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Transplante Celular, Vol. 26, pp. 1001–1016, 2017 0963-6897 / 17 $ 90,00 + 0,00
Impresso nos EUA. Todos os direitos reservados. DOI: https://doi.org/10.3727/096368916X694391
direito autoral Ó 2017 Cognizant, LLC. E-ISSN 1555-3892
www.cognizantcommunication.com

As células-tronco da polpa dentária humana são mais eficazes do que as células-tronco

mesenquimais derivadas da medula óssea humana em lesão isquêmica cerebral

Miyeoun Song, * † Jae-Hyung Lee, † ‡ Jinhyun Bae, § Youngmin Bu, § e Eun-Cheol Kim *

* Departamento de Patologia Bucomaxilofacial, Centro de Pesquisa em Regeneração Dentária e Periodontal (MRC),

Faculdade de Odontologia, Universidade Kyung Hee, Seul, República da Coreia
† Departamento de Ciências da Vida e Nanofarmacêuticas, Universidade Kyung Hee, Seul, República da Coréia ‡ Departamento
de Engenharia Biomédica Maxilofacial, Faculdade de Odontologia, Universidade Kyung Hee, Seul, República da Coréia
§Departamento de Farmacologia Herbal, College of Oriental Medicine, Kyung Hee University, Seul, República da Coreia

Nós comparamos os efeitos terapêuticos e o mecanismo de células-tronco da polpa dentária humana transplantadas (hDPSCs) e
células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hBM-MSCs) em um modelo de acidente vascular cerebral em
rato e um modelo in vitro de isquemia. Os ratos foram injetados por via intravenosa com hDPSCs ou hBM-MSCs 24h após a
oclusão da artéria cerebral média (MCAo), e ambos os grupos apresentaram recuperação funcional melhorada e volume de
infarto reduzido versus ratos controle, mas o grupo hDPSC mostrou maior redução no volume de infarto do que o hBM-MSC
grupo. A área positiva para o marcador de células endoteliais foi maior nas áreas limítrofes da lesão no grupo hDPSC do que no
grupo hBM-MSC. A administração de hDPSCs a ratos com acidente vascular cerebral diminuiu significativamente a gliose reativa,
conforme evidenciado pela atenuação de GFAP induzido por MCAo+/ nestin+ e GFAP+/ Musashi-1+ células, em comparação com
hBM-MSCs. Os achados in vivo foram confirmados por dados in vitro ilustrando que hDPSCs mostraram efeitos neuroprotetores,
migratórios e angiogênicos in vitro superiores na privação de oxigênio-glicose (OGD) - astrócitos humanos lesados (hAs) versus
hBM-MSCs. Análises bioinformáticas comparativas abrangentes de hAs lesados com OGD in vitro tratados com hDPSC e hBM-
MSC foram examinados por tecnologia de sequenciamento de RNA. Na ontologia do gene e nas análises da via KEGG, as vias
significativas no grupo tratado com hDPSC foram o MAPK e o TGF-b vias de sinalização. Assim, hDPSCs podem ser uma melhor
fonte de terapia celular para acidente vascular cerebral isquêmico do que hBM-MSCs.

Palavras-Chave: Células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs); Golpe; Terapia

celular; Privação de oxigênio-glicose (OGD); Injeção intravenosa

INTRODUÇÃO As células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs) são

O AVC continua sendo a principal causa de morte e incapacidade
em todo o mundo, com apenas 3% da população de pacientes com
AVC isquêmico se beneficiando do ativador do plasminogênio
tecidual (TPA), droga trombolítica1. Uma vez estabelecido o dano
celular causado pelo derrame, pouco pode ser feito para restaurar as
condições de pré-ataque. Estudos recentes em animais e ensaios pré-
clínicos investigaram células derivadas de humanos de diferentes
origens, como células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), MSCs
derivadas de medula óssea humana (hBM-MSCs), células do sangue
do cordão umbilical humano (hUCBCs), tecido adiposo humano
derivadas de MSCs (hADSCs) e células-tronco neurais humanas
(hNSCs), como fontes potenciais para terapia celular para o
tratamento de acidente vascular cerebral2-4. No entanto, os métodos
usados para adquirir essas células-tronco são invasivos e dolorosos
para o doador.
células-tronco derivadas da crista neural que residem no nicho
perivascular da polpa dentária5. Os hDPSCs parecem ser uma
excelente fonte de células-tronco porque podem ser obtidos
sem efeitos adversos à saúde e podem ser obtidos de forma não
invasiva de dentes extraídos descartados como lixo médico,
evitando muitas questões éticas6. hDPSCs mostram maior
capacidade de autorrenovação, capacidade imunomoduladora e
proliferação in vitro do que hBM-MSCs, e podem se diferenciar
em músculo, cartilagem, osso e outros tipos de células in vitro e
in vivo5,7. Além disso, foi relatado que DPSCs têm potencial para
uso em terapia baseada em células para doenças sistêmicas,
como doenças neurológicas e cardíacas, e para melhorar a
doença isquêmica8-10. Estudos in vitro mostraram que hDPSCs
podem se diferenciar em neurônios funcionalmente ativos
sob

Recebido em 3 de dezembro de 2015; aceitação final em 29 de março de 2017. Data de pré-inscrição online: 20 de janeiro de 2017.
Endereço de correspondência para Eun-Cheol Kim, DDS, Ph.D., Professor, Departamento de Patologia Oral e Maxilofacial,
Centro de Pesquisa para Regeneração Dentária e Periodontal (MRC), Faculdade de Odontologia, Universidade Kyung Hee, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-
gu, Seul 130-701, República da Coréia. Tel: + 82-2-961-0383; Faxe: + 82-2-960-2324; E-mail: eckim@khu.ac.kr

