Espectroscopia de Massas – QO 423

Matéria da 2ª prova dissertativa

Aula I – Introdução á analisadores e Setor Magnético

Na segunda parte do curso vamos ver o seguinte: Uma vez que eu ionizei e joguei
isso pra dentro do espectrômetro de massas, o que eu faço com esse íon? Como eu vou
medir a razão M/Z dele? Que tipo de informação eu vou conseguir medir a partir disso?
Então eu vou partir pra que tipo de informação eu posso tirar desse espectro. Para todo e
qualquer analisador, a gente consegue definir algumas características:

Resolução: A capacidade de separar dois sinais quão próximos eles estejam;

Sensibilidade: Cada analisador tem a sensibilidade que é intrínseca a ele, e isso está
relacionado com a capacidade de discriminação. Enquanto tem analisadores que eu
consigo medir todos os íons de uma vez só, outros eu tenho que medir sempre um a um.
Quando eu meço íon por íon eu tenho um analisador discriminatório, caso contrário,
ele é não discriminatório. A outra coisa que a gente vai ver é que cada analisador tem
uma exatidão intrínseca, então alguns analisadores vão me dizer ‘’a massa da sua
molécula é 180’’, e outro vai dizer ‘’a massa é 180,1285 +- 0,0085’’ ok? E, por fim,
veremos a possibilidade de acoplamento: analisador, na verdade, pode estar acoplado
com mais de um, e portanto, não ser só um.

Agora, vou falar de resolução e exatidão que vai servir pra todos, e depois iremos
estudar analisador por analisador, ok? Então vamos lá, veja, assim como métodos de
ionização, analisadores tem uma pancada deles, e a gente não vai ver todos. Vamos ver
alguns que são mais fáceis de explicar... Quadrupolo não é simples, mas é importante
pra gente. Setor magnético, quadrupolo e com certeza TOF serão vistos nessa parte do
curso.

Beleza, resolução, aqui é exatamente a mesma coisa de quando a gente fala de

resolução cromatográfica, que é a capacidade de separar dois sinais, ok? Então como é
que eu defino a resolução? Ela normalmente tem uma sigla FWHM, que é a sigla em
inglês para a largura total a meia altura, ou seja, se eu tiver um sinal, esse sinal tem
uma largura à meia altura, e se eu quiser saber a resolução desse sinal, eu vou dividir a
massa por essa largura.

Então, esse sinal aqui tem uma resolução de 1626, ok? Analisadores são sempre de
duas classes: Ou meu analisador tem resolução unitária, ou seja, independente da massa
ele sempre vai separar a massa M da massa M+1 e a largura do sinal é sempre uma
unidade de massa carga; ou meu analisador é de alta resolução, e aí isso aqui vai variar
de acordo com a massa. Suponha que eu tenho um aparelho e fale pra vocês que ele tem
resolução 5000, então veja, se minha resolução é fixa, conforme eu aumento a massa
medida, eu aumento a largura do sinal, visto que a razão é fixa. Portanto, se eu tiver um
espectrômetro com um analisador com capacidade de resolução 5000, eu vou ter o
seguinte: Eu vou lá medir o espectro de uma molécula de massa 180, cujo padrão
isotópico é 180, 181, 182. Você vê que meu sinal é extremamente fino pra uma coisa
com resolução 500, certo? Se eu pegar essa largura e dividir por 180, eu terei 5000 de
resolução. Isso considerando o sinal de 180.

O que eu acontece se eu medir um sinal de uma massa 10 vezes maior? A largura do

meu sinal vai ser 10 vezes maior, de forma que a massa dividida pela largura será 5000.
Aí você olha pra mim e fala ‘’tá e daí’’? Não é tão fininho como aquele lá, mas eu ainda
consigo ver o M, M+1, M+2... Consigo ver a razão isotópica, consigo ver o íon M+1 e
etc. Até aí não tem problema. Mas se eu dobrar essa massa eu saio de 1800 e vou para
3600, e os sinais começam a se sobrepor. Logo, eu já não tenho mais uma separação
completa de sinais. Você ainda pode me falar que consegue ver o M+1, M+2... A
informação tá toda aí né? É... Mais ou menos, por que na vida real, o seu sinal de
interesse não é o mais intenso, e teremos ruído... Ou seja, o quão claro ou não é a
definição do seu sinal depende do ruído, e etc. Mas suponha que eu saia de 3600 para
medir uma coisa de 6000. Os sinais vão de sobrepor totalmente e eu não consigo separar
o meu padrão isotópico. Ou seja, existe um limite até onde o meu espectrômetro
consegue separar dois sinais chamado de resolução mínima, cuja fórmula está no slide.

Para outro exemplo, podemos considerar uma molécula de massa 1087. Tirando o
espectro com analisador com três resoluções diferentes, temos:
 Temos resolução 10000, 3000 e 1000. 10000 é o verdinho e o roxo, o de resolução
3000. Diminuindo três vezes a resolução do meu sinal, então ele fica três vezes mais
largo. Mas eu ainda estou vendo todo mundo aqui. Agora, se eu pegar 1087 e tirar o
espectro com um aparelho de resolução 1000, eu vou ver essa linha preta. Por quê? Por
que eu preciso de uma resolução de no mínimo 2000 (2x1000/1) - onde a separação
entre os sinais é igual a 1 pra eu conseguir separa-los. Então qual é a implicação disso?
Lembra que eu falei pra vocês que se eu jogar um gás e der no espectrômetro que a
massa dele é 28, de todos os gases possíveis, você sabe que aquele gás é nitrogênio, ou
eliteno, ou CO, ou é borano? Qualquer um deles tem massa 28, mas não exatamente 28.
Eles têm diferenças de massa. Mas pra eu conseguir ver a diferença entre eles, eu vou
ter que ter o seguinte: Pegando o CO, e o N2, que são os mais comuns, temos um de
massa igual a 27,9949 e o outro 28,0061. Veja, a diferença entre eles é bem pequena.
Qual tem que ser a resolução do meu aparelho pra eu conseguir separar dois sinais
desses aqui? A resolução tem que ser duas vezes a massa dividida pela distância. Ou
seja, 2x28/(1,0061-0,9949) isso aqui vai dar exatamente 5000. Medindo com um
analisador de 2000, por exemplo, temos vários problemas. Primeiro não saberemos se é
uma mistura, e suponha que eu tente tirar uma massa exata pegando o meio do pico que
não vai corresponder nem com o nitrogênio e nem ao CO. Pra eu medir a massa exata,
eu preciso ter alta resolução, preciso separar os picos.

A resolução é característica de cada instrumento, e em princípio, você sempre vai ter

aquela resolução (a não ser que alguém faça uma besteira naquele aparelho). Qual a
resolução dos aparelhos hoje em dia? Alguma coisa entre 1000, 40-50-60000. E aqueles
que chamamos de ultra alta resolução com cerca de 240000 de resolução, que você
consegue separar o íon de massa de 120000 do de 12001. A outra coisa que a gente vai
ter que saber é a exatidão de massa, que é uma estimativa do quão precisa é sua medida
de massa. Óbvio que isso é válido para instrumentos de alta exatidão e alta resolução.
Aqueles analisadores que são de massa nominal e resolução nominal, não vão conseguir
medir a massa com alta resolução, mas aqueles que conseguem tem um erro que é
definido como a massa medida menos a massa teórica, ou seja, a diferença da massa
normalizada pela massa teórica. Como esse número é muito pequeno, a gente
multiplica por 106 e obtém isso em ppm.

O sinal negativo significa que ele está errando para baixo. Ao contrário da resolução,
esse valor é por analise. Depende da calibração, do operador além de outras
características... Ou seja, quando você faz uma análise, o erro é característico daquela
análise. Quanto é o erro médio pros espectrômetros de alta resolução hoje? A maioria
deles está abaixo de 3 ppm... O erro médio de instrumentos mais antigos está um pouco
mais alto, em torno de 10 ppm. Então vamos lá, o que é um erro de 1 ppm? Erro de 1
ppm é você pegar uma coisa de massa 1000 e você vai errar na terceira casa. Um carro
pesa uma tonelada. O que é uma parte por milhão de uma tonelada? Um grama. Um
pacotinho de salzinho da cantina. Então você pega um carro e joga um salzinho lá
dentro.

Da mesma forma, eu posso até ter 5000 de resolução, mas veja, a exatidão não pode
ser maior que a distância entre os dois sinais. Pra eu conseguir medir dois íons muito
próximos, a largura dele tem que ser no máximo a distância entre os dois sinais. Se você
tem uma coisa de massa 10 e uma de massa 11, a medida da massa de 10 não pode ser
10 +/- 1, por que eu não vou conseguir diferenciar da de massa 11. Logo, a medida tem
que igual a pelo menos 10 +/- 0,09.

Agora vamos olhar os analisadores, começando pelo de setor magnético, que é o

mais clássico deles. É relativamente fácil de explicar e foi o primeiro a ser utilizado.
Mas hoje, raramente ele está em uso. O motivo é por que hoje temos muitos mais
analisadores que fazem a mesma coisa e são mais baratos. Mas tem duas aplicações
exclusivas do setor magnético e eu vou mostrar a principal delas. A outra é só
curiosidade, que é a análise de dioxina cujo método oficial é a analise por setor
magnético.

Então aqui temos um filamento, formando meu feixe do EI, a gente tem aqui a fonte
de EI. Podemos ver na figura que também temos aquelas lentes de aceleração. Então
assim que o íon sai do GC, ele é ionizado e acelerado. O íon tem uma carga e tá indo pra
frente. Se eu tenho um magneto, e isso aqui é um imã, o que acontece com uma carga
em um campo magnético? Ele faz uma curva (regra da mão direita). Então para um
determinado campo magnético especifico acontecerá o seguinte: O meu íon com uma
determinada massa/carga vai ir pra frente, onde eu tenho duas fendas. Se ele fizer a
curva com raio certinho, ele passa pela fenda e bate no detector. Íons de M/Z maior vão
fazer uma curva mais aberta, e os de M/Z menor, irão colidir mais abaixo. Mas em
principio, somente uma determinada M/Z passa pela fenda. Se eu sei o valor do meu
campo magnético, eu sei o tamanho do raio e eu sei qual M/Z vai bater no detector.
Simples né? Tão simples que esse foi o primeiro espectrômetro de massas inventado.
Vamos dar uma olhadinha na física disso.

Como eu já disse, o raio vai ser inversamente proporcional ao campo magnético.

Quanto maior o campo magnético, menor é o raio, vezes a raiz quadrada de duas vezes a
velocidade do íon a hora que ele sai da fonte, vezes a M/Z (fórmula no slide). Como
isso é uma fórmula de física, está como M/Q (que é mais correto que M/Z). Então o
seguinte, para um determinado equipamento, o meu raio é fixo e é dado pela fórmula do
slide.

