Universidade Federal Fluminense Instituto de Química Programa de Pós-Graduação em Química

Universidade Federal Fluminense
Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Eduardo da Silva Gomes de Castro
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO

DIRETA DE SORBITOL E GLUTAMATO EM AMOSTRAS PRÉ-
VACINAIS UTILIZANDO A ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO
INFRAVERMELHO MÉDIO COM TRANSFORMADA DE FOURIER
(FTIR)
Niterói
2012
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DE

SORBITOL E GLUTAMATO EM AMOSTRAS PRÉ-VACINAIS UTILIZANDO A
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO MÉDIO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)
Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para a obtenção do Grau
de Mestre em Química
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Jorgensen Cassella
Niterói
2012
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DE

SORBITOL E GLUTAMATO EM AMOSTRAS PRÉ-VACINAIS UTILIZANDO A
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO MÉDIO COM
Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para a obtenção do Grau
de Mestre em Química
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Jorgensen Cassella – Orientador
________________________________________________
Prof. Dr. Aderval Severino Luna
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
________________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Azevedo Bagueira
Niterói, fevereiro de 2012.

Agradecimentos
 A minha mãe, por todo incentivo e dedicação ao longo da vida que, sem os
quais este momento nunca chegaria;
 Ao professor Ricardo por toda a paciência e esforços despendidos ao longo

da orientação deste trabalho;
 A Anelyse por todo o companheirismo, além da compreensão nos momentos

de ausência;
 Aos grandes amigos Melissa e Lauro pelas valiosas sugestões que ajudaram
a compor este trabalho;
 Para os demais companheiros do Laboratório Físico-Químico (LAFIQ) pelo

importante apoio durante os últimos anos.
Resumo
As metodologias de referência para controle de qualidade de vacinas, tradicionalmente

envolvem técnicas de pré-tratamento de amostras onde a utilização de solventes, extração
e/ou diálise de material excipiente, por vezes, se faz necessária. Tais metodologias são
caras, lentas, insalubres, além de exigirem meticulosas manipulações da amostra, criando
uma potencial fonte de erro analítico. Isto é, estas metodologias encontram-se hoje na
contramão das tendências da Química Analítica Aplicada moderna. O objetivo deste
trabalho foi desenvolver uma metodologia para o controle de qualidade de amostras pré-
vacinais empregando a técnica da Espectrometria no Infravermelho Médio com
Transformada de Fourier (FTIR). A vantagem vislumbrada foi a eliminação da etapa de
preparação da amostra e o desenvolvimento de uma metodologia simples, rápida, barata,
com menor geração de resíduos e pouca manipulação da amostra. Para tanto, foram
utilizadas amostras do termoestabilizador da Vacina contra Febre Amarela produzidos pela
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) no Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-
manguinhos). O termoestabilizador estudado é constituído de L-Glutamato de sódio
monohidratado, Sorbitol e Gelatina bovina hidrolisada. A nova metodologia buscou a
determinação tanto de L-Glutamato de sódio monohidratado quanto de Sorbitol, e foi
otimizada sob seus principais parâmetros de análise, isto é, resolução espectral, número de
varreduras, região espectral e correção de linha de base. O instrumento utilizado foi um
espectrômetro de absorção no infravermelho médio com Transformada de Fourier, da marca
Thermo, modelo 4700, equipado com acessório de Reflectância Total Atenuada (ATR). Para
a manipulação dos espectros obtidos das amostras e soluções-padrão, além da construção
das curvas analíticas e de adição-padrão, foram empregados os softwares OMNIC e
TQAnalyst. Após a otimização, as melhores condições de análise obtidas foram: 64 Scans, 4
cm-1 de resolução espectral e correção de linha de base em 2 pontos; 1369 – 1332 cm-1 para
L-glutamato de sódio e 910 – 825 cm-1 para Sorbitol com 32 scans e 2 cm-1 de resolução
espectral. Ensaios de recuperação foram efetuados obtendo-se valores médios de 99,5% e
100,6% para L-Glutamato de sódio e Sorbitol, respectivamente. As precisões obtidas em
termos dos coeficientes de variação para três determinações independentes das amostras
foram sempre menores do que 4% tanto para L-Glutamato de sódio como para Sorbitol. O
limites de detecção e quantificação para os métodos foram respectivamente de 0,19 e
0,62% (m/v) para L-glutamato de sódio e 0,98 e 3,28% (m/v) para Sorbitol. A fim de avaliar a
exatidão da metodologia proposta para determinação de sorbitol, utilizou-se a técnica da
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), recomendada pela Farmacopéia
Americana. Quanto à exatidão da metodologia para determinação de L-glutamato de sódio,
utilizou-se a técnica da espectrofotometria UV/vis com reação enzimática da L-glutaminase.
Não ficou evidenciada diferença significativa entre os resultados obtidos por ambos os
métodos ao nível de confiança de 95%.
Palavras-Chave: Espectroscopia de absorção no infravermelho médio com transformada de

Fourier (FTIR), Reflectância Total Atenuada (ATR), Termoestabilizador, L-glutamato de
sódio, Sorbitol.
Abstract
The reference methods usually employed for the quality control of vaccines generally
involves pre-treatment of the samples. Such methods are expensive, slow, unhealth
and sometimes require meticulous manipulation of the samples, creating a potential
source of bias. The main goal of this study was to develop a methodology for the
quality control of thermostabilizers used in the preparation of the vaccine for the
yellow fever, employing the Fourier Transform Infrared Spectrometry (FTIR)
technique. The main advantage was the elimination of the separation step,
developing a simple, fast and inexpensive method with less waste generation and
minimum manipulation of the sample. For this purpose, some Yellow Fever
thermosabilizers samples made at Immunobiological Institute of Technology (Bio-
manguinhos) in Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ) were used. The
thermostabilizer consists of Sodium L-glutamate monohydrate, Sorbitol and
hydrolysed bovine gelatin. The new methodology aimed to determine both Sodium L-
glutamate monohydrate and Sorbitol and was optimized taking into account the main
analytical parameters involved in the FTIR technique such as the spectral resolution,
number of scans, spectral bands and baseline correction. A Thermo model 4700
Fourier Transform Infrared spectrometer, equipped with an Attenuated Total
Reflectance accessory was employed for FTIR spectra acquisition. For handling the
spectra of samples and standards, and the construction of calibration curves and
standard addition, OMNIC and TQAnalyst softwares were employed. After
optimization, the best conditions for the analysis were obtained: 64 scans, 4 cm -1 of
spectral resolution and baseline correction at 2 points from 1369 to 1332 cm -1 to
sodium L-glutamate and from 910 to 825 cm-1 to sorbitol with 32 scans, 2 cm-1 of
spectral resolution. Recovery tests were performed yielding mean values of 99.5%
and 100.6% for sodium L-glutamate and sorbitol, respectively. The precision was
estimated through three independent determinations of the analytes and were always
lower than 4%. The limits of detection and quantification were, respectively, 0.19 and
0.62% (m/v) for sodium L-glutamate and 0.98 and 3.28% (w/v) for sorbitol. In order to
evaluate the accuracy of the proposed methodology for the determination of sorbitol,
the results obtained in the analysis of ten samples were compared with those
obtained by the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method, which is
recommended by United States Pharmacopeia (USP). The accuracy of the
methodology for the determination of sodium L-glutamate was tested by comparison
with the spectrophotometric method, based on the measurement of the product of the
enzymatic reaction of the analyte with L-glutaminase. In both cases, there were no
significant differences between the results obtained by the developed and reference
methods at a confidence level of 95%.
Keywords: Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR), Attenuated Total

Reflectance (ATR), Thermostabilizer, Sodium L-glutamate, Sorbitol.
Lista de Tabelas
Página
Tabela 1: Massas de L-Glutamato de sódio e Sorbitol utilizadas no preparo das amostras em laboratório.............. 57
Tabela 2: Preparo da curva analítica para a determinação espectrofotométrica de L-glutamato.............................. 63
Tabela 3: Números de ondas das bandas selecionadas para L-glutamato de sódio e sorbitol................................. 74
Curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio obtidas para as três bandas previamente
Tabela 4: selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à 76
altura................................................................................................................................................................
Tabela 5: 76
selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à área.......................
Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as quatro bandas previamente
Tabela 6: 76
selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à altura.....................
Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as quatro bandas previamente
Tabela 7: 76
selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à área.......................
Avaliação prévia da qualidade das medições em termos do erro relativo para diferentes bandas obtidas
Tabela 8: 77
em altura e área sem correções na linha de base para o L-glutamato de sódio.............................................
Tabela 9: 77
em altura e área sem correções na linha de base para o Sorbitol................................................................
Tabela 10: selecionadas, traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à 78
altura..............................................................................................................................................................
Tabela 11: selecionadas, traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à 78
área...............................................................................................................................................................
Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as três bandas previamente selecionadas,
Tabela 12: 78
traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à altura...................
Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as três bandas previamente selecionadas,
Tabela 13: 79
traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à área.....................
Tabela 14: 79
em altura e área com a linha de base corrigida em dois pontos para o L-glutamato de sódio.....................
Tabela 15: 80
em altura e área com a linha de base corrigida em dois pontos para o Sorbitol..........................................
(a) esquerda. Apresentação dos resultados para cada uma das curvas em uma amostra de concentração
desconhecida de termoestabilizador e (b), direita. Teste F com 95% de confiança realizado com as
Tabela 16: 84
variâncias dos resultados obtidos com as curvas analítica e de adição padrão para L-glutamato de
sódio........................................................................................................................................
Teste t, assumindo variâncias diferentes para as curvas analítica e de adição padrão de L-glutamato de
Tabela 17: 85
sódio..............................................................................................................................................................
(a) esquerda. Apresentação dos resultados para cada uma das curvas em uma amostra de concentração
desconhecida de termoestabilizador e (b), direita. Teste F com 95% de confiança realizado com as
Tabela 18: 86
variâncias dos resultados obtidos com as curvas analítica e de adição padrão para
sorbitol...........................................................................................................................................................
Tabela 19: Teste t, assumindo variâncias diferentes para as curvas analítica e de adição padrão de sorbitol.............. 87
Tabela 20: Resultados obtidos após três determinações independentes de L-glutamato de sódio............................... 89
Tabela 21: Resultados obtidos após três determinações independentes de L-glutamato de sódio............................... 90
Tabela 22: Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva A, suas respectivas médias e desvios padrão... 91
Tabela 23: Análise de variância (ANOVA) da curva A de L-glutamato de sódio........................................................... 92

Tabela 24: Resultados obtidos para os pontos da curva B, suas respectivas médias e desvios padrão....................... 93
Tabela 25: Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva B de L-glutamato de sódio...................................... 93
Tabela 26: Resultados obtidos para os pontos da curva C, suas respectivas médias e desvios padrão....................... 94
Tabela 27: Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva C de L-glutamato de sódio...................................... 94
Curvas analíticas obtidas durante os ensaios de linearidade para o L-glutamato de sódio e seus limites de
Tabela 28: 95
confiança..........................................................................................................................................................
Tabela 29: Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva A, suas respectivas médias e desvios padrão..... 95
Tabela 30: Análise de variância (ANOVA) da curva A de Sorbitol.................................................................................... 96
Tabela 31: Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva B, suas respectivas médias e desvios padrão..... 96
Tabela 32: Análise de variância (ANOVA) da curva B de Sorbitol.................................................................................... 97
Tabela 33: Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva C, suas respectivas médias e desvios padrão..... 97
Tabela 34: Análise de variância (ANOVA) da curva C de Sorbitol.................................................................................... 98
Tabela 35: Curvas analíticas obtidas durante os ensaios de linearidade para o sorbitol e seus limites de confiança...... 98
Tabela 36: Resultados dos ensaios de Repetitividade para o L-glutamato de sódio realizados pelo analista 1.............. 100
Tabela 37: Resultados dos ensaios de Repetitividade para o Sorbitol realizados pelo analista 1.................................... 100
Resultados dos ensaios de precisão intermediária para o L-glutamato de sódio executados pelos
Tabela 38: 101
analistas 1 e 2..................................................................................................................................................
Tabela 39: Resultados dos ensaios de precisão intermediária para o Sorbitol executados pelos analistas 1 e 2............ 101
Tabela 40: Teste F nas variâncias dos analistas 1 e 2 durante os ensaios do L-glutamato de sódio............................... 102
Teste t para variâncias equivalentes realizado entre os analistas 1 e 2 durante os ensaios de precisão
Tabela 41: 102
intermediária na determinação de L-glutamato de sódio.................................................................................
Tabela 42: Teste F nas variâncias dos analistas 1 e 2 durante os ensaios do Sorbitol.................................................... 103
Teste t para variâncias equivalentes realizado entre os analistas 1 e 2 durante os ensaios de precisão
Tabela 43: 103
intermediária na determinação de Sorbitol......................................................................................................
Ensaio de recuperação de L-glutamato de sódio realizado em quatro amostras independentes de

Tabela 44: 105
termoestabilizador............................................................................................................................................
Tabela 45: Ensaio de recuperação de Sorbitol realizado em quatro amostras independentes de termoestabilizador..... 105
Resultados das análises de dez amostras de termoestabilizador realizados pela Espectrofotometria

Tabela 46: 107
UV/vis e FTIR...................................................................................................................................................
Teste t-pareado dos resultados para a determinação de sorbitol nas amostras de termoestabilizador, onde
Tabela 47: 107
Xd e Sd correspondem respectivamente à média e desvio padrão das diferenças................................
Resoluções cromatográficas obtidas após três injeções de uma solução resolução contendo sorbitol e
Tabela 48: 109
manitol..............................................................................................................................................................
Tabela 49: Resultados das análises de dez amostras de termoestabilizador realizados por CLAE e FTIR..................... 111
Teste t-pareado dos resultados para a determinação de sorbitol nas amostras de termoestabilizador, onde
Tabela 50: 111
Xd e Sd correspondem respectivamente à média e desvio padrão das diferenças..........................................
Influência de diferentes temperaturas na robustez do método para determinação de L-glutamato de
Tabela 51: 113
sódio................................................................................................................................................................
ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da temperatura na determinação de L-glutamato de

Tabela 52: 113
sódio.................................................................................................................................................................
Tabela 53: Influência do pH na robustez do método de determinação de L-glutamato de sódio...................................... 114
Tabela 54: ANOVA de fator controlado na avaliação da influência do pH na determinação de L-glutamato de sódio..... 114
Tabela 55: Valores de  em função do pH para as quatro espécies presentes no equilíbrio do ácido glutâmico............ 117
Tabela 56: Influência de diferentes temperaturas na robustez do método para determinação de Sorbitol....................... 118
ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da temperatura na determinação de

Tabela 57: 118
sorbitol..............................................................................................................................................................
Tabela 58: Influência do pH na robustez do método para determinação de Sorbitol........................................................ 118
ANOVA de fator controlado na avaliação da influência do pH na determinação de

Tebale 59: 119
sorbitol..............................................................................................................................................................
Lista de Figuras
Página
Regiões endêmicas da Febre Amarela (cinturões vermelhos). Dados baseados em pesquisas

Figura 1: 25
sorológicas, estudos de campo e informações publicadas previamente.......................................................
Figura 2: Casos, mortes e letalidade por Febre Amarela no Brasil. Período entre 1982-2001.................................... 26
Figura 3: Fluxo do processo produtivo da Vacina contra a Febre Amarela.................................................................. 28
Diminuição da infectividade residual e unidades de potência (a escala no eixo vertical a esquerda é dada
Figura 4: 34
em log da potência) de vacinas liofilizadas estabilizadas e não estabilizadas mantidas a 46 °C por quatro
dias................................................................................................................................................................
Figura 5: Programa de temperatura utilizada no ciclo de liofilizacao da vacina contra a Febre 35

Amarela..........................................................................................................................................................
Processo de medição da resistência da vacina contra a febre amarela durante etapas de congelamento
Figura 6: e descongelamento. As temperaturas em destaque representam mudanças significantes nos valores 36
observados de resistência representando cristalização/descongelamento de porções do
estabilizador...................................................................................................................................................
41
Figura 7: Representação esquemática do interferômetro de Michelson......................................................................
Figura 8: O interferograma gerado pela intensidade de radiação incidente em função da diferença entre os 42
caminhos óticos (8a), e o interferograma decodificado pela transformada de Fourier originando o
espectro de infravermelho (8b)......................................................................................................................
Figura 9: Propagação do feixe de radiação polarizado ao longo do cristal de ATR. Detalhe do ângulo  formado 44
entre o feixe, a interface do cristal (plano YX) e a normal.............................................................................
45
Figura 10: Formação das ondas evanescentes durante o processo de reflexão total atenuada....................................
48
Figura 11: Número de publicações retornadas com as palavras-chave “FTIR” e “quantification...................................
Figura 12: Reação mediada pela enzima L-glutaminase formando -cetoglutarato, NADH e amônio.......................... 62
Figura 13: Espectro do L-Glutamato de sódio em solução aquosa a 7% (m/v).............................................................. 72
Figura 14: Espectro do Sorbitol em solução aquosa a 15% (m/v).................................................................................. 72
Figura 15: Espectro da Gelatina hidrolisada em solução aquosa a 9% (v/v).................................................................. 73
Figura 16: Espectro da amostra de termoestabilizador.................................................................................................. 73
Figura 17: Espectros dos componentes e do termoestabilizador................................................................................... 74
Figura 18: Destaque para as bandas selecionadas de L-glutamato (círculos verdes) de sódio e sorbitol (círculos 75
vermelhos).....................................................................................................................................................
Efeito da resolução nominal (cm-1) e n° de scans acumulados na sensibilidade analítica das curvas de L-
Figura 19: glutamato de sódio. As curvas foram obtidas na banda com máximo em 1347 cm-1 medida em altura em 81
relação à linha de base corrigida entre 1371 e 1332 cm -1 (condição estabelecida em
5.2).................................................................................................................................................................
Efeito da resolução nominal (cm -1) e n° de scans acumulados na sensibilidade analítica das curvas de
Figura 20: Sorbitol. As curvas foram obtidas na banda com máximo em 890 cm-1 medida em altura em relação à 82
linha de base corrigida entre 910 e 838 cm-1 (condição estabelecida em
5.2)...............................................................................................................................................................
Figura 21: 83
Curvas analítica e de adição padrão para o L-glutamato de sódio. Destaque para as equações obtidas
em ambos os casos.......................................................................................................................................
Curvas analítica e de adição padrão para o L-glutamato de sódio. Destaque para as equações obtidas
Figura 22: 84
em ambos os casos......................................................................................................................................
91
Figura 23: Curva analítica A – Determinação de L - glutamato de sódio........................................................................
Figura 24: Curva analítica B – Determinação de L - glutamato de sódio........................................................................ 93
Figura 25: Curva analítica C – Determinação de L – glutamato de sódio................................................................... 94
Figura 26: Curva analítica A – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 95
Figura 27: Curva analítica B – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 96
Figura 28: Curva analítica C – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 97
Figura 29: Cromatograma da primeira injeção da solução resolução............................................................................. 108
Figura 30: Cromatograma da segunda injeção da solução resolução............................................................................ 109
Figura 31: Cromatograma da terceira injeção da solução resolução.............................................................................. 109
Figura 32: Cromatograma do padrão de sorbitol obtido em uma de suas injeções........................................................ 110
Figura 33: Cromatograma típico de uma amostra de termoestabilizador....................................................................... 110
Figura 34. Espectros de soluções de L-glutamato de sódio em água (5%, m/v) preparadas em diferentes pH’s.......... 115
Os mesmos espectros da Figura 34, em destaque para a banda utilizada durante o trabalho em 1347
Figura 35: 115
cm-1...............................................................................................................................................................
Figura 36: Diagrama de distribuição do Ácido Glutâmico............................................................................................... 116

Abreviações
FTIR Infravermelho médio com Transformada de Fourier

ATR Reflectância Total Atenuada
OMS Organização Mundial da Saúde
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
CTV Centro Tecnológico de Vacinas
DEQUA Departamento da Qualidade
SEMES Seção de Preparo de Meios e Soluções
LAFIQ Laboratório Físico-Químico
Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
INMETRO
Industrial
USP Farmacopéia Americana - United States Pharmacopeia
CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
Rs Resolução Cromatográfica
ANOVA Análise de Variância
LD Limite de Detecção
LQ Limite de Quantificação
NAD+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo em sua forma reduzida
L-GLDH L-glutamato desidrogenase
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 22
2.1 A VARÍOLA E A PRIMEIRA IMUNIZAÇÃO ...................................................... 22
2.2 FEBRE AMARELA .............................................................................................. 24
2.2.1 A doença .......................................................................................................... 24
2.2.2 A vacina............................................................................................................ 27
2.2.2.1 A produção da Vacina contra a Febre Amarela (cepa 17 D) no Brasil .......... 28
2.2.3 O Termoestabilizador ....................................................................................... 31
2.2.3.1 Questões relacionadas à preservação das vacinas ...................................... 31
2.2.3.2 A estabilidade da Vacina contra a Febre Amarela ........................................ 33
2.2.3.3 O Termoestabilizador da Vacina contra Febre Amarela ................................ 34
2.3 A ESPECTOSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO MÉDIO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) .................................................................. 37
2.3.2 Considerações gerais ....................................................................................... 37
2.3.3 Alguns princípios básicos da técnica ................................................................ 39
2.3.3.1 O princípio do interferômetro de Michelson ................................................... 40
2.3.4 Uma breve introdução à técnica de Reflectância Total Atenuada (ATR) ......... 43
2.3.5 Vantagens e desvantagens da técnica de FTIR ............................................... 46
2.4 AS APLICAÇÕES QUANTITATIVAS DA FTIR ................................................... 47
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 55
3.1 GERAIS ............................................................................................................... 55
3.2 Específicos .......................................................................................................... 55
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 56
4.1 OBTENÇÃO DA INFORMAÇÃO ANALÍTICA...................................................... 56
4.1.1 Aquisição das amostras de trabalho ................................................................ 56
4.1.2 Espectros de infravermelho .............................................................................. 57
4.1.2.1 Otimização dos parâmetros espectrais ......................................................... 58
4.1.3 Comparação entre metodologias ..................................................................... 60
4.1.4 Cromatografia a líquido de alta eficiência......................................................... 61
4.1.5 Espectrofotometria na região do ultravioleta e do visível (UV/vis) .................... 62
4.1.6 Validação analítica ........................................................................................... 64
4.1.6.1 Especificidade e Seletividade ........................................................................ 65
4.1.6.1.1 Estimativa da seletividade ............................................................ 65
4.1.6.2 Linearidade .................................................................................................... 66
4.1.6.2.1 Estimativa da linearidade ............................................................. 66
4.1.6.3 Intervalo......................................................................................................... 66
4.1.6.4 Limite de detecção (LD) ................................................................................ 67
4.1.6.4.1 Estimativa do Limite de detecção ................................................. 67
4.1.6.5 Limite de Quantificação (LQ) ......................................................................... 68
4.1.6.5.1 Estimativa do limite de quantificação ........................................... 68
4.1.6.6 Precisão ........................................................................................................ 68
4.1.6.6.1 Repetitividade .............................................................................. 69
4.1.6.6.2 Precisão intermediária ................................................................. 69
4.1.6.7 Exatidão ........................................................................................................ 70
4.1.6.8 Robustez ....................................................................................................... 71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 72
5.1 Obtenção dos espectros por FTIR ...................................................................... 72
5.2 Seleção das bandas de interesse ....................................................................... 75
5.3 Otimização das condições experimentais ........................................................... 81
5.4 Verificação de interferências de matriz ............................................................... 82
5.4.1 Tratamento estatístico dos dados analíticos .................................................... 84
5.5 Validação Analítica .............................................................................................. 87
5.5.1 Limite de detecção ........................................................................................... 87
5.5.2 Limite de quantificação ..................................................................................... 88
5.5.3 Especificidade e Seletividade ........................................................................... 88
5.5.3.1 Seletividade da metodologia para determinação de L-glutamato de sódio ... 89
5.5.3.2 Seletividade da metodologia para determinação de Sorbitol......................... 90
5.5.4 Linearidade....................................................................................................... 90
5.5.4.1 Linearidade da curva analítica para a determinação de L-glutamato de sódio91
5.5.4.2 Linearidade da curva analítica para a determinação de Sorbitol ................... 95
5.5.5 Intervalo............................................................................................................ 98
5.5.6 Precisão ........................................................................................................... 99
5.5.6.1 Repetitividade ................................................................................................ 99
5.5.6.2 Precisão intermediária ................................................................................. 100
5.5.6.2.1 Tratamento estatístico dos ensaios de precisão ........................ 101
5.5.7 Exatidão ......................................................................................................... 104
5.5.7.1 Ensaios de recuperação .............................................................................. 104
5.5.7.2 Comparação entre metodologias ................................................................ 106
5.5.7.2.1 L-glutamato de sódio .................................................................. 106
5.5.7.2.2 Sorbitol ....................................................................................... 108
5.5.8 Robustez ........................................................................................................ 112
5.5.8.1 Estudo de robustez do método para determinação de L-glutamato de sódio112
5.5.8.1.1 Influência do pH no espectro do L-glutamato de sódio e discussão
adicional .................................................................................................... 114
5.5.8.2 Estudo de robustez do método para determinação de Sorbitol ................... 117
6 CONCLUSÕES .................................................................................................... 120
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 124
1. INTRODUÇÃO
O controle de qualidade de vacinas no Brasil teve um grande marco histórico

no ano de 1981. Em abril daquele ano, quando o país se via às vésperas de uma
campanha nacional de imunização contra a Poliomielite, foram observadas
alterações de cor, assim como a presença de impurezas macroscópicas nos frascos
das vacinas. O antígeno havia sido produzido pelo Laboratório Torlak, na extinta
Iugoslávia. Tal observação motivou uma análise mais rigorosa acerca da natureza
da contaminação por parte da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), onde foi
identificada a proliferação do fungo Penicillium sp. O resultado da análise tornava
evidente a existência de falhas ao longo do processo produtivo, o que
posteriormente foi confirmado por especialistas do Instituto Butantã e Fiocruz em
visita ao Laboratório Torlak (PONTE, 2003).
Evidentemente, providências, em caráter de emergência tiveram de ser

tomadas na época, em vista da premência na substituição do produto afim de não
atrasar as datas da campanha que se aproximava. Vinte e seis milhões de doses de
vacinas foram devolvidas e o recebimento de outras cinqüenta e quatro milhões
foram canceladas. Outros Órgãos produtores foram acionados a fim de evitar o
desabastecimento, contudo, a campanha teve que ser reagendada (PONTE, 2003).
Tornava-se latente, a necessidade da criação por parte da esfera pública, de

mecanismos de controle e garantia da qualidade desses produtos, consoante ao
contexto social em que o Brasil se encontrava naquele momento. Aqui, cabe lembrar
a multiplicidade de acontecimentos políticos recentes no campo da saúde pública
brasileira a partir da década de 70, tais como: o término da campanha de
erradicação da varíola em 1973 (que teve início em 1962), o Plano Nacional de
Controle da Poliomielite em 1971 e finalmente, a criação, também em 1973, do
Plano Nacional de Imunizações (PNI). Esta última, segundo Temporão (2003),
constitui uma concepção dignamente herdeira da tradição consolidada por Oswaldo
Cruz.
Não faz parte do escopo deste trabalho esgotar o assunto, traçando o

panorama social e político do país naquele período. Seria impossível fazê-lo sem
18
relacionar o entorno da administração pública com os dados demográficos da época.
Muito embora, seja de vital necessidade para um entendimento sólido dos principais
fatores que orientavam as políticas de saúde pública daquele período. Entretanto, é
possível observar que o Brasil pleiteava desde então, ocupar uma posição mais
autônoma em relação ao controle de doenças infecciosas preveníveis por
imunização.
Era preciso equilibrar a dicotomia produção/controle de qualidade existente

até então. Se por um lado o Brasil contava com um consumo exponencial de
imunobiológicos fosse pela produção interna (FIOCRUZ e Instituto Butantã) ou via
importação junto aos Laboratórios produtores estrangeiros, por outro, o país contava
com o Laboratório Central de Controle de Drogas, Medicamentos e Alimentos, o
LCCDMA. Um laboratório que operava em condições estruturais precárias e sem
um corpo técnico devidamente qualificado. Seguindo então as orientações da
Organização Pan-americana da Saúde, a OPAS, o LCCDMA foi imediatamente
incorporado ao campus da FIOCRUZ onde seria posteriormente, sede de sua nova
instalação e receberia a denominação de Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde, o INCQS. Em 1983, nascia então o maior laboratório do
gênero da América Latina (PONTE, 2003).
A partir deste momento, a promoção da saúde pública brasileira ganha um

novo significado para as autoridades sanitárias, muito bem sintetizado por Gil, 2010:
“Qualidade para os medicamentos é um

atributo de caráter não apenas comercial,
mas, também, legal, ético e moral. Assim,
enquanto qualidade para muitos produtos
é uma questão de competitividade, no
campo da saúde deve ser
obrigatoriamente atendida”.
No que tange a qualidade de vacinas, embora seja correto afirmar que haja
uma relação diretamente crescente, garantida por processos cada vez mais
robustos e reprodutíveis, a atuação das Agências Reguladoras, como a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é imperativa. Suas recomendações visam
garantir o mínimo, porém, alto padrão de qualidade dos produtos,
19
internacionalmente estabelecidos. Desde as matérias-primas, passando por seus
produtos intermediários até a obtenção do produto final, devem atender aos níveis
de qualidade pré-determinados. O produto final deve ser investigado quanto a sua
identidade, esterilidade, estabilidade, segurança e potência por metodologias
validadas, tanto pelo órgão produtor quanto pelo Laboratório Nacional onde o
produto será disponibilizado.
Desde os estudos preliminares do que posteriormente ficou conhecido como

