Purificação de proteínas

A purificação de proteínas é um processo pelo qual obtém-se uma proteína de interesse

a partir de uma amostra biológica, como um tecido. É uma técnica bastante utilizada na
ciência para o estudo das propriedades de uma determinada proteína, bem como suas
possíveis interações e sua importância para os sistemas biológicos.
PROCESSAMENTO
Inicialmente, as proteínas precisam estar em solução para que possam ser isoladas. No
caso do sangue, as proteínas do soro já se encontram suspensas em solução, eliminando
essa primeira etapa. No entanto, para isolar proteínas de um tecido específico, é
necessário primeiramente fazer a digestão do tecido – liberando assim as células que o
constituem –, e, em seguida, rompendo essas células para que a proteína de interesse
seja liberada para a solução. Neste ponto existe uma outra checagem a ser feita: a
proteína de interesse é citosólica ou está presente dentro de alguma organela ou inserida
em alguma membrana? No primeiro caso, a lise das células é suficiente para que a
proteína seja solubilizada. Pode-se usar a lise osmótica, colocando as células em contato
com uma solução hipotônica, que tende a entrar no meio intracelular por osmose e
romper a membrana plasmática, liberando o conteúdo citoplasmático na solução. No
caso de a proteína encontrar-se em compartimentos celulares ou membranas, é comum
adicionar-se uma etapa a mais no processo: a separação dos componentes subcelulares
em frações de densidade, através de centrifugação por gradiente (por exemplo, gradiente
de sacarose). A partir do recolhimento da fração de interesse, é necessário solubilizar as
membranas com soluções contendo detergentes ou solventes orgânicos (com certo
cuidado para não desnaturar as proteínas em questão, se a estrutura intacta for
importante para a análise).
CONDIÇÕES A SEREM CONTROLADAS
É importante que durante o processo de solubilização das proteínas, já a partir da lise
celular, tenha-se o cuidado de inibir as proteases, enzimas que degradam proteínas
(catalisam a clivagem hidrolítica das ligações peptídicas). Se a proteína de interesse for
alvo de fosforilação, também é importante inibir as fosfatases (enzimas que catalisam a
hidrólise do grupo fosfato). Outro ponto importante é trabalhar na temperatura e pH em
que a proteína de interesse é estável: muitas proteínas são facilmente desnaturadas em
altas temperaturas, por exemplo.
ANÁLISE DA QUANTIDADE DA PROTEÍNA
Após a purificação, é essencial que se avalie a quantidade da proteína isolada. No caso
de enzimas, é comum relacionar a quantidade por meio de ensaios colorimétricos que
detectam a formação de seus produtos. Para uma proteína com função de receptor,
também é possível a conjugação de seu ligante a um radioisótopo. O complexo ligante
radioativo-receptor pode ser então concentrado por filtragem da solução aquosa que o
contém e posterior detecção. Hormônios podem ser detectados por sua ação biológica
em células ou tecidos. Este tipo de ensaio costuma demorar mais, uma vez que depende
de respostas de sistemas vivos.
Ensaios imunoquímicos são, em geral, uma forma rápida de detectar quantidades
pequenas de proteína. Nesses casos, são utilizados anticorpos que reconhecem
especificamente partes (epítopos) da proteína em questão. Na técnica chamada de
imunoprecipitação, a detecção ou isolamento de proteínas pode ser feita rapidamente
pela precipitação dos anticorpos que as reconhecem. Além disso, nos
radioimunoensaios, as proteínas são detectadas pela sua capacidade de competir pelo
anticorpo com moléculas marcadas radioativamente (quanto maior a detecção de
radioatividade, menor a quantidade da proteína que se ligou ao anticorpo). Os
imunoensaios enzimáticos (ELISA e EIA) não utilizam radioatividade e são técnicas
muito difundidas e bastante sensíveis; também são baseadas no princípio de ligação da
proteína ao seu anticorpo específico, correlacionando a absorbância com a concentração
da proteína presente na amostra.
TÉCNICAS PARA O ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS
As propriedades físico-químicas das proteínas são amplamente exploradas para sua
separação. Dentre elas estão a separação por solubilidade, carga iônica, polaridade,
tamanho molecular e especificidade de ligação. As técnicas que abordam cada uma
dessas propriedades estão resumidas na tabela abaixo:

Técnicas para separação de proteínas baseadas em suas propriedades físico-

químicas

Características Técnicas

» Salting in
Solubilidade
» Salting out

» Cromatografia de troca iônica

Carga iônica » Eletroforese

» Focalização isoelétrica

» Cromatografia de adsorção
» Cromatografia em papel
Polaridade
» Cromatografia de fase reversa
» Cromatografia de interação hidrofóbica

» Diálise e ultrafiltração
» Eletroforese em gel
Tamanho molecular
» Cromatografia de gel filtração
» Ultracentrifugação

Especificidade de ligação » Cromatografia de afinidade

Cromatografia
Os hemoderivados da fábrica do Butantan serão obtidos por cromatografia, método que
utiliza uma coluna cilíndrica contendo resinas sintéticas que permitem a separação das
proteínas. “Ao passar pela coluna, o processo de purificação se repete milhares de vezes
e acaba separando de forma bastante purificada cada proteína”, explica Raw.

Esse procedimento utiliza resinas distintas para separar as proteínas por tamanho, carga
elétrica, rejeição à água ou ainda por sua atividade biológica. A cromatografia já é
utilizada pelos pesquisadores do Instituto Butantan para produção de toxinas
antitetânicas, vacina recombinante contra a hepatite tipo B e para a purificação de soros
hiperimunes.

Para garantir a qualidade dos hemoderivados, os produtos são tratados com um solvente
orgânico e um detergente que decompõem o vírus da hepatite B e todos os demais vírus
com uma cápsula lipoprotéica. “Todavia o detergente e o solvente também têm que ser
removidos, o que só é possível usando a cromatografia”, observa Raw. Um segundo
procedimento é utilizado para remover vírus não encapsulados.

A nova fábrica deverá incorporar também a tecnologia de produção de fatores VIII e IX

a partir da biotecnologia que está sendo desenvolvida pela Rede Brasileira para
Clonagem e Expressão de Fatores de Coagulação, formada por quatro laboratórios
nacionais, entre eles o Hemocentro de Ribeirão Preto. Raw ressalva que a produção
direta do fator IX a partir do plasma atenderia totalmente à demanda nacional, “uma vez
que a hemofilia B é muito mais rara”. O Hemocentro de Ribeirão Preto será responsável
pelo controle do plasma processado e dos hemoderivados produzidos pela fábrica do
Butantan, já que dispõe de um laboratório com alta tecnologia para analisar um grande
número de amostras.

Também está prevista a instalação de um laboratório – “uma fábrica dentro da fábrica”,

explica Raw – para a produção de soros hiperimunes. A idéia é vacinar doadores dos
hemocentros com vacinas contra tétano ou hepatite B produzidas no Butantan e
processar separadamente esse plasma para produzir soros antitetânico e anti-hepatite B.
“Um centro especializado de coleta está sendo projetado para funcionar no Instituto
Pasteur”, afirma.

Mais eficiência
A cromatografia, ele avalia, é mais eficiente que a tecnologia tradicional de produção de
hemoderivados por fracionamento de plasma, utilizada desde a década de 1960, e que
consiste na separação da massa de proteína precipitada no descongelamento da bolsa de
plasma. “Essa tecnologia já está obsoleta. As velhas fábricas de hemoderivados têm se
mantido com a velha tecnologia, depois de adicionar etapas que têm como objetivo
eliminar os vírus: aquecimento, tratamento com solvente-detergente, entre outros.”

“Há duas décadas tentamos implantar uma planta de hemoderivados”, lembra Raw.
Como o acesso ao plasma estava por lei bloqueado, o Butantan investiu na produção de
hemoderivados a partir de pequenas quantidades de plasma disponíveis na placenta,
tecnologia desenvolvida pela Merrieux, na França, mas que apresentava um problema:
utilizava placentas congeladas com o conseqüente rompimento de hemácias
contaminando, assim, o plasma.

“O Butantan desenvolveu tecnologia para isolar simultaneamente das placentas a

albumina, imunoglobulina, transferrina, catalase e superóxido dismutase”, ele conta. A
“colheita” de placentas e o isolamento de proteínas, no entanto, eram procedimentos
muito mais caros que o uso de sangue de doadores. Esse desafio estimulou os
pesquisadores a buscar soluções mais baratas e, ao mesmo tempo, seguras.