O campo magnético é o que eu estou aplicando, então ele só depende da velocidade,

que, a princípio, é o quanto eu acelerei o meu íon. O problema todo é que os meus íons
na fonte são um plasma, e o plasma –para todos os efeitos aqui- é um gás. As
velocidades destes íons obedecerão então a distribuição de velocidades dada pela
distribuição de Maxwell-Boltzman. Dois íons de mesma M/Z, quando acelerados pelo
mesmo potencial, terão uma distribuição de velocidades. O problema é, como é que
meu íon é introduzido na fonte de EI, por exemplo? Na forma de um gás, então a hora
que ele sai, não tem ninguém indicando o caminho pra ele... As moléculas de gases
farão um caminho aleatório. E sua velocidade vai ser a velocidade de aceleração
dependente da componente da velocidade, que por sua vez depende do seu caminho.
Então três íons de mesma M/Z vão ter velocidades diferentes. Suponha que você tem
três íons: Um de M/Z 100, um de M/Z 101 e um de M/Z 99. Eu coloco um magneto
para que o íon de M/Z 100 faça a curva e vá para o detector. O de M/Z 100 vai fazer
essa curva. Agora o de M/Z 101, um pouquinho mais lento, também vai fazer aquela
curva. Ou o de 99 um pouquinho mais rápido, vai fazer a mesma curva. Como eu tenho
uma distribuição quem irá fazer trajetória com este determinado raio? O íon de M/Z
igual a 100 com aquela velocidade, o de 99 mais rápido, e de o 101 mais lerdo.

Então por causa da distribuição de velocidades, eu não consigo separar as

situações em que cada M/Z entra no detector. Para contornar esse problema, a gente
vai acoplar ao setor magnético, um setor elétrico, que vai aplicar um campo elétrico.
Quando eu faço isso, o raio da curva vai depender da carga e da energia cinética do
meu íon, para um íon de menor massa, isso corresponde à velocidade.

Então o setor elétrico vai filtrar meu íon, não pela M/Z, mas pela velocidade. Ou
seja, o que eu vou fazer aqui é: o meu setor elétrico vai só vai deixar passar íons com
determinada velocidade. Eu vou pegar a distribuição de velocidades e deixar uma janela
estreita numa velocidade. Quem tiver velocidade maior ou menor, vai bater e não vai
entrar. Daí eu acoplo o setor magnético, que vai filtrar por M/Z, sobrando o problema da
distribuição de velocidade. O setor elétrico, por sua vez, não vai deixar íons com
velocidades distintas da que eu quero passar. Logo, o 100 que tá passado pelo setor
magnético, tem a velocidade correta pra passar pela janela. O 101 com a velocidade um
pouco menor passa pelo setor magnético, mas como tem uma velocidade menor, ele
bate na janela. O 99 a mesma coisa, mas com velocidade menor. Então eu tenho um
filtro de energia cinética e um filtro de M/Z.

Setor magnético nasce junto com a espectrometria de massas. Thomson foi um cara
católico que determinou a carga do elétron. Só que Thomson era físico, então quando
ele descobriu isso, o resto da pesquisa dele foi em cima de estrutura atômica, partículas
e outras coisas. Ele tinha um aluno de doutorado, o Aston, que olhou tudo isso, e pensou
que seria muito útil na área de química, esse negócio do desvio, de medir a M/Z de
partículas e tal. Em 1919 ele construiu o primeiro espectrógrafo (espectrógrafo por que
ele usava uma chapa fotográfica para registrar o espectro) com focalização de
velocidade e poder de resolução de 130, que permitia separar o íon de massa 65 do de
massa 66. Essas são as fotos históricas dele:
 Ele ionizava as espécies e colocava essa chapa fotográfica registrando essas curvas,
como está na figura. Então aqui, por exemplo, temos o hidrogênio e podemos ver a
curva do hidrogênio e curva do H2. Como ele sabe o raio dessa curva, ele sabe a massa
do hidrogênio e da molécula de H2. E aí ele foi fazendo a mesma coisa para várias
espécies. Até ele tirar registrar a curva do Neônio. Fazendo o raio, batia com o neônio
20. Massa do neônio? Massa do neônio é 20. O problema é que tem essa manchinha que
correspondia a massa 22. E não existia nenhum elemento que tivesse massa 22. Quem é
o 22? É um isótopo do neônio. E, até então, não existia o conceito de isótopo. Todos os
pesquisadores tinham certeza que um elemento só tinha uma massa. Olha que
interessante, quando a gente ensina o conceito de átomo, molécula, a gente já fala de
isótopo. Mas até 100 anos atrás esse conceito era desconhecido. Foi Aston que
descobriu isso, que passou a vida descobrindo que outros elementos tinham isótopo. Ele
saiu tirando espectro de tudo quanto é elemento e foi descobrindo.

Em 1937 ele construiu um espectrômetro com resolução 2000 e aí, e em 1922 ele
ganhou o prêmio Nobel em química pela descoberta dos isótopos através do seu
espectrógrafo de massa. Aston saiu em uma caça e descobriu 212 dos 287 isótopos
conhecidos até hoje. Então assim, a primeira contribuição de espectroscopia de massas
veio com Thomson que descobriu a carga do elétron. Logo depois veio Aston que
descobriu os isótopos. Sua contribuição é quase tão grande quanto a de Thomson. Ele só
comete um erro, no discurso do Nobel ele fala o seguinte: O espectrógrafo de massas é
um instrumento fantástico pra descobrir a massa dos elementos. Mas agora que eu já
descobri todos, esse equipamento não tem mais utilidade nenhuma.

É com isso que a gente vai colocando os isótopos na história da química.

No começo dos anos 80, setor magnético era muito comum e suas características são
descritas abaixo:
 Pra que a gente usa setor magnético? Setor magnético é uma aplicação de nicho, tem
alguns casos específicos. Mas um dos casos mais interessante é o de exploração
espacial. Se você olhar qualquer planeta, qualquer coisa do sistema solar, o pessoal vai
falar ‘’Ah, olha, a atmosfera de Vênus é composta de 98% de CO2. ’’ A parte externa
você pode fazer espectroscopia, beleza, mas e lá embaixo? A gente pega uma sonda e
manda pra lá. No caso de Marte, a sonda Viking. Assim, a gente tem uma caixinha que
é o GC-MS. Os caras mandaram um GC-MS pra Marte! E aí eles foram lá e colocaram
ela ali e uma fonte de EI, setor elétrico, setor magnético e o detector. Na figura abaixo
temos o analisador que eles mandaram pra lá. Você consegue miniaturizar analisador de
setor magnético. É comum mandar esses analisadores pra tudo quanto é sonda para o
sistema solar.

E abaixo temos o espectro da atmosfera de Marte:

 Nele podemos ver 16, que é o metano, 20/22 é o neônio, que é calibrante, 40 é
argônio e 44 é N2... Em seguida temos outra sonda mandada para uma lua de saturno
(Titan):

Isso que tá escuro na foto é um lago de metano, junto com hidrogênio, metano,
benzeno... Essa é outra parte histórica interessante de setor magnético. Da uma olhada
nessa foto:

O que tem de estranho nessa foto? Mulheres! Essa foto é da década de 40 e se você
olhar só tem mulheres. Digamos assim que a sociedade não olhava isso com bons olhos.
Que lugar era esse? Era uma instalação militar secreta. Eles precisavam fazer uma
missão secreta e precisavam de muitos trabalhadores. Como você mantém uma coisa
secreta com muita gente? Aí o setor inteligente norte americano fez uma pesquisa e
descobriu que a melhor forma de manter a missão em segredo era contratando só
mulheres. As mulheres que vinham trabalhar aqui, vocês podem imaginar que elas eram
extremamente avançadas para época, certo? Era mais fácil instalar o patriotismo nessas
mulheres que na dona de casa comum. Outro motivo é que elas eram instruídas a ficar
na frente desse painel e, quando o ponteiro chegasse em determinado número elas
deveriam chamar uma pessoa, que iria fazer alguma coisinha, e elas retornavam a
atividade. E eles achavam que as mulheres se submeteriam a esse tipo de trabalho sem
fazer questionamentos, diferentemente dos homens. Essas mulheres queriam trabalhar.
O homem tinha trabalho em qualquer outro lugar.

Mas no que essas mulheres estavam trabalhando? Atrás daquele painel tinha UF6,
que é gasoso. Então tinha uma fonte de EI e aí o UF6 saía e encontrava um magneto,
fazendo uma curva. Tinha um copinho que coletava um isótopo do urânio e não o outro.
Isso era um espectrômetro de massa preparativo. Obviamente que o rendimento disso
era ridiculamente baixo, então tinha muitos espectrômetros de massa. A primeira bomba
de urânio foi feito com urânio enriquecido feito aqui.

Atualmente, a gente não usa mais setor magnético para tirar espectro. Uma das
aplicações deste analisador é que ele é o único que consegue fazer é uma análise de
razão isotópica.
 Olha só, a gente pega um material qualquer e carrega. A minha amostra passa por um
conjunto de fornos. Vamos considerar o carbono. Então todo material orgânico que eu
queimar aqui vou converter pra CO2. Depois o CO2 sai daqui e encontra uma câmara de
ionização. Em vez de eu fazer uma varredura, e cada hora eu detectar um isótopo, eu
vou deixar ele fixo e aí para cada massa, eu vou colocar um detector especifico. Então é
o seguinte, quais são as massas possíveis para a molécula de CO2? CO2 a massa é 44,
qual outra massa possível? 45, se eu tiver CO2 com carbono 13. Qual outra massa
possível? Eu posso ter carbono 14. Então é o seguinte, se eu pegar todo meu material
orgânico, queimar, vai virar tudo CO2, o CO2 vai vir aqui e vai fazer curvas diferentes, o
44, 45 e 46. E aí eu vou ter um detector para cada. Eu vou medir tudo simultaneamente
para eliminar qualquer tipo de erro. Todo hidrogênio que tiver eu vou queimar e
transformar em água que vai reduzir e virar H2, que pode ter massa 2, ou massa 3 (se
tiver deutério). Pra que eu quero medir isso? Carbono 13 não é 1,07% do carbono 12?
Mais ou menos. Aqui estão os elementos e sua a razão abundante:
 E pra que gás eu converto esses átomos do meu material naquele sistema?
Hidrogênio eu converto pra H2, carbono para CO2... Por que a quantidade de cada isótpo
não é constante depois de um determinado ponto. Isso varia. Existem vários processos
de fracionamento isotópico. Da uma olhada: Hidrogênio eu tenho evaporação,
condensação e precipitação. O que isso quer dizer? Eu tenho a água do rio, do mar ou
do lago. Água eu tenho H2O mas tenho também HDO. Isso significa que 0,15% da água
vai ter um deutério. Essa tem que subir, atingir a nuvem, e precipitar. Quem chega
primeiro na nuvem, H2O ou HDO? H2O por que é mais leve. Ou seja, a água da chuva
tem menos deutério que a água do rio ou a água do mar.