Vacinologia, a utilização de animais no controle de qualidade de vacinas participou
ativamente da rotina de pesquisadores e analistas em todo o mundo. Tal prática
envolve questões relacionadas à ética na ciência, que volta e meia compõe a pauta
de diversos encontros entre cientistas de todo o mundo, chegando a atingir a esfera
política e, até mesmo a opinião pública. Além disso, a utilização de animais é uma
prática dispendiosa, e será ainda mais nos próximos anos. Ainda, não é raro
encontrar grandes variações em resultados interlaboratoriais provavelmente devido
às diferenças genéticas nos animais utilizados, comprometendo assim, a
reprodutibilidade dos ensaios de potência realizados. Por último, a correlação entre
os modelos animais e a situação humana tem sido posta em dúvida. Dentro desse
contexto, a Química Analítica moderna se insere (METZ et al. 2002).
Atualmente em Química Analítica, costuma-se afirmar que é o problema

analítico e não a amostra, o foco de uma análise. Integrando todos os seus aspectos
em uma estratégia de resolução de problemas mais geral. Esta denominação mais
global e moderna do universo de uma análise diz respeito a aspectos que só em
tempos mais recentes vêm sendo levantados. Tudo isso, em virtude do
desenvolvimento expressivo de novas ferramentas analíticas onde virtualmente,
qualquer problema específico é passível de ser resolvido (GUARDIA, 1999).
Consequentemente, o grande objeto de pesquisa dentro da comunidade

científica especializada hoje não é a obtenção de métodos mais sensíveis ou que
ofereçam melhor resolução, pois eles já existem, mas sim obter maior quantidade de
informação analítica com menor tempo, menor custo e menor geração de resíduos
sem que para isso, haja perda das figuras de mérito quando comparadas com as
metodologias clássicas.
20
Dentro do Controle de Qualidade de vacinas em especial, há um interesse em
se conhecer tanto quanto possível a matriz de análise e não apenas as espécies
presentes. Muitas vezes é preciso conhecer a proporção entre determinadas
substâncias e a maneira como elas interagem. Por exemplo, a imunogenicidade, isto
é, a capacidade de induzir uma resposta imune específica, de alguns
imunobiológicos bacterianos é potencializada pela conjugação do encapsulado
bacteriano a proteínas transportadoras (ALMEIDA, 2005; AYUB e PINTO, 1994;
CARVALHO e ANDRADE, 2006). Desta forma, não basta conhecer apenas as
quantidades das espécies envolvidas isoladamente, mas o quanto há do composto
conjugado.
As metodologias de referência para controle de qualidade de vacinas,

tradicionalmente envolvem técnicas de pré-tratamento de amostras onde a utilização
de solventes, extração e/ou diálise de material excipiente assim como a digestão de
amostras se faz necessária. Tais metodologias são caras, tediosas, insalubres,
geram grandes quantidades de resíduos químicos e biológicos além de exigirem
meticulosas manipulações na amostra, criando uma potencial fonte de erro analítico.
Isto é, estas metodologias encontram-se hoje na contramão das tendências da
Química Analítica Aplicada moderna (USP XXIX, 2006).
21
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A VARÍOLA E A PRIMEIRA IMUNIZAÇÃO
Durante o final do século XVIII, a Europa vivia uma epidemia daquela que é
classificada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma das
enfermidades mais devastadoras da história da humanidade. A varíola. Registros
datam que a varíola já ceifava vidas humanas desde o período de 1160 a.C., quando
lesões compatíveis com aquelas provocadas pela doença foram encontradas na
cabeça mumificada do faraó Ramsés V. Contudo, ainda existem especulações de
que ela pode ter surgido por volta de 10.000 a.C. com o fim do nomadismo, nas
primeiras evidências de assentamentos rurais (MCNEIL, 1976). Sendo assim, é
imaginável a dificuldade na obtenção de dados exatos sobre a letalidade/mortalidade
da doença, mas estima-se que durante a idade média, a varíola matava cerca de 3
milhões de pessoas por ano e que, ainda no século XX entre 300 a 500 milhões de
pessoas tenham morrido de varíola em todo mundo (LEVI e KALLÁS, 2002).
Diante do cenário europeu, encontrava-se o médico britânico Edward Jenner.

Ele percebeu durante suas peregrinações para o tratamento de pacientes por áreas
mais remotas da Inglaterra que fazendeiros ou mais precisamente, aqueles que
ordenhavam as vacas, não apenas não desenvolviam a doença, como se
mostravam resistentes à sua exposição (JENNER, 1801). Durante investigações
mais pormenorizadas, o médico observou que as vacas estavam sujeitas a
“erupções espontâneas” em suas mamas, que entravam em contato diretamente
com as mãos dos leiteiros. As tais erupções observadas por Jenner eram idênticas
às observadas em seus pacientes, o que levou o médico a classificar o que ele
observara no gado como varíola bovina, uma variação da varíola humana, mas,
aparentemente menos agressiva tanto para a vaca, quanto para seres humanos.
Jenner então concluiu que o vírus da varíola bovina era o mesmo da forma humana,
porém, havia sofrido modificações sucessivas de tal forma que, quando aplicado à
pele humana em seu estado degenerado, teria propriedades específicas e seria
incapaz de promover modificações à sua estrutura; pré-requisito para a
susceptibilidade humana à varíola (JENNER, 1801).
22
Como conseqüência natural destas observações, o médico britânico estava
seguro que era possível propagar a doença por inoculação sob a forma bovina como
posteriormente, a partir de um ser humano para outro. Então, no dia 14 de maio de
1796, Edward Jenner coletou uma amostra de sangue de uma ordenhadora
chamada Sarah Nelmes e o inoculou em um menino de oito anos de idade chamado
James Phipps (SCHATZMAYR, 2001). Neste dia, nascia então a primeira técnica de
imunização descrita pelo homem.
Durante os meses que se seguiram, Jenner não observou o desenvolvimento

de nenhum dos sintomas naturalmente observados além de leve inflamação local (a
injeção havia sido aplicada no ombro esquerdo do menino). Foi então que Jenner,
(contrariando os princípios bioéticos que conhecemos hoje, porém, não menos
pioneiro) realizou uma espécie de ensaio de desafio, onde o menino foi infectado
propositalmente com o vírus da varíola extraído de seres humanos a fim de observar
a eficácia de sua recém descoberta. Novamente, nada além de uma leve
vermelhidão local, assim como um “perceptível desconforto” eram observados pelo
médico, que então concluiu que a vacina se provava segura e ele, Edward Jenner se
sentia inspirado e confiante para a realização de posteriores imunizações (JENNER,
1801).
Este acontecimento, apesar do já citado contra senso ético, não apenas

revolucionou a medicina como o ser humano a conhecia como rendeu ao médico
britânico o título de “Pai da Imunologia”. Além disso, muitas das conclusões obtidas
por Jenner em seus estudos compõem ainda hoje, as bases dos entendimentos
sobre os princípios de imunizações de várias doenças. Sua metodologia preventiva,
isto é, a prática da vacinação tem sua etimologia no latim vaccinus, de vaca, animal
onde realizou sua descoberta e dá significado ao processo de imunização.
Muitos anos se passaram desde as descobertas de Jenner quando no ano de

1980, a OMS declarou a Varíola como uma doença erradicada do planeta, após o
estabelecimento de um Programa de erradicação global da varíola que teve início
em 1959, após a 12ª Assembléia Mundial da Saúde sob proposta da extinta União
Soviética (ALCAMI et. al, 2010).
23
Atualmente, a Organização Mundial da Saúde define uma vacina como
qualquer preparo que induza imunidade a alguma doença, estimulando a produção
de anticorpos. Vacinas incluem, por exemplo, suspensões de microorganismos
mortos ou atenuados, ou produtos ou derivados de microorganismos. A forma mais
amplamente administrada das vacinas é a injetável, podendo ainda ser encontrada
como spray nasal ou suspensão oral. (http://www.who.int/topics/vaccines/en/,
acessada em 16/12/2011).
2.2 FEBRE AMARELA
2.2.1 A doença
A Febre Amarela pode ser definida como uma doença infecciosa viral, não
contagiosa, aguda de curta duração, que pode ser transmitida ao homem mediante
picada de insetos hematófagos da família Culicidae, em especial dos Gêneros
Aedes e Haemagogus (VASCONCELOS, 2002). Sua sintomatologia é altamente
dependente da gravidade da doença, isto é, podendo ocorrer desde a sua forma
oligossintomática (com pouca ou nenhuma observação de sintomas) até a febre
hemorrágica viral, clássica nos eventos de maior gravidade (MONATH, 2001).
As primeiras descrições da Febre Amarela foram encontradas em

manuscritos Maias que datam de 1648 (MONATH, 2001). Porém, análises da
seqüência do Genoma sugerem que o vírus da Febre Amarela evoluiu de outro vírus
transmitido por mosquitos há cerca de 3000 anos atrás na África, onde se supõe, o
vírus foi importado para as Américas durante o período que compreendeu o
comércio de escravos (ZANOTTO et al., 1996).
Nos dias atuais, a Febre Amarela ainda afeta pelo menos duzentos mil
indivíduos nas regiões tropicais da África e América do Sul (Figura 1), constituindo
risco eminente a viajantes não vacinados a estas regiões. Contudo, cabe ressaltar
que regiões como: América Central, Caribe, Sul dos Estados Unidos, Índia, Sudeste
da Ásia, Austrália (Queensland), sudeste da China, Taiwan, além dos arquipélagos
do Pacífico apesar de não compreenderem as regiões endêmicas da Febre Amarela
(Figura 1), apresentam aumento crescente da densidade e distribuição de Aedes
24
aegypti, principal vetor da forma urbana da doença (MONATH, 2001), caracterizando
assim, regiões potenciais para a introdução e disseminação da doença.
Figura 1. Regiões endêmicas da Febre Amarela (cinturões vermelhos). Dados

baseados em pesquisas sorológicas, estudos de campo e informações publicadas
previamente (MONATH, 2001).
A Febre Amarela pode ser dividida em duas formas epidemiologicamente

diferentes (VASCONCELOS, 2002), sendo uma rural e a outra urbana. Distinguem-
se essencialmente na natureza dos transmissores e dos hospedeiros vertebrados e
naturalmente, no local de ocorrência (MONATH, 1987).
Segundo Vasconcelos e colaboradores (1999) não é conceitualmente correta

a denominação de doença invariavelmente fatal. Esta conclusão se dá com base no
fato de que apenas cerca de 10% dos casos diagnosticados sejam associados aos
eventos mais graves, onde aí sim, sua letalidade é elevada, girando em torno de 40-
60%. Há que se considerar ainda que, este índice de mortalidade é superior ao da
dengue. A Figura 2 relaciona o quantitativo de casos registrados, sua mortalidade e,
consequentemente, sua letalidade.
25
Figura 2. Casos, mortes e letalidade por Febre Amarela no Brasil. Período entre
1982-2001 (VASCONCELOS, 1999).
A Febre Amarela é considerada uma zoonose, isto é, uma doença ou uma

infecção que se transmite naturalmente entre os animais vertebrados e o homem, ou
entre o homem e animais vertebrados (RAMOS SILVA, 2008) onde seu ciclo de
transmissão é mantido na natureza através de primatas não humanos selvagens e
mosquitos diurnamente ativos (MONATH, 2001), sendo assim não pode ser
erradicada.
Apesar de há muito conhecidos, os mecanismos da doença ainda são pouco

claros, além disso, não têm sido objeto de estudo da pesquisa clínica moderna. Em
parte, isto é explicado por entraves éticos e o alto custo da experimentação que, em
geral, envolvem primatas não humanos, hamsters, camundongos (TESH et al., 2001;
VASCONCELOS, 1999).
Não há até o momento um tratamento antiviral específico, apenas tratamentos

de apoio são sugeridos, com a internação do paciente (VASCONCELOS, 2003) e
essencialmente voltados para o combate aos sintomas. Dentre os mecanismos de
prevenção da febre amarela destacam-se o controle vetorial e vacinação. O sucesso
do controle de vetores é restrito ao caso urbano da doença além de difícil
modelagem estratégica (NOBRE e TAUIL, 1994). Por outro lado, a vacina de vírus
vivo atenuado (antiamarílica) utilizada para a imunização ativa contra a febre
amarela em rotina possui melhor relação custo/benefício do que a condução de
campanhas de emergência em resposta a epidemias desta doença. Segundo a
Organização Mundial da Saúde (OMS), é altamente recomendado que países com
26
risco para a Febre amarela incorporem programas de imunização rotineiros (World
Health Organization, disponível em www.who.int/csr/disease/yellowfev/en/, acessado
em 03/01/2012).
2.2.2 A vacina
Inicialmente, dois tipos de vacinas contra a Febre Amarela foram produzidos

durante a década de 1930. A vacina neurotrópica francesa, obtida a partir da
passagem do vírus humano pelo cérebro de ratos e a 17D, obtida através da
passagem do vírus humano por ovos de galinha embrionados. A vacina neurotrópica
francesa começou a ser administrada em 1939 tendo sido aplicadas mais de 38
milhões de doses até o ano de 1952, quando sua utilização em crianças com menos
de 10 anos de idade foi interrompido após o registro de casos de encefalite pós-
vacinal a uma taxa de 3 a 4 indivíduos para cada 1000 vacinados, levando 38% dos
casos ao óbito. Contudo, apenas no ano de 1980 sua produção foi totalmente
descontinuada. Enquanto isso, no ano de 1936, Max Theiler desenvolveu uma cepa
não virulenta através de 176 passagens seriadas da cepa africana virulenta Asibi de
febre amarela, cultivadas em tecido embrionário de galinha. Mais precisamente,
Theiler atingiu duas subcepas atenuadas, 17D-204 e 17DD, as quais são utilizadas
até hoje na produção de vacinas contra Febre Amarela (BARBAN, et al., 2006).
A cepa 17D é uma das mais bem sucedidas vacinas de vírus vivo atenuado já
desenvolvidas e já foi administrada em mais de 540 milhões de pessoas,
desenvolvendo uma resposta imune específica em mais de 95% dos vacinados em
até 10 dias após a vacinação (FIELDS et al., 1996).
Os registros de eventos adversos à administração da vacina são

considerados extremamente raros. Apenas 22 casos de encefalite pós-vacinal
associados à vacina, das quais uma fatal foi registrada desde a sua introdução
(Monath, 2001). Contudo, no ano de 1996, assim como em dezembro de 2004, 25
casos de doença viscerotrópica (associada à vacina) e doença neurotrópica (uma
doença clinicamente e patologicamente semelhante à febre amarela) foram
reportados, sendo 15 destes casos, fatais. Segundo Jennings et al. (1994), não há
qualquer evidência óbvia de inversão da cepa a uma forma virulenta, mas estes
27
eventos levantaram questionamentos junto à comunidade científica e, pontuaram
sobre a necessidade de um extensivo controle da produção destas vacinas.
2.2.2.1 A produção da Vacina contra a Febre Amarela (cepa 17 D) no Brasil
Produzida dentro do campus da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) desde

1937, a Vacina contra a Febre Amarela ou antiamarílica como também é conhecida,
passou por diversas modificações em seu processo de fabricação. Evidentemente,
todas elas derivam das naturais inovações tecnológicas que foram desenvolvidas ao
longo destes 75 anos de existência, as quais conferiram aumento da capacidade
produtiva (produção em batelada), possibilitando o atendimento às demandas
nacionais e internacionais e, principalmente, a adoção de práticas assépticas em
conformidade com as normas estabelecidas pela Organização Mundial da Saúde
(OMS) na busca de um padrão de excelência em qualidade. Característica essencial
de um produto injetável.
A Figura abaixo ilustra o fluxo básico atualmente seguido por Bio-

manguinhos/FIOCRUZ para a produção da vacina contra a febre amarela, seguida
de uma sucinta discussão sobre suas principais etapas.
Figura 3. Fluxo do processo produtivo da Vacina contra a Febre Amarela (BENCHIMOL, 2001).
28
A primeira etapa que envolve a produção de um lote de vacinas contra a febre
amarela compreende o recebimento dos ovos onde os vírus serão inoculados. Estes
ovos são produzidos por granjas comuns, todavia, as aves produtoras destes ovos
encontram-se em áreas assépticas e segregadas das demais, voltadas ao
abastecimento comum. Estes ovos são conhecidos pela sigla em inglês SPF
(Specfic Pathogenic Free), ou livre de agentes infecciosos específicos. Possuem a
vantagem de serem livres de 15 diferentes vírus que contaminam os ovos comuns.
Então, quando do recebimento destes ovos SPF, eles são verificados à contraluz
para a retirada das unidades trincadas ou rachadas e ainda, os ovos chamados
“brancos” (estéreis) ou com embriões mortos (BENCHIMOL, 2001).
Os ovos selecionados são encaminhados para incubadoras estéreis que são

previamente descontaminadas através de uma etapa de fumigação com solução de
formol e permanganato de potássio. Nas incubadoras os ovos permanecem por nove
dias onde a temperatura é rigorosamente mantida e controlada a 37,8 °C, a umidade
interna permanece entre 55 e 60% e, além disso, os ovos são automaticamente
virados por todo o período (BENCHIMOL, 2001).
No nono dia, realiza-se a etapa conhecida como ovoscopia, que consiste em

observar o interior do ovo através de uma fonte de luz em ambiente escuro. Neste
procedimento, observa-se o desenvolvimento do embrião. Novamente, através da
avaliação visual da silhueta dos embriões, os mortos são descartados
(BENCHIMOL, 2001).
A segunda etapa do processo de fabricação da vacina antiamarílica

compreende a inoculação dos ovos. Esta etapa é realizada em ambientes biolimpos
conhecidos como salas limpas, onde não apenas a temperatura e a umidade são
controladas, mas a pressão é mantida positiva em relação às salas precedentes
além de possuírem um rigoroso controle da quantidade de partículas viáveis e não
viáveis em seu interior. A técnica empregada pelos operadores durante a inoculação
consiste em utilizar a chama de um maçarico de oxi-acetileno a fim de fragilizar a
casca do ovo para em seguida, introduzir com uma seringa uma quantidade de 1000
PFU, sigla em inglês para Plaque-forming unit ou Unidades formadoras de placas,
de suspensão viral de febre amarela obtidas do lote semente. A injeção se dá
29
diretamente na cavidade vitelina do embrião e então, o ovo é selado com uma cola
plástica. A inoculação já exige que uma amostra dos ovos seja retirada para o
controle de qualidade a fim de avaliar sua esterilidade (BENCHIMOL, 2001).
Em seguida os ovos são levados para nova etapa de incubação, desta vez
por mais três dias, mantidas as mesmas condições da primeira incubação. Nova
ovoscopia também é realizada no décimo segundo dia e os embriões mortos são
descartados. A seqüência desta etapa é a coleta dos embriões vivos. Extremamente
delicada, ela se dá no interior das salas limpas, onde os ovos são colocados sobre
suportes giratórios e os operadores aplicam um maçarico, tangencialmente,
queimando apenas a superfície superior do ovo, onde a sua calota e retirada, sem
que seu interior seja excessivamente aquecido. Tal e qual uma linha de produção, o
operador seguinte retira a calota extraída e expõe o embrião com uma espátula
estéril, removendo-os com o fórceps e colocando-os em trituradores. Após a
trituração, os embriões são transferidos para frascos de centrífuga de 1000 mL, onde
se dá a centrifugação por uma hora a uma temperatura de 4 °C a 8 °C.
Uma pressão negativa é aplicada aos frascos de centrífuga onde então o

sobrenadante é retirado. Neste sobrenadante encontra-se a suspensão viral
atenuada. Dado seu caráter termolábil a suspensão viral é extremamente vulnerável
a intempéries em geral e, durante muitos anos este foi um dos maiores entraves
tecnológicos para a produção deste, e de outros imunobiológicos como será
discutido adiante. Porém, atualmente, após a separação, a suspensão viral segue
para a etapa de formulação, onde uma solução termoestabilizadora é adicionada,
momento em que se obtém o produto acabado a granel (BENCHIMOL, 2001).
O produto acabado a granel é levado para as etapas de processamento final.