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 1002
condições de cultura apropriadas11-13. Além disso, estudos in vivo
demonstraram que as células-tronco da polpa dentária porcina
promovem um alto grau de vascularização na isquemia do
membro posterior14, e essas células, quando transplantadas
para o cérebro do rato, promoveram a migração e a
diferenciação neurogênica e melhoraram a lesão cerebral
isquêmica após a oclusão da artéria cerebral média (MCAo)8.
Além disso, o transplante intracerebral de hDPSCs melhorou a
recuperação funcional pós-AVC em um modelo de roedor12. No
entanto, a injeção intracerebral é um procedimento invasivo que
envolve riscos raros, mas significativos, incluindo novos
derrames15, enquanto a injeção intravenosa (IV) é clinicamente
segura.
Até onde sabemos, nenhum estudo comparativo do
potencial terapêutico do transplante IV de hDPSCs e hBM-MSCs
em um modelo de AVC em ratos foi relatado. O objetivo deste
estudo foi investigar se hDPSCs administrados por IV migram
para a área limite da lesão, se diferenciam em células neuronais
e melhoram a recuperação funcional após acidente vascular
cerebral em ratos induzidos por MCAo, em comparação com
hBM-MSCs. Habilidades neuroprotetoras, migratórias e
angiogênicas de hDPSCs e hBM-MSCs foram avaliadas em
astrócitos humanos isquêmicos (hAs), um modelo in vitro de
acidente vascular cerebral. Além disso, o perfil transcricional de
sequenciamento de RNA (RNA-Seq) foi usado para obter
informações sobre o mecanismo molecular do modelo in vitro.
MATERIAIS E MÉTODOS
Cultura primária de hAs, hBM-MSCs e hDPSCs
Tecidos de polpa dentária humana (n= 10) foram obtidos dos
terceiros molares ou pré-molares, extraídos para tratamento
ortodôntico, de pacientes (quatro homens, seis mulheres, 14-22
anos de idade) no Departamento de Cirurgia Oral do Kyung Hee
Dental Hospital (Seul, República da Coréia) . O consentimento
informado foi obtido de cada paciente antes das extrações. O
comitê de ética da Kyung Hee University (Seul, República da
Coréia) aprovou o procedimento e o protocolo experimental. O
estudo está em conformidade com a declaração 2013WMAD de
Helsinque. hDPSCs foram isolados e cultivados conforme
descrito anteriormente5. Resumidamente, a polpa foi imersa em
uma solução digestiva [colagenase tipo I (3 mg / ml; Merck
Millipore, Darmstadt, Alemanha) mais dispase (4 mg / ml; Gibco;
Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Alemanha) em solução
salina tamponada com fosfato (PBS; Invitrogen; Thermo Fisher
Scientific) contendo 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de
estreptomicina (Gibco)] por 1 h a 37°C com agitação. Após
filtração, as células primárias foram cultivadas em meio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal
bovino (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e antibióticos.
CD34+/ c-kit+/ STRO-1+ A população hDPSC foi classificada a partir
das células primárias da polpa dentária cultivadas
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SONG ETAL.
por um método de classificação de células ativadas magneticamente,
conforme descrito anteriormente16,17. hDPSCs foram usados nas
passagens 3-5. Os hAs primários foram adquiridos da Gibco BRL
(Grand Island, NY, EUA) e cultivados em meio hA (Gibco)
suplementado com DMEM, N-2 e 10% de FBS a 37°C
em 5% CO2. Os hAs foram cultivados em vasos de cultura de tecidos
revestidos com Geltrex; a superexposição à luz foi evitada. tem
foram usados nas passagens 7–9. As culturas foram monitoradas
regularmente quanto à expressão do marcador de astrócitos da
proteína glial fibrilar ácida (GFAP) usando coloração por
imunofluorescência.
MSCs humanas de três doadores saudáveis diferentes (19–
24 anos, duas mulheres) foram isoladas do aspirado de medula
óssea obtido por Lonza (Lonza, Walkersville, MD, EUA). hBM-
MSCs foram cultivadas em meio basal de células-tronco
mesenquimais (MSCBM; Cambrex Bio Science, Verviers, Bélgica),
suplementado com suplemento de crescimento de células
mesenquimais (Cambrex Bio Science),eu-glutamina, (Gibco;
Thermo Fisher Scientific) e antibióticos (penicilina /
estreptomicina; Gibco; Thermo Fisher Scientific), em 37°C
em 5% CO2 atmosfera. Neste estudo, hBM-MSCs foram usados
antes de sua quinta passagem.
Modelo Animal MCAo e
Procedimento de Transplante Celular
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo
Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais (IACUC) da
Universidade Kyung Hee (Seul, República da Coréia). Ratos Sprague-
Dawley machos adultos pesando 250–300 g (Orient Bio Inc., Seul,
República da Coréia) foram usados. A isquemia cerebral focal
transitória foi induzida usando a oclusão do fio intraluminal da
artéria cerebral média esquerda (MCAo), conforme descrito
anteriormente18. Resumidamente, a isquemia cerebral focal
transitória foi induzida por oclusão do fio intraluminal do MCA por 2
h seguida de reperfusão. Durante a isquemia cerebral, a
temperatura retal foi mantida em 37±0,5°C usando um cobertor
aquecido controlado por termistor. 24 horas após a cirurgia, os ratos
foram avaliados quanto à flexão do membro anterior e rotação
contralateral para confirmar a presença de isquemia. Originalmente,
12 ratos foram usados simultaneamente, mas os ratos com um
padrão de comportamento normal após a cirurgia ou aqueles que
foram encontrados mortos foram excluídos. Assim, foram avaliados
nove ratos por grupo.
Três grupos experimentais foram usados: injeção de MCAo +
PBS [ratos injetados com PBS com o modelo MCAo (PI;
n= 9), injeção de MCAo + hDPSC (hDPSCs injetados em ratos
modelo MCAo (hDI; n= 9), e injeção de MCAo + hBM-MSC
(ratos modelo MCAo injetados com hBM-MSC (hMI;
n= 9)]. hDPSCs ou hBM-MSCs (4 ́ 106 células em 500 ml de