“O Butantan desenvolveu e está patenteando uma tecnologia onde o plasma degelado

passa diretamente numa coluna, separando e purificando cerca de cem vezes o fator de
coagulação. Eliminando a separação por congelamento, o rendimento do fator VIII
duplica. O concentrado permite separar os fatores e, depois do tratamento antiviral,
chegar a um produto muito mais barato para tratar hemofílicos”, afirma Raw.

Hemobrás
A União também tem planos de construir a Empresa Brasileira para o Fracionamento de
Plasma (Hemobrás), uma fábrica orçada em US$ 60 milhões, arquitetada para produzir
hemoderivados a partir do fracionamento do plasma sangüíneo e que teria como
objetivo atender parte da demanda do Sistema Único de Saúde.

O projeto da Hemobrás, no entanto, está parado no Congresso Nacional. “A proposta

paulista não pretende monopolizar o fracionamento do plasma. Muito pelo contrário:
oferece todos os detalhes e treinamento para que seu projeto seja replicado em outros
pontos do território nacional. Não se pode desperdiçar um salto tecnológico, repetindo
instalações e processos obsoletos”, conclui Raw.
Os produtos hemoderivados são medicamentos obtidos por meio da matéria-prima plasma
humano, proveniente do sangue coletado de doadores voluntários, altruístas e não
remunerados, posteriormente submetidos ao processo de fracionamento.3,4 O termo
fracionamento é usado para descrever a seguinte sequência de processos: separação das
proteínas plasmáticas (precipitação e/ou cromatografia), purificação (cromatografia de troca
iônica ou afinidade) e uma ou mais etapas de inativação ou remoção viral,5 com a finalidade
de conferir estabilidade, eficácia, qualidade e segurança.6,7 O método de fracionamento do
plasma humano desenvolvido por Cohn e colaboradores da Universidade de Harvard, durante
a 2a Guerra Mundial, consiste na precipitação das proteínas plasmáticas pela combinação de
diferentes concentrações de etanol a baixa temperatura, a partir de ajustes de pH e constante
dielétrica, para precipitação seletiva das diferentes proteínas.8 No entanto, outros produtores
alternativamente separam as proteínas através de cromatografia de troca iônica, gel filtração
ou por outros métodos de afinidade, sem a utilização do etanol.9 No método de Cohn-Oncley,
a fração I contém, especificamente, fibrinogênio, que é o principal componente proteico da
coagulação sanguínea, enquanto na fração II+III está contida a maior concentração de
imunoglobulinas. A fração V é a matéria-prima da albumina humana, e o fator VIII é um
componente da fração crioprecipitado do plasma humano. O fator IX e complexo
protrombínico (fatores da coagulação II, VII, IX e X) são obtidos após a remoção do
crioprecipitado, com etapas de fracionamento semelhantes, assim como o processo de
inativação/remoção viral.10,11 Os hemoderivados, em destaque neste estudo são: albumina
humana, imunoglobulina normal, concentrado de fator VIII, concentrado de fator IX, complexo
protrombínico e imunoglobulina específica,3 devidamente registrados na Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (Anvisa) do Ministério da Saúde.1
A albumina humana é um produto de ampla utilização e de custo elevado. O
consumo mundial, de cerca de seiscentas toneladas por ano, corresponde a um
gasto de mais de US$ 1,2 bilhão 1. Está disponível no mercado brasileiro em solução
injetável nas concentrações de 20 a 25%, e existem mais de cinqüenta registros do
produto no Ministério da Saúde (MS), entre importadores e produtores 2.

No Brasil, a administração de albumina humana integra o elenco de procedimentos

especiais do MS 3. O consumo interno atinge a mais de 10.000kg, sendo que a
produção nacional atende a menos de 10,0% do total. Atualmente, o MS
desenvolve um projeto de implantação de unidades industriais públicas, que visa a
atingir auto-suficiência em hemoderivados, utilizando o plasma excedente dos
Serviços de Hemoterapia do país 4.

A albumina humana é um medicamento hemoderivado injetável, extraído do

plasma humano, desenvolvido na década de 1940. A partir da coleta de sangue
humano são obtidos os produtos sangüíneos lábeis (hemocomponentes), por
fracionamento do sangue total, e os produtos sangüíneos estáveis
(hemoderivados), que passaram por fracionamento e processos de purificação e
estabilização industriais. Dessa forma são produzidos os hemoderivados não anti-
hemofílicos, como a albumina humana, e os anti-hemofílicos 5.

