UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA

QO 423 – FUNDAMENTOS DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Instrumentações, Aplicações e Interpretações Básicas

Professor: Dr. César Fábio Gozzo

Nome: Vitor Hugo Rigolin RA: 157545

UNICAMP – CAMPINAS/SP

2º Semestre de 2015
2
 “Tomei a decisão de fingir que todas as coisas
que até então haviam entrado em minha mente não
eram mais verdadeiras do que as ilusões dos meus
sonhos”

-DESCARTES, René (1596-1650)

3
4
SUMÁRIO

SUMÁRIO ......................................................................................................................... 5

INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 9

CAPÍTULO I – O CONCEITO MODERNO DE MASSA E ÁTOMO .................... 11

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 13

2. AS QUATRO FORÇAS UNIVERSAIS ........................................................... 14

3. DEFEITO DE MASSA ...................................................................................... 16

4. OS TIPOS DE MASSAS ................................................................................... 15

CAPÍTULO II – SOBRE O ESPECTRÔMETRO E ESPECTRO DE MASSAS ... 17

1. SOBRE UM ESPECTRO DE MASSAS............................................................ 18

1.1. PADRÃO ISOTÓPICO PARA O CARBONO ................................................... 18

1.2. OUTROS PADRÕES ISOTÓPICOS .................................................................. 21

1.3. REGRA DO NITROGÊNIO ............................................................................... 24

CAPÍTULO III – TÉCNICAS DE IONIZAÇÃO ...................................................... 25

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 25

5
 2. IONIZAÇÃO POR IMPACTO ELETRÔNICO (EI) ..................................... 25

3. IONIZAÇÃO POR ELETRONSPRAY (ESI) ................................................. 27

4. ACOPLAMENTS COM CROMATOGRAFIA .............................................. 29

5. ESPECTROS ESI- MULTIPROTONAÇÕES/MULTIDESPROTONAÇÕES

................................................................................................................................ 31

CAPÍTULO IV – MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E REARRANJOS ..... 37

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 37

2. PRINCIPAIS CLASSES DE FRAGMENTAÇÕES ....................................... 38

2.1. CLIVAGEM ALFA (α) ........................................................................................ 38

2.2. CLIVAGEM INDUTIVA (i) ................................................................................ 38

2.3.REARRANJOS DE McLAFFERTY...................................................................... 45

3. FRAGMENTAÇÕES E REARRANJOS EM AROMÁTICOS ..................... 47

3.1. FRAGMENTAÇÕES TÍPICAS .......................................................................... 47

3.2. REARRANJOS EM AROMÁTICOS .................................................................. 48

4. PREDIÇÃO DE FRAGMENTOS E ESPECTROS DE MASSA ................... 51

6
CAPÍTULO V – ANALISADORES MASSA/CARGA ............................................. 55

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 55

2. ANALISADOR POR SETOR MAGNÉTICO (S.M.) ................................... 58

2.1. APLICAÇÕES DO SETOR MAGNÉTICO ...................................................... 63

2.1.1. O Início da Espectrometria de Massas – Descoberta dos Isótopos . 63

2.1.2. A Exploração Espacial e o Setor Magnético ....................................... 64
2.1.3. Caloutrons – Enriquecimento de Urânio............................................... 64
2.1.4. Padrão Isotópico – Dopping e Análises Elementares ........................ 65