PBS) foram administrados por meio de injeção na veia da
cauda 24 h após MCAo. hDPSCs e hBM-MSCs foram colhidos
de três doadores. Todos os animais foram atribuídos
aleatoriamente a hDPSCs ou hBM-MSCs de cultura primária.
 EFEITOS DAS CÉLULAS-TRONCO DA PASTA DENTÁRIA HUMANA EM CURSO
Os grupos experimentais (PI, hDI e hMI) foram testados três
vezes diferentes.
Testes Comportamentais
O teste de pontuação de gravidade neurológica modificada
(mNSS) foi realizado em 1, 7, 14, 21 e 28 dias (n= 9 para cada
grupo) após MCAo por dois indivíduos cegos para os grupos
experimentais. O teste mNSS é um composto de testes motores,
sensoriais, reflexos e de equilíbrio2,19. A função neurológica foi
graduada em uma escala de 0 a 18 (pontuação normal = 0,
pontuação máxima de déficit = 18).
Avaliação Histológica
Os ratos foram sacrificados 28 dias após a MCAo.
Resumidamente, os animais foram anestesiados e perfundidos
através do coração com 100 ml de soro fisiológico frio (Sigma-
Aldrich), seguido de 100 ml de paraformaldeído 4% (PFA) em
tampão fosfato 0,1 M (Sigma-Aldrich). Os cérebros foram pós-
fixados no mesmo fixador por 24 horas, seguido por imersão
em sacarose a 30% (Sigma-Aldrich) por 24 horas e
seccionamento em um criostato (Leica CM 1900; Leica, Milton
Keynes, Reino Unido) em 30mm. Outros órgãos, como fígado e
rim, também foram coletados para exame histológico.
Para medir o volume do infarto, cinco seções de cérebros
em intervalos de 2 mm em 28 dias após MCAo (n= 5 por
grupo) foram coletados para coloração de Nissl. A análise foi
realizada usando o software ImageJ [National Institutes of
Health (NIH), Bethesda, MD, EUA]. Os volumes totais dos
hemisférios contralateral e ipsilateral e os volumes do
estriado e córtex em ambos os hemisférios foram medidos;
a área do infarto (não corada) foi calculada como mm3.
Avaliações imunohistoquímicas simples e duplas
Resumidamente, as seções foram incubadas com anticorpos
primários, como antígeno de matriz nuclear anti-humano
(hNuA; camundongo; 1:20; EMD Millipore, Temecula, CA, EUA),
antígeno nuclear neuronal (NeuN; coelho; 1: 100; EMD
Millipore ), GFAP (1: 1.000; coelho; EMD Millipore), fator de von
Willebrand (vWF; coelho; 1: 200; Sigma-Aldrich), nestina (coelho;
1: 200; EMD Millipore) e Musashi-1 (camundongo; 1:40; R&D
Systems, Minneapolis, MN, EUA). Anticorpos secundários
conjugados com flúor Alexa (1: 200; Molecular Probes, Eugene,
OR, EUA) foram usados para identificação de
imunorreatividade duplamente marcada. As lâminas foram
contrastadas com 4¢,Dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) e lamínula. Os anticorpos foram então detectados no
comprimento de onda apropriado usando microscopia confocal
(Cell Voyager CV1000; Yokogawa Electric Corporation, Tóquio,
Japão). Para os controles negativos, o anticorpo primário foi
omitido e as seções foram incubadas apenas em soro normal.
Análise do FvW+- área manchada, GFAP / Musashi-1+- área
manchada e GFAP / nestin+ células foi baseado na avaliação de
pelo menos cinco
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campos de visão selecionados aleatoriamente (ampliação da
objetiva: 200´) de uma média de cinco slides por grupo experimental
usando o software ImageJ (NIH). Para quantificar a sobrevivência do
enxerto, hNuA+ células no mesmo plano focal foram contadas para
pelo menos cinco campos de visão selecionados aleatoriamente
(ampliação da objetiva: 200 ') de uma média de cinco lâminas por
grupo experimental.
Co-cultura de hAs com hDPSCs ou hBM-MSCs
Astrócitos (4 ́ 104/ poço) foram cultivadas em placas de 24
poços. hDPSCs ou hBM-MSCs (104 células) foram co-cultivadas na
câmara superior das inserções de células Transwell [0,4-mm
tamanho de poro, membrana de poliéster transparente (PET);
BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA] das mesmas placas (uma
proporção de 1: 4 hDPSC / hBM-MSC-para-hAs).
Privação de oxigênio-glicose (OGD)
e reoxigenação
O insulto OGD seguido de reoxigenação é um modelo
estabelecido de isquemia in vitro, conforme descrito
anteriormente19,20. Para induzir OGD, o meio de cultura foi
substituído por DMEM livre de glicose e soro e
desoxigenado usando uma câmara anaeróbia (Bionex;
Vision Scientific, Gyeonggi-do, República da Coréia) com 1%
O2, 94% N2, e 5% CO2 atmosfera por 2 h. hDPSCs e
hBM-MSCs foram incubados com astrócitos por um
2 h adicionais sob condições de reoxigenação. A cultura
controle foi mantida em meio completo e colocada na
incubadora em condições normais.
Avaliação da Viabilidade Celular
A viabilidade celular foi avaliada com o ensaio de
brometo de 3- [4,5-dimetiltialzol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio
(MTT). MTT (0,5 mg / ml) foi adicionado às células
estimuladas durante 3 h. Após a remoção do meio e
adição de dimetilsulfóxido (DMSO), a absorbância a 570
nm foi medida usando um leitor de microplaca (Bio-Rad,
Mississauga, ON, Canadá).
Migração de hDPSCs ou hBM-MSCs para hAs isquêmicos
Astrócitos (4 ́ 104/ poço) foram cultivadas em placas de 24
poços e, em seguida, foram incubadas no estado OGD por 2 h.
Em seguida, hDPSCs ou hBM-MSCs marcados com éster
acetoximetílico de calceína 5 mM (calceína-AM; BD Falcon) (104
células) foram co-cultivadas na câmara superior de inserções de
células Transwell (3,0-mm tamanho de poro, membrana PET
transparente; BD Falcon) das mesmas placas (uma proporção de
1: 4 hDPSCs / hBM-MSCs-para-hAs) por 24 h. No final da co-
cultura, a inserção superior foi removida e, em seguida, as
células da camada inferior foram fixadas com PFA a 4%. As
células foram coradas com DAPI e calceína-AM migrada+ as
células foram investigadas por microscopia confocal a laser (Cell
Voyager CV1000).
 1004
Ensaio de angiogênese in vitro