Então padrão isotópico serve pra isso, você consegue rastrear a origem dos
elementos. Outra aplicação é datação. Supondo que tem um cadáver que você quer
datar. Logo, você vai lá, queima, e vê a quantidade de carbono 14 em relação a
quantidade de carbono 12. Por que no nosso planeta, a gente tem N2. O sol emite um
monte de partículas que converte o nitrogênio 14 em carbono 14, constantemente. O que
eu preciso pra transformar o nitrogênio 14 em carbono 14? Eu preciso pegar um próton
e transformar em um neutron. Desta forma temos o seguinte: o sol tá sempre
bombardiando a terra e transformando nitrogênio 14 em carbono 14. Só que agora o
carbono é radioativo, certo? Esse carbono 14 vai ser adsorvido pelas plantas e vai virar
mato, a gente come. Enquanto eu to comendo, eu to ingerindo carbono 14, e portanto
quantidade de carbono 14 no meu corpo é constante. Quando eu morro, eu paro de
comer, e aí a quantidade de carbono 14 no meu corpo começa a decair radioativamente.
Sabendo a meia vida do carbono 14, eu sei quanto tempo passou da minha morte. Eu sei
a quantidade de carbono 14 em seres vivos ‘’normais’’, e só basta fazer a diferença da
razão carbono 14 com carbono 12 que eu sei quanto tempo se passou da morte.

Usando este método eu sei que a terra tem 4,5 bilhões de anos: Por que o cálcio 40
decai para argonio 40... Como é que eles fazem isso? Usando o setor magnético pra
razão isotópica. Denovo, eu tenho que usar o setor magnético, por que eu tenho que
medir isso simultâneamente, caso contrário, o meu erro é grande. Então o setor
magnético não é usado mais hoje pra quase nada. Mas a aplicação de razão isotópica é
usada. Tudo quanto é datação, pra sistema de dopping, ou qualquer coisa que você
queira rastrear.

Aula II – Quadrupolo: Princípios e Aplicações

Hoje a gente vai ver um outro analisador que é, de longe, o mais comum: o
quadrupolo. O quadrupolo é um arranjo constituido de quatro polos. E ele é o analisador
fisicamente mais simples que existe, mas que tem uma teoria por trás um pouco mais
complicada. Eu vou dar um visão qualitativa de como ele funciona.

Inicialmente eu pego quatro polos acoplando diagonalmente e vou aplicar uma

voltagem RF e DC. Antes, vamos lá. O que é uma voltagem DC? Ou uma corrente
AC? Remetem a corresnte alternada (AC) ou corrente contínua (DC). Ok. Onde é que
eu tenho uma corrente alternada? Na tomada. Qual a frequencia? 60 Hz. O que é uma
voltagem DC? A da bateria, da pilha, de uma corrente continua. E o que é uma
voltagem RF? RF vem de radio frequencia.

Pergunta: A onde da recepcão de radio, am/fm, ou a onda de recepção de bluetoooth

ou de wifi, é uma onda DC ou AC? Ela teria que ser AC, por que a outra é contínua, não
tem nem onda. A minha pergunta é a seguinte: RF é uma radiofrequência, também é
uma onda. Qual a diferença entre a onda de radiofrequencia e onda de corrente
alternada? Vamos lá, se eu tiver aqui um potencial elétrico, isso aqui é uma corrente
AC, a da tomada. Agora, temos o campo elétrico que tá variando. Se eu pegar dois
pólos, o que tá variando é o campo elétrico. O que é a luz? Uma radiação
eletromagnética. O que significa que uma radiação é elétromagnética? É um campo
elétrico e um campo magnético, oscilando, cujo o grau entre eles é 90. RF é qualquer
radiação que possui a componente elétrica e a magnética. A AC daqui só tem a
componente elétrica. Por isso é chamada de AC. Então eu vou pegar e aplicar uma RF e
uma DC. Eu vou pegar quatro polos, e vou manter essas proporções de diâmetro e
distância... Não vou entrar muito em detalhes. Mas ele vai ser algo assim:

Então eu tenho dois pares de barras que estão ligados, então o potencial é o mesmo.
E esses dois pares de barras também tem o mesmo potencial. Então em um par eu vou
aplicar uma DC acolpado a uma RF. Isso aqui é uma voltagem constante, então de um
lado, por exemplo, vai dar positivo, e de outro lado vai dar negativo. E em cima da DC
eu vou aplicar uma corrente oscilante, uma radiofrequência. Ok? A combinação desses
dois vai criar um campo oscilante aqui dentro. Este campo oscilante, eu vou colocar na
frente da minha fonte de ionização. A hora que meus íons entram aqui, eles começam a
oscilar, por que eu tenho agora um campo oscilante, beleza? Se eu ajustar certinho essa
voltagem RF, DC, eu vou ter a seguinte situação: Um íon de determinada M/Z vai
entrar, vai oscilar de forma estável, que vai sair e bater no meu detector. Nessa situação
que um íon M/Z vermelho passa reto, todas as outras massas maiores ou menores que
ela, vão oscilar de forma instável como é o verde, e vão colidir na barra. Então o
quadrupolo nada mais é do que um filtro de íons. Eu vou filtrar uma única M/Z, e se ela
passa, todas as outras são barradas.
 Esse aqui é um esquema da elétronica. Tenho os dois acolpados, eu tenho o DC, um
do lado negativo e um do lado positivo, e emcima disso eu vou ter um RF que eu vou
acoplar junto com a minha DC:
Bom, agora eu vou mostrar mais ou menos como seria a variação de voltagem no meu
quadrupolo.

Então, em um dos polos, por exemplo, os dois horizontais, eu vou aplicar um DC de

500V. Um vai tar com +500 e o outro com -500. Em cima desse 500, eu vou aplicar
uma voltagem RF, no caso 2800 V pico a pico. Então o seguinte, se é 2800 pico a pico,
significa que eu tenho 1400 pra cima e 1400 pra baixo, certo? 1400V mais 500V, temos
1900. E aí, 500 - 1400V, -900V.

Então imagina o seguinte, eu tenho uma DC de 500 e um RF de 1400, então sai 700
pra cada lado. O que significa que o par de barras da horizontal, por exemplo, passa a
maor parte do tempo positiva, e um curto espaço de tempo negativo, mas aí já volta pra
positiva. O outro par de barra é o contrário.

Então, vamos pegar o primeiro par de barras, e eu to chegando com meus íons
positivos. O meu primeiro bar de barras, ele fica na maior parte do tempo positivo. Se
isso aqui fica positivo, e está conectado com outra barra, e tem o mesmo potencial, os
íons vão tender a ficar aonde? No centro ou perto da barra? No centro. Se o campo
elétrico variasse linearmente, tanto faz, ta no meio, pra cima ou pra baixo, tanto faz. Por
que se eu me aproximo de um, eu me afasto de outro. Mas como varia inversamente
com o quadrado da distância, o meu campo é mais intenso próximo das barras e menos
intenso no meio. Então os íons irão tentar ficar no meio. Enquanto meus pares de barras
estiverem positivas, meus íons irão ficar no meio para minimizar a repulsão. Mas há um
curto momento de tempo que a barra ficar negativa. Suponha agora que eu tenha dois
íons, um de massa bem baixa e um de massa bem mais alta. Agora que eles estiverem
aqui dentro, e as barras ficarem negativas, os dois vão tender a se aproximar da barra.
Quem tem a menor massa consegue ser atraído. O de maior massa vai começar a se
oscilar. Então se eu vou chegar a bater na barra ou não, vai depender da minha massa.
Os íons de massa baixa batem na barra, os íons de massa alta, antes de bater na barra,
ela fica positiva denovo. E ele é jogado denovo para o centro. Então veja, um par de
barras, vai fazer com que íons de massa mais leve sejam eliminados e não tenham uma
trajetória estável.

A hora que eles entrarem no outro par de barras, que vai estar negativo, eles vão
tender a vir pra perto da barra. Só que em um curto espaço de tempo, ele vai ficar
positivo. Nesse curto espaço de tempo, quem tem uma massa muito pequena consegue
ser trazido de volta pro centro. O que tem a maior massa não consegue chegar no centro,
e antes de ele chegar no centro, ele fica negativo denovo, e aí ele vai oscilando e bate na
barra. Ou seja, o outro par de barras, ele filtra uma determinada M/Z para baixo, e o
outro de uma certa M/Z para cima. Então seguinte, como é que isso funciona na prática:

Suponha que eu tenho um quadrupolo, com o RF e o DC, e eu sintonize meu RF e

meu DC para passar um íon de M/Z igual a duzentos, e eu vou jogar nele um íon de
M/Z 200.
 O tempo de travessia do íon aqui é 64 micro segundos, ok? Então eu vou jogar um
íon de M/Z 200 em um quadrupolo que está especificado para passar um íon de M/Z
200. Quando eu faço isso, um íon que não é de massa 200 vai oscilando, se
aproximando da barra, mas vai para outro lado. A trajetória para um íon de M/Z e M/Z
maior pode ser visto aqui:

Enquanto que o de M/Z 200 vai passar pelo quadrupolo sem sofrer nenuma colisão
com as barras. Para um íon de M/Z 204, um pouquinho maior que 200, ele oscila sem
problemas na vertical, mas na horizontal, ele vai indo até que chega uma hora que ele
bate. Então íons de massa carga maior, serão barrados pelo meu par de barras da
horizontal. Ao contrário, íons de M/Z um pouco menor, ele descreve uma trajetória
estável na horizontal, mas aquela amplitude agora, é mais fácil de aumentar, por que ele
é mais leve, então ela aumenta tanto até que o íon bate na barra. Então um par de barra
vai barra de uma massa para baixo, e um bar de barra vai barrar de uma massa pra cima.
E eu vou ter uma única M/Z que vai adquirir uma trajetória estável. Então, como eu faço
para obter um espectro? Eu coloco uma janela de seleção, por exemplo, no M/Z igual a
100, e vejo se bateu no meu detector, que está no final do quadrupolo. Se não chegou
sinal, é por que não tem íon de M/Z igual a 100. Aí eu vou e ajusto minha voltagem
para M/Z igual a 101. Se bater algo no meu detector, significa que eu tenho um íon com
M/Z igual a 101, e assim por diante. Eu vou deslocando essa janela de estabilidade até
onde eu quero. E aí eu adquiro um espectro.

Veja, quadrupolo são estremamente simples: são quatro barras. Então ele é, de longe,
o analisador mais comum que a gente tem. O que eu quero chamar atenção aqui é o
seguinte: pra eu adquirir um espectro, eu vou ter um íon batendo no meu detector, e os
outros batendo nas barras, certo? E aí eu vou deslocando aquela janela. Ou seja,
justamente por ele ter um filtro, pra eu detectar um íon, eu discrimino ele do resto. Dito
de outra forma, enquanto eu detecto um íon que eu estou interessado, eu jogo todos os
outros fora. Esse tipo de análise, a gente chama de uma análise discriminatória.

Onde eu detecto um íon jogando os outros fora? O setor magnético, também. Havia
só uma M/Z que batia no detector. Quais são as caracteristicas de um quadrupolo? Ele é
extremamente simples, barato, mas ele tem aquilo que a gente chama de resolução
unitária. Ou seja, ele só consegue diferenciar íons que diferem de uma unidade de M/Z.
Ou seja, aqui, a janela vai de 100 a 101. Então ele separa o 100 do 101. O 101 do 102...
Mas eu não consigo separar, por exemplo, CO de N2. Por que um é 28,00 e o outro é
27,99. E eles faz uma varredura discriminatória. O fato de meu quadrupolo ter resolução
unitária, significa que a largura do meu sinal vai ser de uma unidade M/Z.