3. ANALISADOR POR QUADRUPOLO (Q) ................................................... 67

3.1. DESCRIÇÃO QUALITATIVA ......................................................................... 68

3.2. APROVEITAMENTO DO QUADRUPOLO (Q aprov.) ...................................... 71

4. ANALISADOR POR TEMPO DE VOÔ (TOF) ............................................ 72

4.1. TOF LINEAR E CONTÍNUO ............................................................................ 73

4.1.1. A Utilidade do Refletor .......................................................................... 74

4.1.2. Pusher – TOF em Modo Contínuo ....................................................... 75

5. ANALISADORES – REVISÃO ...................................................................... 76

7
 CAPÍTULO VI - ANÁLISES SEQUENCIAIS E APLICAÇÕES MS/MS .............. 77

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 77

2. EXPERIMENTOS MS/MS ............................................................................... 78

3. DISSOCIAÇÃO INDUZIDA POR COLISÃO – CID .................................... 80

4. VARREDURA DE ÍONS PRODUTOS ........................................................... 82

4.1. VARREDURA QqQ e QqTOF ............................................................................ 83

5. VARREDURA DE ÍONS PRECURSORES .................................................... 87

6. MONITORAMENTO SELETIVO DE REAÇÕES (SRM) ........................... 88

6.1. TRANSIÇÃO DE CONFIRMAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO ............................ 94

6.2. SOBRE GENÉRICOS, DOPPING E SRM ......................................................... 95

CAPÍTULO VII – PLANEJAMENTO DE UM EXPERIMENTO SEM .................99

8
INTRODUÇÃO

A espectrometria de massas é uma das técnicas para identificação e elucidação de

estruturas orgânicas e inorgânicas mais utilizadas na atualidade. Suas aplicações partem
da determinação estrutural de compostos com menos de 50 Dalton até para proteínas,
polímeros, complexos organometálicos e estruturas com mais de 5000 Dalton.

Seus primórdios datam em 1886, quando E. Goldstein descobre a existência dos raios
catódicos. Assim, o progresso da técnica sempre acompanhou o desenvolvimento e
modificações vistas para o modelo atômico: a presença de isótopos, a massa molecular, a
diferenciação de núcleo e eletrosfera, a ionização e elucidação de mecanismos radicalares
e iônicos, entre outros avanços científicos.

Na atualidade a espectrometria de massas está presente em diversas áreas, como a

análise de drogas e metabólitos, caracterização de polímeros, lipídeos, proteínas,
peptídeos, DNA e RNA, desenvolvimento de métodos analíticos, caracterização de
produtos e rotas sintéticas, além de áreas mais remotas como a proteômica, genômica,
métodos clínicos e química orgânica não-farmacêutica.

Para a IUPAC, a definição de espectrometria de massas é vista em: “o estudo da

matéria através da formação de íons em fase gasosa, que são caracterizados pela relação
massa/carga (m/z) para os íons formados”. Note que, para esta primeira definição tem-se
dois pré-requisitos que devem ser atendidos:

i. Formação de íons: desta forma, qualquer composto neutro ou radicalar que não
esteja na forma de íon não poderá ser analisado;

ii. Íons em fase gasosa: os íons gerados devem estar em fase gasosa antes de serem
analisados. Assim, caso forme-se o íons, mas este esteja em fase líquida ou sólida (menos
provável), este não conseguirá ser detectado;

Estas características, bem como a instrumentação e os métodos para formação destes

íons em fase gasosa serão abordados no curso, bem como a interpretação básica dos
espectros gerados pela diferentes formas da técnica de espectrometria de massas.

9
10
CAPÍTULO I – O CONCEITO MODERNO DE MASSA E ÁTOMO

1. INTRODUÇÃO

Para a técnica de espectrometria de massas deve-se inicialmente compreender todos os

avanços e modelos já propostos para a estrutura de um átomo. Desde a Grécia Antiga,
grandes pensadores como Ptolomeu já tinham primitivas noções e teorias sobre do que
era formada a matéria. A história já é conhecida: passando por Dalton, Thompson,
Ruthenford, Böhr e outros grandes cientistas, cada um contribuiu para o aprimoramento
do modelo atômico até a forma à que se conhece nos dias atuais.

Além da elucidação do modelo estrutural, a interpretação da massa atômica sofreu

diversas modificações. Iniciando pela descoberta de isótopos e nêutrons, até mesmo a
descoberta da massa dos elétrons, o conhecimento que se tem hoje do átomo é essencial
para entender os fenômenos que ocorrem na técnica de espectrometria de massas.