A angiogênese foi determinada usando um kit de ensaio
de angiogênese in vitro (EMD Millipore) de acordo com o
protocolo do fabricante. hDPSCs e hBM-MSCs (4 ́ 105 células)
foram cultivadas em meio de células endoteliais sem soro
(ECM; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA). O
meio condicionado (CM) foi feito semeando hDPSCs ou hBM-
MSCs a uma densidade de
20.000 células / cm2 em 25 cm2 frascos de cultura de células.
As células foram deixadas aderir durante a noite, lavadas
duas vezes com PBS e incubadas com 5 ml de meio de
cultura padrão contendo 0,1% de FBS. Após 48 h de
incubação, o CM foi colhido e armazenado a -80°C.
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs; 1 ́
104 células / poço) foram semeadas em gel de ECM e foram
cultivadas com o CM descrito acima em 37°C sob a
5% CO2 atmosfera por 16 h. Em seguida, cinco campos aleatórios de
cada poço foram analisados para a formação de tubos sob um
microscópio de luz invertida (Olympus, Tóquio, Japão) com
aumento de 40´. O comprimento e o número de tubos por
campo foram medidos usando o software NIH ImageJ (ver.
1,29; http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Análise estatística
As análises estatísticas foram conduzidas usando GraphPad
Prism (ver. 6 para Windows; GraphPad Software, La Jolla, CA,
EUA). As diferenças entre os dois grupos em termos de
variáveis contínuas foram analisadas usando o Student's
t-teste, e para comparações múltiplas, a análise de variância
(ANOVA) unilateral foi usada com a correção de Bonferroni.
Valores dep<0,05 foram considerados para indicar
significância estatística.
Extração e sequenciamento de RNA
RNAs totais de hAs isquêmicos danificados com ou sem
tratamento com hDPSCs e hBM-MSCs foram preparados. A
integridade do RNA total extraído foi analisada com um
BioAnalyzer (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies,
Santa Clara, CA, EUA), e o protocolo Illumina padrão foi usado
para preparar bibliotecas para RNA-Seq. Usando eletroforese
em gel, fragmentos de cerca de 300 bp foram isolados e
amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) e
sequenciados em uma Illumina HiSeq 2000 no modo de
sequenciamento de extremidade pareada (leituras de 2´ 101 bp).
Análise de expressão gênica diferencial de sequenciamento de RNA
As leituras de sequenciamento brutas foram pré-processadas para
remover adaptadores de sequenciamento e, em seguida, as leituras foram
alinhadas com a sequência do genoma humano (hg19) usando o
Programa de Alinhamento de Nucleotídeos de Shortread Genômico
(GSNAP)21. Apenas pares de leitura mapeados de forma única e adequada
foram usados para análises posteriores. Para identificar genes expressos
diferencialmente, DESeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/ DESeq)
22 foi usado, e genes diferencialmente expressos
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SONG ETAL.
foram definidos como aqueles com alterações de pelo menos
1,5 vezes entre um par de amostras a uma taxa de descoberta
falsa (FDR) de 10%. A análise da classe funcional da proteína
para os genes regulados positivamente em hAs danificados
tratados com hDPSCs ou hBM-MSCs foi realizada usando as
ferramentas ProteinANalysis THrough Evolutionary
Relationships (PANTHER) (http://www.pantherdb.org/)23.
Termo de Ontologia Genética (GO) e Encyclopedia de
Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) Termo de
Enriquecimento de Testes
As análises de enriquecimento da via KEGG e do termo GO foram
conduzidas de forma semelhante à de um relatório anterior24. Resumidamente,
para testar o termo GO e o enriquecimento da via KEGG em um determinado
conjunto de genes regulados positivamente, a fração de
genes no conjunto de teste (Fteste) associado a cada categoria GO
foi calculado. Em seguida, criamos um controle aleatório
conjunto de genes que tinha o mesmo número de genes do conjunto
de teste. Nesse processo, um gene de controle aleatório foi
escolhido combinando o comprimento do gene de teste. A fração de
genes neste conjunto de controle escolhido aleatoriamente (Fao
) associado à categoria GO atual foi calculado. Esse
controle
processo de amostragem aleatória foi repetido 100.000 vezes para
calcular um empírico p valor. UMAp valor de corte (1 / número total
de termos GO considerados) foi aplicado para escolher termos GO
significativamente enriquecidos ou vias KEGG.
Métodos Computacionais
O resultado p os valores do DESeq foram corrigidos pelo
método de Benjamini e Hochberg68, conforme implementado
em “R.” Para análise GO, empíricap os valores foram estimados
com base em 100.000 simulações aleatórias, e o ponto de corte
de Bonferroni foi usado para determinar
p valores. Para conduzir o agrupamento hierárquico e gerar
mapas de calor para a via de sinalização da proteína quinase
ativada por mitogênio (MAPK) e do fator de crescimento
transformadorb (TGF-b) genes de sinalização, o pacote MeV (ver.
4.8.1) (http://www.tm4.org/mev.html) foi usado.
RESULTADOS
hDPSCs promoveu recuperação funcional e
redução do volume de enfarte
Para determinar se os hDPSCs ou hBM-MSCs
transplantados poderiam melhorar a função neurológica, o
mNSS foi usado. Os escores de gravidade neurológica no dia
1 não diferiram significativamente entre os três grupos. As
pontuações de mNSS nos grupos hDI e hMI nos dias 7, 14,
21 e 28 foram menores do que as do grupo de controle (p
<0,05), embora não tenha havido diferença significativa
entre os grupos hDI e hMI (fig. 1A).
O volume do infarto de isquemia-reperfusão foi calculado
nas seções coronais coradas de Nissl dos cérebros de ratos. O
MCAo resultou em infarto cortical e normalmente incluía a
maior parte do córtex sensório-motor parietal
 EFEITOS DA DE HUMANA 1005