Agora eu quero falar um pouco sobre varredura discriminatória. Suponha que eu

tenha um espectro hipotético com íon de massa 101 até 110, ou seja, tenha 10 íons. E
todos eles tem a mesma intensidade. Isso é o que minha fonte de ionização está
produzindo. A minha fonta está produzindo 10 íons com a mesma intensidade. Se eu
quiser adquirir um espectro aqui, eu vou ter que colocar meu quadrupolo na M/Z 101, e
ver se chegou o íon com essa M/Z no detector. Mas veja, suponha que a intensidade seja
um. A minha fonte está produzindo 10 íons de intensidade 1, ao todo ela tá produzindo
10 íons. Mas a hora que eu selecionar o meu quadrupolo nessa massa, eu to detectando
essa massa e jogando as outras 9 fora. Ou seja, dos 10 íons que minha fonte está
produzindo, eu to detectando 1 deles, e jogando o resto fora. Se eu estou fazendo uma
varredura de 10 unidades M/Z, eu vou detectar um e jogar o resto fora. Qual o meu
rendimento? 10%. Mas na vida real, você não quer adquirir um espectro só das massas
101 á 110. Você vai querer adquirir um espectro de massa o á 200, por exemplo. Então
eu tenho 200 M/Z. A hora que eu colocar um quadrupolo na posição 1, eu to detectando
o íon de M/Z 1 e jogando os outros 199 fora. Meu aproveitamento, meu rendimento, é
de 0,05%. E se eu varrer de 0 a 1000, eu vou detectar um e jogar 999 fora.
Então, em um quadrupolo, o aproveitamento vai ser igual a 1/(faixa de M/Z medida).
Como podemos ver, o aproveitamento é baixo.

Análise Sequencial – Experimentos MS/MS

Uma vez que a gente entendeu o quadrupolo, eu vou introduzir um conceito que
existe para qualquer analisador, inclusive para o setor magnético. Que é o conceito de
espectrometria de massas sequencial. Tem instrumentos que tem mais de um analisador.
Eu posso ter dois analisadores, fazer combinação entre eles, e etc. Essa combinação de
analisadores me da origem do que eu chamo de experimento de espectroscopia de
massas sequencial. O que é isso? É o emprego de mais de um estágio de análise de
razão M/Z. Para todos os efeitos, estágio é um analisador. Então toda vez que eu uso
mais de um analisador, pra fazer um experimento, eu tenho um experimento de
espectrocospia de massas sequencial. E o uso de dois analisadores me da um conjunto
de experimentos possiveis pra fazer. E como é que eu designo isso? Se eu usar dois
analisadores, eu tenho experimentos do tipo MS/MS. Aqui a gente vai se limitar a dois
estágios. Qualquer instrumento que tenha dois analisadores, eu consigo fazer um
experimento de espectroscopia de massas sequencial, ou um experimento MS/MS. Mas
isso são vários experimentos juntos. Então é o seguinte: que experimentos eu consigo
fazer? Se eu tiver apenas um analisador, existem dois tipos de experimentos que eu
posso fazer. Um experimento que eu posso fazer é o experimento de varredura. Eu vou
varrendo os potenciais RF e DC de forma que cada hora um passe, e eu adquiro um
espectro.

Suponha que eu tenha uma substância de massa 200, e eu queira quantificar essa
substância. Eu não preciso ficar obtendo espectro de M/Z 400, 500, se a substância que
eu vou quantificar tem massa 200. Eu só vou ficar gastando tempo varrendo outras
massas.Então eu deixo o 200 fixo e só ela passa. As outras massas, vão bater no
quadrupolo. Esse modo aqui eu chamo de monitoramento seletivo de íons. Por que uma
hora eu vou monitorar uma única M/Z. Isso aqui tem uma abreviatura em inglês que é
SIM. Quantos por cento dos íons de M/Z 200 formados na fonte de EI chegam no
detector? 100%. Por que meu aproveitamento é 1/(faixa de massa) e qual a minha faixa
de massa? 200. É um único M/Z. Então 100% dos meus íons 200 vão chegar no
detector. Agora suponha que eu vou fazer uma varredura de 1 a 200 para adquirir meu
espectro. Meu aproveitamento aqui vai ser de 0,05%. Ou seja, no primeiro caso, o meu
sinal vai ser 200 vezes mais intenso que no segundo. Então veja, o fato do quadrupolo
ser um analisador discriminatório, se eu quiser fazer uma varredura, não é muito bom.
Eu vou jogar muito íon fora. Mas se eu estou querendo monitorar um único íon, ele me
dá 100% de aproveitamento. Todos os meus íons produzidos na fonte irão bater no meu
detector. Ao mesmo tempo que ele é ruim para varreduras, ele é excelente para fazer
monitoramentos.

Para o quadrupolo, eu tenho dois modos de operação: Como eu to usando um único

analisador, tanto para a varredura quanto para o SIM, eu chamo o experimento de MS.
Agora suponha que eu tenha dois analisadores, dois quadrupolos. Cada um tem dois
formas de operações. Se eu fizer as combinação, eu tenho quatro tipos de experimentos
distintos: um que eu vou selecionar e selecionar, o outro que eu vou selecionar e varrer,
o outro que eu vou varrer e selecionar e por fim o que eu vou varrer e varrer. Dois
analisadores, com dois modos de operação cada um. Todos esses experimentos são
experimentos de MS/MS, por que eu to usando dois analisadores.

O mesmo instrumento com dois quadrupolos serve para fazer um experimento

intrinsicamente quantitativo e também um experimento intrinsicamente de análise
estrutural. Antes de tudo eu preciso introduzir uma coisa: Lembra quando eu apresentei
eletrospray pra vocês? E eu disse que nem sempre eu tenho o meu íon molecular. Isso é
complicado do ponto de viesta estrurual, por que eu não sei a massa da minha molecula.
E eu disse que quem resolve esse problema é o eletrospray, por que eu sempre vejo a
minha molécula protonada ou desprotonada. Mas com o eletrospray o problema é que
não da pra fazer nenhuma análise estrutural, por que eu não tenho fragmentação.
Para resolver isso, eu vou pegar uma câmara, pode ser um quadrupolo em uma caixa, e
vou colocar gás inerte. E o meu íon que está vindo, eu vou acelerar com esse gás. A
hora que ele estiver atravessando, ele começa a colidir com as moléculas de gás, e
começa a ganhar energia interna, até que essa energia interna é maior que a energia de
ligação da ligação mais fraca, e essa ligação se rompe. O íon se fragmenta. No EI a
molécula se fragmenta por que na ionização eu dou energia pra ela. No eletrospray, a
ionização não leva o meu íon a ter energia interna, então eu vou fazer ele ganhar energia
interna colidindo com um gás. Ele colide e no meio ele fragmenta. Esse experimento
tem o nome de Dissociação Induzida por Colisão:

Se eu tiver um íon que não fragmente, eu faço esse experimento. Fatores que afetam
a fragmentação: Espécie gasosa que está relacionada com a massa. Quanto maior a
massa, maior a chance de fragmentar. A pressão, por que quanto maior a pressão, maior
o número de coliões. E isso depende também da energia de colisão, ou seja, da
velocidade com a qual meu íon entra na câmara. Como eu tenho agora vários fatores
que afetam afragmentação, a minha fragmentação não é tão reprodutível quanto é EI.

É reprodutível, mas não tanto quanto EI. Eu tenho vários fatores que afetam a
aparência do meu espectro. Ou seja, eu não tenho uma biblioteca de espectros de CID.
Então o meu instrumento que tem dois analisadores é sempre assim: Eu tenho um
analisador, uma câmara de colisão, e um outro analisador. Sempre vai ser assim, quando
eu tiver dois analisadores, entre eles eu vou ter uma câmara de colisão. Tipicamente,
esse aparelho é assim:
 Eu tenho a minha fonte de ionização, o meu quadrupolo 1, o quadrupolo 2 que é
minha câmara de colisões que não vai fazer nenhuma varredura, o terceiro quadruplo,
que é um analisador igualzinho ao 1.

Suponha que eu peguei um amostra e injetei, por exemplo, no eletrospray. Eu peguei

uma amostra e achei lá 3 íons, 200; 400; 600. Como isso aqui é ESI, significa que eu
tenho 3 substâncias aqui dentro, certo? Se for ESI(+), uma de massa 199, uma de massa
299 e uma de massa 599, que com o próton virou 200; 400; 600. Aí eu penso ‘’poxa,
minha amostra tem três substâncias. Era pra ter apenas a de massa 200, o que significa
que eu tenho dois contaminantes.’’ Aí eu quero saber que contaminante é esse.

Eu tenho que ter informação estrutural, então tenho que fragmentar ele, certo? Então,
nesse exemplo que eu tenho a fonte, os dois quadrupolos e a fonte de ionização, se eu
pegar essa amostra e injetar, eu vou ter os três íons. Se eu fragmentar todo mundo, não
adianta. Por que eu não sei quem é fragmento de quem. Mas, se eu estou interessado no
íon de M/Z 400, eu posso pegar o meu primeiro quadrupolo e deixar ele fixo em M/Z
400.E aí ele vai filtrar o meu íon. O 200 e o 600 vão bater na barra. Ou seja, depois do
meu primeiro quadrupolo, o meu 400 está puro. Então eu posso colocar um gás na
minha câmara de colisão e com a diferença de potencial do meu quadrupolo, eu posso
acelerar esse íon pra colidir com o gás. Quando isso acontece, ele fragmenta, eu pego
esse último quadrupolo e meço a massa desses fragmentos.

Fragmentos apenas do íon de M/Z 400! Reparem, eu to usando dois analisadores pra
saber quem são os fragmentos desse íon. Eu to usando o primeiro pra selecionar o meu
íon e o segundo pra medir a massa dos fragmentos desse íon. Dois analisadores MS/MS.
Onde um tá fixo, e o outro tá varrendo. Esse tipo de experimento é o tipo de
experimento MS/MS do tipo varredura de íons produtos. Nome óbvio né? Eu to fazendo
uma varredura dos íons produtos da minha colisão.
 Como isso acontece na vida real. Tem lá um pesquisador que isolou uma substância
que ele viu lá que tem uma atividade biológica que ele tava procurando, etc etc, então o
que ele fez, fez uma purificação, injetou no cromatógrafo e quando o composto saiu da
coluna, ele coletou o composto purificado. A pessoa já sabia que tratava-se de um
peptídeo. Então ela ligou no laboratório e disse que precisava sequenciar esse peptídeo.
Então a gente dissolveu esse peptídeo, e fez ESI. Esse é o espectro de MS, daquele
composto que tá ‘’purinho’’:

Só que se isso é um espectro de ESI, cada pico é um composto. Tudo isso aí é

contaminante. Então tudo isso tava em um pico do cromatógrafo. Isso é sujeira de
solvente, de manipulação... Mas o composto que a pessoa queria, realmente estava ali...
Indicado pela seta vermelha. Para analisar isso, eu pego o meu primeiro quadrupolo e
seleciono só essa massa, e mato todo mundo pra cima e todo mundo pra baixo.