Pode-se iniciar este capítulo com uma observação perturbadora: para um curso que se
trata de massas como o próprio nome já diz, em nenhum momento deve-se utilizar a
tabela periódica. Isto se deve ao fato de que a tabela periódica contém diversas
aproximações que afastam esta da realidade encontrada. Por exemplo:

i. A massa de um próton é igual a massa de um nêutron;

ii. A massa de um elétron ser desprezível;
iii. A massa atômica de um elemento ser calculada pela massa ponderada dos
isótopos formadores do elemento;

Os exemplos a seguir apenas são uma prévia das anormalidades que podem ser vistas:

Exemplo: considere o deutério - 2H (1 próton, 1 elétrons e 1 nêutron);

considere o hélio – 4He (2 prótons, 2 elétrons e 2 nêutrons);
Se MM 2H: 2,0141 g mol-1; MM 4He: 4,0026 g mol-1; o que explica:

se a composição do hélio é o dobro?

11
 Exemplo 2: considerando o modelo atômico até o momento
conhecido, sendo o núcleo formado por prótons e nêutrons, com
elétrons presentes na eletrosfera. Pode-se inclusive considerar o
modelo atômico mais antigo, o que apenas facilitaria a compreensão
do problema proposto. Figura 1: Modelo atômico
mais antigo
Admitindo que a interação eletrostática seja a que mantém prótons e elétrons em
conjunto, por que o núcleo não entra em colapso pelo excesso de cargas positivas? Por
que os elétrons não escapam do átomo? Se os nêutrons não tem carga, como se sabe, qual
a sua contribuição para estabilidade do núcleo?

2. AS QUATRO FORÇAS UNIVERSAIS

Na natureza, todos os fenômenos são basicamente governados por quatro forças

universais. A resposta para a estabilidade das questões levantadas nos exemplos
anteriores se encontra nestas forças universais.

i. Gravitacional: atua em qualquer conjunto de partículas com massa, com alcance

infinito, porém com intensidade mínima (em uma escala relativa entre estas forças, a força
gravitacional assume intensidade da ordem de 10 -39);

ii. Nuclear Fraca: relacionada com o decaimento nuclear e o spin dos núcleos, com
alcance de 10-18 metros, mas com intensidade baixa (escala relativa de intensidade de
10-6), podendo ser desconsiderada, igualmente a força gravitacional;

iii. Eletrostática: possui uma interação que pode ser repulsiva ou atrativa dependendo
da carga dos íons, elétron ou outra entidade. Possui alcance infinito, porém com uma
intensidade relativa de 1/137;

iv. Nuclear Forte: a natureza desta interação é sempre atrativa, independendo da

carga. Sua intensidade relativa é 1, sendo esta a mais forte. Entretanto, seu alcance é da
ordem de 10-15 metros, ou seja, distâncias muito pequenas;

12
 Assim, o que ocorre para um Repulsão
Eletromagnética
átomo? Inicialmente como se observa
a interação eletrostática é a
governante, fazendo com que ocorra a Atração
repulsão eletromagnética. Esta força Nuclear Forte

tem menor energia que a nuclear forte,

mas atua em distâncias maiores.
Entretanto, quando a aproximação Figura 2: Interações envolvidas para dois prótons
torna-se muito grande a força nuclear
forte passa a ter maior importância e, devido sua maior intensidade relativa, ela passa a
predominar, promovendo a estabilidade para o núcleo atômico.

É através desta força que o núcleo se mantém estável.

Como a força nuclear forte é 137 vezes maior que a eletrostática, a atração pode
ocorrer, diminuindo em enorme extensão a energia do sistema. Este processo altamente
exotérmico, fonte de uma quantidade absurda de energia é conhecido popularmente por
fusão nuclear ou fusão atômica. Um exemplo da quantidade de energia liberada nestes
processos pode ser visto nas bombas atômicas de hidrogênio.