A primeira delas consiste em transferir o produto de seu recipiente atual, que, em
geral são dornas de aço especial ou garrafões de vidro para as embalagens
primárias, que são frascos de vidro em borosilicato previamente esterilizados e
despirogenizados. Ainda durante esta etapa, rolhas de borracha, também estéreis,
são posicionadas automaticamente sobre a parte superior dos frascos de modo que
estes permaneçam entreabertos. Esta etapa é conhecida como envasamento e
atualmente também é realizada em salas limpas.
30
Ao final do envasamento, o lote de vacina é carregado em equipamentos
liofilizadores. A liofilização é uma etapa de secagem por sublimação e tem por
finalidade remover pelo menos 97% de água da suspensão vacinal, formando um
liófilo ou pastilha. Durante a liofilização, a vacina é congelada a temperaturas abaixo
de – 40 °C por algumas horas. Em seguida, aplica-se vácuo na câmara onde se
encontram os frascos de vacina. Inicia-se então o processo de sublimação da água,
que é expelida do frasco que até então está entreaberto com a rolha. A totalidade
deste processo leva alguns dias e se encerra quando os frascos são
automaticamente selados, ainda em atmosfera de vácuo. Encerrada a liofilização, os
frascos de vacina são levados para a etapa de recravação, onde selos de alumínio
são colocados sobre as rolhas de borracha, garantindo que as mesmas não serão
violadas até seu destino final. A partir de então, os frascos são rotulados, embalados
e seguem em quarentena, estocados em câmaras frias a temperaturas entre 2 °C e
8 °C até serem expedidos.
2.2.3 O Termoestabilizador
2.2.3.1 Questões relacionadas à preservação das vacinas
A capacidade de alguns vírus vivos atenuados em gerar resposta imune

protetora, reduzindo a incidência de algumas doenças infecciosas no homem é
conhecida já há algum tempo. Contudo, também é sabido que determinadas
condições ambientais são capazes de afetar a estabilidade física das vacinas
(WIGGAN et al., 2011), reduzindo sua potência, que é justamente definida como a
capacidade de uma vacina em gerar uma resposta imune protetora (METZ et al.,
2002). Tal efeito de perda de potência se dá naturalmente após sua reconstituição,
sendo os profissionais de saúde que as manipulam instruídos a descartá-las, caso
não sejam aplicadas em até uma hora (WIGGAN et al., 2011). De fato, é lógica a
observação de que a liofilização não oferece qualquer segurança à vacina após sua
reconstituição, implicando em cuidados adicionais. Não obstante, está o fato de que
a maioria das vacinas (dentre elas a vacina contra a febre amarela) exigem que seu
31
armazenamento e transporte seja feito dentro de uma estreita faixa de temperatura
de 2 a 8 °C.
Tendo alguns destes elementos discutidos acima em mente, torna-se mais

simples a compreensão da definição de Rocha (2001) para Rede de Frio. A Rede de
Frio ou Cadeia de Frio é o processo de armazenamento, conservação, manipulação
e transporte dos imunobiológicos, e deve possuir as condições adequadas de
refrigeração desde o laboratório produtor até o momento em que a vacina é
administrada. Além disso, a autora lista um conjunto básico de elementos que
compõe uma Rede de Frio:
1. Equipe técnica;
2. Equipamentos;
3. Instâncias de armazenamento.
4. Transporte entre as instâncias;
5. Controle de temperatura;
6. Financiamento.
Muitos países em desenvolvimento sofrem dificuldades com o fornecimento

de energia elétrica e a refrigeração adequada. Avaliações realizadas em países
como a Índia, Malásia, Nepal, Tanzânia e Tunísia mostraram fragilidades em suas
Redes de Frio. Dentre estas fragilidades, a mais frequentemente observada nestes
estudos foi a alta temperatura durante a estocagem ou transporte. Enquanto isto,
pouca importância é dada na manutenção da Rede de Frio pelos países de clima
temperado, onde se encontram os países desenvolvidos. Paralelamente, estudos
similares aos citados acima mostraram falhas nas Cadeias de Frio de países como
os Estados Unidos, Irlanda do Norte, Reino Unido, além de Polônia e Hungria.
Porém, nestes casos, os principais fatores responsáveis pela quebra da Rede de
Frio foram: manipulação equivocada das vacinas, falhas no descarte de vacinas não
utilizadas e vacinas estocadas em conjunto com alimentos e bebidas (GALAZKA,
MILSTIEN e ZAFFRAN, 1998).
Alguns pesquisadores se dedicam a estimar o período de validade de uma

vacina. Estes estudos são desenvolvidos avaliando-se a perda de potência
observada após longos períodos de armazenamento em diferentes temperaturas.
32
Para isto, o teste de degradação acelerada é frequentemente citado como
conveniente (GALAZKA, MILSTIEN e ZAFFRAN, 1998). Nestes testes, uma
degradação forçada é induzida com o aumento proposital de temperatura.
Concomitantemente, promove-se a diminuição da potência da vacina em um tempo
relativamente menor que o que ocorreria naturalmente. A velocidade na qual a
degradação ocorre é medida e, por extrapolação, é estimada também para
temperaturas menores que a de armazenamento, de acordo com a equação de
Arrhenius (KIRKWOOD e TYDEMAN, 1984). A capacidade preditiva do teste de
degradação acelerada, contudo, sofre influência de diversos fatores que, por vezes,
os fazem divergirem significativamente. A faixa de temperatura utilizada, número de
amostras utilizadas durante o teste, e principalmente, a metodologia utilizada para a
estimativa da potência podem variar amplamente dificultando a obtenção de dados
confiáveis (GALAZKA, MILSTIEN e ZAFFRAN, 1998).
2.2.3.2 A estabilidade da Vacina contra a Febre Amarela
As diferentes estabilidades observadas entre as vacinas com e sem

termoestabilizadores é bem demonstrada na Figura 4, adaptada de Galazka, Milstien
e Zaffran (1998). A vacina contra a febre amarela pode ser seguramente
armazenada entre -20 °C a + 4 °C por dois anos ou mais (BURFOOT, YOUND e
FINTER, 1977). A meia-vida estimada da infectividade da vacina é de três a dez
meses a temperatura ambiente (25 °C), dez a vinte dias a 37 °C e cerca de dois dias
a 46 °C (BURFOOT, YOUND e FINTER, 1977 e FINTER, 1978). Quando
reconstituída, a vacina retém sua dosagem imunizante mínima por pelo menos dez
dias quando mantida a uma temperatura em entre 0 e 8 °C (ISHAK e HOWARD,
1990). Contudo, quando exposta a elevadas temperaturas, rapidamente perde sua
potência. A 37 °C, 31 °C e 27 °C, a vacina reduz sua potência a 50% da inicial após,
1,5, 3,1 e 4,9 horas de exposição, respectivamente (FINTER, 1978 e ISHAK e
HOWARD, 1990). Ademais, o uso de diluentes (água para injeção) a 37 °C é capaz
de inativar em definitivo o vírus, resultando em total perda de atividade dentro de um
período de uma hora (LOPEZ, 1988).
33
Figura 4. Diminuição da infectividade residual e unidades de potência (a escala no eixo
vertical a esquerda é dada em log da potência) de vacinas liofilizadas estabilizadas e não
estabilizadas mantidas a 46 °C por quatro dias. Adaptada de Galazka, Milstien e Zaffran
(1998).
Com o crescimento e a diversificação dos Programas de imunização, os

desenvolvimentos logísticos têm sido capazes de levar as campanhas de
imunização a áreas mais remotas em um esforço de se cobrir determinadas
populações alvo. Neste sentido, a termoestabilidade das vacinas deixa de ser
apenas uma característica de cunho técnico-científico e atinge o campo das políticas
de saúde pública em todo o planeta.
2.2.3.3 O Termoestabilizador da Vacina contra Febre Amarela
A Vacina contra a Febre Amarela produzida no Brasil recebe a adição de

termoestabilizador desde 1980. Esta solução é composta por L-Glutamato de sódio
monohidratado, sorbitol e gelatina hidrolisada. Entretanto, muitos estudos são
promovidos, principalmente pelos diferentes produtores desta vacina que
desenvolvem, otimizam e testam suas soluções com diferentes composições
(BENCHIMOL, 2001).
Além do impacto gerado pelos termoestabilizadores na termolabilidade

resultante da vacina apos sua reconstituição, outro parâmetro digno de atenção por
parte dos pesquisadores é a avaliação das características de congelamento destas
34
substancias crioprotetoras. Este parâmetro é considerado de extrema importância,
exercendo influência no desenvolvimento dos ciclos de liofilização.
Consequentemente, as propriedades de cristalização da vacina estabilizada a baixas
temperaturas são extensivamente estudadas. Adebayo e colaboradores (1998)
chamam a atenção que alguns açúcares, aminoácidos e cátions divalentes,
substâncias frequentemente utilizadas em preparos de estabilizadores, deverem ser
cuidadosamente avaliadas devido ao fato de algumas delas apresentarem ponto de
congelamento muito baixo, o que não é muito adequado em ciclos de liofilização.
Além disso, repetidas etapas de congelamento e descongelamento devem ser
evitadas, pois depreciam o título viral (LOPEZ, GUIMARAES e CARVALHO, 1987).
Uma interessante avaliação das características de congelamento e

descongelamento dos estabilizadores foi feita por Adebayo e colaboradores (1998).
Os autores estimaram a cristalização medindo-se a resistência elétrica das vacinas
estabilizadas durante o processo de liofilização. A Figura 5 ilustra o programa de
temperatura estabelecido para o ciclo de liofilização empregado no estudo.
Figura 5. Programa de temperatura utilizada no ciclo de liofilização da vacina contra a Febre Amarela
(Adebayo et al., 1998).
35
A velocidade de congelamento utilizada neste estudo foi de 1 ºC/min., e a de
descongelamento foi de 3 ºC/min. Na Figura 6 observam-se os valores de variação
da resistência em função da temperatura ao longo do tempo, obtidos para um
termoestabilizador estudado e composto pela mistura em partes iguais de: 7,5 g de
myo-inositol, 3,8 g de D-sorbitol dissolvidos em 50 mL de solução de NaCl 0.9% e,
3,5 g Na2HPO4 dissolvidos em 50 ml de solução de NaCl 0,9%. As curvas
observadas na parte inferior da Figura representam as derivadas dos valores obtidos
para a resistência durante o processo de congelamento e descongelamento
(orientados de acordo com as setas).
Figura 6. Processo de medição da resistência da vacina contra a febre amarela durante etapas de congelamento e
descongelamento. As temperaturas em destaque representam mudanças significantes nos valores observados de
resistência representando cristalização/descongelamento de porções do estabilizador (Adebayo et al., 1998).
Como já foi descrito, as soluções estabilizadoras são constituídas por

diferentes espécies de acordo com seu fabricante. A literatura relacionada relata a
36
utilização de soluções tampão, como fosfato ou TRIS-HCl
(hidroximetilaminometano), açúcares como lactose, sorbitol, sacarose ou trehalose,
sais de cálcio e magnésio como CaCl2 e MgSO4, albuminas humana, bovina ou do
leite (esta mais comum por envolver menores riscos de contaminação), meios de
cultura como Hawk ou gelatina hidrolisada e aminoácidos como alanina, histidina,
valina, treonina, ácido glutâmico/glutamato, arginina, metionina, lisina, isoleucina,
hidroxiprolina, fenilalanina, glicina e serina. Cada uma destas substâncias
desempenha uma função específica dentro da composição do termoestabilizador.
Em alguns casos, algumas substâncias atuam de forma conjunta no aumento da
termoestabilidade da vacina (Adebayo et al., 1998).
Os mecanismos de ação das substâncias componentes dos

termoestabilizadores ainda não são bem conhecidos. Contudo, sabe-se que na
composição da vacina brasileira, o sorbitol tem como principal finalidade proteger a
infectividade do vírus durante o ciclo de liofilização, o que, como já discutido,
segundo Lopez, Guimarães e Carvalho (1987), constitui etapa crítica ao vírus
atenuado da febre amarela. É conferido ao glutamato de sódio o efeito protetor do
termoestabilizador à suspensão viral. Isto é, a manutenção do título da vacina
(Adebayo et al., 1998). A gelatina hidrolisada por sua vez, melhora a coesão física
da vacina. Uma característica importante que interfere na reconstituição da vacina,
uma vez que a gelatina é capaz de absorver de cinco a seis vezes a sua massa em
água (FERREIRA, 2006).
2.3 A ESPECTOSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO MÉDIO COM

2.3.2 Considerações gerais
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho médio não é uma

técnica instrumental recente, ao contrário, bandas de absorção características de
alguns grupos funcionais na região do infravermelho são conhecidas desde o século
XIX. Ademais, o primeiro atlas de infravermelho foi publicado em 1905, ou seja, vinte
anos antes do surgimento da mecânica quântica (CHRISTY, OZAKI e GREGORIOU,
2001). Contudo, apesar de antiga, a técnica se manteve estática e, segundo alguns
37
autores (GRIFFITHS e HASETH, 1986) no início da década de 1970, acreditavam se
tratar de uma técnica instrumental obsoleta e em franco desuso. Além de
implicações em sua instrumentação que a tornavam desinteressante, a
espectroscopia no infravermelho perdia cada vez mais espaço frente aos avanços
observados nas técnicas de ressonância magnética nuclear (RMN) e de
espectrometria de massas, para fins de elucidações estruturais e das técnicas de
cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) e a gás (CG) para análises
quantitativas. Contudo, este cenário mudou drasticamente durante meados da
década de 80. Em parte, este fenômeno se deve a comercialização dos instrumentos
interferométricos, isto é, que utilizam o interferômetro de Michelson. Até então, os
instrumentos disponíveis eram do tipo dispersivos e apresentavam várias
desvantagens como lentidão na varredura, o que acarretava em baixa velocidade de
aquisição de dados, além da baixa intensidade da fonte e baixa resolução espectral.
Estas desvantagens tornavam a técnica pouco competitiva (GRIFFITHS e HASETH,
1986).
No final do século XIX, Michelson e Lord Rayleigh reconheceram através do

conceito do interferômetro que, teoricamente era possível obter espectros a partir do
padrão de interferência por ele gerado. Todavia, era necessário um engenhoso
sistema para armazenar estes dados, o que até então não existia e por isso, os
interferômetros permaneceram sem serem utilizados em equipamentos de
infravermelho pelos cerca de cinqüenta anos seguintes. Perto de 1950, duas
descobertas foram realizadas. Na primeira, Fellgett descobriu que toda informação
espectral de uma dada substância era obtida simultaneamente através de um
interferômetro. Esta vantagem ficou conhecida como “vantagem multiplex” e constitui
uma vantagem teórica não apenas para instrumentos de infravermelho, mas também
RMN e espectrometria de massas. Pouco tempo depois, Jacquinot concluiu que o
ângulo máximo do feixe colimado que passa através de um interferômetro é maior
que o feixe de mesma área transversal que passa através de um prisma ou grade de
um monocromador, medindo na mesma resolução. Estas duas vantagens
combinadas formam a base teórica que justificam a melhoria de desempenho dos
equipamentos interferométricos frente aos dispersivos (GRIFFITHS e HASETH,
1986).
38
Entretanto, a obtenção de um espectro ainda era lenta. Os interferogramas
gerados necessitavam ser transportados para outras interfaces para assim serem
processados. A popularização dos microcomputadores que ocorreu nos últimos vinte
anos tornou possível não apenas o controle total do instrumento, como também o
processamento matemático do grande número de informações espectrais geradas
em até poucos segundos. A partir de então, a espectrometria de absorção no
infravermelho médio com transformada de Fourier se tornou uma técnica
instrumental dinâmica com uma ampla variedade de aplicações (GRIFFITHS e
HASETH, 1986).
2.3.3 Alguns princípios básicos da técnica
Antes de introduzirem-se alguns conceitos básicos sobre a técnica, torna-se

interessante delimitar três subdivisões frequentemente encontradas na literatura
para o espectro eletromagnético da região infravermelha. Esta divisão se faz
interessante tanto sob o ponto de vista instrumental como das diferentes aplicações
encontradas para cada uma das regiões. Classifica-se então como região do
infravermelho próximo, a região de frequências compreendidas entre 4000 e 12800
cm-1, região do infravermelho médio, a região de freqüências compreendidas entre
200 e 4000 cm-1, e por último, a região do infravermelho afastado de freqüências
compreendidas entre 10 e 200 cm-1.
Este trabalho se dedica a obtenção e tratamentos quantitativos de espectros

de infravermelho médio. Nesta região, a radiação proveniente da fonte emitida sob a
forma de fótons é absorvida pela molécula, induzindo uma transição fundamental
onde ela passa de seu estado vibracional fundamental, de menor energia, e alcança
um estado vibracional excitado, de maior energia e, em seguida, a molécula retorna
a seu estado inicial, quando esta energia é transmitida. Ambos os fenômenos são
ditos quantizados, isto é, a radiação emitida pela fonte tem energia definida e
equivalente a h, onde h é a constante de Planck e  é a freqüência de radiação, a
energia transmitida pela molécula por sua vez também é quantizada e equivale a h.
39
Como exposto no parágrafo anterior, a energia da radiação infravermelha
absorvida é a diferença de energia entre certos níveis de energia vibracional da
molécula. Considerando como Ee e Ef as energias vibracionais das moléculas em
seus estados excitados e fundamentais respectivamente, tem-se então que:
hEe - Ef,
Contudo, satisfazer a esta equação não é a única condição para que ocorra a
absorção da radiação na região do infravermelho. Para tal, as transições
necessariamente devem obedecer as regras de seleção, isto é, existem transições
que são permitidas enquanto que outras são ditas proibidas. De uma maneira geral,
as transições que envolvem a variação de número quântico principal em + 1 são
transições permitidas enquanto que as demais, não. Além disso, outra imposição à
absorção infravermelha diz respeito à simetria da molécula. Isto é, a radiação só é
absorvida quando há uma modificação no momento de dipolo de uma molécula
(CHRISTY, OZAKI e GREGORIOU, 2001).
2.3.3.1 O princípio do interferômetro de Michelson
De uma maneira geral, os equipamentos interferométricos se diferem dos

dispersivos por conta da presença do interferômetro de Michelson. Além disso, a
instrumentação que compõe o equipamento possui diversas semelhanças com
outros instrumentos óticos, como fonte, espelhos e detectores. O interferômetro de
Michelson (Figura 7) é um aparato que tem por finalidade registrar a intensidade
como função da diferença entre os caminhos óticos e o resultado deste registro,
conhecido como interferograma, é posteriormente relacionado com a freqüência da
radiação incidente mediante a transformada de Fourier. Trata-se de um dispositivo
que consiste em dois espelhos planos, sendo um fixo e outro livre para se
movimentar. Além de um beamsplitter, que do inglês significa separador de feixe
(GRIFFITHS e HASETH, 1986).
40
Figura 7. Representação esquemática do interferômetro de Michelson
A radiação proveniente da fonte alcança o beamsplitter em um ângulo de 45 °.

Uma propriedade característica do beamsplitter é sua capacidade de refletir e
transmitir o feixe de radiação em partes iguais. Outra característica importante do
beamsplitter é que seu substrato seja inerte na região do infravermelho, de forma a
não absorver qualquer porção da radiação. Os feixes retornam ao beamsplitter
refletidos por seus respectivos espelhos, onde novamente são refletidos e
transmitidos. Consequentemente ocorre uma interferência no beamsplitter onde os
dois feixes são combinados. Quando os dois espelhos estão equidistantes em
relação ao beamsplitter ocorre uma interferência construtiva no feixe que alcança o
detector em todos os comprimentos de onda. Neste caso, os caminhos óticos dos
dois feixes que se combinam são iguais, isto é, estão em fase ou, a diferença entre
seus caminhos óticos que também é conhecida como retardamento, é zero
(CHRISTY, OZAKI e GREGORIOU, 2001).
Um gráfico da resposta do detector em função do retardamento produz um

padrão de intensidade de radiação em função do retardamento, que é conhecido
como interferograma (Figura 8). O interferograma de uma fonte monocromática é
uma função cosseno descrita pela equação abaixo:
Icos(2), onde  é o número de onda (cm-1) e  é a diferença de

caminho ótico ou retardamento.
A transformada de Fourier da expressão acima é o pico na freqüência da

radiação monocromática. I é a intensidade do feixe de saída como função do
41
retardamento , e  é a intensidade como função da freqüência de radiação No
caso de uma fonte de radiação policromática, seu interferograma será a soma de
todas as funções (ondas) cosseno produzidas a partir de “fontes” monocromáticas. O
interferograma policromático também possui uma intensidade máxima no ponto de
retardamento zero, novamente, todas as componentes estão em fase (CHRISTY,
OZAKI e GREGORIOU, 2001). A expressão para a intensidade do interferograma de
uma fonte policromática é descrita abaixo:

∫ 
[[𝐵()[1 + cos (2𝑑
Logo, com a interferometria os dados são codificados pelo padrão de

interferência produzido pelo retardamento e então, decodificados pela transformada
de Fourier gerando um gráfico da intensidade em função da freqüência, ou mais
comumente encontrado, o comprimento de onda, ou ainda seu recíproco, o número
de onda (CHRISTY, OZAKI e GREGORIOU, 2001).
Figura 8. O interferograma gerado pela intensidade de radiação incidente em

função da diferença entre os caminhos óticos (8a), e o interferograma
decodificado pela transformada de Fourier originando o espectro de
infravermelho (8b). (disponível em www.quimica.com.br, acessado em
07/01/2012)
42
2.3.4 Uma breve introdução à técnica de Reflectância Total Atenuada (ATR)
O desenvolvimento da técnica da espectroscopia de absorção no

infravermelho médio com transformada de Fourier permite a aquisição de espectros
de amostras sólidas, líquidas ou gasosas e, por vezes, permite fazê-lo em um
mesmo modelo de equipamento. Para tanto, o analista deve selecionar o acessório
de medição mais adequado à amostra que deseja trabalhar. A escolha da técnica de
amostragem mais adequada a se empregar depende de diversos fatores. Moros
(2006) classifica a forma física da amostra como uma das características mais
relevantes, apesar de chamar atenção para o tempo que se deseja levar durante a
etapa de aquisição dos espectros, assim como o tipo de informação desejada. Aqui
ainda cabe adicionar que, por vezes, a quantidade de amostra disponível pode ser
um fator importante, e até limitante, para a realização de um dado experimento e,
diferentes técnicas de amostragem envolvem diferentes quantidades de amostras
para realizá-lo, e portanto, outro fator a ser dimensionado durante a etapa de
planejamento experimental.
Não faz parte do escopo deste trabalho discorrer sobre as diferentes técnicas
de medição, assim como os acessórios disponíveis para executá-las, mas cabe citar
que os processos mais comuns em infravermelho médio se baseiam na medição da
radiação transmitida. Ainda, observa-se a técnica da reflectância difusa, de grande
importância em medições na região do infravermelho médio, além da que será
brevemente discutida aqui, a técnica da reflectância total atenuada (MOROS, 2006).
Considere-se a imagem trapezoidal da Figura 9. Ela constitui o cristal de ATR,

que pode ser composto por diferentes substâncias, sendo o Ge, ZnSe e o diamante
os mais comuns. A fonte de infravermelho é focalizada em direção a uma das faces
do cristal.
43
Figura 9. Propagação do feixe de radiação polarizado ao longo do cristal de
ATR. Detalhe do ângulo  formado entre o feixe, a interface do cristal (plano
YX) e a normal (CHITTUR, 1997).
Se o ângulo o qual a radiação eletromagnética alcança a interface entre o

cristal de ATR (o meio mais denso) e o ar, por exemplo, ou a amostra for maior que
o ângulo crítico, então a radiação será totalmente refletida no cristal. A fórmula para
o cálculo do ângulo crítico é dada por:
crítico = seno-1. (1 / 2); onde,1 é o índice de refração do meio menos

densoe 2 é o índice de refração do meio mais denso.
Assumindo que o feixe alcança o cristal perpendicularmente em relação a

uma das faces, conhecendo-se a espessura e o comprimento do cristal, é possível
então controlar o número de reflexões durante sua propagação por toda a extensão
do cristal até emergir na extremidade oposta. O número total de reflexões internas N,
pode então ser conhecido através da seguinte equação:
N = (L / h) . cotangente (); onde L é o comprimento do cristal de ATR e h é a

espessura do cristal de ATR.
O ângulo  da equação acima, ainda sofrerá influência do alinhamento do

sistema ótico. Um procedimento de calibração utilizando uma solução de
absortividade molar conhecida () foi proposto por Sperline (1991), a fim de se
44
determinar o número de reflexões no cristal de ATR que, segundo o autor, seria uma
informação análoga ao caminho ótico em outros sistemas espectroscópicos.
Tem sido demonstrado teórica e experimentalmente que, a cada reflexão

realizada na interface, o feixe se comporta como uma onda, conhecida como onda
evanescente. Esta onda é resultado da interação entre o próprio feixe e uma
substância capaz de absorver radiação infravermelha, como mostrado na Figura 10
(MOROS, 2006). Ela ainda penetra alguns poucos micrômetros no meio menos
denso e, a intensidade de energia desta onda decai exponencialmente em função da
distância penetrada. Se E é a energia da onda evanescente, (z) a distância
percorrida no meio menos denso, então:
E = E0 e-z/dp, onde dp é a profundidade de penetração e z é a

distância na qual a energia da onda evanescente cai a 1/e da intensidade inicial na
interface (CHITTUR, 1997).
Figura 10. Formação das ondas evanescentes durante o

processo de reflexão total atenuada (MOROS, 2006).
A profundidade de penetração dp pode ser obtida segundo Harrick (1967), de

acordo com a fórmula adiante:
dp =  / 2  1 √ (seno2  – 212), onde  é o comprimento de onda do

feixe, 1 é o índice de refração do cristal de ATR, 2 é o índice de refração do meio
menos denso e, 21 é 2/1.
45
2.3.5 Vantagens e desvantagens da técnica de FTIR
Como toda técnica analítica, a espectroscopia de absorção no infravermelho

médio com transformada de Fourier apresenta vantagens e desvantagens.
Evidentemente, conhecê-las é fundamental para qualquer profissional interessado
em propor uma nova metodologia, assim como o entendimento mais aprofundado
quanto possível do problema analítico como um todo, e não somente limitando sua
atenção ao conhecimento da amostra (DE LA GUARDIA, 1999).
Algumas vantagens do emprego da técnica de FTIR compreendem a

possibilidade da realização de determinações diretas do analito (MEANWELL e
SHAMA, 2005), isto é, sem as desvantagens oriundas das chamadas operações
prévias que invariavelmente aumentam o tempo de análise e, por vezes, envolvem a
utilização de etapas de separação que necessariamente aumentarão o custo da
análise, podendo envolver a utilização de solventes e reagentes perigosos, os quais
além de influenciarem no fator custo, implicarão na geração de resíduos, que
atualmente exigem um cuidadoso gerenciamento (VALCÁRCEL, 2000).
A utilização da técnica FTIR-ATR possui vantagens adicionais como, não

destruir a amostra e exigir apenas algumas gotas para a sua amostragem, o que é
extremamente interessante em casos onde há pouca disponibilidade de amostras ou
as mesmas precisam ser reaproveitadas (TEWARI e IRUDAYARAJ, 2004).
Em geral, um espectro de infravermelho pode ser obtido em poucos segundos

(MOROS et al., 2010). Esta vantagem pode ser crucial na escolha de uma
metodologia onde a solução do problema analítico envolva um tempo de resposta
curto. O que em controles de processos produtivos, geralmente é o caso
(OHNSMANN et al., 2002).
Por outro lado, a técnica de infravermelho médio com transformada de Fourier

também oferece desvantagens. Em primeiro lugar, alguns dos melhores solventes
empregados pela técnica, isto é, aqueles que não absorvem significativamente na
região do infravermelho médio são; CCl4, CHCl3 e CH2Cl2 (SÁNCHEZ-DASI et al.,
1998). Estes solventes são altamente agressivos à saúde humana, além de
46
causarem contaminação de solos, mares, atmosfera, além do dano causado à
camada de ozônio, devido ao alto tempo de residência na troposfera que, em geral,
varia de 30 a 50 anos. Por isto, estes solventes encontram-se em desuso pela
Comunidade Européia (ZHOU et al. 1998).
Outra desvantagem diz respeito à forte absorção de moléculas como H 2O e