Figura 1. Efeitos do transplante intravenoso (IV) de células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs) e células-tronco mesenquimais derivadas
da medula óssea humana (hBM-MSCs) na função neurológica e no volume do infarto após a oclusão da artéria cerebral média (MCAo).
(A) A recuperação funcional foi avaliada por um teste de escore de gravidade neurológica modificado (mNSS) nos dias 7, 14, 21 e 28. PI, isquemia com injeção
de PBS (n= 9); hDI, isquemia com injeção de hDPSC (n= 9); hMI, isquemia com injeção de hBM-MSC (n= 9). (B) Tamanho do enfarte de cérebros de ratos 28
dias após MCAo. As medições do volume do enfarte foram realizadas em cortes coronais corados com Nissl. (C) Seções cerebrais coradas com Nissl dos
grupos PI, hDI e hMI, respectivamente. Os dados são expressos como média±desvio padrão (DP). *p<0,05 comparado
para o grupo de controle (do aluno t-teste).

(Fig. 1C). O transplante de hDPSC e hBM-MSC reduziu
significativamente o volume de infarto, em comparação com o
grupo de PBS (hDI: 106,2±18,5 mm3, hMI: 136,1±13,8 mm3, PI:
187,9±6,1 mm3; p<0,05). O hDI (redução de 44%) também
mostrou uma diminuição significativa do volume do infarto em
relação ao hMI (redução de 28%) (Fig. 1B).
Os hDPSCs administrados por IV não foram
encontrados em órgãos sistêmicos
Para detectar qualquer reação adversa devido aos hDPSCs,
órgãos sistêmicos como o fígado e o rim foram examinados em cada
animal transplantado com hDPSC. A análise imunohistoquímica para
anticorpos de núcleos humanos (hNuA), um marcador específico
para núcleos celulares humanos, foi realizada para avaliar a
migração de hDPSCs injetados em órgãos sistêmicos. Sem hNuA+
células foram encontradas em órgãos sistêmicos, incluindo fígado e
rim - em animais hDI. Em contraste, algumas células positivas para
núcleos humanos foram encontradas no fígado e nos rins no grupo
HMI.
A imuno-histoquímica de dupla coloração foi realizada nas
regiões cerebrais do hemisfério isquêmico: núcleo isquêmico
(Fig. 2A) e zona limite (Fig. 2B). hDPSCs e hBM-MSCs,
identificados pelo marcador neuronal de imunorreatividade
hNuA, sobreviveram e foram distribuídos em áreas limítrofes de
lesão nos cérebros danificados de ratos receptores (Fig. 2B).
Conforme mostrado na Figura 2, alguns hNuA+ células (verde
para hNuA+, azul para identificação do núcleo da célula)
colocalizados com anticorpos para NeuN e GFAP (vermelho para
marcadores específicos de neurônios e astrócitos,
respectivamente) nos cérebros de ratos injetados com hDI e hMI.
Para determinar a eficácia relativa do transplante de
hDPSC e hBM-MSC na lesão isquêmica, as células
humanas duplas positivas para NeuN e GFAP ou hNuA+
foram contados no tecido cerebral a partir do total de células
injetadas (4 ́ 106) Conforme mostrado na Figura 2C, a análise
quantitativa demonstrou que o número de hNuA+ células no
grupo hDI foi significativamente maior do que no grupo hMI (p
<0,05) (Fig. 2C).

Os hDPSCs administrados por IV migraram para a área Angiogênese promovida por hDPSCs administrados por IV
limite da lesão no cérebro de rato isquêmico e se significativamente versus o grupo injetado por hBM-MSC
diferenciaram em astrócitos e neurônios em cérebro de rato isquêmico e astrogliose

Para determinar se hDPSCs ou hBM-MSCs injetados significativamente inibida

migraram e se diferenciaram em neurônios e astrócitos nos A angiogênese foi identificada por um marcador endotelial: o
cérebros de ratos transplantados com células-tronco, FvW+-área manchada (mm2) no cérebro de ratos.

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 1006 ETAL.