A albumina é considerada um produto seguro quanto à transmissão de doenças

infecciosas, desde que garantidas as boas práticas de fabricação, armazenamento e
administração. Na fase de fabricação, o produto é submetido a um processo de
esterilização por pasteurização a 60ºC por dez horas. Entretanto, subsiste sempre
um risco potencial de transmissão de vírus e de partículas subvirais e, atualmente,
há estudos que visam ao aperfeiçoamento do processo de inativação por
nanofiltração 5,6.

As indicações terapêuticas da albumina humana estão, em sua maioria,

relacionadas à reposição de perdas volêmicas agudas e à manutenção da pressão
coloidosmótica do plasma. Em muitos casos é recomendada a substituição
terapêutica da albumina humana por expansores plasmáticos sintéticos, que
reduzem a chance de efeitos adversos e os custos de tratamento. Os principais
expansores sintéticos são as soluções cristalóides (cloreto de sódio, Ringer) e os
colóides não protéicos (dextrana, poligelina, amido hidroxetil) 7,8.
 Métodos de produção

A produção comercial pode ser feita a partir de crioprecipitado de plasma, que são
fontes de fibrinogênio. A primeira fonte é obtida pelo descongelamento de plasma,
produzindo assim uma pasta recuperada na centrifugação. O crioprecipitado
contém fibrinogênio, fibronectina, fator XIII e outros componentes do plasma que
são sedimentados (depositados sobre uma superfície aquosa) durante a fase de
centrifugação. A segunda fonte é obtida a partir de plasma humano integral
precipitado à baixa temperatura (-3 a –5ºC).

A produção compreende, em geral, diversas fases de precipitação para aumentar

a pureza do fibrinogênio pela diminuição da proporção relativa de fibronectina. As
fases de purificação devem ser programadas de maneira que não altere a
coagulabilidade do fibrinogênio (RADOSEVICH et al., 1997).

A variação no modo de precipitação e de purificação influencia na composição do

produto final, o mesmo acontece com o tipo de tratamento de inativação de vírus.
Isso afeta a recuperação e o comportamento biológico dos componentes do
plasma (RADOSEVICH et al., 1997).

 Aplicações clínicas do adesivo fibrínico

Os primeiros resultados clínicos do uso do adesivo utilizando trombina bovina

foram observados em paciente submetidos à cirúrgias oftálmicas e tais resultados
foram excelentes. Mas somente após muitos anos, o produto começou a ser
comercializado porque já possuía uma maior segurança viral.

Para todos os tipos de cirurgias a hemostasia rápida e eficiente é de extrema

importância. Assim sendo, o adesivo fibrínico tem sido um bom indicador para
hemostasia local e para prevenção de hemorragia recorrente em praticamente
todas as indicações cirúrgicas.

BERG et al. (1991) e MORAWITZ et al. (1995), avaliaram as recidivas de

sangramento em pacientes hemofílicos submetidos a pequenas cirurgias e
constataram que com a utilização do adesivo fibrínico diminuiu em
aproximadamente quatro vezes as hemorragias tardias, quando comparados a
pacientes operados sem o adesivo.

Em se tratando de hemostasia em cirúrgias dentárias, um estudo foi feito com 59

pacientes portadores de distúrbios de coagulação, onde a recidiva de sangramento
foi de 3% (2 pacientes), demonstrando assim que com a alta potência hemostática
do adesivo, obteve-se novas opções de tratamento cirúrgico em pacientes de alto
risco, sem substituição excessiva dos fatores de coagulação ou suspensão da
terapia anticoagulante (MARTINOWITZ et al., 1990). Uma outra área que
comprovou a eficácia do adesivo foi na selagem de cavidades corporais, como na
cirurgia torácica para fechamento do esterno, anastomose da traquéia e,
particularmente, na selagem de lesões pulmonares (GUST et al.,1990; KOIKE et
al.), onde podem levar a infecções em 2 a 3 % dos pacientes (WILLIANS & LEWIS,
1976).
Em se tratando de reações adversas, elas são discretas, caracterizando-se por
eventuais febres, calafrios e pequenas reações alérgicas e são observadas em
apenas 1% dos casos. (MARTINOWITZ & SCHULMAN, 1995).