a
utilização de um gel bioadesivo aplicado in situ, sendo que este gel forma um sistema de
liberação de fármaco controlado por diversos estímulos (JOHAL et al., 2016).
Géis termossensíveis possuem uma baixa viscosidade inicial, porém com o aumento
de temperatura ocorre um brusco aumento da viscosidade, facilitando a aplicação e mantendo
a propriedade de gel. Alguns polímeros termossensíveis, utilizados em géis termossensíveis,
também possuem ação bioadesiva, como a quitosana (NAGARWAL e PANDIT, 2008),

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característica que pode ser de grande utilidade para formulação de géis para sistemas de drug
delivery, como os citados neste trabalho.

3.3.1 Gel intravaginal

A vantagem da aplicação de medicamentos via intravaginal se deve principalmente ao

fato de que o tratamento é realizado de forma direta, prevenindo efeitos fora da região da
vagina (esquema detalhado na Figura 5) (COOK e BROWN, 2018; SILVA et al., 2020). Além
disso, há o aproveitamento do efeito de primeira passagem uterina, que se refere à passagem
preferencial de um fármaco aplicado via intravaginal para o útero (SILVA et al., 2020). Esse
efeito é benéfico no caso de tratamento contra a M. genitalium, já que essa bactéria é
altamente relacionada a casos de doença inflamatória pélvica e endometrite (COHEN et al.,
2002). Por possuir uma grande área de superfície e possuir uma densa rede de irrigação
sanguínea, o epitélio vaginal apresenta alta permeabilidade de fármacos, na maioria dos casos
maior que a de outras vias, como a retal, bucal e transdérmica, sendo menor somente que a
das vias nasal e pulmonar (SILVA et al., 2020). Por outro lado, algumas substâncias podem
encontrar dificuldade para penetrar na mucosa vaginal, e isso pode ser contornado por agentes
mucoadesivos, como o Carbopol®, pois permitem um contato próximo e contínuo com o
epitélio vaginal (ALVES, 2018).

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 Figura 5. Fluxograma representativo das vantagens da administração vaginal de fármacos (SILVA et
al., 2020).

Tendo em vista uma maior capacidade bioadesiva juntamente a um maior controle de

liberação de medicamento, utilizaremos um gel com 20% poloxamer 407, 0,2% Carbopol® e
0,2% de carragenina, que resultará em uma temperatura de gelificação de 23,5 °C. Uma
comparação de viscosidade entre essa e outras formulações do gel está presente na Figura 6).
Experimentos in vivo realizados em ratas mostraram que o fármaco continuou sendo liberado
pelo gel mesmo após 12h. Foram mensuradas as quantidades de fármaco remanescentes na
vagina após 0, 3, 6, 9 e 12 horas da aplicação do gel. Os resultados aproximados foram os
seguintes, respectivamente: 91, 73, 18, 14 e 8% (LIU et al., 2009).

A administração do gel será realizada com o auxílio de aplicador ginecológico.

11
 Figura 6. Curva de viscosidade em relação a temperatura de diversas formulações do gel (LIU et al.,
2009).

3.3.2 Obtenção dos componentes do gel

Poloxamer 407 (Lutrol® F127, F127) será comprada da BASF

(Ludwigshaften, Germany). Carragenina (k-Carrageenan) será comprada da FTA Co.
(Shanghai, China). Carbopol 934P-NF (Carbopol®) será comprado da Noveon Inc.
(Cleveland, OH, USA). Albumina de soro bovino, necessária para o “método Cold”, será
comprada da Sigma (St. Louis, MO, USA). Todos os outros componentes são de grau
analítico (LIU et al., 2009).

3.3.3 Preparação do gel intravaginal

A preparação do gel será realizada da seguinte maneira, adotando o “método

Cold” com pequenas alterações, de acordo com LIU et al. (2009):

- Faz-se solução de carragenina em água pura entre 70 e 80 °C para estoque;

- Adiciona-se a solução de carragenina juntamente ao poloxamer 407 e ao Carbopol®;
- Mantém-se a mistura adquirida a 4 °C até completa solubilização do poloxamer 407 e
do Carbopol®;
- Realiza-se a mistura dos fármacos no gel até completa solubilização, se necessário
utiliza-se um agitador eletromagnético.

12
 - A concentração de enzima BpsB no gel deve ser entre 0,8 µM - 1,2 µM, conforme
previsto segundo ensaios de redução de biomassa de biofilme de diferentes espécies
(LITTLE et al., 2015).