Figura 2. Coloração imunohistoquímica de cérebros de ratos para avaliar a migração de direcionamento e diferenciação neurogênica de hDPSCs
injetados (hDI) ou hBM-MSCs (hMI) 28 dias após MCAo. Diagrama esquemático representando as regiões das células transplantadas. hDPSCs e
hBM-MSCs foram investigados nas regiões do cérebro do hemisfério isquêmico: (A) núcleo isquêmico indicado por cinza escuro;
(B) zona limite indicada por cinza claro. Imagem representativa de dupla coloração do núcleo [4¢,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), azul], núcleo humano
(hNuA, verde), astrócitos [proteína glial fibrilar ácida (GFAP), vermelho] e neurônios (NeuN, vermelho). As janelas superiores direitas das imagens mostram
imagens de alta ampliação da área da seta. Setas grossas na janela superior direita indicam hNuA+/ NeuN+ e hNuA+/ GFAP+ células. Barras de escala: 100 µm
(imagens de seção coradas com hNuA / DAPI), 50 µm (imagens de seção coradas com hNuA / GFAP ou hNuA / NeuN). Essas imagens são representativas de
três experimentos independentes. (C) Quantificação de células-tronco humanas por imunorreatividade de anticorpos humanos no cérebro de ratos. Os
dados são expressos como média±SD. *p<0,05 em comparação com o grupo controle
(Do aluno t-teste).

A análise quantitativa demonstrou que a área de
coloração do FvW nos grupos hDI e hMI foi maior do que
no grupo PI (p<0,05). Além disso, a área de coloração do
FvW no grupo de hDI foi significativamente maior do
que no grupo de injeção de HMI (p<0,05) (Fig. 3).
Como o transplante de hDPSCs e hBM-MSCs
aumentou a neurogênese no córtex isquêmico de ratos
(Fig. 2), examinamos a seguir a imunocoloração para
GFAP e nestina, que são induzidas em astrócitos reativos
após lesão cerebral (Fig. 3). A imunohistoquímica de
dupla coloração de seções cerebrais revelou que GFAP+
e aninhado+ células estavam presentes nas áreas limítrofes
isquêmicas de ratos MCAo em 28 dias. A análise semiquantitativa
mostrou que o hDI e o hMI diminuíram significativamente o GFAP
induzido por MCAo+/ nestin+ células, em comparação com PI ( p<0,05)
(Fig. 3). Para explorar ainda mais os efeitos de hDI e hMI na
astrogliose, avaliamos a coloração de fluorescência dupla de GFAP e
Musashi-1, um marcador para astrócitos reativos (Fig. 4). hDI e hMI
suprimiram significativamente o GFAP+/ Musashi-1+-área manchada,
em comparação com PI (p<0,05). No entanto, os efeitos do hDI foram
semelhantes aos observados nos grupos tratados com hMI.

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 EFEITOS DE H 7

Figura 3. Coloração imunohistoquímica de cérebros de ratos para avaliar a angiogênese e astrogliose de hDI ou hMI 28 dias após MCAo. Imagem
representativa da coloração dupla do núcleo (DAPI, azul), fator de von Willebrand (vWF, vermelho), GFAP (verde) e nestina (vermelho). Barra de
escala: 50 µm. Células positivas e áreas no cérebro de ratos MCAo foram analisadas usando um analisador de imagem. As janelas superiores
direitas das imagens mostram imagens de alta ampliação da área da seta. A seta grossa na janela superior direita indica GFAP+/ nestin+ células.
vWF+ (A) e células duplamente marcadas (GFAP e nestina; B) foram contadas em três a cinco seções coronais por animal (n= 5). Os dados são
expressos como média±SD. *p<0,05 em comparação com o grupo de controle (Student's t-teste); #p<0,05 em comparação com cada grupo
(Do aluno t-teste).

Os hDPSCs reduziram a morte celular em hAs induzidos por
OGD, migrados para hAs isquêmicos e promovidos
Angiogênese In Vitro
Para examinar mais profundamente os efeitos de hDI ou hMI
em um modelo in vitro de acidente vascular cerebral, OGD e hAs
expostos à reperfusão foram pós-tratados com hDI ou hMI.
Como mostrado na Figura 5A, a exposição a OGD por 2 h e
reperfusão por 2 h induziu uma diminuição significativa na
viabilidade celular de hAs. No entanto, o pós-tratamento com
hDI ou hMI protegeu hAs contra lesão induzida por OGD.
Consistente com os achados in vivo, os efeitos neuroprotetores
do hDI foram significativamente superiores aos do hMI (p<0,05).
A migração de hDI e hMI marcados com calceína AM foi avaliada
em um sistema de cultura Transwell in vitro (Fig. 5C). hDI
mostrou mais migração celular do que o grupo hMI (Fig. 5B).
Para examinar se hDPSCs e hBM-MSCs induzem
angiogênese, foi realizado um ensaio de formação de tubo tipo
capilar in vitro em um modelo HUVEC. Conforme mostrado na
Figura 5D, CM de hDPSCs e hBM-MSCs aumentaram a formação
de tubos semelhantes a capilares em HUVECs, em comparação
com HUVECs incubados com meio de cultura de controle. O
número e o comprimento total de estruturas tubulares por poço
em CM de hDPSCs aumentaram significativamente em HUVECs
em relação aos tratados com CM de hBM-MSCs (p
<0,05) (Fig. 5E e F).
Genes diferencialmente regulados por hDPSCor
hBM-MSC-tratado com OGD-hAs danificado
Para compreender a regulação gênica diferencial,
comparamos os perfis de expressão gênica entre hAs
danificados por OGD tratados com hDPSCs e hBM-MSCs. Em
cada comparação, mais de 31.000 genes Ensembl (versão 75)
foram usados para os testes de expressão gênica diferencial.
Quando aplicamos uma diferença de mudança de prega de 1,5 e
um FDR de 10%, 196 e 121 genes foram expressos
diferencialmente entre o tratamento de hAs lesionados por OGD
com hDPSCs e hBM-MSCs, respectivamente (Fig. 6A). Com foco
em genes regulados positivamente nos grupos tratados, muitas
classes interessantes de proteínas foram detectadas com base
nas categorias de classes de proteínas PANTHER23 (Fig. 6B). As
frações das classes "receptor", "hidrolase" e "molécula de
sinalização" nos genes regulados positivamente no grupo
hDPSC eram maiores do que aquelas no grupo hBM-MSC. As
frações de proteínas estruturais e fatores de transcrição
mostraram tendência oposta.
Para investigar o significado funcional dos genes regulados
positivamente, realizamos enriquecimento funcional

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 1008 SONG ETAL.

Figura 4. Coloração imunohistoquímica de cérebros de ratos para avaliar astrogliose usando coloração GFAP / Musashi-1 de hDPSCs injetados (grupo hDI)
ou hBM-MSCs (grupo hMI) 28 dias após MCAo. Diagrama esquemático representando as regiões de células transplantadas amostradas para análises
quantitativas. O núcleo isquêmico é indicado por cinza escuro e a zona limite é indicada por cinza claro. Imagem representativa da coloração dupla do núcleo
(DAPI, azul), GFAP (verde) e Musashi-1 (vermelho). Barras de escala: 50 µm. Áreas com coloração positiva (GFAP+/ Musashi-1+ células) no cérebro de ratos
MCAo foram analisados usando um analisador de imagem. As áreas duplamente coradas de GFAP e Musashi-1 foram medidas em três a cinco seções
coronais por animal (n= 5). Os dados são expressos como média±SD. *p<0,05 em comparação com o controle
grupo (do aluno t-teste).