Assim, eu obtenho o espectro de baixo. Então eu coloco o gás na câmara, ele vai se
fragmentar, e eu vou usar o último analisador pra medir a massa deles, que é o terceiro
espectro. Todos os íons dele, são fragmentos do 544.Temos que ressaltar que o espaço
entre os sinais é de 0,5, logo a carga do íon é igual a dois e a sua massa é de 1088. Por
isso temos fragmentos de massa maior que 540. Como isso é um espectro de uma
proteína, cada fragmento me dá um aminoácido. Então se eu medir a diferença de massa
entre dois sinais, eu tenho a massa de um aminoácido. Em ESI eu consigo tirar um
espectro de uma mistura e depois fragmentar cada um dos componentes.
O mais interessante é que isso é uma composto de 1088, se eu pegassa um composto
dessa massa e jogar no EI ele iria de despedaçar.

Uma das vantagens do CID é que eu quebrar minha molécula sempre nos blocos
construtores dela. Podemos usar isso dessa forma: Temos esse espectro de um lipídio
ionizado no modo negtivo, que eu vejo a molécula inteira, mas não vejo nenhum
fragmento. Então eu faço uma varredura de íons produtos do íon 1001, seleciono ele e
fragmento:

8 fragmentos em uma molécula de massa 1000. O que é um lípido? Lipídio é um

ester de ácido graxo e glicerol, como podemos ver no espectro, por CID fragmentamos a
molécula em seus blocos construtores, ou seja, em ácido graxo e glicerol. Eu to
fragmentando um éster e vou separar em ácido graxo e em glicerol.
Aqui temos ilustrado o efeito da energia de colisão, que é a energia com a qual meu
íoon entra na camara de colisão antes de fragmentar.
 Se eu utilizar a aceleração de 5eV (entre meu primeiro quadrupolo e a câmara de
colisão tem uma diferença de energia de 5eV), ele fica praticamente intacto e eu só vejo
um pouco de fragmento. Se eu passar ele pra 7eV, ele já consome mais e eu vejo sinais
mais intensos e mais fragmentação. Aumentando pra 9, temos mais fragmentos, a
molécula já quase não sobrevive mais e se eu passar pra 11, a maioria já virou
fragmento, e se eu continuar aumentando, a maioria some.

O ponto a salientar aqui são dois: esse experimento de varredura de íons produtos, que é
um experimento do tipo MS/MS, extremamente útil pra fazer análise estrutural de
compostos. Por que eu consigo fragmentar um único composto mesmo na presença de
outros, simplesmente mudando a massa que meu primeiro quadrupolo está filtrando. E
dois, a fragmentação por dissociação induzida por colisão é um pouco mais branda, o
que torna o espectro de CID muito mais fácil de interpretar. A única coisa que eu não
tenho aqui é pesquisa em biblioteca de espectro. Tem, mas não é tão específica. Da pra
saber quais lípidos fragmentam de determinada maneira.
Aula 3 – Monitoramento seletivo de íons (SIM) e Monitoramento seletivo de
reação (SRM).

Aula passada eu falei pra vocês que toda vez que a gente usa dois analisadores, eu
tenho um experimento do tipo MS/MS. Cada analisador em principio pode funcionar
de dois modos: varredura ou selecionando. Sendo assim, temos dois analisadores e dois
modos tendo portanto, quatro modos. Eu também falei sobre o experimento MS/MS de
varredura de íons produtos, que pode ser usado para sequenciar proteínas, ver a
estrutura de um carboidrato, entre outras coisas. Hoje, vamos falar de um outro modo: O
monitoramento seletivo de reações usado para análise quantitativa.

Como eu já mostrei pra vocês, espectroscopia de massas é bastante sensível e

versátil, por que na prática eu consigo analisar quase tudo, além de ser bastante robusto
e rápido. Pra eu fazer uma análise quantitativa, eu geralmente faço isso através de
monitoramento. Eu vou fazer aqui uma analogia com UV-VIS. Como eu opero um
espectofotômetro? Eu vou medir a absorbância em função do meu comprimento de onda
e obter um espectro de absorção. Mas quando eu to no laboratório de analítica, e eu vou
fazer uma determinação por espectofotometria, eu obtenho um espectro? Não. Eu pego
o máximo da absorção e monitoro a absorbância para um único comprimento de onda.
Se eu só quiser quantitificar, eu não preciso obter o espectro. Eu sei que a absorbância é
proporcional a quantidade de produto que eu tenho. Assim, eu posso fazer a medida em
um único comprimento de onda.

É exatamente o mesmo método aqui. Se eu quero quantificar, eu já sei a estrutura da

minha molécula. Logo, para fazer uma análise quantitativa, eu vou fazer um
monitoramento. E isso eu faço via quadrupolo. Como eu poderia fazer meu
monitoramento? Teremos a fonte e ESI e na frente eu tenho um HPLC, que é minha
coluna. Quando os íons saem da coluna eles entram no ESI. Mais a frente eu tenho a
câmara de colisão de gás e o quadrupolo desligado. Suponha que eu tenha um composto
de massa 100. Eu deixo o primeiro quadrupolo fixo na massa 100:
 Então os íons vem pra cá e eu seleciono a massa 100. É a mesma coisa que o caso do
UV-VIS onde eu seleciono um comprimento de onda e meço a absorbância. Eu
seleciono a massa, que é massa do meu composto, e meço a intensidade dele no
detector. Em principio isso funcionaria para eu fazer uma análise. Vou ilustrar como
isso funciona, pegando um analito um pouquinho mais complexo:

Esse composto é um produto natural que tem vários nomes, um dele é FK-506. Ele é
um imunosupressor, ou seja, um composto que joga seu sistema imune pra baixo. Eu
quero fazer isso, por exemplo, em um caso de transplante de órgãos. Logo, você pega
esse composto e analisa-o no plasma.
 Qual o método oficial para a gente analisar isso por cromatogria usando um detector
de UV-VIS? O problema de um detector UV-VIS é que se eu tiver um comprimento de
onda de 280, existem 470 bilhões de substâncias que absorvem em 280. Nos
comprimentos de onda baixos no UV-VIS, qualquer composto absorve. Assim, para
analisar esse composto é necessário eliminar vários interferentes.

O plasma é a coisa mais suja que você pode encontrar do ponto de vista analítico.
Tirando o petróleo, analiticamente falando, é o compostoque possui mais interferentes.
Por exemplo: só de proteínas, você têm 4000 tipos diferentes. Todos os lipidios que
existem no seu corpo, todas vitaminas, sais, aminoácidos, bases e entre outros
compostos. Dessa forma, para analisar o imunosupressor, você tem que tirar um monte
de interferente. Isso pode ser realizado da seguinte maneira:

A análise é feita em duas colunas de 25 centímetos com 30 minutos de corrida. E

então é obtido um cromatograma desse:
 Onde seu composto é o pequeno pico destacado. Por que você precisa fazer tudo
isso? Por que você tem uma mesma substância que absorve em 280 e é representada por
um pico que está do lado do composto de interesse. Deve-se então tirar todo mundo que
coluiria ali. Mesmo fazendo todo esse processo de extração, repare no tanto de sujeira
que ainda resta no seu plasma. Então você vai tirar o UV-VIS e depois o massas.
Primeiro, como eu vou preparar a minha amostra para o massas?
 Quanto eu faço as três primeiras etapas, as protéinas que estão no plasma irão
precipitar. Quando eu centrifugo e separo o sobrenadante é por que eu não quero que a
proteina precipite na minha coluna. O resto que está no plasma ainda está no
sobrenadante, exceto as proteínas que eu tirei. Então eu vou pegar e fazer um
monitoramento.

Se a massa do meu composto ionizado é 821,5 eu vou monitorar o 821,5. Todo

composto com esta massa que sair da cromatografia vem para o massas. Qualquer
outra massa não passa. O que resulta no meu cromatograma assim:
 Podemos ver que eu ainda tenho um monte de interferentes, ou seja, eu tenho um
monte de compostos que tem a massa de 821,5 no meu plasma. Isso se eu tiver um
único analisador. Se eu tiver um analisador e monitorar o íon 821,5 eu vou ter essa
meleca aí. Mas eu vou coloquei um quadrupolo, certo? Então vamos utilizar isso. Eu
vou pegar o meu composto que tem massa 821,5 e fazer uma varredura de íons
produtos. Eu vou selecionar ele, fragmentar e medir a massa dos fragmentos.

O íon 821,5 se fragmenta em todos esses: 768, 718, 750... Sendo o principal
fragmento de massa o 768. Então em vez de monitorar só o 821,5 que eu tenho um
monte de contaminante, eu vou fazer um experimento MS/MS no qual eu vou monitorar
duas coisas: A massa do meu íon e a massa de um dos seus fragmentos.

O fragmento de massa igual a 768 foi escolhido para ser monitorado por que ele é o
mais intenso, mas eu posso escolher qualquer um. Então agora meu experimento fica
assim: O primeiro quadrupolo vai selecionar a massa do meu composto, 821,5. Os íons
com massa de 821,5 vão colidir e fragmentar formando todos os íons do espectro. Mas
eu vou pegar o 768 e vou filtrar ele no segundo quadrupolo, onde eu vou ter o meu
detector.

Quando é que eu vou ter sinal no meu detector? Quando da minha coluna sair um
composto que quando ionizado forma um íon de M/Z 821,5 e ao ser fragmentado
formar um composto de massa 768. A chance de eu ter algum outro composto que
ionizado tem M/Z 821,5 e fragmentado também tem massa 768 é muito pequena. Ele
pode formar qualquer outra coisa. Se ele formar o 767 ou 769, não irá obter sinal. É
necessário que o composto tenha M/Z 821,5 e que se fragmente em algo com massa 768
para que seja gerado o sinal.

Resumindo, eu coloquei uma segunda condição para que o analito dê sinal no meu
detector. Lembra que quando eu coloco só o 821,5, o cromatograma apresenta um
monte de composto? Agora que eu to monitorando tanto a massa do meu composto
quanto o fragmento, só tem um único sinal:

Ou seja, eu tornei a análise de algo muito pouco seletiva, a de um composto com

massa 821,5, e transformei em uma análise extremamente seletiva, a de um composto de
massa 821,5 e que forma um fragmento de massa 768. Essa análise é tão seletiva que o
tempo de corrida é só de um minuto e meio. Vocês se lembram como era a preparação
da amostra? Só precipitei as proteínas, peguei tudo o que sobrou e analisei. O que eu
separo em um minuto e meio de cromatografia? Nada, quando eluindo com esse
composto existem outros 700 mil. Mas nenhum deles tem a massa 821,5 e se tiver, não
forma 768 como fragmento. Então, veja só, a diferença de eu ter um detector
extremamente seletivo. No outro caso eu tinha que eliminar vários contaminantes,
fazendo extrações, simplificando a minha amostra e eliminando interferentes; e mesmo
assim eu tinha que fazer uma corrida longa, por ainda exixtia muitos interferentes.
 Um monte de compostos absorvem no 278, por que é uma absorbância muito pouco
seletiva. Se eu monitorar só a massa a análise é muito pouco seletiva também. Mas se
eu monitorar a massa do composto e do fragmento, eu tenho uma análise extremamente
seletiva. Então, eu estou monitorando uma reação de fragmentação específica:
Monitoramento Seletivo de Reação (SRM). Aí você olha pra mim e diz: Não tem chance
mesmo de ter outro composto com massa 821,5 e que se fragmente em alguma coisa
com massa 768? É dificil, mas tem. E tem uma outra coisa, além de tudo: esse
interferente tem que ter o mesmo tempo de retenção. Então na prática, o que eu preciso
pra ter um interferente? O meu composto tem que ter mesma massa, mesmo fragmento
e mesmo tempo de retenção. Aí você fala: E se eu for o azarado e eu tenho um
composto com massa 821, fragmento 768 e que coeluí? Não tem importância, é só ir no
espectro de fragmentos e pegar um fragmento com outra massa, por exemplo, 718, pois
eu tenho outros fragmentos. Óbvio que eu tinha selecionado o 768 por que é mais
intenso e portanto, o limite de detecção é menor.