CO2 na região do infravermelho. A água sabe-se, absorve fortemente nas regiões
em 3360 cm-1 (estiramento H-O), 2130 cm-1 (banda de associação da água) e em
1640 cm-1 (vibração das ligações H-O-H), (CHITTUR, 1998). Já o CO2, apresenta
uma banda que absorve em 2350 cm-1 (estiramento assimétrico), (SILVERSTEIN,
WEBSTER E KIEMLE, 2005). Além da dificuldade natural em se criar um ambiente
livre destas substâncias, ao se trabalhar com amostras em solução aquosa,
sacrifica-se a sensibilidade analítica por conta da necessidade em se subtrair ou
compensar o espectro da água.
2.4 AS APLICAÇÕES QUANTITATIVAS DA FTIR
Os espectros de infravermelho médio diferem de seus análogos na região do

ultravioleta-visível (UV/vis) por conta de uma maior complexidade, que é oriunda de
uma maior quantidade de transições possíveis de ocorrer. Entretanto, assim como
na técnica da espectroscopia UV/vis, sob certas condições, é possível observar uma
relação linearizada entre o sinal analítico registrado em um determinado
comprimento de onda com a variação da concentração de uma espécie. Esta
relação que se conhece como a Lei de Lambert-Beer apesar de possuir severas
limitações, continua válida na região do infravermelho.
Como já descrito, dada a sua singularidade que confere uma alta

especificidade a seus espectros, há muitos anos, a técnica da espectroscopia de
absorção na região do infravermelho médio vem sendo utilizada em aplicações
qualitativas diversas (TAKAHASHI e POLITO, 1997 e CHITTUR, 1997) e seus
fundamentos são amplamente discutidos em livros acadêmicos (SILVERSTEIN,
WEBSTER E KIEMLE, 2005). Por outro lado, a literatura dedicada a aplicações
quantitativas não acompanhou o mesmo ritmo, e isto em parte está associado ao
fato destas aplicações serem fortemente dependentes das evoluções tecnológicas
47
descritas no início do capítulo. Porém, especialmente nos últimos dez/vinte anos, o
número de publicações acerca de aplicações quantitativas utilizando-se da
espectroscopia de absorção no infravermelho médio com transformada de Fourier
vem crescendo. Uma revisão da literatura que vem sendo publicada nesta área ao
longo dos últimos anos é útil, no sentido de apresentar novas aplicações analíticas
desta ferramenta até então, pouco utilizada.
Em julho de 2010 foi realizado pelos autores deste trabalho um levantamento

bibliográfico que envolveu as palavras-chave “FTIR” e “quantification” pelas bases de
dados do Scopus e do ISI web of Science. Além disso, a pesquisa concentrou
esforços nas referências datadas nos últimos 22 anos, no máximo. Esta delimitação
levou em consideração o início da comercialização dos instrumentos
interferométricos controlado por microcomputadores pessoais do tipo PC, como já foi
discutido. Os dados obtidos nesta pesquisa são apresentados abaixo, na Figura 11a
e b sob a forma de um gráfico de número de publicações ao longo dos anos, até o
referido mês e ano da pesquisa.
Figura 11. Número de publicações retornadas com as palavras-chave “FTIR” e “quantification”. Á esquerda, fig. 11a pela base
Scopus e à direita, fig. 11b, pela base ISI web of science.
A pesquisa pela base Scopus retornou 269 referências enquanto que a busca
realizada com as mesmas palavras-chave pela base ISI web of Science retornou 366
resultados. Entretanto, a observação mais importante não se reflete no número de
ocorrências retornadas ao longo da pesquisa. De certa forma, é até razoável
imaginar que estes dados já estejam desatualizados em virtude da data em que
foram obtidos, porém, nos dois casos, o levantamento mostra um aumento do
48
número de publicações nesta área ao longo dos últimos anos, o que leva a crer que
há um interesse crescente por parte dos grupos de pesquisa no assunto.
Uma pesquisa de cunho qualitativo pode, por sua vez, ilustrar como esta
técnica tem sido empregada e, em quais áreas ela tem despertado maiores
interesses.
Uma área em que a FTIR apresenta um crescente interesse é a

Farmacêutica. Moros, Garrigues e De La Guardia (2007), propuseram uma
metodologia para a determinação de diazepam em comprimidos por FTIR. Neste
trabalho, a extração deste ansiolítico foi assistida por ultrassom, empregando
clorofórmio como solvente. Durante os experimentos, a fim de obter a melhor relação
sinal/ruído, os autores realizaram um estudo monoparamétrico onde eles variaram
em primeiro lugar o número de scans, e em seguida, a resolução nominal. As
recuperações obtidas estiveram entre 98,2 e 104,1% e a exatidão do método foi
estimada através da comparação com a metodologia de referência, que envolve a
determinação espectrofotométrica deste fármaco. Os autores concluíram não haver
diferença estatística significativa entre sua proposta e a da metodologia de
referência ao nível de confiança de 95%, ademais, segundo eles o novo
procedimento se mostrou vantajoso no que tange ao consumo de reagentes (7 g de
clorofórmio por amostra no FTIR contra 100 mL de clorofórmio mais 50 mL de etanol
pelo método espectrofotométrico), além de apresentar maior produtividade, sendo
capaz de processar quatro amostras por hora enquanto que no método atua, a
capacidade se limita a uma amostra a cada duas horas.
Bouhsain, Garrigues e de La Guardia (1996) publicaram uma metodologia

para a determinação simultânea de paracetamol, ácido acetilsalicílico e cafeína em
formulações farmacêuticas de analgésicos. Para tal, estes autores exploraram a
potencialidade da calibração multivariada, empregando o algoritmo de mínimos
quadrados parciais (PLS, do inglês, partial least-squares) nos espectros de FTIR. De
fato, dada a riqueza de informação contida em um espectro de infravermelho, o
emprego de modelos quimiométricos de calibração multivariada como o PLS podem
ser vantajosos sob alguns aspectos, inclusive em determinados casos de
sobreposição de bandas. Neste trabalho, o principal objetivo dos autores foi obter
49
uma metodologia de operação simples, e principalmente, ganhos de produtividade,
reduzindo o tempo necessário para o pré-tratamento da amostra. No ano seguinte,
estes autores estenderam a aplicação, hifenizando a FTIR com a técnica da análise
por injeção em fluxo (FIA), para a determinação simultânea de propifenazona e
cafeína, também em formulações farmacêuticas. Além disso, o grupo incorporou
uma unidade de destilação ao sistema, a fim de reciclar o clorofórmio, utilizado como
solvente e como transportador. Ao final, os autores atingiram uma freqüência de
injeção da ordem de 120 amostras por hora, reduzindo extensivamente o custo e a
geração de resíduos pelo laboratório (BOUHSAIN, GARRIGUES E DE LA
GUARDIA, 1997).
Mallah et al. (2011), propuzeram a determinação do antibiótico azitromicina

em formulações farmacêuticas por FTIR. O objetivo primário era obter uma
metodologia alternativa aplicada ao Controle de processos, capaz de eliminar a
grande quantidade de solventes utilizada pela técnica da cromatografia a líquido de
alta eficiência (CLAE), reduzindo ainda as etapas de pré-tratamento das amostras. A
proposta se mostrou interessante por conta da não utilização de solventes, as
medições foram realizadas em fase sólida através do preparo de pastilhas com
quantidades conhecidas de azitromicina e KBr. Os autores declararam que suas
recuperações estiveram entre 98,4 e 105,2% e atendiam às exigências das boas
práticas de fabricação (BPF) da Indústria Farmacêutica, publicadas pelos
compêndios internacionais.
Outra área que se mostra aberta a técnica da FTIR é a da ciência dos

alimentos. É sabido que o conteúdo de açúcares totais é frequentemente utilizado
como parâmetro indicador do amadurecimento de uma fruta, e por isto, configura-se
como um critério importante na avaliação da comestibilidade de frutas, além da
qualidade de produtos processados (POMERANZ e MELOAN, 1994). Além disso,
mais especificamente, sabe-se que a glicose, a frutose e a sacarose são os
açúcares mais abundantes de determinadas frutas, como a manga, por exemplo
(MEDLICOTT e THOMPSON, 1985). Baseado nestas informações, Duarte et al.
(2002), propuseram uma metodologia para a determinação simultânea de glicose,
frutose e sacarose em amostras de suco de manga. No modelo de calibração, o
grupo aplicou o algoritmo PLS. Até aqui, exceto pela matriz, não há qualquer
50
diferença entre esta aplicação e as demais já descritas. Contudo, utilizando a
Análise por Componentes Principais (PCA), os autores foram capazes de
estabelecer quais eram as principais fontes de variabilidade dentro do conjunto de
dados. Resumidamente, o grupo foi capaz de estabelecer através de um conjunto de
calibração construído a partir de amostras reais, a relação entre o grau de
amadurecimento de uma amostra de fruta e a composição de cada um dos três
açúcares. Este modelo permitiu a análise de amostras comerciais de sucos de
manga de diferentes fabricantes, e assim, controlar uma possível utilização de frutas
consideradas inadequadas ao consumo. Publicações semelhantes podem ser
facilmente encontradas para outras frutas como damasco (BUREAU et al, 2009),
maçã (IRUDAYARAJ e TEWARI, 2003) e laranja (KELLNER et al, 1997). Neste
último, os autores publicaram uma técnica automatizada para a determinação de
sacarose por FIA-FTIR através da hidrólise enzimática.
Uma interessante aplicação foi publicada por Fairbrother, George e Williams

(1991). Os pesquisadores estavam interessados em monitorar o processo de
fermentação do soro do leite pelo Lactobacillus helveticus 8652, em linha. Para isso,
os níveis de substrato (lactose) e produto (ácido lático) foram monitorados por 47
horas. A exatidão do método foi estimada entre 0,9 e 1,1% através de amostras de
composição conhecida, entretanto, para fins de Controle em Processo a maior
vantagem adquirida pela proposta da FTIR foi a velocidade com que a informação
era gerada (aproximadamente 3 minutos), característica que não pôde ser igualada
pelas técnicas correlatas como a cromatografia a gás e kits para determinação
espectrofotométrica em bancada.
Moros et al. (2006) fizeram uma avaliação crítica da aplicação por eles
proposta para a determinação de vários parâmetros nutricionais em amostras
comerciais de iogurtes por ATR-FTIR. Nesta avaliação, os parâmetros nutricionais
em estudo foram: o valor energético, assim como o de carboidratos, proteínas e
conteúdo de cálcio. Os autores utilizaram uma população de 48 amostras, cobrindo
uma ampla faixa de tipos de iogurtes comercializados nos mercados espanhóis, a
fim de construírem um conjunto de calibração representativo. Este conjunto de
amostras incluiu segundo o grupo; iogurte comum, com adição de açúcar, sem
gordura, com baixos teores de gordura, com altos teores de gordura, aromatizados,
51
dentre outros. Esta heterogeneidade, segundo os autores, causou influência
negativa na robustez do método. Por outro lado, os pesquisadores concluíram boas
estimativas para todos os parâmetros nutricionais, inclusive para o conteúdo de
cálcio, o que apenas não foi observado na medição do conteúdo de gordura, onde
se acredita haver interferências espectrais mediante a presença de ácidos láticos
que absorvem em regiões muito próximas às dessas espécies.
A análise de amostras ambientais se mostra de interesse proeminente em

química analítica. Mais especificamente, a determinação de defensivos agrícolas em
formulações de pesticidas tem sido extensivamente explorada com o uso da FTIR.
Akbal, Akdemir e Onar (2000), propuseram uma metodologia para a determinação
do pesticida lambda-cialotrina em amostras de águas pela FTIR. Os autores
adicionaram uma etapa de pré-concentração do analito através da sorção do
pesticida em pedra-pomes modificada quimicamente com brometo de
hexadeciltrimetilamônio. Desta forma, foi possível alcançar sensibilidades
comparáveis às obtidas pela cromatografia a gás, que é a metodologia mais
amplamente difundida para esta aplicação, reduzindo drasticamente o custo da
análise.
Outra aplicação de interesse ambiental foi proposta por Moros et al. (2010). O
grupo estudou a qualidade dos sedimentos estuarinos1 da região ao longo de Ria de
Arousa, localizada na costa noroeste da Espanha. Utilizando um modelo
quimiométrico (PLS) e a FTIR, o grupo foi capaz de realizar a medição de alguns
marcadores químicos que podem ser aplicados no controle da contaminação do
ambiente estuarino. Baseando-se na capacidade dos sedimentos em ligarem-se a
metais através de processos de precipitação, adsorção ou troca-iônica
(CROMPTON, 2001), os pesquisadores realizaram a especiação de cromo, além da
determinação de metais em níveis de traços de estanho, chumbo, cádmio, antimônio
e arsênio, acessando a biodisponibilidade de metais ao longo da região, associada à
medição do pH e do potencial redox. A aplicação desta característica química dos
sedimentos tornou possível a determinação de metais, o que de outra maneira seria
inconcebível por esta técnica, consequentemente, o grupo conseguiu explorar as
1
Estuários são ambientes aquáticos transicionais entre um rio e o mar, além disso, são complexos no
que diz respeito à fonte e composição de seus sedimentos aquáticos (MOROS et al., 2010).
52
facilidades operacionais da FTIR, como a capacidade de processar um grande
número de amostras coletadas em diferentes pontos da região, e ao longo de um
intervalo de tempo de mais de um ano, fato que ofereceu à pesquisa valiosas
informações acerca da variabilidade e sazonalidade daquela localização.
O manuseio de proteínas de valor farmacêutico ainda é um grande desafio da

biotecnologia. Isto muito se deve à sua baixa estabilidade em soluções. Contudo,
apesar da remoção de água, em geral provocar uma melhoria de estabilidade, sabe-
se que processos deste tipo envolvem riscos, em virtude da dependência de sítios
hidrofóbicos e hidrofílicos nas estruturas secundárias e terciárias das proteínas
(WANG, 2000). Além disso, de acordo com Yoshioka e Aso (1994), mesmo em
formulações desidratadas aparentemente estáveis, tais modificações são
observadas em função do tempo de armazenamento, com uma conseqüente
influência negativa à sua estabilidade. Vonhoff, Condliffe e Schiffter (2010)
implementaram uma estratégia para determinar mudanças na estrutura secundária
de proteínas, empregando ferramentas quimiométricas, como modelo de calibração
de espectros de proteínas obtidos pela FTIR. De fato, modificações nas
conformações do tipo -hélice ou -pregueada (intramolecular) para conformações
agregadas (-pregueada, intermolecular) estão diretamente associadas a danos
estruturais e, tais modificações, são facilmente observadas através de espectros de
infravermelho médio (VONHOFF, CONDLIFFE E SCHIFFTER, 2010). Assim, os
autores puderam quantificar possíveis danos causados a proteínas em virtude de
diferentes processos industriais.
Dentro da indústria Petroquímica são diversas as aplicações da FTIR. A fim

de monitorar a indesejável precipitação de asfaltenos, que dentre outros
inconvenientes, são responsáveis por entupimento de poços além de incrustações
em trocadores de calor. Wilt, Welch e Rankin (1998) desenvolveram uma
metodologia para a determinação de asfaltenos em amostras de óleos crus. O
modelo de calibração foi construído a partir de cinqüenta amostras de petróleos
obtidas de diferentes condições geológicas ao redor do mundo. Os autores
enalteceram o fato da não utilização de solventes, o que não é observado pela
53
metodologia de referência publicada pela ASTM2 (American Society for Testing and
Materials), além da alta capacidade de processamento, também superior àquela
observada pela norma.
Oliveira et al. (2006) desenvolveram uma metodologia para a determinação

de metil ésteres em misturas de biodiesel. Os modelos de calibração utilizados
combinaram os espectros de infravermelho próximo com transformada de Fourier
(FTNIR) e ATR-FTIR com os algoritmos PLS e redes neurais artificiais. Os metil
ésteres foram obtidos através da transesterificação do óleo de soja, óleo de soja
frito, além do óleo de babaçu e de dendê. Esta cuidadosa e específica escolha dos
produtos de transesterificação é de extrema importância, pois, de acordo com as
normas regulatórias brasileiras para a produção de biodiesel, não há restrição
quanto ao uso de óleos vegetais. Ademais, as leis brasileiras oferecem benefícios
para a produção de biodiesel que utilizem óleos produzidos através da agricultura
familiar. Em vista disto, e a fim de obter uma metodologia capaz de evitar possíveis
fraudes fiscais, os autores utilizaram diferentes fontes de biodiesel para a solução do
problema analítico.
2
A referência não descreve a técnica utilizada pela norma ASTM.
54
3 OBJETIVOS
3.1 GERAIS
 Desenvolver uma metodologia analítica para a determinação direta de

L-Glutamato de sódio e Sorbitol em amostras pré-vacinais empregando
a técnica da Espectroscopia de Absorção no Infravermelho médio com
Transformada de Fourier (FTIR).
3.2 ESPECÍFICOS
 Otimização dos parâmetros analíticos, tais como: resolução nominal e

número de scans acumulados, além da seleção de bandas
específicas a fim de se obter as melhores condições para a realização
das medições;
 Comparação dos resultados obtidos através de análises de amostras

de rotina com a metodologia proposta e outras metodologias de
referência ou metodologia difundida e amplamente aceita no meio
científico;
 Validação completa da metodologia proposta;
55
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO DA INFORMAÇÃO ANALÍTICA
4.1.1 Aquisição das amostras de trabalho
As amostras de termoestabilizador foram adquiridas a partir de duas fontes

distintas. Primeiramente, foram recebidas cinco amostras de diferentes lotes
aleatoriamente selecionados, e produzidos em rotina pelo laboratório responsável
pelo preparo de meios de cultura e soluções (SEMES), localizado no Departamento
de Vacinas Virais de Bio-Manguinhos/FIOCRUZ. As amostras estavam identificadas
pelos seguintes números de lote: 012/11, 060/11, 069/11, 076/11 e 082/11. Outro
conjunto de cinco amostras foi preparado no próprio laboratório onde os
experimentos foram realizados, isto é, no Laboratório Físico-Químico (LAFIQ), que
pertence ao Departamento da Qualidade (DEQUA), localizado no Centro
Tecnológico de Vacinas (CTV) de Bio-Manguinhos/FIOCRUZ. As amostras foram
preparadas seguindo procedimento semelhante ao do laboratório SEMES, porém,
foram produzidas em menor escala. Com isso, as concentrações teóricas das
espécies componentes Sorbitol e L-Glutamato de sódio eram conhecidas. Em função
de dificuldades operacionais que inviabilizaram o preparo da gelatina hidrolisada no
LAFIQ, ela foi enviada pelo SEMES sob a forma de uma solução a 25 % (m/v). Em
seguida, esta solução era diluída a aproximadamente 9% (m/v), concentração na
qual se estima que esta espécie esteja presente na solução de termoestabilizador.
Estas cinco amostras sintéticas foram identificadas pelas letras B, C, D, E e F. Em
seguida a Tabela 1, com as respectivas massas de cada uma das espécies das
amostras preparadas em laboratório.
Para o preparo destas amostras, foi utilizado L-Glutamato de sódio, marca

Merck EMPOVE® EXP, lote 39104443 adequado para o uso como excipiente e
sorbitol, marca Roquette Freres, lote E608J, grau analítico.
56
Tabela 1. Massas de L-Glutamato de sódio e Sorbitol utilizadas no preparo das amostras em laboratório.
Amostra B Amostra C Amostra D Amostra E Amostra F

Massa de L-Glutamato de sódio (g) 3,436 3,670 3,429 3,477 3,523
Massa de Sorbitol (g) 7,876 7,752 7,900 7,951 7,879
Volume de solução (mL) 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00
Identificação do balão volumétrico V-13-234 V1874 V-13-236 V-13-229 V-13-096
Desde o recebimento/preparo das amostras até a completa execução dos

experimentos deste trabalho, as amostras permaneceram estocadas em câmara fria
a uma temperatura que variou entre 2 e 8 °C, sendo retiradas desta condição
apenas para o preparo das amostras de trabalho, a fim de garantir as mesmas
condições de armazenamento das vacinas contra a febre amarela.
4.1.2 Espectros de infravermelho
Para a obtenção dos espectros de infravermelho médio, foi utilizado durante o

trabalho um espectrômetro de marca Thermo Nicolet, modelo 4700. Este modelo
estava equipado com uma fonte ECT (Eletronically Temperature Controlled)
EVERGLO®, um beamsplitter de KBr, além de um detector do tipo DTGS (sulfato de
triglicina deuterado). O acessório de reflectância total atenuada (ATR) contava com
um cristal de diamante como elemento de reflexão, além disso, o equipamento era
dotado de um sistema de purga intermitente de ar comprimido seco, a fim de manter
o equipamento livre de umidade interna. Os espectros foram tratados através do
software OMNIC, versão 6.0a e o software TQ Analyst 6.1.1.356 Professional Edition
foi utilizado para obtenção dos modelos de regressão.
Todos os espectros foram adquiridos introduzindo-se a amostra diretamente

sobre o cristal de ATR, o que em geral, exigiu de uma a duas gotas de amostra. Não
foi realizada qualquer etapa de preparação da amostra e antes da obtenção de cada
um dos espectros, foi realizado um background com água. O background se dá em
função da necessidade de se obter uma escala relativa de intensidade de absorção,
e a utilização da água se dá, a fim de descontar a sua contribuição no espectro da
amostra, uma vez que as mesmas se encontram em solução aquosa.
57
A primeira etapa de pré-tratamento teve por finalidade a obtenção dos
espectros de cada uma das espécies individualmente. Para isto, foram preparadas
soluções de L-glutamato de sódio, sorbitol e gelatina hidrolisada, desta forma seria
possível identificar algumas bandas de potencial interesse analítico.
Em seguida, dedicou-se a estudar o espectro da amostra. Nas mesmas

condições não otimizadas da etapa anterior, a amostra foi introduzida no
equipamento. A proposta era que, ao final desta etapa, fosse possível correlacionar
qualitativamente as bandas previamente selecionadas com as obtidas no espectro
da amostra de termoestabilizador.
A última etapa do pré-tratamento dos espectros consistiu na construção de

curvas analíticas para L-glutamato de sódio e sorbitol em cada uma de suas bandas
selecionadas. O objetivo era verificar uma possível relação linear entre a variação do
sinal analítico e a concentração, ou seja, a validade da Lei de Lambert-Beer.
4.1.2.1 Otimização dos parâmetros espectrais
Sob a abordagem utilizada na manipulação da informação espectral, cabe

destacar que todos os espectros foram obtidos tendo-se em mente a construção de
um modelo de calibração mais sensível possível, desde que fosse capaz de explicar
a relação entre o sinal analítico e a propriedade de interesse (a concentração), posto
que desde sempre se vislumbrou o equilíbrio entre a simplicidade, adequação e
ajuste dos dados experimentais.
O primeiro parâmetro a ser otimizado foi o registro do sinal analítico. Foram

testadas duas alternativas. A primeira consistiu na construção de uma curva analítica
onde o sinal foi estabelecido a partir das áreas sob as curvas para cada uma das
bandas, enquanto que a outra repetiu o procedimento anterior, porém, a construção
da curva foi obtida pela altura do sinal no ponto de máxima absortividade molar
(max). Estes dois procedimentos de calibração externa foram realizados corrigindo-
se a linha de base em dois pontos de cada banda, além disso, a recíproca também
foi testada, isto é, sem qualquer correção de linha de base. Para avaliação desta
58
etapa, foi preparada uma amostra na qual a concentração de L-glutamato de sódio e
sorbitol eram conhecidas. Em seguida, cada uma destas curvas foram testadas com
esta amostra. A partir daí, estabeleceu-se um erro percentual de acordo com a
fórmula abaixo:
Erro (%) = [(Conc.teórica-Conc.experimental)/Conc.teórica] x 100
Onde, Conc.teórica representa a concentração estimada através das massas

pesadas e os valores nominais de seus respectivos balões volumétricos declarados
nos certificados de calibração e, Conc.experimental é o valor obtido nesta etapa.
A proposta desta etapa, com estabelecimento deste erro, é a sua associação

com possíveis interferências espectrais decorrentes da sobreposição de bandas.
Contudo, sabe-se que esta afirmação poderia ainda não ser verdadeira. Além disso,
a possibilidade da ocorrência de interferências não espectrais, também conhecidas
como interferências de matriz também não poderia ser descartada. A intenção
destes experimentos era eliminar, o quanto antes, as bandas que já apresentavam
erro sistemático frente ao valor teórico, restringindo a continuidade do trabalho a
apenas duas bandas (uma para cada analito), que apresentassem o menor erro
percentual. Desde então era sabido que a ausência ou evidência de interferências
espectrais só poderia concluída após a estimativa de exatidão do método, durante a
validação analítica. Quanto às interferências não espectrais (matriz), apenas após o
ensaio de adição padrão, seria possível inferir conclusões.
Posteriormente, foram otimizados dois parâmetros de interesse particular na