Conhecido pela sua célebre equação E = mc², Albert Einstein introduz o conceito de
transformação de matéria em energia. Esta promove a resposta para o primeiro exemplo
mostrado anteriormente. Como o hélio é um elemento que veio da fusão de dois átomos
de hidrogênio, sua massa não é igual a massa original uma vez que, para o processo de
fusão ocorre a diminuição da massa total pela liberação de energia no processo.

Quanto mais pesado o átomo, maior a energia necessária para a fusão atômica e assim,
consequentemente maior energia liberada. Desta forma, quanto mais pesado o átomo,
maior o desvio entre a massa original e a final para o átomo.

A introdução deste fenômeno é essencial para compreender como os elementos mais

pesados são formados, bem como a diferença entre as massas observadas e previstas.

13
 3. DEFEITO DE MASSA

É a diferença entre a massa exata e a massa verdadeira para determinado átomo.

Nenhum átomo, com exceção do carbono-12 tem massa inteira, uma vez que este é o
elemento usado como referência. O defeito de massa traz muitas informações:

Exemplo: 1H: massa real – 1,0078 g; Defeito de massa: 0,0078 gramas

massa teórica – 1,0000 g

16
O massa real – 15,9949 g; Defeito de massa: - 0,0051 gramas

massa teórica – 16,0000 g

Desta forma, toda vez que um elemento é

formado através da fusão de outros núcleos,
ocorre uma violeta liberação de energia.
Utilizado como referência, todos os
elementos antes do carbono tem defeito de
massa positivo, já os depois do carbono
possuem defeito de massa negativo. A única
exceção é para o nitrogênio, entretanto os Figura 3: Gráfico comparativo entre defeito de
massa para cada núcleo
motivos para tal caso não serão abordados.

Mesmo com a liberação de uma enorme quantidade de

energia, para a fusão atômica ocorrer também é requerida uma
energia muito grande. Assim, as fusões atômicas ocorrem
principalmente em estrelas, onde seu ciclo de vida inicia-se
com a fusão de átomos leves como o hidrogênio. Passando
bilhões de anos, núcleos cada vez mais pesados começam a ser
fundidos, chegando ao seu máximo com a formação do ferro.
56
O Fe é o núcleo mais estável de todos, sendo por isso o
mais abundante no universo. A partir deste as reações de
formação de núcleos passam a ser endotérmicas, unicamente
favoráveis em casos como as explosões de supernovas.
Figura 4: Estabilidade relativa de
núcleos atômicos

14
4. OS TIPOS DE MASSAS

As massas dos elementos podem ser vistas de diversas formas:

i. Massa Nominal: corresponde a massa arredondada para cada isótopo;

ii. Massa Média: é a massa vista na tabela periódica, baseando-se na média

ponderada isotopicamente para cada elemento;

iii. Massa Monoisotópica: é a massa do isótopo mais abundante para cada elemento.
Possui a particularidade de ser única para cada elemento químico;

Exemplo: a massa nominal para o hidrogênio é 1 Dalton, para o oxigênio 16 Dalton

(lembrando que 1 Dalton = 1 u). Já a massa monoisotópica para o hidrogênio é
1,0078 Dalton, enquanto para o oxigênio é 15,9998 Dalton.
A massa média para o cloro é 37,5 Dalton, uma vez que sua média ponderada consiste em
33.1% de 35Cl e 66,9% de 37Cl, seus isótopos mais abundantes.

Nenhuma massa isotópica é igual a outra, nem mesmo múltipla de outra. Assim, a
determinação da massa com um número suficientemente de exatidão consegue prever
com grande confiabilidade a fórmula molecular para uma estrutura.