Com o monitoramento seletivo de íons, eu vou monitorar várias coisas ao mesmo

tempo: Um, a massa do analito. A massa, no nosso caso é M/Z. Então se eu tiver um
analito que não tem a mesma massa, já não é um interferente. Dois, vou monitorar a
massa, também na forma de M/Z, do fragmento. Três, eu também vou olhar pro tempo
de retenção. Então se eu tiver um composto que não tenha a mesma massa, ele não é um
inteferente. Se ele tiver a mesma massa e não formar o fragmento, ele também não vai
ser interferente. Se ele tiver a mesma massa e o mesmo fragmento, mas não tiver o
mesmo tempo de retenção, ele também não é um interferente.

É quase impossível você ter um interferente, ou seja, um composto que tenha mesma
massa, mesmo fragmento e mesmo tempo de retenção. Em uma análise convencional,
esquece. Agora, vamos supor que você pegou a coisa mais complexa que tem, que é o
plasma. E eu fiz a preparação de amostra assim, meia boca, só tirei a proteína lá do
meio. Não tem chance mesmo de ter um interferente? Então agora a gente vai ver a
outra coisa que podemos fazer. Repare o seguinte: O sinal que eu vou ter no meu
detector é proporcional a intensidade do fragmento formado na fragmenteção, certo? O
que tá batendo no detector é meu fragmento. Então meu sinal vai ser proporcional a
quantos íons fragmentos que estão batendo ali com aquela massa específica.
 Se eu monitorar o fragmento de massa 821 no primeiro quadrupolo e 768 no
segundo quadrupolo, eu vou ter um certo sinal. Mas vai que eu não gostei do 768 e
quero monitorar o 576, veja, o 576 é aproximadamento 20% do 768. Então se eu
monitorar o 821 e o 576 a área do meu cromatografa tem que ser 20% da área do 768,
certo? Então, na prática, eu vou monitorar, duas transições. Uma que eu vou chamar
de transição de quantificação na qual eu pego o mais intenso tendo, portanto, um
quadrupolo no 821 e outro no 768. Esta, eu vou monitorar alternadamente com a outra
que eu chamo de transição de confirmação, que é, eu vou pegar o segundo mais
intenso, o 576, e vou monitorar 821 e o 576. E eu fico alternando entre eles. No final eu
vou ter dois cromatogranmas: um para cada transição.

As duas transições tem que ter o mesmo tempo de retenção, por que afinal, esse
sinal só aparece quando meu composto coelui. Independete de quem é o fragmento, eu
só vou ter o sinal durante o tempo de retenção do meu composto. Além disso sabemos
que a área da segunda transição tem que ser 20% da área da primeira transição, por que
é a relação entre os meus íons. Logo, se você for extremamente azarado e ter um
composto com a mesma massa, mesmo fragmento e que coeluí, obviamente que o 576
dele não vai ter a mesma razão do que esse aqui. Se essa razão não for em torno de
20%, você tem agora uma característica fantastica: O seu próprio método de análise vai
olhar pra esse composto e dizer: você tem um interferente.

Na prática, no programa que você coloca você informa essa razão que pode variar até
20%. Assim, 20% de 22, é quatro e então ele pode ir até 26 ou até 18. Entre 18 e 26, é
aceitável. Você coloca esse limite e roda a amostra. Se não tiver dentro desse limite, ele
já avisa que é interferente. Desta forma, eu tenho um método extremamente seletivo e
isso faz com que eu não precise fazer uma preparação de amostra exaustiva por que a
chance de eu ter um contaminante é muito pequeno. Eu posso fazer uma preparação de
amostra simplificada, tirando apenas aquilo que iria danificar a minha coluna. Depois,
justamente por eu ter um método seletivo, eu não preciso separar composto por
composto, não tem problema se coeluir. O método ainda é capaz de, através do
monitoramento da razão das transições -transição é cada mitoramento que eu faço- a
obtenção de uma medida da presença ou não de um interferente.

O que eu não ionizo por ESI? Hidrocarbontos e haletos de alquila. Você raramente
vai tá interessado em detectar dodecano em plasma. Ou seja, qualquer composto que em
principio tenho um heteroátomo, eu posso fazer uma análise por SRM. Desde que ele
ionize por ESI, o método funciona. Temos assim mais uma característica do método:
Ele é extremamente seletivo e, ao mesmo tempo, extremamente universal. Um exemplo
de métodos extremamente seletivos são os método elétroquímicos que também são
muito específicos. Os aparelhinhos que diabéticos usam para medir glicose no sangue,
são um exemplo. Você consegue analisar na hora e com micro litros de sangue. Mas o
que o aparelho consegue medir é apenas glicose. Então em SRM eu tenho uma análise
que além de ser extremamente seletiva, também é universal.

Suponha que eu tenha um composto ‘’x’’. Em um espectro de MS, ele tem massa
732. Eu vou fazer uma varredura de íons produtos e vou selecionar 732 e sabemos que o
composto irá se dissociar formando fragmentos de 628, 490, 277 e 77 por que ele era
aromático. Essa é minha varredura de íons produtos. Agora, pra eu montar um método
de SRM, o primeiro quadrupolo vai filtrar o 732, e o segundo vai filtrar o 490 (supondo
que é o fragmento mais intenso). Essa é minha transição de quantificação. Mas eu quero
adicionar agora uma transição para verificar se não há interferente. Quem eu escolho? O
primeiro quadrupolo em 732 e o segundo no 620. Então na primeira análise eu tenho um
método de MS e só tenho um analisador funcionando. Como eu adquiro o espectro de
varredura de íons produtos? O meu primeiro quadrupolo vai estar selecionando o 732.
Eu vou ter o gás e vai dissociar. O segundo quadrupolo vai varrer, 50 até 740. Faz
diferença entre eu varrer de 50 até 740 ou de 50 até 2000? Não, a aparência do espectro
vai ser a mesma, mas eu vou diminuir o aproveitamento que é dado por 1/(faixa de
massa).

Se eu tiver que varrer 100 unidades de massa, eu to varrendo um e jogando 99 fora, o

meu aproveitamento é de 1%. Se eu varrer de 0 a 1000, o meu aproveitamento vai ser
um milésimo. Então, o controle da faixa de massa altera a intensidade do sinal.
Aí você fala assim: Poxa, não é ridículo eu ter um quadrupolo cujo o aproveitamento de
íons é péssimo e usar ele para fazer uma análise quantitativa? Não, por que um
quadrupolo tá fixo no 732. Quanto % dos íons de massa 732 passam no primeiro
quadrupolo? 100%. E ele vai dissociar e formar o 490. Quanto % dos íons 490 formados
na CID chegam no detector? 100%. Veja, o aproveitamento continua sendo 1/(faixa de
massa), mas um quadrupolo está fixo em uma massa, a minha faixa de massa é 1, e 1/1
é igual a 100%. Olha que interessante, pro quadrupolo fazer uma varredura, eu vou ter
uma perda grande, que é inversamente proporcional a faixa de massa que eu to
adquirindo. Mas se eu to monitorando, ele vai ter um aproveitamento impecável de
100%.

O que eu quero dizer com ‘’ele monitora duas transições’’? Por que veja, ele não
pode selecionar ao mesmo tempo o 490 e o 732. Ou ele monitora um, ou ele monitora
outro, certo? O que meu espectromêtro de massa vai fazer aqui é adquirir a transição de
732 a 490 por um certo tempo e depois ele muda pra transição de confirmação que vai
ser 732 a 620 adquirindo por um certo tempo. Depois ele volta pra primeira transição e
fica oscilando entre uma e outra. Então vamos exemplificar com um caso: Eu vou ter
agora o cromatograma para transição de quantificação. E eu vou ter um outro
cromatograma, que é a minha transição de confirmação. E eu vou de 0 a 5 minutos.
Suponha que o tempo de retenção do meu composto seja de uma janela y. Assim, a
primeira transição será monitorada por um segundo e a outra também. Ele monitora um,
depois outro e assim por diante.
 O meu pico tem tempo de eluição de um minuto. Se meu composto sai em um
minuto e eu demoro um segundo para adquirir cada transição, eu adquiro a transição do
732 a 490 a cada dois segundos. A hora que meu composto saiu e começou a eluir, meu
sinal aumenta. Veja, se meu pico dura um minuto, e eu adquiro um ponto pro espectro a
cada dois segundos, pra primeira transição vou ter 30 pontos descrevendo o meu pico do
cromatograma. A transição de confirmação é 732 a 620 e a intensidade do 620 em
relação ao 490 é a metade. Então o pico da transição de confirmação vai ter metade da
área do primeiro pico. Agora vamos lá, quantos pontos eu preciso pra definir um pico?
Eu preciso de 7 pontos sendo que 15 ou mais é o ideal. No meu cromatograma, eu
tenho 30, ou seja, tá sobrando. Mas aí você diz ‘’Ah, Fábio, nenhum pico
cromatográfico tem um minuto, né?’’. Sim, no equipamento atual, o mínimo de
monitoramento são 5 milisegundos. 5 milisegundos, vai me dar 200 pontos por segundo.
Se eu monitorar duas transições, da 100 pontos por segundo.