testes usando termos GO e vias KEGG. Conforme mostrado
na Figura 6C, muitos termos GO interessantes ou vias KEGG
em hDPSCs ou hBM-MSCs foram significativamente
enriquecidos: (1) processos celulares, como "regulação
positiva da proliferação celular", "regulação negativa de
processo apoptótico ”,“ regulação positiva da migração
celular ”,“ regulação positiva da angiogênese ”,“
regulação positiva da diferenciação celular ”e“ regulação
positiva da diferenciação celular ”; (2) vias de sinalização,
como "cascata ERK1 e ERK2", "quinase ativada por Janus

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 EFEITOS DA DEN HUMANA 1009

Figura 5. Efeito de hDPSCs e hBM-MSCs na viabilidade celular (A), migração (B, C) e angiogênese (D, E) na privação de oxigênio-glicose (OGD) -
astrócitos humanos lesados (hAs). (A) a viabilidade das células hA foi medida pelo ensaio de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)
-2,5difeniltetrazólio (MTT). Os dados são representativos de três experimentos independentes. Ctl., Controle. (B) Gráfico mostrando que hDPSCs
ou hBM-MSCs migraram para hAs isquêmicos no sistema Transwell. (C) Imagem representativa da migração de hDPSCs ou hBM-MSCs para hAs
isquêmicos. As células duplamente positivas de éster acetoximetílico de calceína (calceína AM) / DAPI indicam hDPSCs ou hBM-MSCs migrados.
(D) Formação capilar representativa com meio condicionado (CM) obtido a partir de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)
tratadas com hDPSC- e hBM-MSC. O gráfico mostra o comprimento total médio do tubo capilar (µm) (E) e o número de tubos por campo (F) em
três experimentos independentes. Os dados são expressos como média±SD (n= 5). *p<0,05 em comparação com o grupo de controle (Student's t
-teste); #p<0,05 em comparação com cada grupo (do aluno t-teste).

(JAK) - via de sinalização do transdutor de sinal e ativador
da transcrição (STAT) ”,“ atividade da proteína quinase
ativada por mitogênio (MAPK) ”e“ fator de crescimento
transformadorb (TGF-b) via de sinalização ”; e (3)
fenômenos OGD conhecidos, como "angiogênese" e
"resposta à hipóxia".
Tratamento de hDPSC e hBM-MSC na regulação de genes
afetados por hAs danificados por OGD nas vias de sinalização
de MAPK e TGF-β
Para pesquisar sistematicamente os dados do transcriptoma
para o subconjunto de genes com expressão diferencial> 1,5
vezes em hAs tratados com hDPSC- e hBM-MSC, a variação

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 1010

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Figura 6. Diferenças de perfil de expressão gênica em hAs lesados por OGD tratados com hDPSCs e hBM-MSCs. (A) Expressão diferencial de genes em hAs de controle com lesão de OGD e pós-
tratamento de hDPSCs (à esquerda) ou hBM-MSCs (à direita). HDPSCs cultivados primários e hBM-MSCs comerciais foram obtidos de 10 e 3 doadores separadamente. ox-eixo representa
o registro2 mudanças de dobra, e o y-eixo é o −log10-ajustado p valor. Genes regulados positivamente e regulados negativamente em cada tratamento são coloridos em vermelho e azul, respectivamente. (B) Classificação de
proteínas de genes regulados positivamente em hDPSCs e hBM-MSCs. Quatro setas vermelhas indicam as seguintes classes de proteínas: "receptor", "proteína estrutural", "hidrolase" e "sinalização
molécula ”, mostrando as diferenças na composição dos genes regulados positivamente entre os tratamentos. (C) Termo de ontologia genética (GO) e enriquecimento da via da Enciclopédia de Genes e Genomas
de Kyoto (KEGG) em genes regulados positivamente em hAs tratados com hDPSC e hBM-MSC. op valores de termos ou vias significativamente enriquecidos e o número de genes
no termo GO e as vias KEGG são mostradas como gráficos de barra (-log10 p valor) e gráficos de linha (número de genes nos termos enriquecidos específicos ou vias).
SONG ETAL.

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 EFEITOS DAS CÉLULAS-TRONCO DA PASTA DENTÁRIA HUMANA EM CURSO
O pacote de análise DESeq foi usado. Um diagrama de Venn
ilustrando a sobreposição é mostrado na Figura 7A. No
total, 66 genes comuns se sobrepuseram entre 104 e 39
genes regulados positivamente das hDPSCs e hBM-MSCs,
respectivamente (Fig. 7A). Quando verificamos os termos
GO enriquecidos ou vias KEGG nos 66 conjuntos de genes
regulados positivamente comuns, havia termos GO e vias
KEGG comuns significativos, como MAPK e TGF-b vias de
sinalização (Fig. 7B). A inativação da atividade de MAPK e da
via de sinalização de MAPK foram significativamente
induzidas em hDPSCs, versus hBM-MSCs (Fig. 7B).
Conforme mostrado na Figura 7C, uma análise qualitativa de
agrupamento e uma comparação da expressão diferencial de
MAPK e TGF- selecionadosb genes de vias foram realizados e
mapas de calor foram gerados. Para a via de sinalização MAPK,
interrupção do crescimento e dano ao DNA induzívelb (Os genes
GADD45B), fator de resposta sérica (SRF), fator 4 de neurotrofina
(NTF4) e proteína supressora de dano 1 (DSUP1) foram
comumente regulados positivamente em hDPSCs e hBM-MSCs.
No entanto, os genes das vias de sinalização MAPK, incluindo a
proteína-serina quinase MAPK3 (MAP2K3), fator de crescimento
de fibroblastos 5 (FGF5), fator de crescimento derivado de
plaquetas subunidade A (PDFGA), MYC, DUSP4, DUSP6, receptor
nuclear subfamília 4 grupo A membro 1 (NR4A1), fator de
crescimento de fibroblasto 18 (FGF18) e DUSP5, foram
marcadamente regulados positivamente com hDPSCs em
comparação com hBM-MSCs. Para o TGF-b
via de sinalização, inibina b Os genes A (INHBA),
trombospondina 1 (THBS1) e Sma e família relacionada a mad 7
(SMAD7) foram comumente regulados positivamente em
hDPSCs e hBM-MSCs. Além disso, TGF-b genes relacionados à
via, incluindo MYC e fator de diferenciação de crescimento 6
(GDF6), foram regulados positivamente com hDPSCs em
comparação com hBM-MSCs (Fig. 7C).
DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou que a administração IV de hDPSCs após
acidente vascular cerebral induzido por MCAo melhorou a função
neurocomportamental, semelhante à melhora observada com a
administração de hBM-MSC, e reduziu maior volume de infarto do
que o tratamento com hBM-MSCs em 28 dias após MCAo. O teste
mNSS é um composto de testes motores, sensoriais, reflexos e de
equilíbrio2,25. Foi relatado anteriormente que hNSCs promoveram
significativamente a recuperação do déficit funcional, mas não
reduziram significativamente a área de infarto, em comparação com
os controles26. Assim, o volume histológico do infarto não indicou
diretamente a recuperação funcional. Nossos resultados são
consistentes com um relatório anterior de que DPSC suíno (CD31-/
CD146- células de população lateral) promoveu a recuperação da
deficiência motora e reduziu o volume do infarto após MCAo em 3 e
21 dias em ratos, em comparação com um grupo injetado com PBS8.
Da mesma forma, o transplante de células-tronco de dentes
decíduos esfoliados humanos (SHED) em hipóxia-isquemia
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IP: 95.85.80.81 Em: Seg, 19 de junho de 2017 05:40:28
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1011
(HI) - cérebro de camundongo lesionado melhorou a função
neurológica em 8 dias após HI, em comparação com o grupo tratado
com PBS27. Além disso, o transplante intracerebral de hDPSCs 24 h
após MCAo em um modelo de rato melhorou a função sensório-
motora do membro anterior 21 e 28 dias após o acidente vascular
cerebral9. Embora não tenhamos usado MSCs de cultura primária,
hBM-MSCs comerciais usados no presente estudo são um modelo
experimental adequado para estudar a diferenciação em AVC
isquêmico in vitro e in vivo2,3. As diferenças entre hDPSCs cultivadas
primárias e hBM-MSCs comerciais em termos de proliferação,
expansão da cultura, condição da cultura e, especialmente, o meio
de cultura podem afetar o volume do infarto cerebral e o resultado
funcional em um modelo de acidente vascular cerebral em rato. Uma
investigação mais aprofundada sobre os mecanismos terapêuticos
de hBM-MSCs de cultura primária e hBM-MSCs comerciais ajudará a
tornar este tipo de terapia celular uma opção clínica.
Nossos dados indicaram que hDPSCs e hBM-MSCs injetados
por IV sobrevivem, migram ao longo de zonas limítrofes
adjacentes à lesão e se diferenciam em neurônios e astrócitos
no cérebro de ratos isquêmicos. Esses resultados são
consistentes com relatórios anteriores de que as células-tronco
enxertadas podem se diferenciar em neurônios e astrócitos no
microambiente do cérebro danificado em modelos de rato de
isquemia após injeção IV28,29. Além disso, hDPSCs enxertados
intracerebral migraram em direção à lesão de acidente vascular
cerebral e se diferenciaram em astrócitos ou neurônios9,27. No
presente estudo, alguns dos 4 ́ 10 originalmente injetados por
via IV6 As HDPSCs estavam presentes no cérebro 4 semanas
após a isquemia. Chen et al. estimou que após a administração
IV de sangue do cordão umbilical humano (hUCB) em ratos
MCAo, apenas 1% das células injetadas foram detectadas no
cérebro30. Esses resultados sugeriram que a maioria dos hDPSCs
não cruzou com sucesso a barreira hematoencefálica (BBB)
danificada pelo infarto. As interações diretas célula a célula
entre as células-tronco e o tecido cerebral local podem ser uma
necessidade para a restauração de tecidos e neurogênese
suficiente, conforme sugerido por estudos em que o transplante
intracerebral de MSCs na área de infarto induziu neuroproteção
e diferenciação de células-tronco endógenas31. No entanto, os
mecanismos de ação do tratamento exógeno de hDPSC em
vários experimentos in vivo foram atribuídos à secreção de uma
série de fatores resultando em efeitos parácrinos. Foi
demonstrado que hDPSCs produzem e secretam uma ampla
variedade de citocinas e fatores de crescimento, como fator de
crescimento do nervo (NGF), fator neurotrófico derivado do
cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado de células gliais
(GDNF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que
desempenham papéis importantes nos processos de
neurogênese e angiogênese após lesão cerebral e isquemia32,33.
Essas funções autócrinas e parácrinas de hDPSCs podem
melhorar o microambiente e torná-lo mais favorável para
hospedar células.
 1012