3.4 Procedimento Operacional Padrão (POP)

O procedimento operacional padrão (POP) padroniza o design do gel bioadesivo contendo

azitromicina e BpsB recombinante, interligando a relação de todos os componentes na
metodologia. O POP se encontra em anexo na última página deste documento. Para testar o
efeito do bioproduto, a formulação de biogel adesivo-BpsB-azitromicina será testada de
forma padronizada em cada um dos poços de microplaca com Mycobacterium genitalium,
variando as concentrações dos componentes dentro de um limite de toxicidade, para que se
possa determinar a concentração ideal dos componentes do bioproduto. Espera-se que o
bioproduto cause uma redução na biomassa de biofilme, o que poderá ser verificado pelo
método cristal violeta. Além disso, a microscopia de varredura eletrônica ajudará a
determinar se houve mudança na estrutura dos biofilmes (LITTLE et al., 2018).

3.5 Análise de mercado

Conforme anteriormente mencionado, o fármaco e seu sistema de liberação proposto

tem como objetivo tratar mulheres infectadas por M. genitalium, em casos onde o tratamento
inicial recomendado não erradique a infecção da bactéria, a qual afeta em grande parte dos
casos o sistema reprodutor feminino. Assim, empresas farmacêuticas que produzem e vendem
medicamentos direcionados a tais sistemas ou a infecções bacterianas podem se interessar e
comprar a tecnologia proposta, podendo-se citar a Bayer, a Astellas e a Apsen como
exemplos de empresas multinacionais do ramo de bastante destaque e poder no mercado,
capaz de produzir e comercializar o bioproduto proposto em grande escala. Logo, o setor
farmacêutico, biotecnológico, voltado para a área da saúde, além de que médicos
ginecologistas podem ter grande interesse em utilizar a tecnologia proposta para tratar
pacientes infectados por M. genitalium, e, finalmente, os pacientes também seriam bastante
beneficiados pelo tratamento.

3.6 Bem social do projeto

Mulheres infectadas por M. genitalium poderão ter acesso a um tratamento

biotecnológico inovador e de grande eficácia contra a bactéria e contra seus efeitos

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inflamatórios, caso o tratamento inicial recomendado não seja eficaz.
Como descrito anteriormente, o patógeno além de gerar desconfortos e inflamações na
região genital em ambos os sexos, pode gerar sangramentos e febre particularmente a
mulheres, gerando uma grande sensação de mal-estar. Assim, o bioproduto e o tratamento
proposto visam melhorar a saúde sexual e o bem-estar geral dos pacientes.

3.7 Regulamentação do bioproduto

A solicitação de registro do bioproduto e de seu método de administração será enviado

para Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) a fim de que o órgão especializado os
avaliem e envie, se for aceito, o protocolo a ser seguido de acordo com a complexidade da
tecnologia e com os seus benefícios clínicos e socioeconômicos. Como no caso de qualquer
estratégia farmacêutica inovadora, é fundamental realizar as próximas etapas do processo de
pesquisa e desenvolvimento de fármacos para atestar a segurança e a eficácia da tecnologia.
Por isso, após a pesquisa sobre o candidato a fármaco e outros materiais, deve-se
realizar testes pré-clínicos usando modelo animal e testes clínicos para avaliar a segurança
(analisando a toxicidade e os efeitos colaterais da azitromicina, da enzima recombinante PgaB
e do gel termossensível in vivo, fazendo o mesmo para o bioproduto como um todo, em testes
com animais modelos e com voluntários humanos) e a eficácia do bioproduto e do tratamento
propostos. É importante destacar que os testes pré-clínicos e clínicos ocorrerão conforme os
protocolos do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo (FMUSP) nas etapas de testes in vivo utilizando modelo animal e nos testes
clínicos com voluntários humanos, os quais devem preencher um termo de adesão ao estudo
clínico, informando tudo acerca do estudo, incluindo os possíveis riscos à saúde do
tratamento proposto, a fim de que estejam bem cientes antes de se voluntariar como cobaias
para essa etapa do projeto.
Finalmente, após a aprovação do bioproduto pela Anvisa, o mesmo deverá ser
vendido com uma bula e rótulo que contenham todas as informações exigidas, incluindo a
necessidade da aplicação exclusiva médica ou de profissionais da saúde especializados do
fármaco para que não ocorram problemas na aplicação e para que tanto os profissionais da
saúde, quanto os pacientes estejam cientes da eficácia, segurança e possíveis riscos do
bioproduto. Da mesma forma que outros fármacos, deverá ser realizada a vigilância do
fármaco para avaliar continuamente a eficácia e a segurança do fármaco a fim de que o

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bioproduto não cause problemas ou perca sua efetividade ao longo de sua fabricação e venda.
Resumindo, as etapas de surgimento de novos fármacos se encontram na Figura 7.