FTIR. São eles, o número de scans e a resolução nominal. Sucintamente, é possível
definir a resolução como o mínimo intervalo espectral distinguível. Em
espectroscopia de absorção no infravermelho médio com transformada de Fourier a
resolução é determinada pelo retardamento (diferença de caminho óptico) máximo
de uma dada varredura. A resolução óptica máxima alcançável por um
espectrômetro é dada por (Dmax)-1 cm-1, onde Dmax é a máxima diferença entre os
caminhos ópticos (entre os espelhos fixo e móvel) em um dado interferômetro. O
scan é um parâmetro que representa uma varredura completa do espelho móvel ao
longo do caminho óptico, logo o espectro resultante é o sinal médio obtido para cada
59
elemento de resolução espectral. O aumento sucessivo do número de scans
aumenta a relação sinal/ruído por um fator proporcional a t1/2, onde t é o tempo de
medição equivalente a um scan ou uma varredura completa (CHRISTY, OZAKI e
GREGORIOU, 2001).
Diante do exposto acima, foi desenvolvido um estudo monoparamétrico para

cada um dos analitos em que as condições analíticas mais adequadas seriam
aquelas obtidas com a maior sensibilidade e maior freqüência de análise, isto é,
menor tempo. Ou seja, para uma dada resolução nominal, variou-se o número de
scans de 16, 32, 64 e 100, registrando-se a inclinação obtida para cada uma das
curvas. As resoluções nominais testadas foram 2, 4, 8 e 16 cm-1.
4.1.3 Comparação entre metodologias
De acordo com a resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA), RE n° 899 intitulada “Guia para validação de métodos analíticos e
bioanalíticos” a exatidão de um método analítico é a proximidade entre os resultados
obtidos pelo método em estudo e o valor aceito como verdadeiro. Esta resolução
define que a exatidão pode ser estimada através de várias metodologias diferentes,
das quais a aplicação da metodologia analítica na análise de um material de
referência certificado da substância de interesse da mesma é a mais recomendada
delas. Contudo, a disponibilidade de materiais de referência certificados é ainda
muito restrita, o que torna esta metodologia, por vezes, inviável. Outra proposta é a
comparação entre os resultados obtidos pela metodologia proposta com uma
segunda, bem caracterizada cuja exatidão tenha sido estabelecida, podendo esta
ser um método farmacopéico ou outro procedimento analítico validado.
Dada a singularidade da amostra, não é de causar estranheza a inexistência

de um material de referência certificado, ou apenas um material de referência para o
termoestabilizador da vacina contra a febre amarela. Além disso, está fora do
escopo deste trabalho a elaboração do mesmo. Desta forma, a fim de possibilitar a
estimativa da exatidão do método proposto, buscou-se estabelecer a comparação
com outras metodologias. Neste sentido, utilizou-se a Farmacopéia Americana, USP
60
(United States Pharmacopeia) 30ª edição, como fonte primária de pesquisa e como
compêndio de referência.
Para a determinação de sorbitol nas amostras de termoestabilizador, foi

utilizada a metodologia descrita pelo referido compêndio que emprega a técnica da
Cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE), que será descrita no item a seguir.
Para a determinação de L-glutamato de sódio, contudo, houve uma dificuldade
adicional, oriunda da natureza do termoestabilizador na escolha de uma proposta
alternativa adequada. Não há, publicado na Farmacopéia, qualquer procedimento
para determinação de aminoácidos em soluções aquosas de qualquer espécie.
Sendo assim, optou-se pela utilização de um kit para determinação de L-glutamato,
através da reação enzimática com a enzima L-glutaminase com detecção
espectrofotométrica na região do ultravioleta, comercializado pela empresa Sigma-
Aldrich. Foram encontradas algumas referências na literatura onde o referido kit
havia sido empregado (KORENAGA et al., 2005; WICKS e RANDALL, 2002 e
COWLEY et al., 2004). A principal característica que motivou a utilização deste kit foi
a alta especificidade, promovida pela reação enzimática mediada pela L-
glutaminase, de forma que eventuais proteínas e/ou peptídeos provenientes da
gelatina não seriam interferências, característica também explorada pelos autores
nos trabalhos citados acima.
4.1.4 Cromatografia a líquido de alta eficiência
Para a determinação de sorbitol nas amostras de termoestabilizador foi

utilizado um sistema cromatográfico da marca Waters, modelo Alliance 2695 com
detector por índice de refração modelo 2414 que, durante todo o procedimento foi
mantido a 40 °C. O software utilizado para controle do sistema foi o ENPOWER® 2.
O fluxo utilizado durante o procedimento foi de 0,8 mL/min e o volume de injeção foi
de 20 L. O tempo de cada corrida foi de 20 minutos. A coluna analítica utilizada foi
a Sugar Pak, SC1011, marca Shodex (Waters) a qual é preenchida com uma resina
sulfônica de troca catiônica de copolímero de estireno-divinilbenzeno, 8,0 x 300 mm
e 6 m de tamanho de partícula, além de uma coluna de guarda Sugar Pak,
SC1011P, mesmo fabricante, de dimensões 6,0 x 50 mm onde a temperatura de
61
trabalho programada foi de 80 °C + 5°C. A fase móvel empregada na análise foi
água deionizada.
Durante o preparo da amostra, 1,52 mL do estabilizador foi pipetado para um

balão volumétrico calibrado de 50,00 mL. Esta etapa foi repetida três vezes. Para o
preparo do padrão, a metodologia recomenda a utilização do Sorbitol USP, citado
pelo compêndio como “padrão de referência”. Desta forma, foi pesada uma
quantidade de padrão para que a concentração da solução final fosse de 4,8 mg/mL.
Entretanto, para que a análise seja considerada como válida, a metodologia

propõe que seja injetada no sistema uma solução de resolução, composta por
sorbitol e manitol, a fim de se estimar a eficiência da separação cromatográfica
obtida em termos da resolução. Sendo assim, a solução foi preparada de modo que
a concentração final de cada um dos açúcares na solução fosse também de 4,8
mg/mL.
Cabe ressaltar que cada uma das soluções, isto é, padrão e amostras foram
preparadas em triplicada e, cada um destes preparos foram injetados por três vezes
caracterizando assim, ensaios mutuamente independentes. Ao final da sequência de
injeções, as áreas sob os picos cromatográficos foram integrados com o auxílio do
software ENPOWER® 2 para que fossem efetuados os cálculos pertinentes.
4.1.5 Espectrofotometria na região do ultravioleta e do visível (UV/vis)
A metodologia comparativa para a determinação de L-glutamato baseia-se na

reação enzimática mediada pela L-glutaminase que promove a desidrogenação do
L-glutamato além da redução do NAD+, de acordo com a reação abaixo.
L-GLDH
+ + H2O + + NH4+
L-Glutamato α-cetoglutarato
NAD+ NADH
Figura 12. Reação mediada pela enzima L-glutaminase formando -cetoglutarato, NADH e amônio.
62
A reação se dá em uma única etapa em que ocorre a desidrogenação do L-
glutamato coma formação do -cetoglutarato liberando amônio, com a concomitante
redução do NAD+ a NADH que pode ser detectado espectrofotometricamente na
região do visível a 340 nm.
Para a realização dos ensaios, como descrito no item 4.1.3, foi utilizado um kit
para a determinação de L-glutamato, cujo código de identificação é GLN-1, fornecido
pela empresa Sigma-Aldrich. Cabe ressaltar que o kit é específico para L-glutamato,
não sendo aplicado ao seu isômero óptico. Ademais, todos os reagentes utilizados
descritos adiante foram fornecidos pelo kit.
A construção da curva analítica obedeceu as etapas descritas pelo

procedimento que acompanha o kit. Isto é, em tubos de ensaio foram adicionados
1,0 mL de solução tampão Tris-EDTA-Hidrazina, 0,1 mL de solução de NAD e 0,01
mL de solução de ADP. Para cada um dos tubos, devidamente identificados, foram
adicionadas as quantidades descritas pela Tabela abaixo de padrão de glutamato e
água, respectivamente.
Tabela 2. Preparo da curva analítica para a determinação espectrofotométrica de L-glutamato.
Glu (mL) H2O (mL)

0 0,89
0,05 0,84
0,1 0,79
0,15 0,74
0,2 0,69
0,25 0,64
Quanto ao preparo da amostra, procedeu-se como segue: pipetou-se 1,0 mL

da amostra de termoestabilizador para um balão volumétrico calibrado de 500,00
mL. Em seguida, tomou-se uma alíquota de 250 L desta solução em um tubo de
ensaio contendo os reagentes descritos acima, e adicionou-se 640 L de água
deionizada.
Em seguida, cada um dos tubos foram tampados e agitados por inversão.

Posteriormente, adicionou-se 0,02 mL de L-glutaminase em todos os tubos de
ensaio e novamente eles foram agitados do mesmo modo. Após 40 minutos de
63
repouso foram realizadas as devidas medições a 340 nm em um espectrofotômetro
da marca Hitachi, modelo U5100 com o auxílio de uma cubeta de quartzo. Após o
registro das medições, procedeu-se a elaboração da curva analítica em uma planilha
eletrônica.
4.1.6 Validação analítica
A validação de um método tem por finalidade avaliar a adequabilidade de um

dado procedimento analítico, demonstrando se o mesmo é ou não apropriado para a
finalidade pretendida (ANVISA, 2003). De acordo com o Instituto Nacional de
Metrologia (INMETRO), as validações analíticas se estendem ao seguinte conjunto
de métodos (INMETRO, 2010):
 Métodos não normalizados;

 Métodos criados/desenvolvidos pelo próprio laboratório;
 Métodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram
concebidos;
 Ampliações e modificações de métodos normalizados.
Além disso, os parâmetros a serem avaliados durante o processo de

validação analítica sofrem algumas variações de acordo com a finalidade pretendida,
entretanto, de acordo com os objetivos do presente trabalho a validação deverá
avaliar as seguintes figuras de mérito:
 Especificidade e Seletividade;
 Linearidade;
 Intervalo;
 Precisão;
 Limite de detecção;
 Limite de quantificação;
 Exatidão;
 Robustez.
64
4.1.6.1 Especificidade e Seletividade
Ainda hoje há muita discussão acerca dos termos especificidade e

seletividade. De acordo com o Guia para validação de métodos analíticos e
bioanalíticos da ANVISA, ambos os termos são utilizados indiscriminadamente.
Contudo, durante o documento “Orientação sobre Validação de métodos analíticos”
do INMETRO, apenas o termo seletividade é usado, todavia, o parâmetro não é
claramente definido, restringindo a discussão tão somente à estimativa e avaliação
deste parâmetro. Este documento salienta, entretanto que, caso a seletividade não
seja assegurada, a linearidade, a tendência e a precisão estarão seriamente
comprometidas.
Recorrendo a União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC),

verifica-se que, de fato, o termo especificidade não é mais empregado. Por outro
lado, deve ser utilizada a palavra seletividade a fim de expressar a extensão na qual
um método particular pode ser usado para determinar analitos sob dadas condições
na presença de outras substâncias de comportamento similar (VESSMAN et al.,
2001).
Entretanto, o referido guia publicado pela ANVISA em 2003 permanece em

vigor até o momento da redação deste trabalho, sendo este documento válido e
aplicável em todo território nacional, dentro do escopo da indústria farmacêutica e de
imunobiológicos. O termo especificidade será então mantido, porém, é sabido se
tratar de um termo em desuso.
4.1.6.1.1 Estimativa da seletividade
A avaliação da seletividade foi realizada através do preparo de uma amostra

em laboratório, na qual não foi adicionada qualquer quantidade do analito em
questão. Desta forma, foram conduzidos dois preparos independentes, isto é, um
preparo sem adição de sorbitol, para a estimativa da seletividade na determinação
de L-glutamato de sódio e outro preparo, sem a adição deste último, a fim de se
estimar a seletividade do método proposto para a determinação de sorbitol.
65
4.1.6.2 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os

resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra (ANVISA, 2003). A quantificação requer o conhecimento da dependência
entre o sinal obtido e a sua concomitante concentração. A linearidade pode ser
obtida por padronização interna ou externa, e formulada como uma equação
matemática a ser posteriormente utilizada para o estabelecimento da concentração
da amostra (INMETRO, 2010). O coeficiente de determinação (r2), obtido após a
regressão pelo método dos mínimos quadrados mínimo aceitável é de 0,99, de
acordo com o guia publicado pela ANVISA (ANVISA, 2003).
4.1.6.2.1 Estimativa da linearidade
Para cada um dos analitos estudados, construíram-se três curvas analíticas

independentes onde cada um dos pontos da curva foram medidos em triplicata,
caracterizando ensaios mutuamente independentes. A curva analítica para L-
glutamato de sódio foi construída nas seguintes concentrações: 0, 2, 4, 6, 8 e 10%
(m/v), enquanto que a curva analítica para a determinação de sorbitol foi construída
seguindo as concentrações: 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (m/v). Em seguida, procedeu-se
a regressão pelo método dos mínimos quadrados para ambas as curvas.
4.1.6.3 Intervalo
É conhecida como intervalo, a faixa entre os limites de quantificação inferior e

superior de um método analítico (ANVISA, 2003). Na prática, torna-se uma
conseqüência natural e derivada do estudo de linearidade. De acordo com o
INMETRO, este parâmetro representa a faixa de concentrações onde o método pode
ser aplicado.
A ANVISA estabelece que, para determinações quantitativas do analito em

matérias-primas ou em formas farmacêuticas, o alcance do intervalo deve ser de 80
a 120% da concentração teórica do teste. Além disto, é desejável que, sempre que
66
possível, esta concentração teórica esteja no centro da faixa de trabalho, local onde
a incerteza relativa aos pontos experimentais é menor.
Considerando que a concentração teórica de L-glutamato de sódio esteja em

torno de 7% (m/v) nas soluções de termoestabilizador, o que compreende uma faixa
de trabalho mínima de 1,4 a 8,4% (m/v). Em relação ao sorbitol, estima-se uma
concentração teórica estabelecida em torno de 16% (m/v). Logo, a faixa de trabalho
desejada deverá estar entre 3,2 e 19,2% (m/v).
4.1.6.4 Limite de detecção (LD)
A ANVISA define o limite de detecção como a menor quantidade do analito

presente em uma amostra que pode ser detectado sob as condições experimentais
estabelecidas. Também pode ser entendido como a concentração de um dado
analito tal, que pode ser estatisticamente diferenciado do sinal do branco.
Quanto ao limite de detecção e o parâmetro que será descrito a seguir, o

limite de quantificação, há muita controvérsia, não sendo um termo aceito por todos
(INMETRO, 2010). Além disso, o limite de detecção pode variar em função da
natureza da amostra, assim como de certas condições ambientais, dependendo da
metodologia aplicada. Hoje, existem várias propostas para a estimativa dos limites
de detecção, assim como os de quantificação. Durante a execução destes
experimentos, procedeu-se conforme a metodologia descrita a seguir, também
conhecida como a técnica dos 3s.
4.1.6.4.1 Estimativa do Limite de detecção
Através da construção de três curvas analíticas independentes, determinou-se
o desvio padrão do intercepto (ou o coeficiente linear), a. Adiante, este valor é
aplicado na fórmula abaixo (ANVISA).
LD = (3 x a)/IC, onde IC é a inclinação (ou o coeficiente angular) da curva

analítica.
67
4.1.6.5 Limite de Quantificação (LQ)
Também conhecido como limite de determinação, é a concentração do analito

que origina um sinal que pode ser considerado como o limite inferior da faixa linear
(VALCÁRCEL, 2000). Evidentemente, representa um parâmetro mais significativo
em análises quantitativas que o limite de detecção, sendo de especial relevância em
ensaios para determinações de impurezas e produtos de degradação.
4.1.6.5.1 Estimativa do limite de quantificação
O limite de quantificação pode ser estimado através do ruído nas técnicas

instrumentais. Nestes casos, determina-se o ruído da linha de base, considerando-
se como limite de quantificação, uma concentração tal que produza uma relação
sinal/ruído acima de 10 vezes (ANVISA, 2003). Contudo, procedeu-se de modo
análogo ao item anterior, isto é, construíram-se três curvas analíticas independentes,
determinou-se o desvio padrão do intercepto (ou o coeficiente linear), a. Em
seguida, aplicou-se na fórmula abaixo.
LQ = (10x a)/IC, onde IC é a inclinação (ou o coeficiente angular) da curva

analítica.
4.1.6.6 Precisão
A precisão é a descrição do erro aleatório inerente a um dado processo de

medição (MILLER e MILLER, 2005). É a proximidade dos resultados obtidos em um
conjunto de medições de uma dada amostra (ANVISA, 2003). Em geral, é expressa
em três diferentes níveis. A repetitividade, a precisão intermediária e a
reprodutibilidade. Matematicamente, o modo mais usual de descrever a precisão é
através do cálculo do desvio padrão ou, de modo percentual, o coeficiente de
variação (ou desvio padrão relativo).
Durante a execução deste trabalho a estimativa da precisão obtida pelo

método foi feita através da repetitividade e da precisão intermediária. Sabe-se,
68
contudo que, apesar da reprodutibilidade não ser considerado como um parâmetro
de validação a ser trabalhado por um único laboratório, é de suma importância para
a avaliação de metodologias através de estudos interlaboratoriais (INMETRO, 2010).
4.1.6.6.1 Repetitividade
Metrologicamente, a repetitividade pode ser entendida como a mínima

dispersão ou, a máxima precisão que pode ser obtida por um método analítico
considerando-se ensaios mutuamente independentes (VALCÁRCEL, 2000). A fim de
se obter a repetitividade em um processo de validação analítica, devem ser
obedecidas as seguintes condições:
 Mesmo procedimento de medição;

 Mesmo observador;
 Mesmo instrumento usado sob as mesmas condições;
 Mesmo local;
 Repetições obtidas no menor espaço de tempo possível.
Além disso, a ANVISA determina que a repetitividade de um método seja

obtida através de, no mínimo, nove determinações, desde que sejam contempladas
as faixas de concentrações baixa, média e alta do intervalo da curva (em triplicata)
ou, no mínimo, seis determinações a 100% da concentração do teste.
4.1.6.6.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária ou precisão inter-corridas por sua vez, é definida

pelo grau de concordância dos resultados obtidos pelo mesmo laboratório, porém:
 Obtidos por diferentes analistas;
 Em dias diferentes;
 Se possível, equipamentos diferentes.
Desta forma, a precisão intermediária representa a máxima variabilidade

(dispersão) obtida em um conjunto de medições mutuamente independentes pelo
69
mesmo laboratório ou, a mínima precisão obtida por ele nestas circunstâncias
(VALCÁRCEL, 2000).
Neste trabalho estimou-se a precisão intermediária da metodologia através da

análise de uma amostra de termoestabilizador por dois analistas diferentes em dois
dias diferentes.
4.1.6.7 Exatidão
A exatidão de um método analítico, a exemplo da representatividade é

considerada uma propriedade suprema em química analítica (VALCÁRCEL, 2000). A
exatidão é suportada pela precisão, sensibilidade e seletividade, e é definida como a
diferença entre um valor obtido experimentalmente e o valor aceito como verdadeiro
(valor de referência).
Como já foi anteriormente discutido, devido à ausência de material de

referência certificado, recomenda-se a comparação dos resultados com aqueles
obtidos por uma segunda metodologia bem caracterizada, isto é, cuja exatidão seja
conhecida. A ANVISA ainda considera como válido o ensaio conhecido como ensaio
de recuperação, onde se adiciona quantidades conhecidas do analito (Spike) à
amostra submetendo-a a análise. Este ensaio de recuperação, também conhecido
como ensaio de fortificação, possui a limitação de que o analito adicionado pode não
estar necessariamente na mesma forma que a observada na amostra. Sendo assim,
caso sejam adicionados analitos em apresentações mais facilmente detectáveis,
admite-se o risco de realizar avaliações excessivamente otimistas sobre a exatidão
(INMETRO, 2010).
Todavia, durante este trabalho, os dois procedimentos supracitados foram

utilizados, de modo a realizar a melhor estimativa o tanto quanto possível da
presença ou ausência de erros sistemáticos através da avaliação da exatidão.
70
4.1.6.8 Robustez
A robustez é a medida da capacidade de um método analítico em resistir a

pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Por conta disto, torna-
se um indicativo de sua confiabilidade durante o uso rotineiro.
Durante o desenvolvimento desta metodologia, planejou-se a estimativa da

robustez mediante a avaliação da susceptibilidade do método a variações no pH e
temperatura da amostra, que de fato, entende-se, são variáveis mais
frequentemente osciláveis mediante as condições de formulação, amostragem,
transporte e estocagem. Para tanto, uma amostra de concentração desconhecida foi
utilizada, sendo que as determinações de L-glutamato de sódio e sorbitol foram
efetivadas nas temperaturas baixa (entre 2 e 8 °C) e alta (40 °C) e o pH da amostra
foi ajustado para a faixa ácida (4,5) e alcalina (9,0) seguido das respectivas
medições.
71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 OBTENÇÃO DOS ESPECTROS POR FTIR
Como discutido no item 4.1.2, isoladamente, os espectros de cada uma das

substâncias do termoestabilizador foram obtidos com uma configuração inicial de 32
scans e resolução nominal de 4 cm-1. Preparou-se uma solução de L-glutamato de
sódio a 7% (m/v), uma solução de sorbitol a 15% (m/v), além de uma solução de
gelatina hidrolisada de concentração aproximada de 9% (v/v). As Figuras 13, 14 e 15
apresentam os espectros de L-glutamato de sódio, sorbitol e gelatina hidrolisada,
respectivamente.
Figura 13. Espectro do L-Glutamato de sódio em solução aquosa a 7% (m/v).
Figura 14. Espectro do Sorbitol em solução aquosa a 15% (m/v).
72
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
Absorbance
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
- 0,01
350 0 300 0 250 0 200 0 150 0 100 0
W av enu mber s ( c m- 1)
Figura 15. Espectro da Gelatina hidrolisada em solução aquosa a 9% (v/v).
A seguir, na Figura 16, observa-se o espectro de uma amostra de

termoestabilizador produzido em rotina no DEVIR, obtido com resolução nominal de
4 cm-1 e 32 scans.
Figura 16. Espectro da amostra de termoestabilizador.
73
Na Figura 17 ilustram-se os espectros das três substâncias componentes,
além da própria amostra3.
0,32
0,30
0,28
0,26
0,24 Gelatina
0,22
0,20
0,18 Sorbitol
Ab sor ba nce
0,16
0,14
0,12
Glutamato de sódio
0,10
0,08
0,06
0,04
Termoestabilizador
0,02
0,00
200 0 180 0 160 0 140 0 120 0 100 0 800

W av enu mber s ( c m- 1)
Figura 17. Espectros dos componentes e do termoestabilizador.
Adiante, com base em uma análise preliminar dos espectros da Figura 17, foi
possível fazer uma seleção prévia de algumas bandas de interesse em cada uma
das substâncias presentes no termoestabilizador. Foram selecionadas três bandas
para o L-glutamato de sódio e quatro bandas para o sorbitol com seus respectivos
números de onda (cm-1). As bandas selecionadas encontram-se na Tabela 3.
Tabela 3. Números de ondas das bandas selecionadas para L-glutamato de sódio e

sorbitol.
Glutamato de sódio Sorbitol
1557 1415
N° de onda (cm-1)
1402 1084
1347 1046
- 890
Na Figura 18 é apresentado o espectro do termoestabilizador destacando as

bandas selecionadas na Tabela 3.
3
Os Espectros da Figura 17 encontram-se fora de escala e dispostos apenas para fins de
visualização das bandas.
74
Figura 18. Destaque para as bandas selecionadas de L-glutamato (círculos verdes) de
sódio e sorbitol (círculos vermelhos).
Cabe aqui, neste momento do texto, um esclarecimento. Apesar da presença

da gelatina hidrolisada na composição do termoestabilizador, a determinação desta
substância não foi proposta ao longo do trabalho e, é possível que o leitor venha a
questionar os motivos para não fazê-lo. De fato, apreciando cuidadosamente a
Figura 17, é possível observar a intensa sobreposição entre as bandas de gelatina
hidrolisada e L-glutamato de sódio na região que vai aproximadamente de 1500 a
1700 cm-1. Em virtude desta sobreposição, medições realizadas nestas regiões
apresentaram claras interferências espectrais em experimentos realizados
previamente. Dada a ausência de bandas relativas a gelatina com intensidades
significativas em regiões livres de tais sobreposições no espectro do
termoestbilizador e, associado ao fato daquela espécie apresentar uma finalidade
menos crítica durante a formulação do termoestabilizador, assim como na
estabilização da suspensão viral, optou-se então por não proceder adiante com os
estudos.
5.2 SELEÇÃO DAS BANDAS DE INTERESSE
As Tabelas 4, 5, 6 e 7 apresentam as curvas analíticas para a determinação

de L-glutamato de sódio e sorbitol respectivamente, onde seus espectros oram
obtidos sem correção de linha de base através de uma condição experimental
primariamente estabelecida em 32 scans e 4cm-1 de resolução nominal. Os sinais
analíticos foram registrados através da altura em relação à linha de base (Tabelas 4
e 6) além da área sob a curva da região espectral de interesse (Tabelas 5 e 7).
75
Tabela 4. Curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio obtidas para as três bandas
previamente selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à altura.
Altura da banda Curva analítica Coef iciente de correlação

-1
(cm ) y = a + bx ¥ (r2)
1557 y = - 0,0145 + 0,00808x 1,00000
1402 y = - 0,0450 + 0,00627x 0,99998
1347 y = - 0,0859 + 0,00332x 0,99993
Tabela 5. Curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio obtidas para as três bandas
previamente selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à área.
Área da banda Curva analítica Coef iciente de correlação

-1
(cm ) y = a + bx ¥ (r2)
1723 - 1463 y = - 0,0323 + 0,922x 0,99996
1436 - 1371 y = - 0,0714 + 0,257x 0,99996
1101 - 1056 y = - 0,106 + 0,0975x 0,99989
Tabela 6. Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as quatro bandas previamente
selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à altura.
Altura da banda Curva analítica Coef iciente de correlação

(cm-1) y = a + bx ¥
(r2)
1415 y = - 0,117 + 0,00158x 0,99998
1084 y = - 0,113 + 0,00431x 0,99995
1046 y = - 0,251 + 0,00353x 0,99979

890 y = - 0,377 + 0,00110x 0,99989
Tabela 7. Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as quatro bandas previamente
selecionadas, traçadas sem correção de linha de base. Sinais medidos em relação à área.
Área da banda Curva analítica Coef iciente de correlação

(cm-1) y = a + bx ¥
(r2)
1492 - 1354 y = - 0,187 + 0,139x 1,00000
1118 - 1062 y = - 0,122 + 0,176x 0,99997
1063 - 990 y = - 0,278 + 0,206x 0,99960

910 - 838 y = - 0,294 + 0,059x 0,99988
¥ Curvas analíticas onde a e b correspondem à interseção e inclinação respectivamente.
76
Em princípio, todas as bandas previamente selecionadas apresentaram bom
ajuste ao modelo linear4. Esta informação, entretanto, não oferece elementos para
que se decida sobre qual banda, assim como qual condição é a mais adequada para
se proceder as medições subseqüentes. Desta forma, com uma amostra de
termoestabilizador de concentração conhecida de L-glutamato de sódio (6,9% m/v) e
sorbitol (16,0 % m/v) produzida em laboratório, testaram-se cada uma das curvas
obtidas para cada banda selecionada nas condições já descritas, estabelecendo-se
o erro relativo conforme discutido no item 4.1.2.1. As Tabelas 8 e 9 a seguir ilustram
os resultados obtidos para L-glutamato de sódio e sorbitol respectivamente.
Tabela 8. Avaliação prévia da qualidade das medições em termos do erro relativo

para diferentes bandas obtidas em altura e área sem correções na linha de base
para o L-glutamato de sódio.
Altura da banda Erro

Desvio padrão relativo 1
(cm-1) (%)
1557 0,25 73,2
1402 0,36 104
1347 0,47 133
Área da banda Erro
(cm-1) (%)
1723 - 1463 0,36 84,6
1436 - 1371 0,38 145,8
1371 - 1332 0,39 168,8
Tabela 9. Avaliação prévia da qualidade das medições em termos do erro relativo

para diferentes bandas obtidas em altura e área sem correções na linha de base
para o Sorbitol.
Altura da banda Erro