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Figura 7. Comparação da regulação do gene hA tratado com hDPSC e hBM-MSC. (A) Diagrama de Venn de genes regulados positivamente em hAs tratados com hDPSC e hBM-MSC. HDPSCs
cultivados primários e hBM-MSCs comerciais foram obtidos de 10 e 3 doadores separadamente. (B) Termo GO e enriquecimento da via KEGG de genes comumente (esquerda) e exclusivamente
(direita) regulados positivamente entre os grupos tratados com hDPSC- e hBM-MSC. As vias super-representadas e o número de genes nos termos GO e vias KEGG são mostrados como barras
plotagens (−log10 p valor) e gráficos de linha, semelhantes à Figura 6C. (C) Mapas de calor da proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) e fator de crescimento transformadorb (TGF-b) sinalização
caminhos. Os valores da expressão (log2 RPKM) de genes regulados positivamente em hDPSCs e hBM-MSCs foram calculados e usados para realizar agrupamento hierárquico e para geração de mapas de calor.
No lado direito do mapa de calor, os rótulos mostram os genes regulados positivamente em hDPSCs e hBM-MSCs e aqueles regulados exclusivamente em hDPSCs.
SONG ETAL.

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 EFEITOS DAS CÉLULAS-TRONCO DA PASTA DENTÁRIA HUMANA EM CURSO
O mecanismo preciso das células-tronco transplantadas em
modelos experimentais de isquemia cerebral permanece obscuro,
mas acredita-se que a angiogênese seja um importante fator
contribuinte25. As CTMs transplantadas podem estimular a
angiogênese, secretando várias citocinas angiogênicas34,35. No
presente estudo, um marcador de células endoteliais, vWF, mostrou
uma área positiva em hDPSCs que foi significativamente maior do
que com hBM-MSCs. Além disso, em nossos resultados, hDPSCs
mostraram maior capacidade migratória em um sistema de cultura
Transwell in vitro e maior potencial angiogênico in vitro do que hBM-
MSCs. Estes resultados in vivo e in vitro são consistentes com um
relatório anterior de que subfrações de hDPSCs (CD31-/ CD146-
Células SP e CD105+ células) demonstraram alto potencial
angiogênico e neurogênico em modelos de camundongo de
isquemia de membro posterior36. Além disso, hDPSCs promoveram
migração endotelial significativamente em Matrigel in vitro e ensaios
de migração e formação de vasos sanguíneos induzida em um
ensaio de membrana corioalantóide37. Estes resultados indicam o
maior potencial angiogênico in vivo e in vitro de hDPSCs versus hBM-
MSCs, o que poderia potencialmente promover angiogênese e
neurogênese no cérebro lesado após acidente vascular cerebral
isquêmico.
No presente estudo, não foi observada rejeição imunológica
aguda do hospedeiro, como grande infiltração de linfócitos,
direcionada às células transplantadas. Estudos anteriores relataram
que hDPSCs apresentam um nível elevado de atividades
imunossupressoras quando comparados com BM-MSCs. Huang et al.
mostraram que a implantação de DPSCs derivados de macacos
rhesus no hipocampo de camundongos não causou qualquer
rejeição imunológica38. Da mesma forma, as expressões mais
elevadas do complexo 1 de histocompatibilidade principal humano
(MHC-1), o que indica um grau mais forte de imunossupressão40,
foram vistos em fígados de camundongos, que foram incorporados
com hDPSCs39.
Insultos do sistema nervoso central (SNC), como isquemia e
doença neurodegenerativa, induzem astrogliose reativa,
caracterizada por aumento da expressão de GFAP e hipertrofia
41,42. GFAP e regulação positiva de nestina são universalmente
reconhecidos como marcadores de astrócitos reativos19. No
presente estudo, a injeção IV de hDPSCs diminuiu
significativamente a gliose reativa, conforme evidenciado pela
atenuação de GFAP induzida por isquemia cerebral+ e aninhado+
células em ratos, em comparação com os ratos isquêmicos
tratados com hBM-MSC. Estes resultados são semelhantes a um
estudo in vitro anterior com células estromais da medula óssea
de camundongo20. Musashi-1 é considerado um marcador
seletivo para células-tronco neurais / células progenitoras,
semelhante à nestina. Além disso, Musashi-1+ células na área
peri-infarto após isquemia cerebral são consideradas astrócitos
reativos, com base em sua coexpressão de GFAP e nestina e sua
morfologia43. No presente estudo, o GFAP+/ Musashi-1+A área
manchada foi suprimida significativamente por hDPSCs e hBM-
MSCs, sugerindo que a administração de hDPSCs e MSCs inibiu
significativamente a astrogliose.
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1013
Nossos achados in vivo foram confirmados por dados in vitro
que mostram que o tratamento com hDPSCs teve efeitos
neuroprotetores superiores contra a citotoxicidade induzida por
OGD em hAs em comparação com hBM-MSCs. Nossos
resultados são consistentes com relatórios anteriores de que
hDPSCs liberam moléculas neuroprotetoras e antiinflamatórias,
resultando na indução de resgate neuronal e sobrevivência12,44.
Esses resultados sugerem que a administração de hDPSCs
aumentou a migração para os hAs isquêmicos e aumentou a
angiogênese, promovendo efeitos neuroprotetores no cérebro
isquêmico.
O perfil de expressão do gene em todo o genoma por
RNA-Seq foi usado para investigar as respostas
moleculares a hDPSCs e hBM-MSCs nos hAs danificados
por OGD. No presente estudo, as anotações KEGG
mostraram que ERK1 e ERK2, JAK – STAT, MAPK e TGF-b
vias de sinalização eram abundantes em hDPSCs. A
maioria deles já foi relatada como estando envolvida na
astrogliose reativa42. Por exemplo, ERK45, p3846, e STAT347
vias de sinalização estavam envolvidas na formação da
cicatriz glial e astrócitos reativos. Além disso, o TGF-b via
de sinalização foi considerada essencial para a formação
de cicatriz fibrosa no SNC lesionado48,49.
p38 e ERK são ativados por FGF, fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) e NR4A1 em vários tipos de
células, incluindo células-tronco50–52. PDGF e FGF podem ser
regulados positivamente durante lesões cerebrais agudas e
induzir a migração de células progenitoras in vitro e in vivo44.
Um enxerto de DPSC desencadeou fatores neurotróficos
regulados positivamente, como VEGF, NGF e FGF, no hipocampo
de camundongos imunossuprimidos54. Além disso, a
administração de FGF18 no modelo de acidente vascular
cerebral induzido por MCAo em ratos reduziu os volumes de
infarto e os déficits comportamentais55. FGF5, um fator de
crescimento neurotrófico, induziu angiogênese terapêutica56.
NR4A1, também conhecido como Nur77 e NGFIB, é uma
subfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores
de transcrição e é um novo protetor para células neurais em um
modelo OGD in vitro para imitar dano isquêmico57. MAP2K3
fosforila e ativa p38 durante a diferenciação de NSC58. V-Myc
avian mielocitomatose oncogene homólogo do oncogene viral
(MYC) é um dos genes a jusante das vias MAPK e desempenha
um papel importante no controle da proliferação e
sobrevivência de muitos tipos de células59. A desfosforilação
específica de MAPKs em resíduos de treonina e tirosina é
mediada por uma subfamília de fosfatases de proteínas de
especificidade dupla dependentes de cisteína (DUSPs), também
conhecidas como fosfatases de MAPK (MKPs)60. DUSP1, DUSP2 e
DUSP4 exibem atividade de fosfatase para ERK1 e ERK2 e as
quinases ativadas por estresse, p38 e proteína quinase c-Jun N-
terminal (JNK)61. Em contraste, DUSP5 é um gene indutível por
fator de crescimento e, especificamente, interage com e inativa
as quinases ERK1 / 2 MAP em células de mamíferos.62. DUSP6 é
induzido pela sinalização de FGF e atua
 1014
como um regulador negativo da atividade ERK63. Nossos
resultados demonstraram que a expressão de fatores
neurotrópicos, como FGF5, FGF18 e PDGFA, bem como
MAPK a montante (MAP2K3 e DUSPs) ou genes da via a
jusante (MYC e NR4A1), foi significativamente maior nos
genes de resposta MAPK de hDPSCs do que aquele de hBM-
MSCs. Esses resultados sugerem que as hDPSCs secretam
fatores de crescimento como fatores neurotróficos através
da via da proteína quinase receptora, levando à fosforilação
de MAPK e, portanto, induzindo a ativação de fatores de
transcrição, como MYC e NR4A1.
O TGF-b via demonstrou ser importante na
diferenciação de MSC na linhagem neurogênica64.
Smad7 é um Smad inibitório que é induzido por TGF-b
e reprime TGF-b sinalizando por um loop de feedback
negativo65. Myc e TGF-b a sinalização é mutuamente
antagônica; ou seja, Myc suprime a ativação de TGF-
b-genes induzidos66. GDF6 (BMP13) é um membro do TGF-b
superfamília, e seu knockdown interrompe a diferenciação
neural67. Nossos resultados indicam que o TGF-b a via de
sinalização foi significativamente enriquecida nas análises do
termo GO e KEGG. Além disso, os níveis de expressão de GDF6
(TGF-b família da molécula de sinalização secretada) e MYC
(inibidor de feedback para TGF-b) foram significativamente
maiores no TGF-b genes de resposta de hDPSCs do que hBM-
MSCs. Estes resultados sugerem que os hDPSCs ativam o TGF-b
caminhos dentro de um ciclo de feedback negativo para limitar
a resposta da célula. Esta observação suporta ainda que Smad7
é um gene comum regulado positivamente em hDPSCs e hBM-
MSCs.
CONCLUSÃO
Em conclusão, este é o primeiro estudo relatado a
demonstrar que o transplante IV de hDPSCs confere
recuperação funcional semelhante e redução superior do
tamanho do infarto após MCAo em um modelo de rato, em
comparação com hBM-MSCs. O benefício terapêutico de hDPSCs
pode ser devido, em parte, à alta angiogênese e diferenciação
neurogênica, e redução da gliose reativa in vivo, e hDPSCs
protegidos que visam a migração de hAs danificados e potencial
angiogênico promovido de hDPSCs in vitro através de
mecanismos autócrinos / parácrinos. As análises do termo GO e
da via KEGG forneceram informações moleculares sobre os
mecanismos pelos quais os hDPSCs exercem seus efeitos em
um modelo de AVC in vitro. Assim, as hDPSCs podem fornecer
uma estratégia nova e eficaz para terapia baseada em células no
tratamento de doenças isquêmicas, como acidente vascular
cerebral.
AGRADECIMENTOS: Esta pesquisa foi apoiada pelo Basic
Science Research Program através da National Research
Foundation of Korea (NRF), financiado pelo Ministério da
Educação, Ciência e Tecnologia (2015054225,
NRF-2016R1A6A3A11931841 e 2012R1A5A2051384). Os
autores declaram não haver conflitos de interesse.
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SONG ETAL.
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