Figura 7. Esquema ilustrativo do processo de Pesquisa e Desenvolvimento de fármacos. Adaptado do

Boletim ISMP Vol 9 n2, Abril de 2020.

4. RESULTADOS ESPERADOS

A infecção por Mycoplasma genitalium já acomete cerca de 3% da população e tem

sido associada a outras inflamações, como a doença inflamatória pélvica, endometrite aguda e
anexite. Ademais, tem-se observado cepas resistentes aos diferentes tipos de antibióticos
administrados atualmente. Estes fatos evidenciam a necessidade de novos tratamentos mais
efetivos para conter o patógeno (HAGGERTY, 2008; FALK, ENGER, JENSEN, 2015).
É esperado que, com a aplicação do biogel via administração intravaginal, a bactéria
seja combatida em duas vias distintas, porém compiladas em um mesmo bioproduto. A
primeira via seria a ação local do antibiótico azitromicina para inibir a montagem da
subunidade ribossômica 50S da Mycoplasma genitalium, essencial para sua sobrevivência.
Desta forma, será realizada uma ação direta no local de infecção do patógeno (vagina e útero
feminino) sem, no entanto, agredir demasiadamente as paredes e os tecidos desses órgãos.
(WYETH, 2019)
Ademais, espera-se que, conforme a adesão do gel na vagina, além da ação do
antibiótico, a enzima recombinante BpsB seja capaz de clivar o exopolissacarídeo formado

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por PNAG para que as bactérias percam o fator de proteção que provém do biofilme -
incrementando a capacidade da azitromicina de atacar a bactéria (LITTLE et al., 2018).

Pode ser que o corpo forme anticorpos contra BpsB recombinante e, desta forma,
inviabilize a eficácia do bioproduto. Para contornar este problema, poderiam ser feitas
mutações nos epítopos da superfície de BpsB que são reconhecidos por células do sistema
imune. Desta forma, a concentração de anticorpos anti-BpsB diminuiria substancialmente.
Este procedimento deve ser feito com cautela, para não afetar a atividade catalítica da enzima
(MAZOR; KING; PASTAN, 2018).
No que se refere a aplicação de teste clínicos e pré-clínicos de segurança, serão
avaliados os possíveis efeitos colaterais e toxicológicos e espera-se que o bioproduto seja
aprovado pela Anvisa. Essa seria uma imprevisão da elaboração do bioproduto, visto que não
se sabe exatamente o comportamento do antibiótico e da enzima dentro do gel.
E por fim, imagina-se que, após a aplicação do gel, em pouco tempo suas
propriedades comecem a agir, já que a liberação dos fármacos começa muito rapidamente,
resultando no desaparecimento dos sintomas em poucos dias e, consequentemente, no retorno
da normalidade na vida dos até então infectados.
Vale ressaltar que se trata de uma tecnologia inovadora mas que, no entanto, possui
custo relativamente baixo, fazendo com que seja um tratamento mais acessível para a
população. E no Brasil, por exemplo, isso é de suma importância, visto que o sistema único
de saúde (SUS) possui uma verba anual fixa a ser destinada para tratamentos e medicamentos
para a população. Desta forma, trata-se de um projeto que visa contribuir, também, para a
democratização dos medicamentos e tratamentos.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A infecção por M. genitalium é tratada atualmente utilizando antibióticos

administrados por via oral, os quais sofrem metabolismo de primeira passagem e,
consequentemente, perdem parte de seu efeito original, além de que não são tão eficientes
quando as bactérias formam biofilmes. Desse modo, o presente projeto inova na estratégia de
drug-delivery e administração, utilizando um gel bioadesivo específico para vagina, cuja
aplicação in situ é inédita no tratamento dessa infecção bacteriana e evita o metabolismo de
primeira passagem. Ademais, o projeto é inovador devido ao fato de conter, em sua
formulação, não só azitromicina, antibiótico potente contra M. genitalium, mas também a

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enzima recombinante PgaB, capaz de desfazer biofilmes formados por essa bactéria, evitando
maior resistência patogênica. Logo, é um projeto com grande potencial, que utiliza técnicas
biotecnológicas modernas e inéditas para o tratamento da infecção por M. genitalium.

As figuras abaixo resumem visualmente os procedimentos para viabilização prática do projeto

descrito neste documento.

5.1. Esquema da Clonagem do Gene BpsB

5.2. Esquema da Expressão e Purificação da Enzima Recombinante

17
5.3. Esquema visual da Produção do Gel Intravaginal

5.4. Esquema visual macro do Projeto

6. BIBLIOGRAFIA

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21
22
 BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ANEXO I - PROTOCOLO EXPERIMENTAL PADRÃO

NOME: Biogel conjugado com enzima anti-biofilme para o tratamento alternativo de infecção por
Mycoplasma genitalium

OBJETIVO Padronizar o design dos géis bioadesivo contendo azitromicina e BpsB recombinante.