Exemplo: para uma massa encontrada de114 Da, observa-se que esta pode representar ao
mesmo tempo diversos compostos, como: C6H10O2, C6H14N2, C7H14O ou C8H18.

Entretanto elevando a precisão da massa encontrada para 114,1039 Da:

Tabela 1: Determinação da fórmula molecular para o composto de massa 114 Dalton

Fórmula Molecular Massa Molecular Teórica Erro em ppm

C6H10O2 114,068075 358

C6H14N2 114,115693 118

C7H14O 114,104457 5

C8H18 114,140844 369

15
 Desta forma pode-se encontrar com grande precisão a formula molecular para tal
composto. Os espectrômetros atuais conseguem determinar com mais de cinco casas
decimais o valor da massa molecular, permitindo que o erro seja praticamente mínimo
quando comparado com o valor calculado da massa molecular.

A IUPAC possui como referência para a determinação da massa atômica 1/12 do

isótopo de Carbono-12. Esta massa é assim representada em Dalton, ou “u”. Não se deve
confundir a unidade “u” com a unidade americana “u.a.”.

- Próton: 1,0073 Dalton; - Nêutron: 1,0086 Dalton; - Elétron: 0,0005 Dalton;

- 1 Dalton = 1 u. = 1,6605 x 10-27 Kg;

Diversos elementos já citados possuem a particularidade de se apresentarem em mais

de uma forma estável, além de possui mesmo número atômico. Estas formas, conhecidas
como isótopos, são dispostos em quantidades relativas de abundância, o que será
importante para os resultados observados para a técnica de espectrometria de massas. O
curso de QO 423 se enfoca principalmente na determinação de compostos orgânicos;
assim, os átomos e seus isótopos de natureza orgânica mais comum são:

- 1H (99,98 %); 2H (0,01 %); 3H (<0,01 %);

- 12C (98,93 %); 13C (1,07 %);

- 14N (99,93 %); 15N (0,63 %);

- 16O (99,80 %); 18O (0,20 %);

- 35Cl (75,78 %); 37Cl (24,22 %);  Proporção de 3:1

- 79Br (50,69 %); 81Br (49,31 %);  Proporção de 1:1

A espectrometria de massas (que a partir de agora poderá ser abreviada para MS) é
uma técnica que mede as massas moleculares levando em consideração os isótopos
constituintes, considerando suas devidas proporções. Assim, dependendo dos isótopos e
suas proporções relativas, uma mesma molécula poderá ter mais que uma massa.

16
CAPÍTULO II – SOBRE O ESPECTRÔMETRO E ESPECTRO DE MASSAS

Um espectrômetro de massas é basicamente constituído das seguintes partes:

Figura 5: Esquema básico para um espectrômetro de massas

Cada uma das partes que compõe o espectrômetro de massas será individualmente
estudada, comentando sobre suas importâncias, características principais e utilizações.

i. Introdução da Amostra: é o meio ao qual se introduz a amostra no sistema do

espectrômetro de massas. Pode ser direto ou acoplado com técnicas como a
High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Gas Chromatography (GC) ou
Capillary Electrophoresis (CE);

ii. Fonte de Ionização: tem a finalidade de transformar o analito em íons em fase

gasosa para ser posteriormente separado. Pode ser de diferentes naturezas, como
Electronic Ionization (EI), Chemistry Ionization (CI), Electron-Spray Ionization (ESI),
Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization (MALDI), entre outras;

iii. Analisador de m/z: sua função é a de separar e analsiador os íons de acordo com
suas razões massa/carga. Os analisadores mais comuns são: Bipole (B),
Quadrupole (Q), Time of Flying (TOF), Orbitrap, Ion Trap (IT), entre outros;

iv. Detector: sua função é a de detectar e quantificar os íons selecionados

anteriormente pelo analisador, para dada razão massa/carga previamente selecionada. Os
mais utilizados são: Electron Multiplier (EM) ou Micro-Channel Plate (MCP);

Alguns detectores, analisadores ou fontes de ionização devem ser mantidos no vácuo

ou com pressões e temperaturas apropriadas. Para acoplamentos das técnicas
mencionadas, deve-se regulamentar as condições de saída para os analitos.