(cm-1) (%)
1415 0,37 181,7
1084 0,43 33,3
1046 0,33 25,2
890 0,98 22,4
Área da banda Erro
(cm-1) (%)
1492 - 1354 0,35 241,3
1118 - 1062 0,39 35,0
1063 - 990 0,39 29,3
910 - 838 0,64 31,3
1 Desvio padrão relativo para três determinações independentes calculados para
uma solução contendo 6,9% (m/v) de L-glutamato de sódio.
4
A rigor, um tratamento estatístico baseado na análise de variância (ANOVA) é mais adequado antes
de se fazer qualquer inferência acerca da qualidade do ajuste obtido. Contudo, por se tratar de uma
etapa prévia onde se deseja conhecer a banda assim como as condições de medição (altura ou área)
mais adequadas, esta avaliação foi mantida.
77
Uma análise crítica destes dados ainda não permite concluir nada a respeito
das medições realizadas através das alturas das bandas ou áreas das bandas,
porém, torna evidente a presença de erro sistemático proveniente da não correção
da linha de base, independente da natureza da espécie, ou modo de medição,
caracterizando a necessidade desta correção a fim de eliminar os enormes erros
observados. Sendo assim, um novo conjunto de experimentos foi realizado de modo
semelhante ao anterior, contudo, cada banda foi corrigida em dois pontos de seu
espectro. Os resultados encontram-se expostos nas Tabelas 10, 11, 12 e 13 abaixo,
para L-glutamato de sódio e Sorbitol respectivamente.
Tabela 10. Curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio obtidas para as três bandas previamente
selecionadas, traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à altura.
Altura da banda Correção Curva analítica Coeficiente de correlação

(cm-1) linha de base (cm-1) y = a + bx (r 2 )
1557 1723 - 1463 y = - 0,00833 + 0,00670x 0,99999
1402 1436 - 1371 y = - 0,0199 + 0,00426x 0,99999
1347 1371 - 1332 y = - 0,0407 + 0,00139x 0,99996
Tabela 11. Curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio obtidas para as três bandas previamente
selecionadas, traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à área.
Área da banda Correção Curva analítica Coeficiente de correlação

(cm-1) linha de base (cm-1) y = a + bx (r2 )
1723 - 1463 1723 - 1463 y = 0,641x - 0,0231 0,99994
1436 - 1371 1436 - 1371 y = 0,124x - 0,0417 0,99998
1371 - 1332 1371 - 1332 y = 0,0235x - 0,0732 0,99992
Tabela 12. Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as três bandas previamente selecionadas,
traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à altura.
Altura da banda Correção Curva analítica Coeficiente de correlação

-1
(cm ) linha de base (cm ) -1 y = a + bx (r2 )
1415 1492 - 1354 y = 0,00102x - 0,00459 0,99992
1084 1118 - 1062 y = 0,00189x - 0,0241 0,99998
1046 1063 - 990 y = 0,000997x - 0,376 0,9995
890 910 - 838 y = 0,000626x - 0,374 0,99982
78
Tabela 13. Curvas analíticas para determinação de Sorbitol obtidas para as três bandas previamente selecionadas,
traçadas com correção de linha de base em dois pontos. Sinais medidos em relação à área.
Área da banda Correção Curva analítica Coeficiente de correlação

(cm-1) linha de base (cm ) -1 y = a + bx (r2)
1492 - 1354 1492 - 1354 y = 0,0680x - 0,0178 0,99989
1118 - 1062 1118 - 1062 y = 0,0506x - 0,0442 0,99998
1063 - 990 1063 - 990 y = 0,0550x - 0,341 0,99922
910 - 838 910 - 838 y = 0,0212x - 0,319 0,99887
A exemplo do experimento anterior, em todas as condições observaram-se

ajustes satisfatórios (vide nota de rodapé 4), não servindo portanto, como critério de
seleção de condições experimentais. Ressalta-se por outro lado, que a correção de
linha de base acarreta desde já em um inevitável sacrifício da sensibilidade analítica,
o qual pode ser observado pela diminuição das inclinações nas curvas analíticas em
relação aos experimentos anteriores.
Adiante, a qualidade das medições das bandas foi avaliada em cada uma das
condições sugeridas mais uma vez, através da estimativa do erro avaliado,
empregando-se a mesma solução de concentração conhecida a cada uma das
curvas. Os resultados são demonstrados nas Tabelas 14 e 15 para L-glutamato e
Sorbitol respectivamente.
Tabela 14. Avaliação prévia da qualidade das medições em termos do erro relativo para diferentes
bandas obtidas em altura e área com a linha de base corrigida em dois pontos para o L-glutamato de
sódio.
Altura da banda Correção Erro

Desvio padrão relativo
(cm-1) linha de base (cm-1) (%)
1557 1723 - 1463 0,18 43,0
1402 1436 - 1371 0,36 44,1
1347 1371 - 1332 0,30 2,8
Área da banda Correção Erro
1723 - 1463 1723 - 1463 0,33 34,3
1436 - 1371 1436 - 1371 0,35 55,1
1371 - 1332 1371 - 1332 0,35 13,9
79
Tabela 15. Avaliação prévia da qualidade das medições em termos do erro relativo para diferentes
bandas obtidas em altura e área com a linha de base corrigida em dois pontos para o Sorbitol.
Altura da banda Correção Erro

1415 1492 - 1354 0,47 97,0
1084 1118 - 1062 0,42 28,0
1046 1063 - 990 1,93 10,0
890 910 - 838 0,78 0,40
Área da banda Correção Erro
1492 - 1354 1492 - 1354 0,49 68,0
1118 - 1062 1118 - 1062 0,39 23,0
1063 - 990 1063 - 990 2,50 16,0
910 - 838 910 - 838 1,64 20,0
Observando-se os resultados expostos nas Tabelas 14 e 15, é possível

perceber que, de um modo geral, os erros ainda são muito pronunciados. Entretanto,
a banda localizada em 1347 cm-1 (L-glutamato de sódio) e em 890 cm -1 (sorbitol),
apresentam um erro relativo que, ao menos em princípio, se mostram razoáveis para
as propostas de trabalho quando suas medições procedem através da altura em
relação à linha de base devidamente corrigida.
Elucidando a natureza química das bandas escolhidas, atribui-se ao

estiramento assimétrico do ânion carboxilato do L-glutamato, a banda observada em
1347 cm-1 (SILVERSTEIN, WEBSTER E KIEMLE, 2005), enquanto que bandas
relativas a hidroxilas de alcoóis (para fora do plano) são observadas nesta região,
aproximadamente, 890 cm-1 (COATES, 2006).
Cabe aqui uma breve discussão acerca dos dados obtidos neste experimento.
Não é de causar surpresa o fato de não terem sido observados resultados
satisfatórios para as medições realizadas através das áreas, apesar dos bons
ajustes obtidos em todas as curvas. O fato é que, à medida que a faixa espectral de
interesse é ampliada, começa a haver uma interferência espectral devido à
sobreposição de bandas das demais espécies presentes. Esta interferência, também
é conhecida como interferência específica e não pode ser corrigida por métodos
tradicionais de calibração como a curva de adição-padrão ou a padronização interna.
80
5.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS
Uma vez estabelecidas condições, como as bandas de interesse analítico,

além do modo de medição do sinal, as atenções se voltam para a otimização das
condições instrumentais. O n° de scans acumulados, assim como a resolução
nominal exercem influência em determinadas figuras de mérito como a sensibilidade
analítica e a precisão, por exemplo. Tendo isto em mente, foram obtidas curvas
analíticas nas condições previamente estabelecidas no item 5.2 em que, para cada
resolução nominal estudada, variou-se o n° de scans, registrando graficamente as
sensibilidades consequentemente obtidas, em função das inclinações das curvas.
0,0016
Sensibilidade (U.a.)
0,0014
0,0014-0,0016
0,0012
0,0012-0,0014
2
0,001 0,001-0,0012
4 0,0008-0,001
0,0008
100
8
64
32
16
16
Figura 19. Efeito da resolução nominal (cm-1) e n° de scans acumulados na sensibilidade analítica
das curvas de L-glutamato de sódio. As curvas foram obtidas na banda com máximo em 1347 cm-1
medida em altura em relação à linha de base corrigida entre 1371 e 1332 cm -1 (condição
estabelecida em 5.2).
81
7
Sensibilidade (U.a.; x10 -4 )

6,5
6 6,5-7
2
5,5 6-6,5
4 5,5-6
5
100 5-5,5
8
64
32
16
16
Figura 20. Efeito da resolução nominal (cm-1) e n° de scans acumulados na sensibilidade analítica
das curvas de Sorbitol. As curvas foram obtidas na banda com máximo em 890 cm-1 medida em altura
em relação à linha de base corrigida entre 910 e 838 cm-1 (condição estabelecida em 5.2).
Uma simples observação dos resultados mostrados nas Figuras 19 e 20

permite concluir que a máxima sensibilidade analítica foi obtida quando se acumulou
64 scans em uma resolução nominal de 4 cm -1 para a determinação de L-glutamato
de sódio, enquanto que no caso do sorbitol, o mesmo pôde ser observado através
de 32 scans acumulados e 2 cm-1 de resolução nominal ou através de 100 scans
acumulados e 2 cm-1 de resolução nominal. Uma vez que os princípios que orientam
este trabalho envolvem a adequação e o equilíbrio entre as figuras de mérito
analíticas e suas condições experimentais, é razoável aceitar a condição de 32
scans acumulados como ótima, dado que a alternativa (100 scans acumulados)
envolveria um tempo de aquisição três vezes maior para cada espectro.
5.4 VERIFICAÇÃO DE INTERFERÊNCIAS DE MATRIZ
Antes de dar-se início à execução do protocolo de validação, conduziu-se um

importante ensaio a fim de verificar possíveis interferentes de matriz, também
conhecidos como interferentes não específicos. Dada à sua natureza, influenciam
diretamente a inclinação das curvas analíticas interferindo anomalamente na relação
de proporcionalidade do modelo de calibração. Tais interferentes não são possíveis
de serem detectados através da curva analítica convencional, motivo pelo qual sua
utilização não é recomendada nestes casos. As causas destas interferências em
geral, envolvem a presença de componentes na matriz que a tornam incompatíveis
82
com as soluções-padrão. Quer seja uma incompatibilização química, mediada por
modificações na composição do analito, quer seja por divergências entre as
propriedades físicas de amostra/padrão, as interferências de matriz podem ser
evidenciadas e eliminadas através da construção da curva de adição-padrão.
Sendo assim, foi construída uma curva de adição padrão sobre uma amostra
de termoestabilizador produzida em rotina pelo laboratório SEMES (DEVIR), onde a
concentração dos analitos era desconhecida. Foram adicionadas quantidades
adequadas de solução padrão a seis balões volumétricos, a fim de se obter
concentrações finais equivalentes a 0, 1, 2, 3, 4 e 5% (m/v) de L-glutamato de sódio,
além da quantidade do analito presente na amostra que fora previamente adicionado
em volumes iguais a cada um destes balões. Este procedimento foi seguido
analogamente para o caso do sorbitol. A Figura 21 ilustra graficamente os resultados
obtidos nas curvas analítica e de adição padrão através da comparação entre as
inclinações obtidas em cada uma delas no caso do L-glutamato de sódio. Neste
caso a diferença entre elas foi de 2,7%.
Comparação entre as curvas analítica e de adição padrão
L-glutamato de sódio
0,0160
0,0140
Absorvância (u.a)
0,0120 y = 0,00143x + 0,00443

R² = 0,99962
0,0100
0,0080 y = 0,00147x - 0,00018
Adição padrão
0,0060 R² = 0,99934
Curva analítica
0,0040
0,0020
0,0000
0 2 4 6 8 10
Concentração % (m/v)
Figura 21. Curvas analítica e de adição padrão para o L-glutamato de sódio. Destaque para as
equações obtidas em ambos os casos.
A Figura 22 adiante ilustra o procedimento análogo seguido para o caso do

sorbitol, onde o mesmo conjunto de calibração foi criado na curva de adição padrão.
As diferenças entre ambas as inclinações foram de 5,0%.
83
Comparação entre as curvas analítica e de adição padrão
Sorbitol
0,014
0,012
y = 0,000622x + 0,00454
Absorvância (u.a)
0,010 R² = 0,9946
0,008
0,006
y = 0,000655x - 0,000342 Adição padrão
0,004 R² = 0,9984 Curva analítica
0,002
0,000
0 5 10 15 20
Figura 22. Curvas analítica e de adição padrão para o L-glutamato de sódio. Destaque para as
equações obtidas em ambos os casos.
5.4.1 Tratamento estatístico dos dados analíticos
Em ambos os casos, a semelhança entre as inclinações obtidas pelos dois

pares de curvas sugere a ausência de interferências de matriz. Contudo, a fim de
avaliar a validade desta suposição, uma amostra de rotina recebida pelo laboratório
SEMES, foi analisada por ambas as curvas para a determinação dos dois analitos.
Para tanto, foram realizadas quatro determinações independentes e as variâncias
obtidas pelas curvas analítica e de adição padrão foram primariamente avaliadas
através do teste F. Em seguida, orientado pelo resultado deste teste, isto é,
conhecendo se as variâncias são comparáveis ou não, procedeu-se com teste t
adequado. A apresentação dos dados experimentais é feita na Tabela 16a,
enquanto que na Tabela 16b é possível observar os resultados do teste F obtido na
amostra desconhecida para a determinação de L-glutamato de sódio.
Tabela 16. (a) esquerda. Apresentação dos resultados para cada uma das curvas em uma amostra de concentração
desconhecida de termoestabilizador e (b), direita. Teste F com 95% de confiança realizado com as variâncias dos
resultados obtidos com as curvas analítica e de adição padrão para L-glutamato de sódio.
Adição padrão Curva analítica

Resultados % (m/v) Média 6,33 6,34
Adição padrão Curva analítica Variância 0,07 0,001
6,69 6,33 Observações 4 4
6,20 6,38 gl 3 3
6,35 6,32 F 70,0
6,08 6,31 F crítico uni-caudal 9,28
84
Como os resultados demonstram, Fcalculado é maior que Fcrítico, de onde é
possível concluir que as variâncias obtidas pelas curvas analítica e de adição padrão
não são comparáveis, isto é, são consideradas heterocedásticas com um nível de
confiança de 95%. Neste caso, é recomendada a utilização do teste t para variâncias
estatisticamente diferentes, e a equação que o descreve segue abaixo.
Onde X1 e X2, S1 e S2 e n1 e n2 são respectivamente os valores médios,

variâncias e tamanhos amostrais obtidos pelas curvas analítica (1) e de adição
padrão (2). O número de graus de liberdade é obtido a partir da equação abaixo.
Na Tabela 17, estão disponíveis os resultados deste teste t.
Tabela 17. Teste t, assumindo variâncias diferentes para as curvas
analítica e de adição padrão de L-glutamato de sódio.
Adição padrão Curva analítica

Média 6,34 6,33
Variância 0,000967 0,0698
Observações 4 4
Hipótese da diferença de média
0
gl 3
Stat t 0,04
t crítico bi-caudal 3,18
A interpretação do resultado do teste nos informa que, ao nível de 95% de

confiança, não foi possível evidenciar diferença estatística entre os dois resultados.
Sendo assim, a hipótese nula é mantida, isto é, H0: 1 = 2, logo é possível concluir
com o mesmo nível de confiança que, não foi possível evidenciar a presença de
interferências de matriz na determinação do L-glutamato de sódio.
85
As Tabelas 18a e 18b apresentam os resultados obtidos pela mesma amostra
desconhecida na determinação de sorbitol pelas curvas analítica e de adição padrão
(18a) e seu respectivo teste F.
Tabela 18. (a) esquerda. Apresentação dos resultados para cada uma das curvas em uma amostra de concentração
desconhecida de termoestabilizador e (b), direita. Teste F com 95% de confiança realizado com as variâncias dos
resultados obtidos com as curvas analítica e de adição padrão para sorbitol.
Curva analítica Adição padrão

Resultados % (m/v) Média 14,52 14,63
Curva analítica Adição padrão Variância 0,0055 0,0043
14,61 14,59 Observações 4 4
14,56 14,73 gl 3 3
14,71 14,59 F 1,270
14,60 14,62 F crítico uni-caudal 9,277
Diferentemente do que foi observado no caso do L-glutamato de sódio, o valor

encontrado para Fcalculado é menor que o FTabelado, então é possível aferir que as
variâncias dos dois valores médios são comparáveis ao nível de confiança de 95%,
ou homocedásticos, de maneira que o teste t recomendado nesta circunstância
segue de acordo com a equação abaixo.
Neste caso, S representa o desvio padrão agrupado, uma vez que ambos os
desvios-padrão das duas médias são equivalentes. S pode ser calculado conforme
abaixo.
Além disso, o número de graus de liberdade a ser aplicado no teste t é obtido

simplesmente por: (n1 + n2) – 2.
De posse destas informações, é possível avaliar os resultados do teste t para

o sorbitol na Tabela 19.
86
Tabela 19. Teste t, assumindo variâncias diferentes para as curvas
analítica e de adição padrão de sorbitol.
Curva analítica Adição padrão
Média 14,52 14,63
Variância 0,0055 0,0043
Observações 4 4
Variância agrupada 0,0049
Hipótese da diferença de média 0
Stat t 2,32
O teste t acima mostra que o valor de tcalculado é menor que tTabelado ao nível de
95% de confiança, então a hipótese nula (H0: 1 = 2) é mantida, de onde se conclui
que, com este nível de confiança, não foram evidenciadas interferências de matriz
no método para determinação de sorbitol.
Como foi discutido anteriormente, este estudo é importante neste momento do
trabalho, isto é, em um momento anterior ao início da execução do protocolo de
validação. Uma vez que, em ambos os casos não foi possível evidenciar a presença
de interferências de matriz, é permitida a utilização da curva analítica, o que,
indubitavelmente é vantajoso por sua simplicidade e menor consumo de amostras.
5.5 VALIDAÇÃO ANALÍTICA
5.5.1 Limite de detecção
A partir da construção de três curvas analíticas independentes, determinou-se
o desvio padrão de suas interseções (a).
Para o limite de detecção do método para determinação de L-glutamato de

sódio:
a = 8,3 x 10-5, sendo assim LD = (3 x a)/ IC5, logo:

LDL-glutamato = 0,19% (m/v)
O mesmo procedimento foi adotado para o cálculo do limite de detecção do

método para a determinação de sorbitol. Desta forma:
5
Como critério na escolha da inclinação a ser utilizada, optou-se sempre pela de menor valor.
0,00133 para L-glutamato e 0,000630 para Sorbitol.
87
a = 2,1 x 10-4, sendo assim LD = (3 x a)/ IC5, logo:
LDSorbitol = 0,98% (m/v)
5.5.2 Limite de quantificação
Através do critério adotado neste trabalho para o estabelecimento dos limites

de detecção e de quantificação, é perceptível que a relação entre eles é constante.
Logo, o procedimento utilizado para a obtenção do limite de quantificação do método
para a determinação do L-glutamato de sódio segue de acordo com o cálculo
abaixo.
LQ = (10 x a)/ IC, então:
LQL-glutamato = 0,62% (m/v)

Consequentemente, o limite de quantificação da curva analítica para
determinação de sorbitol estabelecido durante o estudo foi:
LQ = (10 x a)/ IC, assim:
LQSorbitol = 3,28% (m/v)
5.5.3 Especificidade e Seletividade
Como descrito no item 4.1.6.1.1, para a avaliação da seletividade, foram

preparadas duas amostras, sendo que a cada uma delas apenas um analito foi
adicionado. Então, na amostra destinada a avaliação da seletividade do L-glutamato
de sódio, apenas o sorbitol foi adicionado (do modo convencional), enquanto que na
amostra destinada a avaliação da seletividade do sorbitol, este analito estava
ausente e o L-glutamato de sódio foi adicionado normalmente. Cada uma das
amostras foi submetida à sua respectiva curva analítica e seus resultados serão
discutidos nos itens a seguir.
88
5.5.3.1 Seletividade da metodologia para determinação de L-glutamato de sódio
Foram realizadas três determinações independentes de amostra de

termoestabilizador sem adição de L-glutamato de sódio. Os resultados encontram-se
na Tabela 20.
Tabela 20. Resultados obtidos após três determinações
independentes de L-glutamato de sódio.
Resultado % (m/v) Média % Desvio padrão

1 -0,011
2 -0,036 -0,016 0,018
3 -0,001
Evidentemente, os valores obtidos para as determinações não apresentam

qualquer sentido físico para o sistema estudado. Desta forma, calculou-se o intervalo
de confiança da média, de acordo com a equação abaixo.
Onde 𝑠 representa o erro padrão da média e não somente o desvio

√𝑛
padrão (s) e tn-1 expressa o valor de tTabelado para n-1 graus de liberdade. O intervalo
de confiança da média para 2 graus de liberdade e 95% de confiança torna-se
então:
_
X = -0,016 + 0,045 % (m/v)
Este resultado compreende valores que vão de zero a 0,029% (m/v) 6,

resultado que encontra-se bem abaixo do limite de detecção calculado no item 5.5.1.
É possível concluir então que estes valores são relativos ao ruído instrumental.
6
O intervalo relativo aos valores negativos foi desprezado.
89
5.5.3.2 Seletividade da metodologia para determinação de Sorbitol
O procedimento anterior foi repetido com a amostra preparada sem a adição

de sorbitol, então, após três determinações independentes, foram obtidos os
seguintes resultados apresentados na Tabela 21.
Tabela 21. Resultados obtidos após três determinações

independentes de L-glutamato de sódio.
Resultado % (m/v) Média % Desvio padrão

1 0,221
2 0,246 0,250 0,032
3 0,284
Analogamente, o intervalo de confiança da média obtido foi:

_
X = 0,250 + 0,079 % (m/v)
Este intervalo compreende valores de 0,171 a 0,329 % (m/v) que, quando

confrontados com o seu respectivo limite de detecção (ver item 5.5.2) percebe-se
estar bem abaixo. Logo, este valor não pode ser atribuído ao sinal do analito, sendo
então considerado como ruído instrumental.
5.5.4 Linearidade
Como anteriormente descrito, foram preparadas três curvas identificadas

como curvas A, B e C para ambos os analitos. Para cada ponto das curvas foram
feitos três preparos individuais a fim de caracterizar ensaios mutuamente
independentes. Os dois itens seguintes descrevem os resultados obtidos para L-
glutamato de sódio e sorbitol respectivamente. Cabe aqui informar que, o nível de
confiança utilizado durante o tratamento estatístico dos dados obtidos nas
regressões foi de 95%.
90
5.5.4.1 Linearidade da curva analítica para a determinação de L-glutamato de sódio
A Tabela 22 e a Figura 23 apresentam os resultados obtidos pela curva A

para a determinação de L-glutamato de sódio.
Tabela 22. Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva A, suas respectivas médias e
desvios padrão.
Curva A
Concentração (%) Abs1 Abs2 Abs3 Média Desvio padrão

0 -5,13E-05 1,13E-04 -5,21E-05 3,32E-06 9,53E-05
2,11 3,35E-03 3,28E-03 3,29E-03 3,31E-03 3,98E-05
4,22 6,57E-03 6,67E-03 6,99E-03 6,74E-03 2,15E-04
6,33 1,01E-02 9,79E-03 1,04E-02 1,01E-02 3,14E-04
8,44 1,34E-02 1,36E-02 1,35E-02 1,35E-02 8,59E-05
10,54 1,69E-02 1,68E-02 1,67E-02 1,68E-02 7,42E-05
Curva A - L-glutamato de sódio

0,02
0,015
Absorvância (u.a)
0,01
y = 0,00160x - 0,00002
R² = 0,99998
0,005
0
0 2 4 6 8 10 12
Figura 23. Curva analítica A – Determinação de L-glutamato de sódio.
Uma avaliação preliminar nos dados acima aparentemente leva a crer em um

bom ajuste dos dados, tendo em vista o valor do coeficiente de determinação (r2) e a
pouca variabilidade observada entre medições de um dado ponto da curva. Contudo,
uma avaliação mais significativa da regressão pode ser feita através da Análise de
variância (ANOVA).
A utilização da ANOVA nas regressões obtidas neste trabalho partiu da

consideração que a ocorrência de erros mais significativa é observada no eixo das
91
ordenadas (y), onde os sinais instrumentais foram plotados, isto é, todos os erros
ocorrentes em x foram desprezados. Esta assunção é amplamente recomendada
pela literatura científica (MILLER e MILLER, 2005), uma vez que, na maioria dos
casos, os erros observados em y são muito mais pronunciados que os observados
em x. Além disso, assumir os erros ocorrentes em x como desprezíveis oferece
enormes simplificações no cálculo da ANOVA da regressão linear, contudo, é
importante salientar que se trata apenas de uma convenção simplificativa, não é
verdadeira a afirmativa que os erros em x são inexistentes.
A partir das considerações do parágrafo anterior, cabe separar a natureza dos

erros observados em y como provenientes de duas fontes. A primeira fonte é a
variabilidade devida à regressão, isto é, a relação entre o sinal instrumental e a
concentração do analito. A segunda é devida ao erro aleatório experimental, que é
intrínseco a qualquer processo de medição.
A Tabela 23 ilustra os resultados obtidos pela ANOVA da regressão da curva

A onde SQ representa a soma quadrática e MQ é a média quadrática.
Tabela 23. Análise de variância (ANOVA) da curva A de L-glutamato de sódio.
ANOVA
gl SQ MQ F F de significação
Regressão 1 5,962E-04 5,962E-04 27582 2,507E-27
Resíduo 16 3,458E-07 2,162E-08
Total 17 5,965E-04
A interpretação dos resultados da Tabela 23 indica que, Fcalculado é maior que

FTabelado, de onde é possível concluir que os pontos experimentais estão bem
ajustados ao modelo de regressão, ou o modelo “explica” de forma satisfatória o
resultado dos experimentos. Além disso, quase a totalidade da variabilidade
presente no modelo é relativa ao erro da regressão e não ao resíduo que é a
distância entre o valor obtido experimentalmente e o da regressão.
Conforme previsto pelo Guia para validação da ANVISA e já discutido

anteriormente, foram realizadas mais duas curvas analíticas a partir de três
determinações individuais para cada ponto da mesma. Abaixo na Tabela 24 e Figura
24, é possível observar os resultados para a curva B.
92
Tabela 24. Resultados obtidos para os pontos da curva B, suas respectivas médias e desvios
padrão.
Curva B
Concentração (%) Abs 1 Abs 2 Abs 3 Média Desvio padrão
0 -2,29E-04 -2,42E-04 -1,75E-04 -2,15E-04 3,55E-05
2,00 3,10E-03 3,11E-03 3,26E-03 3,16E-03 9,12E-05
4,00 7,24E-03 6,34E-03 6,45E-03 6,68E-03 4,91E-04
6,00 9,78E-03 9,90E-03 9,85E-03 9,84E-03 6,03E-05
8,00 1,31E-02 1,40E-02 1,32E-02 1,34E-02 4,93E-04
10,0 1,65E-02 1,64E-02 1,65E-02 1,65E-02 5,77E-05
Curva B - L-glutamato de sódio