1. Produção de BpsB recombinante

Procedimentos Riscos
Produção: Criar primers
a) Isolar o DNA genômico em quantidade adequada de Bordetella corretamente para que não
bronchiseptica sejam complementares entre
b) Amplificar por PCR o gene BpsB utilizando primers contendo sítios de si; armazenar as enzimas de
restrição; restrição e DNA genômico na
c) Separar o fragmento de interesse por eletroforese em gel de agarose e utilizar temperatura adequada; evitar
de utilizar a mesma ponteira
enzimas de restrição BamHI e NdeI para digerir o produto da PCR e o
em diferentes amostras;
plasmídeo. Utilizar DNA ligase para circularizar a molécula; trabalhar em um fluxo
d) Utilizar eletroforese em gel de agarose nas condições indicadas (Fig. 4) para laminar; Esterilizar materiais
detectar se houve sucesso na clonagem do vetor pET-24c(+)-BpsB-DA-GH. biológicos após o uso para
Confirmar a sequência do plasmídeo com sequenciamento; evitar dispersão de
e) Inserir o plasmídeo em Escherichia coli eletrocompetentes BL21 (DE3) por transgênicos;
eletrocorporação e selecioná-las com ampicilina; Aplicação: reação alérgica
(imunogenicidade à proteína
f) Cultivar Escherichia coli em meio de cultura LB. Determinar os parâmetros
recombinante); possível perda
ótimos para produção da proteína em Erlenmeyer; de eficácia da enzima BpsB
g) Induzir a proteína recombinante com isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida após a formação de
(IPTG, Sigma Aldrich, USA); anticorpos humanos
h) Centrifugar e lisar as células. A proteína de interesse BpsB estará no
sobrenadante e deve ser purificada,
i) Aplicar cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados
utilizando a coluna HisTrap para obter a proteína purificada.
ETAPAS j) Caso seja verificado que a proteína recombinante BpsB causa formação de
anticorpos que inibem sua função in vivo, seguir o método de mutação
direcionada para produção de proteínas recombinantes sem epítopos
reconhecidos por células do sistema imune.

2. Antibiotico azitromicina
Procedimentos Riscos
a) Comprar azitromicina Aplicação: náuseas, dores de
cabeça, dores no abdômen

3. Síntese do gel Bioadesivo Termossensível

Procedimentos Riscos
I) Gel intravaginal Produção: utilização de
a) Seguir o “método Cold”; quantidade errada de
b) Fazer solução de carragenina em água pura entre 70 e 80 °C para estoque; componente pode gerar
toxicidade.
c) Adicionar a solução de carragenina juntamente ao poloxamer 407 e ao
Aplicação: obstrução do colo
Carbopol®; do útero, dificultando ou
d) Manter a mistura adquirida a 4 °C até completa solubilização do poloxamer impedindo passagem de fluxo
407 e do Carbopol®; menstrual; interação entre as
e) Realizar a mistura dos fármacos no gel até completa solubilização, se substâncias aplicadas e o gel
necessário utiliza-se um agitador eletromagnético. pode gerar efeitos colaterais
que devem ser investigados
nos testes.
 II) Integração dos fármacos

a) Adicionar antibiótico na concentração indicada no gel;

b) Adicionar BpsB recombinante na faixa de concentrações indicadas;
c) Deixar sistema em repouso;
d) Armazenar em condições ideais;
e) Testar a inibição da formação de biofilme de Mycoplasma genitalium in
vitro e in vivo, variando as concentrações dos bioprodutos para chegar na
melhor formulação com menores efeitos adversos.
f) Eventualmente acrescentar mais moléculas ao bioproduto, como
estabilizantes e antiinflamatórios

Referências

KAUR, J.; KUMAR, A.; KAUR, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in
E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of Biological Macromolecules, v.
106, p. 803–822, 2018;

LIU, Y. et al. Effect of carrageenan on poloxamer-based in situ gel for vaginal use: Improved in vitro
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SHERIF, A. Y.; M., Gamal Mohamed; ALANAZI, Fars Kaed. Novel in-situ gel for intravesical
administration of ketorolac. Saudi Pharmaceutical Journal, v. 26, n. 6, p. 845-851, 2018;

MAZOR, R.; KING, E. M.; PASTAN, I. Strategies to Reduce the Immunogenicity of Recombinant
Immunotoxins. American Journal of Pathology, v. 188, n. 8, p. 1736–1743, 2018.