17
 1. SOBRE UM ESPECTRO DE MASSAS
Pico mais intenso: Pico Base

Um espectro de massas consiste Porcentagem relativa ao Pico Base

basicamente em uma disposição gráfica

onde se analisa as intensidades relativas
de abundância para cada sinal levando
em consideração a massa/carga do íon. A
intensidade do sinal é tida com relação de
porcentagem para o bico base (ou seja, o

pico mais intenso).

Figura 6: Típico espectro de massas obtido

Inicialmente deve-se preocupar

unicamente com o pico base. O espectro de massas inicialmente obtido de maneira
contínua, onde os picos são obtidos, medindo-se também os desvios experimentais
obtidos. Entretanto por facilidade e convenção o espectro é obtido de maneira centroide,
onde se expressa unicamente um sinal, centrado na média dos valores obtidos.

Figura 7: Comparação de um espectro obtido de maneira centróide (esquerda) e contínua (direita)

1.1. PADRÃO ISOTÓPICO PARA O CARBONO

Como se sabe, o Carbono-12 é o isótopo mais abundante para este elemento. Assim,
realizando-se um espectro de massas para o metano, se vê um pico (chamado de pico
molecular por representar a massa molecular do composto) em 16. Isto corresponde à
massa molecular desta molécula; entretanto, também se vê um pico inferior para 17. Isto

18
corresponde a pequena parcela de moléculas de metano onde o átomo de carbono consiste
nos isótopos de Carbono-13. Este pico possui a intensidade relativa de praticamente 1%,
o que corresponde a proporção isotópica para este elemento. Poder-se-ia pensar também
que este pico corresponde aos hidrogênios presentes na forma de Deutério, mas isto não
seria necessário, uma vez que a proporção isotópica deste elemento é inferior a 0,01% de
abundância relativa com o
Hidrogênio-1.

Aumentado a cadeia
molecular para o decano,
observa-se que houve um
aumento do sinal corresponde à
M+1, uma vez que agora a
probabilidade de existir um Figura 8: Diferentes espectros de massa obtidos para o metano
(esquerda) e decano (direita)
átomo de Carbono-13 em dez
átomos de carbono é próximo à 11%. Nestes casos deve-se lembrar de que a
probabilidade é aditiva (ou seja, soma-se a probabilidade de tal átomo ser Carbono-13).
Isto continua de maneira linear para cada átomo de carbono somado a molécula. Assim,
para uma cadeia de cinquenta carbonos, além da probabilidade de se existir um Carbono-
13, existe a probabilidade de existirem dois Carbono-13, mostrando assim um pico M,
M+1 e M+2. Em casos com cadeias superiores a cem carbonos, a probabilidade de se
existir um Carbono-13 em cem carbonos é maior do que existir uma cadeia com cem
Carbonos-12, fazendo com que o pico M+1 supere o pico corresponde à M.

Com uma cadeia com cento e cinquenta carbonos os picos correspondentes à M+1e
M+2 são superiores aos de M. Isto se deve unicamente a probabilidade. Quanto maior a
cadeia, maior a probabilidade de se existirem um átomos diferente do outro,
acompanhando logicamente a proporção isotópica deste elemento.

Figura 9: Espectros demonstrando as modificações dos picos referentes à M, M+1 e M+2

19
 –Assim, nem sempre o pico molecular corresponde ao pico mais intenso do espectro. Isto
somente ocorrerá em cadeias onde se encontram um número inferior à noventa carbonos.
Esta proporcionalidade e picos demonstrados são denominados de padrão isotópico do
carbono. Este padrão revela uma informação muito importante: uma vez que se sabe que
o pico M+1 varia unicamente com o número de carbonos na molécula, sua intensidade
relativa para o pico molecular revela o número de carbonos do analito.