1,80E-02
1,50E-02
Absorvância (u.a)
1,20E-02
y = 0,0017x - 0,0002
r² = 0,9979
9,00E-03
6,00E-03
3,00E-03
0,00E+00
0 2 4 6 8 10 12
Figura 24. Curva analítica B – L-glutamato de sódio.
Adiante, a Tabela 25 ilustra os resultados da ANOVA realizados na curva B.
Tabela 25. Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva B de L-glutamato de sódio.
ANOVA
Regressão 1 5,908E-04 5,908E-04 7676 6,889E-23
Resíduo 16 1,231E-06 7,697E-08
Total 17 5,920E-04
Novamente, o valor de Fcalculado é maior que FTabelado, caracterizando um bom

ajuste linear e, além disso, apenas 0,20% do erro observado na curva é proveniente
do erro aleatório experimental.
93
Prosseguindo com a terceira curva analítica traçada para a determinação de
L-glutamato de sódio, a Tabela 26 e a Figura 25 ilustram seus resultados.
Tabela 26. Resultados obtidos para os pontos da curva C, suas respectivas médias e desvios
padrão.
Curva C

0 -2,66E-05 -2,94E-05 -2,64E-05 -2,75E-05 1,68E-06
2,00 3,20E-03 3,11E-03 3,15E-03 3,15E-03 4,51E-05
4,00 6,42E-03 6,42E-03 6,42E-03 6,42E-03 1,06E-18
6,00 9,65E-03 9,80E-03 9,72E-03 9,72E-03 7,51E-05
8,00 1,30E-02 1,30E-02 1,30E-02 1,30E-02 0,00E+00
10,0 1,64E-02 1,62E-02 1,69E-02 1,65E-02 3,61E-04
Curva C - L-glutamato de sódio

1,80E-02
1,50E-02
Absorvância (u.a)
1,20E-02
9,00E-03
y = 0,0017x - 0,0002
r² = 0,9989
6,00E-03
3,00E-03
0,00E+00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 25. Curva analítica C – Determinação de L – glutamato de sódio.
A ANOVA realizada nesta terceira regressão apresentou os seguintes

resultados.
Tabela 27. Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva C de L-glutamato de sódio.
ANOVA
Regressão 1 5,715E-04 5,715E-04 23696 8,443E-27
Resíduo 16 3,859E-07 2,412E-08
Total 17 5,719E-04
Após a execução dos ensaios de linearidade e seus respectivos tratamentos

estatísticos das curvas analíticas para determinação de L-glutamato de sódio, é
possível considerar com a segurança oferecida pelo nível de confiança utilizado que,
o modelo oferece uma linearidade adequada durante a faixa de trabalho adotada.
94
A Tabela 28 adiante sumariza as curvas A, B e C.
Tabela 28. Curvas analíticas obtidas durante os ensaios de linearidade para o L-glutamato de sódio e seus
limites de confiança.
Curva analíticaa y = (a + LCa) + (b + LCb)[X]

Curva A y = (-0,00002 + 0,00006) + (0,00160 + 0,00001)[Glu]
Curva B y = (-0,00016 + 0,00027) + (0,00159 + 0,00004)[Glu]

Curva C y = (-0,00012 + 0,00020) + (0,00156 + 0,00003)[Sor]
a
Curva analítica onde (a + LCa) e (b + LCb) correspondem a intecepção e inclinação respectivamente + seus correspondentes limites
de confiança, para um nível de confiança de 95%.
5.5.4.2 Linearidade da curva analítica para a determinação de Sorbitol
Prosseguindo com os ensaios de linearidade, a Tabela 29 e a Figura 26

apresentam os resultados da curva A para a linearidade do método proposto para a
determinação de sorbitol.
Tabela 29. Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva A, suas respectivas médias e
desvios padrão.
Curva A
Concentração (%) Abs1 Abs2 Abs3 Média Desvio padrão
0 5,00E-05 -6,00E-05 9,00E-05 2,67E-05 7,77E-05
4,93 2,59E-03 2,84E-03 2,89E-03 2,77E-03 1,61E-04
9,86 5,79E-03 6,01E-03 5,94E-03 5,91E-03 1,12E-04
14,79 9,08E-03 8,88E-03 8,98E-03 8,98E-03 1,00E-04
19,72 1,26E-02 1,26E-02 1,25E-02 1,26E-02 1,00E-05
24,65 1,62E-02 1,61E-02 1,62E-02 1,62E-02 6,56E-05
Curva A - Sorbitol
0,018
0,015
Absorvância (u.a)
0,012
y = 0,0007x - 0,0003
0,009 R² = 0,9973
0,006
0,003
0
0 5 10 15 20 25
Figura 26. Curva analítica A – Determinação de Sorbitol.
95
Avaliando os resultados através da ANOVA na regressão, segue os seguintes
dados na Tabela 30.
Tabela 30. Análise de variância (ANOVA) da curva A de Sorbitol.
ANOVA
Regressão 1 5,479E-04 5,479E-04 5959 5,198E-22
Resíduo 16 1,471E-06 9,194E-08
Total 17 5,493E-04
A interpretação dos resultados encontrados na ANOVA permite concluir que o

ajuste obtido satisfaz o modelo experimental, isto é, Fcalculado é maior que FTabelado e a
maior parte (99,7%) do erro observado na curva é relativo à regressão.
Em seguida, procedeu-se de forma análoga com a curva B para determinação
de Sorbitol. Seus resultados estão expostos na Tabela 31 e Figura 27.
Tabela 31. Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva B, suas respectivas médias e
desvios padrão.
Curva B
0 -6,53E-05 -1,84E-03 -1,27E-04 -6,77E-04 1,01E-03
5,00 3,00E-03 2,93E-03 2,80E-03 2,91E-03 1,01E-04
10,00 6,09E-03 5,92E-03 5,79E-03 5,93E-03 1,50E-04
15,00 9,18E-03 9,08E-03 9,16E-03 9,14E-03 5,29E-05
20,00 1,27E-02 1,27E-02 1,26E-02 1,27E-02 5,77E-05
25,00 1,63E-02 1,65E-02 1,66E-02 1,65E-02 1,53E-04
Curva B - Sorbitol
1,80E-02
1,50E-02
Absorvância (u.a)
1,20E-02
9,00E-03 y = 0,0007x - 0,0007

R² = 0,9952
6,00E-03
3,00E-03
0,00E+00
0 5 10 15 20 25
Figura 27. Curva analítica B – Determinação de Sorbitol.
Consequentemente, a Tabela 32 ilustra a ANOVA realizada nesta curva.
96
Tabela 32. Análise de variância (ANOVA) da curva B de Sorbitol.
ANOVA
Regressão 1 5,987E-04 5,987E-04 3288 5,959E-20
Resíduo 16 2,914E-06 1,821E-07
Total 17 6,017E-04
Observando a Tabela 32 percebe-se que a parcela do erro observada na

curva relativa ao resíduo corresponde a menos de 1 % do erro total do modelo, onde
Todo o restante é atribuído ao próprio erro da regressão. Ainda, F calculado é maior que
FTabelado caracterizando um bom ajuste dos dados.
A curva C ilustrada abaixo encerra o conjunto de ensaios de linearidade para

a curva analítica de sorbitol, de acordo com a Tabela 33 e a Figura 28.
Tabela 33. Resultados obtidos em triplicata em cada ponto da curva C, suas respectivas
médias e desvios padrão.
Curva C

0 -2,40E-05 -5,22E-05 -1,66E-05 -3,09E-05 1,88E-05
5,00 2,92E-03 2,97E-03 2,76E-03 2,88E-03 1,10E-04
10,00 6,04E-03 5,78E-03 5,74E-03 5,85E-03 1,63E-04
15,00 9,20E-03 9,39E-03 9,34E-03 9,31E-03 9,85E-05
20,00 1,25E-02 1,26E-02 1,25E-02 1,25E-02 5,77E-05
25,00 1,63E-02 1,62E-02 1,60E-02 1,62E-02 1,53E-04
Curva C - Sorbitol
1,80E-02
1,50E-02
Absorvância (u.a)
1,20E-02
9,00E-03
y = 0,0007x - 0,0007
R² = 0,9972
6,00E-03
3,00E-03
0,00E+00
0 5 10 15 20 25
Figura 28. Curva analítica C – Determinação de Sorbitol.
Diante dos dados acima, segue então a respectiva ANOVA na Tabela 34.
97
Tabela 34. Análise de variância (ANOVA) da curva C de Sorbitol.
ANOVA
Regressão 1 5,89E-04 5,89E-04 5663 7,81E-22
Resíduo 16 1,67E-06 1,04E-07
Total 17 5,91E-04
A avaliação da ANOVA realizada na curva C de sorbitol demonstra o bom

ajuste obtido, uma vez que Fcalculado é maior que FTabelado.
Com esta última curva, encerram-se os ensaios de linearidade para Sorbitol.
É possível então considerar que, dentro do nível de significância adotado (95%), o
modelo de regressão obtido para a curva analítica de sorbitol apresenta linearidade
satisfatória na faixa de trabalho escolhida.
A Tabela 35 sumariza as curvas analíticas para determinação de sorbitol.
Tabela 35. Curvas analíticas obtidas durante os ensaios de linearidade para o sorbitol e seus limites
de confiança.
Curva analíticaa y = (a + LCa) + (b + LCb)[X]
Curva A y = (-0,0003 + 0,00068) + (0,0007 + 0,00004)[Sor]
Curva B y = (-0,0007 + 0,00051) + (0,0007 + 0,00003)[Sor]

Curva C y = (-0,0003 + 0,00053) + (0,0007 + 0,00003)[Sor]
a
Curva analítica onde (a + LCa) e (b + LCb) correspondem a intecepção e inclinação respectivamente + seus correspondentes limites
de confiança, para um nível de confiança de 95%.
5.5.5 Intervalo
No item 4.1.6.3 foram previamente calculados os intervalos de trabalho para

L-glutamato de sódio e sorbitol, baseando-se nas concentrações teóricas das suas
espécies durante a etapa de formulação do termoestabilizador.
Dado que a curva analítica proposta para a determinação de L-glutamato de

sódio foi construída no intervalo de 0 a 10% e sendo considerada como satisfatória a
linearidade obtida por ela, é possível concluir desta forma que o intervalo mínimo
exigido é totalmente contemplado e por isso, igualmente linear.
Quanto à determinação de sorbitol na mesma amostra, as curvas foram
obtidas no intervalo compreendido entre 0 e 25%, contemplando a faixa de trabalho
98
mínima exigida. Sendo assim, os resultados satisfatórios obtidos no estudo de
linearidade da curva suportam a linearidade para a faixa de trabalho.
5.5.6 Precisão
Seguindo com o protocolo de validação das metodologias propostas, uma

importante figura de mérito diz respeito à precisão. É preciso conhecer o tanto
quanto possível durante a etapa de validação de um método, a mínima e a máxima
variabilidade que pode ser alcançada por um conjunto de medidas em um dado
método analítico. Dada a freqüente impossibilidade de se estimar adequadamente a
reprodutibilidade de um método (figura que reflete a mínima precisão), é comum que
este parâmetro seja substituído pela precisão intermediária. Os dois itens seguintes
abordarão os ensaios que visaram obter a repetitividade e a precisão intermediária
na determinação de L-glutamato de sódio e sorbitol.
5.5.6.1 Repetitividade
Para a estimativa da repetitividade do método para determinação de L-

glutamato de sódio em amostras de termoestabilizador, o analista identificado como
analista 1 realizou em um dia estabelecido, seis determinações de L-glutamato de
sódio e seis determinações de Sorbitol em uma amostra de concentrações
desconhecidas fornecidas pelo laboratório responsável pela sua produção, SEMES.
As Tabelas 36 e 37 explicitam os resultados obtidos pelo analista 1 para a
determinação de L-glutamato de sódio e Sorbitol respectivamente.
A título de informação, o nível de significância utilizado nos cálculos dos

intervalos de confiança das médias apresentados neste item e no seguinte (precisão
intermediária), foi de 95%.
99
Tabela 36. Resultados dos ensaios de Repetitividade para o L-
glutamato de sódio realizados pelo analista 1.
Determinações Resultados % (m/v)

1 6,88
2 6,90
3 6,91
4 6,67
5 6,69
6 6,80
Média 6,81
Desvio padrão 0,11
Coeficiente de variação 1,56
Intervalo de confiança + 0,11
Tabela 37. Resultados dos ensaios de Repetitividade para o

Sorbitol realizados pelo analista 1.

1 16,60
2 15,79
3 16,80
4 16,88
5 16,28
6 17,30
Média 16,61
Desvio padrão 0,52
Coeficiente de variação 3,14
Intervalo de confiança + 0,55
5.5.6.2 Precisão intermediária
Transcorridos seis dias, o analista 2 repetiu o mesmo procedimento

executado pelo analista 1. Para tal, utilizou a mesma amostra de concentração
desconhecida de termoestabilizador. Seus resultados encontram-se na Tabela 38 e
39 para L-glutamato de sódio e Sorbitol respectivamente.
100
Tabela 38. Resultados dos ensaios de precisão intermediária para o L-
glutamato de sódio executados pelos analistas 1 e 2.

1 6,88 6,50
2 6,90 6,77
3 6,91 6,78
4 6,67 6,29
5 6,69 6,62
6 6,80 6,84
Média 6,81 6,63

Desvio padrão 0,11 0,21
Coeficiente de variação 1,56 3,15
Intervalo de confiança + 0,11 0,22
Tabela 39. Resultados dos ensaios de precisão intermediária para o

Sorbitol executados pelos analistas 1 e 2.

1 16,60 16,56
2 15,79 17,21
3 16,80 16,41
4 16,88 17,00
5 16,28 16,80
6 17,30 17,03
Média 16,61 16,84

Desvio padrão 0,52 0,30
Coeficiente de variação 3,14 1,81
Intervalo de confiança + 0,55 0,30
5.5.6.2.1 Tratamento estatístico dos ensaios de precisão
A exemplo dos demais parâmetros trabalhados até o momento faz-se

necessário um tratamento adequado dos dados analíticos a fim de possibilitar
alguma aferição acerca da precisão obtida pela metodologia proposta. Neste
sentido, aplicou-se primeiramente o teste F7 nas variâncias dos dois analistas com o
propósito de verificar se as mesmas eram estatisticamente comparáveis, o que pose
ser apreciado na Tabela 40 para a precisão intermediária do L-glutamato de sódio.
7
O nível de confiança dos testes F realizados durante este item foi de 95%.
101
Tabela 40. Teste F nas variâncias dos analistas 1 e 2 durante os
ensaios do L-glutamato de sódio.
Analista 1 Analista 2
Média 6,63 6,81
Variância 0,04 0,01
Observações 6 6
gl 5 5
F 3,841
F crítico uni-caudal 5,050
Neste caso, evidenciou-se que Fcalculado é menor que FTabelado, sendo assim, a
hipótese nula é mantida, as variâncias são consideradas homocedásticas, isto é,
não há diferença estatística significativa entre elas.
Este resultado culminou por orientar o teste t adequado para variâncias

comparáveis, que é descrito na Tabela 41.
Tabela 41. Teste t para variâncias equivalentes realizado entre os

analistas 1 e 2 durante os ensaios de precisão intermediária na
determinação de L-glutamato de sódio.
Média 6,81 6,63
Observações 6 6
gl 10
Stat t 1,806
O teste t da Tabela 41 permite concluir que, dentro do nível de confiança em

que o teste foi realizado, isto é, 95% não foi evidenciada diferença entre as médias
obtidas pelos dois analistas uma vez que tcalculado é menor que tTabelado.
Naturalmente, a mesma abordagem foi adotada para a avaliação da precisão

intermediária do sorbitol. Sendo assim, a Tabela 42 apresenta o teste F realizado
nas variâncias dos resultados obtidos pelos analistas 1 e 2 durante a determinação
de sorbitol na amostra do termoestabilizador.
102
Tabela 42. Teste F nas variâncias dos analistas 1 e 2 durante os ensaios
do Sorbitol.
Média 16,61 16,84
Observações 6 6
gl 5 5
F 2,930
F crítico uni-caudal 5,050
Assim como ocorrido com o L-glutamato de sódio, as variâncias obtidas pelos

analistas 1 e 2 se mostraram estatisticamente equivalentes, logo homocedásticas
então, procedeu-se com o teste t adequado para este caso.
Tabela 43. Teste t para variâncias equivalentes realizado entre os analistas

1 e 2 durante os ensaios de precisão intermediária na determinação de
Sorbitol.
Média 16,84 16,61
Observações 6 6
gl 10
Stat t 0,921
Mais uma vez, o valor encontrado para t calculado é menor que tTabelado com um
nível de confiança de 95%, de onde é possível concluir então que não há (dentro
destas condições) diferença entre os valores médios obtidos pelos dois analistas.
Logo, com base no foi discutido ao longo deste estudo, não foi evidenciada
diferença estatística entre os resultados obtidos por diferentes analistas dentro de
um curto espaço de tempo (seis dias), caracterizando assim uma precisão
intermediária satisfatória. Quanto aos ensaios de repetitividade (repê), o Guia para
validação de métodos analíticos e bioanalíticos da ANVISA orienta que as precisões
intra-corrida devem apresentar coeficientes de variação abaixo de 5%, o que de fato
foi observado ao longo de todos os experimentos.
103
5.5.7 Exatidão
5.5.7.1 Ensaios de recuperação
Em virtude da inexistência de um material de referência certificado para

estimar a exatidão do método proposto, utilizou-se então duas diferentes
metodologias para fazê-lo. A primeira delas foi através do ensaio de recuperação.
Todavia, conforme descrito no item 4.1.6.6, a potencialidade deste ensaio como
estimador de possíveis tendências (também chamada na literatura de bias) é ainda
motivo de discussão. Por outro lado, a adição de quantidades conhecidas do analito,
os chamados spikes de padrão na amostra se mostram uma opção naturalmente
mais simples e barata frente à utilização dos materiais de referência ou a
comparação com outra metodologia já validada. Contudo, uma condição adicional
que deve ser obedecida durante a utilização do ensaio de recuperação é a ausência
de interferências espectrais, dada a incapacidade desta técnica em prevê-las. Neste
sentido, dadas estas características, durante o transcorrer do trabalho os ensaios de
recuperação foram utilizados como ferramenta de avaliação preliminar de possíveis
erros sistemáticos.
Foram tomadas quatro amostras de rotina cujas concentrações eram

desconhecidas produzidas pelo laboratório SEMES. Estas amostras receberam
adições de; 0, 2 e 5% (m/v) de cada analito independentemente. As Tabelas 39 e 40
apresentam os resultados obtidos para L-glutamato de sódio e Sorbitol,
respectivamente. As recuperações foram calculadas de acordo com a equação que
segue abaixo.
( 1-C2)
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜 (%) = × 100
3
Onde C1 corresponde a concentração do analito na amostra fortificada, C2 é a

concentração do analito na amostra não fortificada e C3 equivale a concentração do
analito adicionada a amostra fortificada.
104
Tabela 44. Ensaio de recuperação de L-glutamato de sódio realizado em quatro amostras
independentes de termoestabilizador.
Amostra Glutamato Adicionado (%) Glutamato determinado* (%) Glutamato teórico (%) Recuperação (%)
0 3,32 -
60/11 2 5,27 X 98
5 8,20 98
0 2,3 -
76/11 2 4,25 X 98
5 7,05 95
0 2,93 -
69/11 2 5,05 X 106
5 7,98 101
0 2,97 -
82/11 2 5,01 X 102
5 7,85 98
* Fator de diluição, 2X.
A recuperação média obtida foi de 99,5 + 2,6% (intervalo de confiança, com

tcalculado para 95%).
Tabela 45. Ensaio de recuperação de Sorbitol realizado em quatro amostras independentes

de termoestabilizador.
Amostra Sorbitol Adicionado (%) Sorbitol determinado* (%) Sorbitol teórico (%) Recuperação (%)
0 7,24 -
60/11 2 9,24 X 100
5 12,08 97
0 7,69 -
76/11 2 9,75 X 103
5 13,00 106
0 7,1 -
69/11 2 8,97 X 94
5 12,29 104
0 7,78 -
82/11 2 9,79 X 101
5 12,77 100
* Fator de diluição, 2X.
A recuperação média obtida foi de 100,6 + 3,0% (intervalo de confiança, com

tcalculado para 95%).
Ambas as recuperações acima obtidas se mostram próximas ao valor ideal de

100%, apesar de não se tratar ainda de um ensaio confirmatório, estes dados
corroboram com as suposições feitas no item 5.2, onde foi sugerido que toda a
variabilidade observada nas duas metodologias era proveniente apenas de erros
aleatórios.
105
5.5.7.2 Comparação entre metodologias
Segue os dois próximos itens dedicados à comparação entre diferentes

metodologias, de forma a investigar a ocorrência de possíveis diferenças
significativas entre a exatidão das metodologias propostas em relação a outras mais
bem estabelecidas e estudadas.
5.5.7.2.1 L-glutamato de sódio
A escolha da metodologia com detecção espectrofotométrica após reação

enzimática com a L-glutaminase se mostrou extremamente interessante, uma vez
que o fundamento químico do método oferece uma seletividade raramente
comparável por qualquer outra, dado que nem mesmo os isômeros D-glutamato são
capazes de reagir com a enzima. Naturalmente o trabalho não se propõe em
momento algum a comparar tais seletividades, contudo, torna-se latente que este
método enzimático é uma boa alternativa tendo vista a ausência de um material de
referência certificado para o termoestabilizador.
As análises das dez amostras de termoestabilizador foram realizadas no

mesmo dia a fim de garantir que seriam mantidas condições idênticas de
estabilidade química. O que poderia não ser verdadeiro caso as análises fossem
realizadas em dias diferentes, dado que as soluções termoestabilizadoras não foram
(até a presente data) submetidas a estudos de estabilidade. Desta forma, o
comportamento químico do termoestabilizador quando estocado em separado é
desconhecido, uma vez que, em rotina, a mesma segue prontamente para a etapa
de formulação compondo a suspensão viral estabilizada.
A Tabela 46 apresenta os resultados das análises do termoestabilizador pelo

método da espectroscopia UV/vis e FTIR em termos de suas médias e desvios
padrão.
106
Tabela 46. Resultados das análises de dez amostras de termoestabilizador realizados pela Espectrofotometria UV/vis e FTIR.
UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR
Média (%) 5,47 5,35 5,70 5,88 5,46 5,46 5,39 5,48 5,56 5,56
Desvio padrão 0,19 0,02 0,27 0,08 0,46 0,09 0,30 0,08 0,40 0,04
012/11 082/11 076/11 060/11 069/11

UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR UV/Vis FTIR
Média (%) 5,77 5,52 5,93 5,81 5,58 5,28 4,29 4,16 5,27 5,16
Desvio padrão 0,17 0,10 0,19 0,11 0,06 0,22 0,06 0,05 0,15 0,08
Naturalmente se faz necessária a utilização de alguma ferramenta estatística

que permita avaliar de alguma maneira a relevância de tais dados. Tendo isto em
mente, optou-se pelo teste t-pareado, o qual tem sido a escolha de diversos autores
dentro da literatura especializada (LUPETTI, RAMOS e FATIBELLO-FILHO, 2003;
LOURENÇO et al., 2010), no que tange a comparação entre diferentes
metodologias. Na Tabela 47 é possível observar o resultado do teste t-pareado para
a determinação de L-glutamato de sódio, o qual foi realizado com um nível de
significância de 95%.
Tabela 47. Teste t-pareado dos resultados para a determinação

de sorbitol nas amostras de termoestabilizador, onde Xd e Sd
correspondem respectivamente à média e desvio padrão das
diferenças.
Técnica
Amostas UV/Vis FTIR
B 5,47 5,35
C 5,70 5,88
D 5,46 5,46
E 5,39 5,48
F 5,56 5,56
012/11 5,77 5,52
060/11 5,93 5,81
069/11 5,58 5,28
076/11 4,29 4,16
082/11 5,27 5,16
Xd 1,07
Sd 2,16
tcalculado 1,56
ttabelado 2,26
O que deve ser notado neste caso, isto é, no teste t-pareado, não há
necessidade de que as precisões de ambos os métodos sejam equivalentes
(homocedásticos), assume-se, contudo, que as diferenças entre os valores médios
obedecem a uma distribuição normal (MILLER e MILLER, 2005). O principal objeto
deste teste é verificar se a variabilidade observada através das diferenças é devida
107
ao inevitável erro aleatório ou se de fato há uma tendência (bias) entre os
resultados. Interpretando então os dados da Tabela 47, a hipótese nula é mantida
uma vez que o valor de tcalculado é menor que tTabelado. Sendo assim, não é possível
concluir que haja diferença estatística entre os dois métodos dentro do nível de
confiança em que o teste foi realizado. Não é demais ratificar que, não está sendo
afirmado aqui que erros sistemáticos estão irrefutavelmente ausentes, tão somente
não foi possível nestas condições provar sua existência na determinação de L-
glutamato de sódio.
5.5.7.2.2 Sorbitol
A estimativa da exatidão do método para a determinação de sorbitol foi

feita através da comparação com os resultados obtidos nas mesmas amostras
pela técnica da cromatografia a líquido de alta eficiência, conforme recomendado
pela Farmacopéia Americana (USP). Entretanto, a fim de avaliar se a eficiência
da separação cromatográfica foi mantida ao longo das injeções foi preparada
uma solução de resolução na qual continha padrões de sorbitol e manitol a uma
concentração de 4,8 mg/mL cada. Esta solução foi injetada em três momentos
distintos da corrida; no início, na metade e, ao final da sequência. As Figuras 29,
30 e 31 apresentam em ordem cronológica, os cromatogramas obtidos em três
injeções da solução resolução.
Figura 29. Cromatograma da primeira injeção da solução resolução.
108
Figura 30. Cromatograma da segunda injeção da solução resolução.
Figura 31. Cromatograma da terceira injeção da solução resolução.
Com os cromatogramas acima e de posse dos respectivos tempos de

retenção e larguras de banda, é possível calcular a resolução cromatográfica Rs
através da seguinte equação:
( r sorbitol – r manitol)
Resolução (Rs) =
sorbitol manitol
Onde, tr representa os tempos de retenção de cada espécie e w são as suas

respectivas larguras de banda. Na Tabela 48 é possível observar os resultados de
Rs das três injeções.
Tabela 48. Resoluções cromatográficas obtidas após três injeções de uma solução resolução
contendo sorbitol e manitol.
Injeção 1 Injeção 2 Injeção 3
tr W tr W tr W
Manitol 12,559 1,40 12,553 1,61 12,565 1,38
Sorbitol 15,351 1,94 15,34 1,9 15,362 1,65
Resolução 1,67 1,59 1,85
109
Este estudo, além de ser considerado como fundamental para a validade
desta análise segundo o Compêndio de referência, traz a garantia de que as
condições de separação foram mantidas até o final da análise. O que de fato, trata-
se de uma informação relevante, dada a grande quantidade de injeções que
exigiram mais de 35 horas de análise ininterruptas. A título de informação, segue na
Figura 32 um cromatograma típico obtido após a injeção de um padrão de sorbitol,
seguido de um cromatograma obtido em uma das amostras de termoestabilizador na
Figura 33.
Figura 32. Cromatograma do padrão de sorbitol obtido em uma de suas

injeções.
Figura 33. Cromatograma típico de uma amostra de termoestabilizador.
Seguindo adiante, após o término da corrida cromatográfica, seus respectivos

picos foram integrados em relação à linha de base para a realização dos cálculos
devidos. Simultaneamente às separações cromatográficas, foram realizadas as
determinações de sorbitol nas mesmas amostras através da FTIR. Ambos os
resultados podem então ser comparados em termos de suas médias e desvios
padrão, conforme a Tabela 49.
110
Tabela 49. Resultados das análises de dez amostras de termoestabilizador realizados por CLAE e FTIR.
HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR
Média (%) 15,38 15,35 15,17 15,22 15,52 15,36 15,57 15,64 15,43 15,34
Desvio padrão 0,09 0,14 0,02 0,25 0,05 0,21 0,03 0,11 0,08 0,17
012/11 082/11 076/11 060/11 069/11

HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR HPLC FTIR
Média (%) 15,84 15,91 16,12 16,68 17,05 17,49 15,00 15,32 15,28 15,80
Desvio padrão 0,08 0,18 0,06 0,32 0,25 0,27 0,06 0,35 0,13 0,17
A exemplo do item anterior o tratamento estatístico dos dados experimentais

foi realizado através do teste t-pareado. O nível de confiança utilizado foi de 95% e a
Tabela 50 tornam explícitos os resultados encontrados.
Tabela 50. Teste t-pareado dos resultados para a determinação

de sorbitol nas amostras de termoestabilizador, onde Xd e Sd
correspondem respectivamente à média e desvio padrão das
diferenças.
Técnica
Amostas FTIR HPLC
B 15,35 15,38
C 15,22 15,17
D 15,36 15,52
E 15,64 15,57
F 15,34 15,43
012/11 15,91 15,84
082/11 16,68 16,12
076/11 17,49 17,05
060/11 15,32 15,00
069/11 15,80 15,28
Xd 0,18
Sd 0,26
tcalculado 2,13
ttabelado 2,26
A interpretação dos dados da Tabela 50 indica que, como tcalculado é menor

que tTabelado, a hipótese nula é mantida, isto é, não há diferença estatística entre os
resultados dentro do nível de significância adotado (95%). Extensivamente, não Foi
evidenciada diferença entre as duas metodologias para a determinação de sorbitol
nas amostras de termoestabilizador. Cabe sempre a ressalva que, em nenhum
momento se afirma que os resultados sejam de fato estatisticamente iguais, tão
somente não foi possível evidenciar suas diferenças através do teste.
111
5.5.8 Robustez
Durante a avaliação da robustez do método, optou-se pela variação da

temperatura assim como o pH das amostras. Esta escolha levou em consideração
(no caso das temperaturas baixas) as condições reais de estocagem e
armazenamento que, como mencionado durante o texto, e realizada através de
câmaras frias onde a temperatura é mantida entre 2 e 8 °C. Quanto à temperatura
alta, foi adotada 40 °C como mais adequada, dado que representa condições
extremas que podem ser encontradas durante o transporte das amostras, uma vez
que a distância entre os laboratórios de produção e controle de qualidade exige que
este seja feito por ambientes abertos, sujeitos à temperaturas não controladas. A
faixa de pH foi escolhida aleatoriamente com o intuito de mimetizar impactos sofridos
pelas amostras oriundos de possíveis imperfeições no processo produtivo. Há que
se considerar, entretanto, que não há qualquer fundamento científico ou mesmo
prático que colabore com a escolha das faixas de pH.
5.5.8.1 Estudo de robustez do método para determinação de L-glutamato de sódio
Seguindo adiante, foram realizadas então três determinações independentes

de uma amostra cuja concentração era desconhecida. As determinações tanto de L-
glutamato se sódio quanto de sorbitol foram efetivadas nas faixas de pH escolhidas
assim como na amostra sem alteração de pH, o qual se encontrava em 6,9 no
momento da medição. A mesma lógica foi procedida durante o estudo da influência
da temperatura, isto é, as medições foram realizadas nas duas temperaturas
sugeridas além de uma terceira, na qual a temperatura da amostra era de 22 °C.
A Tabela 51 apresenta os resultados obtidos durante a avaliação da influência

da temperatura na robustez do método para determinação de L-glutamato de sódio.
112
Tabela 51. Influência de diferentes temperaturas na robustez
do método para determinação de L-glutamato de sódio.
Temperatura 2 a 8 °C 22 °C 40 °C
6,51 6,50 6,48
Medições % (m/v) 6,52 6,77 6,44
6,49 6,78 6,50
Média 6,51 6,68 6,47

Desvio padrão 0,02 0,16 0,03
Para o tratamento dos dados gerados durante o estudo de robustez optou-se

pala análise de variância (ANOVA) de fator fixo, ou fato controlado, de modo que a
influência oriunda de cada fator pudesse ser avaliada. Neste sentido, este teste é
adequado e permite avaliar comparativamente a variabilidade devido ao erro
aleatório com a variabilidade proveniente do fator, que, no caso da Tabela 46 é a
temperatura. Mais uma vez, ao longo de todo o estudo de robustez, todos os
tratamentos que daqui se seguem foram realizados com um nível de confiança igual
a 95%. A Tabela 52 expressa os resultados da ANOVA para a influência da
temperatura na determinação de L-glutamato de sódio em amostras de
termoestabilizador.
Tabela 52. ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da temperatura

na determinação de L-glutamato de sódio.
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 0,0766 2 0,0383 4,322 0,068779 5,143
Dentro dos grupos 0,0532 6 0,0089
Total 0,1298 8
A avaliação da Tabela 52 informa que Fcalculado é menor que FTabelado, e neste

caso, a hipótese nula é mantida ao nível de significância do teste. Além disso,
observa-se que 59% de toda a variabilidade encontrada, é devida ao fator
temperatura, enquanto que, 41% representa a variabilidade proveniente do erro
aleatório, presente nas medições. Neste caso, não é possível concluir que o fator
temperatura exerça influência na medição de L-glutamato de sódio em amostras de
termoestabilizador.
113
O estudo procedeu de modo análogo para a avaliação da influência do fator
pH nas medições de L-glutamato de sódio. O que pode ser apreciado através da
Tabela 53 a seguir.
Tabela 53. Influência do pH na robustez do método de

pH 4,5 6,9 9,0

4,95 6,50 5,80
Medições % (m/v) 4,86 6,77 5,86
5,02 6,78 5,90
Média 4,94 6,68 5,85

Naturalmente, deu-se a sequência do estudo da influência do pH na

determinação de L-glutamato de sódio com a ANOVA, conforme descrito na Tabela
54.
Tabela 54. ANOVA de fator controlado na avaliação da influência do pH na

ANOVA
Entre grupos 4,55 2 2,273 202 3,12E-06 5,143
Total 4,61 8
A interpretação da Tabela 54, por sua vez, chama a atenção para o fato de
Fcalculado ser muito maior que FTabelado, dado que é suportado pelo fato de que o fator
em estudo, isto é o pH, é responsável por mais de 98% de toda a variabilidade
observada nos resultados. Neste caso então, a hipótese nula é descartada e pode-
se afirmar que o fator pH exerce influência nos resultados de determinação de L-
glutamato de sódio em amostras de termoestabilizador sendo uma fonte potencial de
erro sistemático.
5.5.8.1.1 Influência do pH no espectro do L-glutamato de sódio e discussão adicional
Com a finalidade de obter uma proposta razoável capaz de explicar a

inobservância da robustez do método para determinação de L-glutamato de sódio
114
frente às variações de pH, foi elaborado um experimento simples, que consistiu no
preparo de soluções desta espécie em água à 5% (m/v) em diferentes condições de
pH. Isto é, foram obtidos espectros de L-glutamato de sódio em pH; 4,0, 5,0, 6,0, 7,0,
8,0, 9,0 e 10,0. As duas Figuras 34 e 35 seguintes ilustram os mesmos alocados em
escala, e sobrepostos para melhor visualização.
Figura 34. Espectros de soluções de L-glutamato de sódio em água (5%, m/v) preparadas em
diferentes pH’s.
Adiante, segue em destaque a banda utilizada durante o trabalho (1347 cm -1).
Figura 35. Os mesmos espectros da Figura 34, em destaque para a banda utilizada durante o
trabalho em 1347 cm-1.
Através de uma avaliação dos espectros acima, percebe-se uma diferença

significativa nos espectros obtidos nos pH’s extremos de 4,0 e 10,0 dos demais.
Além do notável efeito hipocrômico em ambos, há ainda o surgimento de uma nova
banda até então imperceptível na região compreendida entre 1375 e 1370 cm -1
quando em pH 4,0.
115
Com base na informação obtida da literatura, isto é, que a transição
observada em 1347 cm-1 envolve o ânion carboxilato (COO-), é possível, à luz do
estudo do equilíbrio de soluções, estabelecer algumas considerações.
Conhecendo os três pKa’s que envolvem o equilíbrio do ácido glutâmico (pKa 1
= 2,19, pKa2 = 4,25, pKa3 = 9,67), é possível grafar o diagrama de distribuição desta
espécie em função do pH conforme a Figura 36 adiante.
0,9
0,8
H 3GLU
0,7
0,6

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
pH
Figura 36. Diagrama de distribuição do Ácido Glutâmico.
Observando o gráfico da Figura 36, percebe-se que há uma ampla faixa de

pH próximo a 5 que se estende até aproximadamente 9. De fato, o pH de todas as
amostras de termoestabilizador utilizadas durante este trabalho encontrava-se em
torno de 6,9, isto é, dentro desta grande faixa. O que decorre disto é que este
intervalo compreende a predominância da espécie de glutamato onde as duas
carboxilas encontram-se desprotonadas, o que é coerente com a informação da
literatura. Entretanto, a medida em que se avança ao longo do diagrama em direção
ao pH mais ácido (próximo de 4,0) ou em direção ao pH mais alcalino (próximo de
10,0) isto deixa de ser verdadeiro. No primeiro caso, a -carboxila vai sendo
protonada enquanto que no segundo caso, a carga da -carboxila aumenta em
função da formação da amida (NH3+ NH2). Entretanto, em ambos os casos, a
disponibilidade do ânion carboxilato no sistema diminui. De acordo com a Tabela 55
adiante, em pH 4,0, apenas 36% do glutamato presente está sob a forma totalmente
desprotonada e, em pH 10,0 32%.
116
É razoável então observar-se uma diminuição do sinal referente ao anion
carboxilato quando em soluções de pH 4,0 e 10,0. Evidentemente, este efeito
ocasionou uma diminuição da concentração de glutamato, uma vez que a diminuição
da disponibilidade do ânion carboxilato não foi notada nas soluções padrão
utilizadas para a construção da curva analítica.
Tabela 55. Valores de  em função do pH para as quatro espécies presentes no

equilíbrio do ácido glutâmico.
pH α0 α1 α2 α3
0 0,993584519 0,00641512 3,60749E-07 7,71267E-17
0,5 0,979987662 0,02000878 3,55812E-06 2,40558E-15
1 0,939318405 0,06064749 3,41046E-05 7,29143E-14
1,5 0,830194594 0,16950398 0,000301425 2,03789E-12
2 0,606323343 0,39147523 0,002201427 4,70657E-11
2,5 0,324881461 0,663322806 0,011795733 7,97489E-10
3 0,127883445 0,825684872 0,046431673 9,92692E-09
3,5 0,039923088 0,815124842 0,144951972 9,79996E-08
4 0,009816114 0,633781561 0,356401563 7,61973E-07
4,5 0,001759775 0,359300041 0,638935864 4,31974E-06
5 0,000233781 0,150941521 0,848806551 1,81472E-05
5,5 2,60736E-05 0,05323542 0,946674504 6,40031E-05
6 2,70553E-06 0,017468375 0,982318904 0,000210016
6,5 2,73699E-07 0,005588209 0,993739667 0,00067185
7 2,74348E-08 0,001771342 0,996099008 0,002129622
7,5 2,73421E-09 0,000558253 0,992730065 0,006711679
8 2,69611E-10 0,000174075 0,978897468 0,020928457
8,5 2,57968E-11 5,26702E-05 0,93662379 0,06332354
9 2,26907E-12 1,46503E-05 0,823849459 0,176135891
9,5 1,64325E-13 3,35508E-06 0,596627172 0,403369473
10 8,77712E-15 5,66698E-07 0,318677984 0,681321449
10,5 3,54888E-16 7,24589E-08 0,128852192 0,871147735
11 1,23069E-17 7,94598E-09 0,044683509 0,955316483
11,5 4,01443E-19 8,1964E-10 0,014575496 0,985424503
12 1,28225E-20 8,27891E-11 0,004655576 0,995344424
12,5 4,06779E-22 8,30535E-12 0,001476924 0,998523076
13 1,28765E-23 8,31375E-13 0,000467516 0,999532484
13,5 4,0732E-25 8,31641E-14 0,000147889 0,999852111
14 1,28819E-26 8,31725E-15 4,67713E-05 0,999953229
5.5.8.2 Estudo de robustez do método para determinação de Sorbitol
A exemplo do que foi feito no item anterior, o estudo de robustez do método

para determinação de sorbitol levou em consideração os mesmos fatores e procedeu
117
da mesma forma. Em conseqüência, a Tabela 56 apresenta os dados obtidos para a
avaliação da influência da temperatura na robustez.
Tabela 56. Influência de diferentes temperaturas na

robustez do método para determinação de Sorbitol.
Temperatura 2 a 8 °C 22 °C 40 °C
17,00 16,56 16,37
Medições % (m/v) 17,00 17,21 16,84
16,84 16,41 15,98
Média 16,95 16,73 16,40

Analogamente, segue a Tabela 57 com os resultados levantados durante a

ANOVA.
Tabela 57. ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da

temperatura na determinação de sorbitol.
ANOVA
Entre grupos 0,456 2 0,228 1,823 0,241 5,143
Total 1,205 8
Assim como foi observado no caso do L-glutamato de sódio, Fcalculado mostrou-

se menor que FTabelado, condição em que se mantém a hipótese nula, e não é
possível concluir que o fator temperatura exerça influência nos resultados de
medição de sorbitol ao nível de significância empregado.
Finalmente, o estudo de robustez se encerra, avaliando a influência do fator

pH na determinação de sorbitol em amostras de termoestabilizador. É possível
verificar seus resultados na Tabela 58.
Tabela 58. Influência do pH na robustez do método

para determinação de Sorbitol.
pH 4,5 6,9 9,0

16,36 16,56 16,53
Medições % (m/v) 15,87 17,21 17,31
16,20 16,41 16,69
Média 16,14 16,73 16,84

118
Consequentemente, a ANOVA a Tabela 59, ilustra a avaliação da influência
exercida pelo fator pH nas medições de sorbitol.
Tabela 59. ANOVA de fator controlado na avaliação da influência do pH na

determinação de sorbitol.
ANOVA
Entre grupos 0,844 2 0,422 3,065 0,121 5,143
Total 1,670 8
O resultado desta ANOVA traz uma observação interessante, como visto,

Fcalculado é menor que FTabelado, condição em que se mantém a hipótese nula e não se
pode evidenciar a influência do pH nas medições de sorbitol, ao contrário do que foi
observado no estudo da influência deste parâmetro no método de L-glutamato de
sódio. É possível então que esta influência não seja observada ao longo de toda a
região espectral, motivo pelo qual apenas um efeito hipocrômico de natureza ainda
não esclarecida tenha sido observado no estudo do L-glutamato de sódio.
119
6 CONCLUSÕES
À luz de toda informação que foi gerada ao longo deste trabalho, algumas
considerações são dignas de serem levantadas.
Apesar de todo o formalismo e cautela necessários quando da escolha pela

aplicação de uma determinada metodologia, é preciso que se tenha em mente a
solução do problema analítico como foco central. Não se trata apenas de uma
simples e rígida avaliação estatística acerca do conjunto de algumas características
que se julguem importantes dentro de um processo de medição. É preciso se
estabelecer um equilíbrio entre a dicotomia de figuras de mérito naturalmente
contraditórias como a exatidão e a produtividade, ou ainda a precisão e a alta
sensibilidade. Além disso, algumas características apresentadas pelas metodologias
analíticas como o custo ou a rapidez, por exemplo, podem possuir particularidades
inerentemente antagônicas às propriedades analíticas descritas acima.
Dentro deste contexto, a solução de um problema analítico envolve então a

observância de questões que vão além do campo instrumental ou mesmo analítico.
Torna-se latente que toda e qualquer metodologia apresentará seus aspectos
positivos e negativos, e o conhecimento destes é ferramenta fundamental para a
tomada de decisões.
Inicialmente, a proposta deste trabalho envolvia a aplicação da

espectroscopia de absorção no infravermelho médio com transformada de Fourier.
Após os meses em que se transcorreram os experimentos deste trabalho, foi
possível evidenciar alguns dos aspectos que despertaram interesse por esta técnica
e que pode fazer dela uma opção competitiva frente às demais. Um deles trata-se da
alta produtividade analítica. A técnica de ATR-FTIR nas condições estabelecidas
neste trabalho foi capaz de produzir cerca de 30 espectros/hora de sorbitol e 60
espectros/hora de L-glutamato de sódio. Não há dúvidas quanto aos ganhos de
produtividade quando comparados com o tempo de 20 minutos, necessário para
totalizar uma única injeção cromatográfica ou ainda, o 40 minutos de repouso,
necessários para a reação enzimática L-glutamato/L-glutaminase. Evidentemente,
120
dada a premência de se obter uma informação rápida dentro de um curto intervalo
de tempo, tendo em vista toda a discussão acerca da termolabilidade da vacina
contra a febre amarela, urge a necessidade de uma metodologia que ofereça
ganhos em escala de produtividade.
Ainda na mesma linha de raciocínio do parágrafo anterior, outra vantagem

que causa forte influência nas características da técnica é a ausência das operações
prévias. A possibilidade da realização de medições diretas, além de impactar
positivamente na produtividade, elimina uma potencial fonte de erro analítico. O que
é inevitável através da técnica de separação cromatográfica ou mesmo no caso da
reação enzimática.
A respeito da segurança do profissional de laboratório, a técnica oferece a

vantagem da não utilização de solventes outros, além da própria água deionizada.
Esta característica atualmente traz um ganho adicional na outra extremidade do
processo, isto é, em função da Lei de Crimes Ambientais de 1998, a qual
responsabiliza o gerador do lixo pela sua descaracterização na natureza, o
gerenciamento de resíduos químicos por parte dos laboratórios envolve logística
adequada além de altos recursos, motivo pelo qual o desenvolvimento de métodos
ditos “limpos”, vem sendo incentivados.
Apesar do que foi pontuado acima, se faz necessário uma discussão sobre
alguns aspectos negativos observados durante o trabalho. O que foi apresentado no
parágrafo anterior como uma vantagem, pode sob determinadas circunstâncias ser
uma desvantagem. Dada a forte absorção da água na região do infravermelho
médio, analitos em solução aquosa experimentam uma forte atenuação de seus
sinais analíticos. Tal efeito supressor é imediatamente percebido por algumas figuras
de mérito como a sensibilidade analítica, uma vez que o incremento de sinal com a
variação de concentração será menos expressivo, além dos limites de detecção e, é
claro, de quantificação, dado que estão relacionados em algum nível com a
sensibilidade.
No item 2.3.4 foi abordado brevemente os princípios da ATR. Algumas de

suas vantagens foram inclusive, citadas. Contudo, imaginando o fenômeno de
121
absorção molecular como um evento probabilístico, isto é, quanto maior for a
interação da fonte de radiação eletromagnética com a matéria, maior será a
probabilidade de uma dada transição permitida ocorrer, é possível perceber que a
sensibilidade analítica durante a utilização da ATR será dependente do número de
reflexões realizadas pela fonte dentro do elemento de reflexão. Este número de
reflexões também pode ser entendido como o número de vezes que a fonte irá
interagir com a matéria. Comparativamente, durante a ATR o feixe de radiação
interage menos com a amostra do que uma técnica em que o mesmo feixe incide
diretamente sobre ela. A conseqüência disto é a perda de sensibilidade dado que as
transições moleculares ocorrerão em menor número.
Estes dois fatores exercem um fator negativo o qual restringe a aplicação da

técnica, ao menos nas condições experimentais utilizadas neste trabalho. Fato que
pôde ser observado pelos limites de detecção obtidos de 0,19% e 0,98% para L-
glutamato de sódio e sorbitol, o que inviabilizaria a determinação dos analitos em
níveis de traços. Outro fator digno de atenção foi a evidência da influência do pH na
determinação de L-glutamato de sódio na amostras de termoestabilizador. A
robustez do método não foi suportada nestas condições, sendo este parâmetro uma
fonte de erro sistemático para a determinação de L-glutamato de sódio.
Entretanto, ambos os métodos apresentaram boa seletividade, assim como

uma precisão que pode ser considerada satisfatória em termos dos coeficientes de
variação obtidos inferiores a 5%, conforme recomendado pelo Guia de Validação
analítica da ANVISA. Além de não ter sido evidenciada qualquer diferença
significativa entre medições realizadas por diferentes analistas. As duas propostas
metodológicas apresentaram boa linearidade ao longo das respectivas faixas de
trabalho estudadas, o que foi corroborado mediante a análise de variância (ANOVA)
das regressões. E finalmente, não foi evidenciada diferença estatística entre os
valores médios obtidos pelas metodologias de FTIR e CLAE assim como entre FTIR
e UV/vis, sendo assim não foi observada diferença entre as suas exatidões.
Conclusivamente, levantando todos estes aspectos, é possível inferir que as

metodologias atendem ao propósito inicial, oferecendo uma alternativa analítica de
alta produtividade, relativo baixo custo e sem qualquer operação prévia. Tudo isso,
122
mantendo o compromisso com níveis satisfatórios de desempenho, estabelecidos
pelas normas nacionais. Além disso, recomenda-se a utilização desta metodologia
para a elaboração de procedimentos operacionais, os quais podem adequadamente
servir para a execução de análises de rotina, assim como os propósitos de estudos
de estabilidade de termoestabilizadores, a fim de aprimorar o conhecimento acerca
do comportamento químico destas soluções.
123
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Eduardo da Silva Gomes de Castro

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DE

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Tabela 2: Preparo da curva analítica para a determinação espectrofotométrica de L-glutamato.............................. 63

Tabela 23: Análise de variância (ANOVA) da curva A de L-glutamato de sódio........................................................... 92

Tabela 25: Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva B de L-glutamato de sódio...................................... 93

Tabela 27: Análise de variância (ANOVA) na regressão da curva C de L-glutamato de sódio...................................... 94

Tabela 30: Análise de variância (ANOVA) da curva A de Sorbitol.................................................................................... 96

Tabela 32: Análise de variância (ANOVA) da curva B de Sorbitol.................................................................................... 97

Tabela 34: Análise de variância (ANOVA) da curva C de Sorbitol.................................................................................... 98

Ensaio de recuperação de L-glutamato de sódio realizado em quatro amostras independentes de

Resultados das análises de dez amostras de termoestabilizador realizados pela Espectrofotometria

ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da temperatura na determinação de L-glutamato de

Tabela 53: Influência do pH na robustez do método de determinação de L-glutamato de sódio...................................... 114

ANOVA de fator controlado na avaliação da influência da temperatura na determinação de

Tabela 58: Influência do pH na robustez do método para determinação de Sorbitol........................................................ 118

ANOVA de fator controlado na avaliação da influência do pH na determinação de

Regiões endêmicas da Febre Amarela (cinturões vermelhos). Dados baseados em pesquisas

Figura 3: Fluxo do processo produtivo da Vacina contra a Febre Amarela.................................................................. 28

Figura 5: Programa de temperatura utilizada no ciclo de liofilizacao da vacina contra a Febre 35

Figura 13: Espectro do L-Glutamato de sódio em solução aquosa a 7% (m/v).............................................................. 72

Figura 14: Espectro do Sorbitol em solução aquosa a 15% (m/v).................................................................................. 72

Figura 15: Espectro da Gelatina hidrolisada em solução aquosa a 9% (v/v).................................................................. 73

Figura 16: Espectro da amostra de termoestabilizador.................................................................................................. 73

Figura 17: Espectros dos componentes e do termoestabilizador................................................................................... 74

Figura 24: Curva analítica B – Determinação de L - glutamato de sódio........................................................................ 93

Figura 25: Curva analítica C – Determinação de L – glutamato de sódio................................................................... 94

Figura 26: Curva analítica A – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 95

Figura 27: Curva analítica B – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 96

Figura 28: Curva analítica C – Determinação de Sorbitol............................................................................................... 97

Figura 29: Cromatograma da primeira injeção da solução resolução............................................................................. 108

Figura 30: Cromatograma da segunda injeção da solução resolução............................................................................ 109

Figura 31: Cromatograma da terceira injeção da solução resolução.............................................................................. 109

Figura 33: Cromatograma típico de uma amostra de termoestabilizador....................................................................... 110

Figura 36: Diagrama de distribuição do Ácido Glutâmico............................................................................................... 116

FTIR Infravermelho médio com Transformada de Fourier

O controle de qualidade de vacinas no Brasil teve um grande marco histórico

Evidentemente, providências, em caráter de emergência tiveram de ser

Tornava-se latente, a necessidade da criação por parte da esfera pública, de

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2.1 A VARÍOLA E A PRIMEIRA IMUNIZAÇÃO

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Durante os meses que se seguiram, Jenner não observou o desenvolvimento

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