Vamos ver como a gente usa SRM hoje. Sempre que você vai usar o método, você
vai colocar lá seu composto, o tempo de retenção, as duas transições, o tempo de
aquisição e a energia de colisão. Lembra que eu comentei com vocês a respeito de
medicamento genérico que a gente traça a curva de bioequivalência? Esta curva é dada
por concentração no plasma versus tempo. Se eu quiser fazer um medicamento
genérico, eu tenho que tirar uma amostra de sangue de tempos em tempos. Como no
começo a concentração de medicamento no sangue sobe muito rápido, eu tenho que tirar
uma amostra de 15 em 15 minutos, depois de 30 em 30, depois de uma em uma hora...
Até que o intervalo seja de 48 horas. Então veja, se eu tirar 10ml de sangue não é nada,
e eu vou monitorar ele por 48 horas. Se eu vou tirar de meia em meia hora, isso aqui vai
dar 96 amostras, que da quase um litro do paciente. A primeira coisa necessária pra eu
fazer isso é que meu método seja sensível o suficiente,para que eu tire apenas
microlitros de sangue em cada ponto. Assim, se o método for sensível, a quantidade que
eu vou tirar em cada análise é pequena; além disso, eu vou tirar 100 amostras de um
paciente, e eu tenho que medir em jejum e ele alimentado, virou 200 amostras. E você
não vai fazer isso só com um paciente mas sim em algo em torno de 20 a 30 pacientes.
E cada amostra deve ser injetada em triplicata. Portanto, seu método deve ser rápido e
seletivo, por que você tá analisando plasma, que como eu disse é muito ‘’sujo’’
quimicamente falando. A gente faz essa curva de bioequivalência usando SRM. Então
olha, temos esse composto:
 Então eu pego o 458 que fragmentou e formou o 441. A transição nesse caso vai ser
458 para 441. E eu tenho meu padrão interno que eu dissociei e formou o 748, que não
está aparendo aqui, e formou o 158. O meu padrão interno vai ter uma transição 748-
158. Aí eu faço o cromatograma para a transição 458-441, e o de baixo é o do meu
padrão interno, 748-158, certo?

Para
cada
amostra,
eu pego
o
sangue,
precipito as proteínas e injeto. E então eu vou obter a curva acima. Eu faço isso com o
medicamento que eu to querendo além do medicamento padrão. As coisas que têm que
ser iguais são: A área sob a curva, o tempo de concentração máxima, a concentração
máxima e a inclinação. Se tudo isso for igual, seu medicamento é genérico.

Eu tenho um método seletivo, e por isso, eu não preciso tirar tanto interferente.
Consequentemente, a cromatografia não precisa ser fantástica pra seprarar todos os
compostos, muito pelo contrário, vai seprar bem meia boca. O método, via de regra, é
muito sensível. Ele mesmo diz se naquela amostra tem um interferente e eu falei que em
princípio eu posso usar pra qualquer composto que ionize por ESI. E eu posso fazer isso
na mesma corrida; eu não preciso fazer uma corrida pra cada analito.

A coisa fica legal quando a gente começa ver o método para análise de diuréticos,
agentes mascarantes e estimulantes do sistema nervoso central, também conhecido
como Dopping. Diurético não é dopping, mas se eu tomar um agente de dopping e
tomar um diurético, meu volume de urina é tão grande que eu diluo o meu composto a
ponto de não ser detectado. Quantos compostos são dopping? Um zilhão de compostos.
Neste ecemplo está sendo analisada uma classe específica de estimulantes do sistema
nervoso central:

Quantos compostos eu tenho que monitrar? 130. Tenho que detectar e quantificar 130
compostos e eu vou fazer isso com SRM. Como é a preparação da amostra? Veja, isso
aqui é urina. Eu pego um pouco da urina da pessoa, vejo o DNA pra verificar se ela não
tentou passar a urina de outra pessoa no lugar da dela e eu jogo no HPLC para analisar
por SRM. Pra prepação da amostra, é só diluir em um tampão contendo o padrão
interno. Cada composto tem um tempo de retenção. A hora que acaba cada eluição, eu
mudo a transição que eu to monitorando. Como eu sei o tempo de retenção de cada
composto, em cada tempo eu tenho o conjunto de transições que eu vou monitorar, que
são pra aqueles compostos que estão eluindo e eu vou trocando. No gráfico acima eu
tenho cada um dos agentes de dopping, o seu tempo de retenção e as barrinhas cinzas no
meio são os padrões internos. Assim, eu consigo, em uma única corrida de 10 minutos,
identificar e quantificar cada substância. Eu não preciso fazer uma análise pra cada
composto. Como eu consigo mudar a transição, a hora que cada composto eluir, eu vou
monitorando ele. Então, pra resumir:

É importante ter em mente que eu usei o quadrupolo pra passar pra vocês o conceito
de espectrometria de massas sequencial. Na prática, espectrometria de massas
sequencial eu consigo fazer com vários analisadores diferentes.
Aula 4 – Tempo de vôo (TOF)

Agora, o que vamos ver é o primeiro analisador de alta resolução. O analisador de

alta resolução mais simples que a gente tem é o analisador por tempo de voô, cuja a
sigla em inglês é TOF. O TOF na sua implementação mais simples, é extremamente
trivial. Veja, o quadrupolo apesar de ser simples, ser 4 polos, o funcionamento é um
pouco mais complexo. O TOF por outro lado, é um dos analisadores mais faceis de a
gente entender. Como funciona o TOF? Eu tenho um tubo que eu chamo de tubo de
voô. E eu tenho uma plaquinha, onde eu coloco por exemplo, 3 íons de diferentes
massas.

O que eu vou fazer? Se meus íons são positivos, eu vou aplicar um potencial positivo
na plaquinha, e os íos serão arremessados pra dentro do tubo de voô, onde eu não tenho
campo. Então com a aceleração que eles ganharem, eles vão continuar até o final do
tubo. Se eu tiver 3 íons de M/Z diferentes, para uma mesma voltagem de aceleração, o
íon de menor M/Z vai chegar antes. O de M/Z intermediária depois, e o de maior M/Z
por último. Simples assim. A força com que você acelera é a mesma para os três casos,
porém a velocidade que as coisas adquirem dependem da massa. Se eu souber o
comprimento do meu tubo e a voltagem que eu acelerei, é só medir o tempo que o íon
leva pra atravessar o tubo e bater no detector, que eu sei a M/Z dele. Por que o tempo é
igual a uma constante, que é o comprimento e aceleração, vezes a raiz de M/Z.
 O básico é simples assim. O que não é tão simples? O principio de funcionamento de
um TOF; a dificuldade está no fato de que quanto menor a massa, mais rápido ele viaja,
o que resulta em um tempo de voô muito curto. Vou explicar: eu estou medindo um íon
individual, que pesa cerca de 10-27 kg, um número muito pequeno. Logo, por menor que
seja a voltagem aplicada, o tempo que ele leva pra atravessar o tubo é muito curto.
Desta forma você precisa de uma eletrônica muito rápida pra você fazer tudo isso. De
modo geral isso é o analisador: Você pega uma latinha, coloca um detector e um
acelerador e você tem um TOF. As características do TOF linear são:

A primeira é que ele é um analisador pulsado. O que é isso? Enquanto o íon mais
pesado não bater no detector, eu não posso dar outro pulso, por que se não o íon mais
rápido do segundo pulso ultrapassa o primeiro e chega antes. Então, ele dá um pulso e
faz uma análise, da um pulso e faz uma análise e assim por diante. A minha fonte tem
que ser pulsada de alguma forma.

A outra caraterística é que ele tem uma grande sensibilidade quando comparado ao
quadrupolo visto que ele não faz uma varredura. Todos íons que forem acelerados pra
dentro do tubo serão detectados. Lembra do quadrupolo? Se eu quiser varrer de 1 a
1000, eu aproveito um milésimo dos meus íons, por que eu detecto um e jogo os outros
fora. Aqui, se eu quiser varrer de 1 a 10, eu dou um pulso e espero os 10 íons baterem
no detector. Todos os íons que estiverem na frente da plaquinha serão detectados.

A outra vantagem é que eu não tenho limite teórico de massa. Lembram que eu falei
pra vocês que, no quadrupolo, se eu qusier fazer uma varredura, eu tenho que varrer
aquela voltagem RF e DC? Eu vou subindo a voltagem e selecionando massas cada vez
maiores, mas há um limite até onde eu consigo fazer isso. No TOF eu não tenho limite.
Tudo isso é maravilhoso e só tem um problema: Eu não tenho uma alta resolução. Por
que eu não tenho uma alta resolução? Por que eu tenho algumas dispersões de íons,
dentre elas a principal é a dispersão cinética. Imagine dois íons de mesma M/Z e a
plaquinha de aceleração. Se meu íons estão na fase gasosa, eles são praticamente um gás
e eu não consigo colocar todo mundo na frente da plaquinha deixando todos paradinhos.
Eles tem uma componente de velocidade.

Supondo que eu tenha essa placa e dois íons de mesma M/Z mas um com
componente de velocidade pra frente e outro com velocidade pra trás. Aplicando um
potencial positivo pra acelerar eles, o íon com a velocidade pra frente vai ter uma
velocidade ligeiramente maior, por que nesse caso a aceleração vai se somar com a
aceleração inicial, e no outro, vai subtrair. Então íons de mesma M/Z vão chegar em
tempos diferentes. Como a velocidade desses íons seguem a distribuição de Maxwel-
Boltzman, eu vou ter uma distribuição de velocidades e, consequentemente, pra mesma
M/Z eu vou ter uma distribuição de tempos de chegada. Não é um tempo único, o que
faz com que minha resolução seja muito ruim. Mas a gente pode corrigir isso, de uma
forma muito simples:
 No meu TOF, eu coloco uma coisa parecida com TOF, mas que chama refletor. O
que é isso? É um tubo onde eu tenho um potencial que vai crescendo no fundo do tubo.
Se eu to trabalhando com íons positivos, o meu potencial cresce quadraticamente ao
longo do tubo. O que vai acontecer agora é: eu tenho um íon que vai ser acelerado.
Quando ele entra no tubo -que é livre de campo- ele vai ser acelerado, mas na hora que
ele entra no refletor, ele vai ser desacelerado, por que o potencial vai crescendo no
fundo. Então ele dá a volta e bate no meu detector, que agora mudou de posição.

O refletor tem duas funções: Para o mesmo comprimento do tubo, o trajeto do meu
íon quase dobra quando eu coloco o meu refletor. Se eu tiver dois íons de M/Z
diferentes, um 500 e um 501, apesar de serem muito próximos, se eu deixar tempo
suficiente, eles vão se separando. Portanto, o uso do refletor praticamente dobra a
distância percorrida pelos íons resultando em uma maior resolução pro TOF.
A outra função do refletor é a seguinte: Veja, se eu tenho íons de mesma M/Z mas com
velocidades diferentes, eles vão chegar no detector em tempos diferentes.

Esses três íons têm diferentes velocidades iniciais. Se eu colocar meu detector
conforme a figura, e se tivermos M/Z igual a 200, temos um 200 que chega primeiro,
um segundo e um teceiro. Mas se eu tiver o refletor, o que tem uma velocidade maior
entra no tubo e penetra mais no fundo do refletor. Aquele com a velocidade menor faz
uma curva mais rasa cortando caminho.

Se eu tenho um potencial repulsivo pro fundo, quanto mais pro fundo o íon for, mais
ele vai ser acelerado de volta. Então, o íon mais rápido vai mais pro fundo e o mais
lento faz a curva mais curta. No começo o de menor velocidade que fez o caminho mais
curto sai na frente, mas o de maior velocidade vai ser ‘’estilingado de volta’’com força
maior, começando a persegui o de menor velocidade. Os íons irão se encontrar onde
está o detector. Se eles continuassem depois do detector, o que era mais rápido iria
continuar sendo mais rápido. No detector eles estão iguais, mas antes do detector e
depois dele não.

Então essas são as duas funções do reflector: Dobrar a distância percorrida e

corrigir essa dispersão de velocidade inicial. Com isso meu TOF sai de 100 ou 400 de
resolução e atinge resolução igual a 3000, me permitindo medir a massa com maior
exatidão. O que são características exelentes pra fazer análises estruturais. Por que?
Veja, se eu fizer uma analise estrutural, eu quero adquirir o espectro. Ao contrário do
SRM que eu só monitoro um íon, se eu quisesse interpretar a estrutura, eu teria que
adquirir o espectro de fragmentação. Desta forma, eu to sempre trabalhando com
espectro. Em um quadrupolo, se eu quiser adquirir um espectro, eu tenho que fazer uma
varredura, o que faz com que eu perca uma boa parte do meu sinal. Aqui não, todos que
eu jogar pra dentro do TOF, eu detecto. Eu não tenho essa perda variável com a massa.

Uma das coisas que a gente tem é que TOF opera de forma pulsada: eu coloco um
pacote de íons e acelero, um pacote de íons, e acelero. Nenhuma fonte das que a gente
viu até agora é pulsada. EI e ESI não são pulsados já que eu to constantemente
produzindo íons. Como eu faço então para acoplar um TOF com EI ou ESI que não são
fontes pulsadas? Eu faço o seguinte:
 Isso é um GC-MS. Temos o GC, a coluna saindo, e a minha fonte de EI. Então meu
gás sai e como a gente viu, na fonte de EI ele vai ser ionizado e fragmentado; os íons
dos fragmentos vão ser acelerados e irão entrar no TOF. Ao entrar os íons encontram o
pusher que é chamado de ‘’empurrador’’. Então, o feixe continua a trajetória que pode
ser vista na figura e depois de um certo tempo, eu aplico um pulso positivo que repele
os íons que, por sua vez, batem no reflector e posteriormente no detector.

A hora que o último íon bater, o outro pulso bate, e assim por diante. Eu transfomo
um feixe contínuo em um que eu vou fatiar, e cada fatia faz um diferente tempo de voô.
Agora a pergunta é: Quando eu tava falando de quadupolo eu falei pra vocês que o
grande barato dos instrumentos hoje é eu ter a capacidade de fazer MS/MS, tanto pra
fazer análise estrutural varredura de íons produtos quanto para quantificação - o que
vimos em SRM. Em qualquer caso, eu tenho que em algum momento selecionar um íon.
A diferença é que pra varredura de íons produtos, eu selecionei um precursor e varro
com o segundo analisador. No SRM, eu seleciono o precursor e seleciono o fragmento,
É o segundo analisador, que em um varre e no outro fica fixo. Mas eu preciso em algum
momento selecionar. Se eu acabei de dizer que um TOF não vai selecionar um íon e
jogar os outros fora, como eu faço MS/MS?
 Eu faço da seguinte forma: eu posso ter um instrumento híbrido. O que é isso? Eu
misturo dois analisadores.

Esse esquema está mostrado um instrumento que é igualzinho ao quadrupolo que a

gente viu. Eu tenho minha fonte de ESI, um guia pra guiar o feixe de íons, um
quadrupolo e a camara de colisão. Antes a gente tinha dois quadrupolos antes da câmara
de colisão. Agora, a gente tirou um quadrupolo e colocou um TOF no lugar. O que isso
faz? Se eu quiser fazer uma varredura de íons produtos, eu seleciono meu precursor e o
íon que eu selecionei vai para câmara de colisão. Estando lá, o íon colide, fragmenta (na
figura a cor do feixe muda de azul pra vermelho, por que eu esquentei o meu íon) e os
meus fragmentos passam pelo TOF, então eu tiro meu espectro. O que tá representado
na figura é uma varredura de íons produtos. Mas eu também conseguia fazer isso antes
com os dois quadrupolos. A vantagem aqui é a sensibilidade. Se eu adquirir um espectro
de fragmentos de um íon com M/Z 1000, eu tenho que varrer de 0 a 1000, pra pegar a
massa dos produtos. Significa que no quadrupolo eu vou aproveitar um milésimo dos
meu íons.

No caso do TOF não, aqui praticamente todo mundo que vier, eu vou conseguir
detectar. Então, eu ganho quase 1000 vezes de sinal se eu tiro um quadrupolo e coloco
um TOF e varro de 0 a 1000. A outra vantagem é que meu espectro neste caso tem alta
resolução e exatidão. Eu consigo saber a massa exata. Então ele faz o experimento de
varredura de íons produtos como os dois quadrupolos. A vantagem é que a varredura é a
melhor coisa que você pode fazer com o TOF, por que você ganha sensibilidade,
exatidão e resolução. E eu não coloco dois TOF, por que não da pra selecionar íon com
TOF. E o quadrupolo tá sendo usado pra fazer o que ele faz de melhor, que é selecionar
o íon. E o TOF tá fazendo o que ele faz de melhor, que é adquirir um espectro, por que
ele faz isso de forma não discriminatória, ele faz de todo mundo.

Aparelhos com essa plataforma são usados pra fazer a análise estrutural de qualquer
coisa, desde que eu ionize por ESI ou por outros métodos semelhantes. Se eu quiser
fazer uma análise, eu uso essa plataforma, se eu quiser fazer uma quantificação, eu uso
o quadrupolo. Hoje, se eu quiser criar uma nova droga no mercado, as regras são cada
vez mais complicadas. Por que a industria farmacêutica funciona igual a industria de
aviação: Não podemos ter erro. Mas se tiver, a gente descobre o que deu errado e não
deixa acontecer denovo. Hoje, você tem que saber se o metabólito do seu medicamento
não é tóxico. Um caso clássico é o ácido acetil-salicílico. O ácido não é um
medicamento. Na verdade, o ácido salicilíco é extraído da casca da árvore. Os índios
faziam chá com casca de árvore e perceberam que quando tomavam passava a dor de
cabeça. Então eles foram e descobriram que tinha ácido acetilsalicilico na casca da
árvore. O pessoal começou a sintetizar o ácido por que começou a faltar árvore. O
problema é que é um ácido o que significa que vai dar azia. Hoje, você esterifica o ácido
e toma o éster. Ele não tem atividade nenhuma. Mas a hora que ele cai no estomago, ele
hidroliza, e forma o ácido que queremos. Nesse caso, produto de metabolização é que é
ativo. Mas isso é feito propositalemente você tomar e até diminuir a acidez do seu
estomago.

O problema é você ter uma droga que pode não ser tóxica, mas seu metabólito é. Ou
seja, hoje você tem que mapear todos os seus metabólitos se você quiser colocar uma
droga no mercado. Antigamente, se uma industria quisesse comercializar um
medicamento, teria que testar e ver se não é tóxica. Mas como era possivel testar? Em
uma pessoa, você ia lá e injetava o medicamento. Depois de um tempo, começou-se a
usar ratos no lugar. Você pega um ratinho, da um pouco de medicamento pra ele e o
deixa em observação. Se ele continuar correndo, tá tudo bem.
 O protocolo hoje, começa muito antes. Você usa cultura de célula, e vê se a célula
sobrevive. Passado a célula, você normalmente já testa no ratinho, inicialmente com
doses muito pequenas, e depois aumentando. Quando chegar na dose mg/kg, que é a que
você usa normalmente, aí você testa em cachorro. Você dilui a dose e vai aumentando
caso não seja detectado problema. Normalmente, depois disso você vai pra teste clínico.
Alguma drogas, você ainda tem outra etapa: primatas. Principalmente para
medicamentos que agem no sistema nervoso central, por que a bioquimica é muito
próxima da gente. Depois disso, você vai para humanos. Então você pensa: Poxa, é um
protocolo bem seguro. Há uns sete anos atrás, uma empresa estava testando uma nova
droga, já tinha feito todos os testes e estava tudo certinho. Passou o primata de boa,
foram lá e internaram doze pessoas: Deram uma dose subfarmacêutica pra essas doze
pessoas que eram saudáveis. As 12 tomaram a injeção e duas horas depois estavam
todos na UTI com múltipla falência de orgãos. Um morreu, e o resto voltou com
sequelas. Então hoje, se você for desenvolver esse tipo de coisa, o protocolo é cada vez
mais complicado. Isso aqui é um estudo que mostra pra gente uma aplicação real:
 Existem derivados do 4-anilino-quinazolina que são semelhantes a adenina - o ‘’A’’
de ATGC do DNA. Isso aqui tem uma estrutura razoavelmnte semelhante à estrutura da
adenina e ataca alguns de seus alvos. Então existem um monte de medicamentos
derivados desse tipo de estrutura. Por exemplo:

O ‘’miolo’’ é o mesmo, mas muda o que a gente pendura nele. Então, se eu quiser
desenvolver uma coisa análoga a isso, eu tenho que sintetizar uma biblioteca de
análogos e fazer testes, pelo menos in vitro. Quando você faz isso, achar o inibidor, que
não é um medicamento, é a parte mais fácil. Então, a primeira coisa a se fazer é medir a
massa exata por espectrometria de massas.
 Então a gente pega o ratinho, da um comprimidinho pra ele, ele come e depois de um
certo tempo a gente tira 20 microlitros de sangue dos quais extraímos os compostos e
tiramos o espectro de massas. A gente vê o composto original, ele mais oxigênio, ele
mais OSO3, e ele e mais esse outro grupo. A massa exata diferencia se eu adicionei 6
oxigênios ou se eu adicionei um SO4. Então aqui, eu já tenho um ideia de que tipo de
transformação o metabólito do meu composto sofreu. Eu sei os tipos básicos de
transformações que está acontecendo. Essa é a vantagem de eu ter um instrumento de
alta resolução quando eu quero fazer uma análise estrutural: Eu sei exatamente a
identidade do íon que eu to perdendo, mesmo que o que diferencie ele seja a segunda
casa, por exemplo.

Se eu faço isso no quadrupolo, eu não consigo diferenciar. Além de que a

instensidade do sinal iria ser bem menor. Tirar um espectro de alta resolução me
proporciona esse tipo de vantagem. Com isso, a gente consegue destrinchar toda a
fragmentação que acontece na minha molécula: Eu pego a molécula padrão e estabeleço
direitinho o que acontece com ela, usando um quadrupolo com TOF. Então, cada sinal
que vai tá lá, eu sei sua estrutura. Pra eu quantificar cada um dos metabólitos, eu uso
SEM, monitoramento seletivo de reações poia eu já sei qual é o meu composto e eu vou
apenas quantifica-lo. Resumindo, eu já sei quem são os metabólitos e agora eu quero
saber como é a cinética de metabolização deles. A primeira coisa que eu tenho que fazer
é pegar meu composto de estrutura conhecida e fazer sua fragmentação.

Então, eu pego esses dois compostos e eu estabeleço qual são suas rotas de
fragmentação. Dependendo da onde aconteceu alguma mudança, eu tendo estabelecido
como minha molécula fragmenta, e então basta eu ver os fragmentos que estarão
deslocados exatamente da massa que foi alterado. Cada fragmento desse contém uma
informação estrutural de uma parte da molécula. Cada fragmento vai ser sensível a
mudanças em partes específicas da molécula. Uma vez que eu fiz isso e quero
quantificar, eu tenho que fazer SRM.