Em biomoléculas, como proteínas, suas massas facilmente são superiores à 6000

Dalton, fazendo com que o pico molecular seja praticamente indetectável. Isto é lógico
12
uma vez que a probabilidade de haver uma molécula com 1000 átomos de C de 1000
12
possíveis átomos de C é praticamente nula em termos de probabilidade.

O número de carbonos ser obtido a partir do pico M+1 é uma informação muito útil.
Observe na Figura 10 que há três estruturas com distintas fórmulas moleculares.
Entretanto a intensidade de M+1 para todas é exatamente igual, uma vez que o número de
carbonos para todas são iguais. A intensidade de M+1 não depende dos outros átomos
formadores da molécula, como pode ser visto.

Figura 10: Diferentes espectros de massa para compostos com diferentes fórmulas moleculares, mas com
mesmo número de carbono (observar mesma intensidade para M+1)

Exemplo: para um pico molecular de 100%, uma estrutura com:

- 20 Carbonos: M + 1 = 100 – (20 x 1,1%). Assim, M+1 = 22% de M;

- 120 Carbonos: M + 1 = 100 – (120 x 1,1%). Assim, M+1 = 122 % de M; (M+1 > M)

20
1.2. OUTROS PADRÕES ISOTÓPICOS

Em teoria, qualquer elemento que se apresenta em formas isotópicas diferentes podem

ter seus padrões detectados por espectrometria de massas. O único impedimento
relaciona-se com a abundância relativa de tais isótopos.

16 18 14 15
Exemplo: O (99,80 %) x O (0,20 %); N (99,93 %) x N (0,63 %); são dois casos
onde se esperaria um padrão isotópico em M+2 e M+1, respectivamente. Entretanto,
devido suas abundâncias relativas, além de serem raros os casos onde existam moléculas
muito ricas em nitrogênio ou oxigênio, raramente seus espectros serão influenciados pelos
padrões isotópicos destes elementos.

Entretanto para o cloro e bromo suas abundâncias relativas são próximas o suficiente
para influenciar o espectro de massas. Como já visto a proporção de Cloro-35 e
Cloro-37 é de aproximadamente 3:1, enquanto para o Bromo-79 e Bromo-81 a proporção
é de 1:1. Isto significa que seus padrões serão observados para M e M+2.

Figura 11: Padrões isotópicos para molécula com um átomo de cloro e um átomo de bromo

Como observado na Figura 11, uma molécula contendo um átomo de cloro apresenta
um pico em M+2 na proporção relativa de 33% de M. Enquanto isto, uma molécula com
átomo de bromo apresenta M+2 com proporção relativa de 50% de M. Isto segue
exatamente como imaginado para o carbono, seguindo as devidas proporções em termos

21
 de abundância isotópica para cada elemento. Nestes casos onde as moléculas não são
grandes, os picos de M+2 não correspondem para casos com dois Carbono-13.

Para moléculas mais complexas como as da Figura 12 pode haver casos onde um pico
corresponde à soma de duas probabilidades de massa:

Figura 12: Diversos espectros de massas para moléculas com padrões isotópicos observáveis

Compreender estes espectros e o que seus picos representam é de muita importância,

pois apenas estas informações já contribuem em grande extensão para a estrutura do
composto. Suas interpretações seguem linhas de probabilidade matemática:

12
i. Para C15H31Cl: sabe-se que M: 246 corresponde à C151H3135Cl; sabe-se que
M+1: 247, corresponde à 13C112C141H3135Cl e que este tem intensidade relativa de 16% de
M, o que resulta em um número de carbonos de 15, como é esperado. Já em M+2
12
observa-se os sinais de C151H3137Cl junto à 13
C212C131H3135Cl, porém este último
contribui em proporção quase insignificante devido ao número de carbonos, sua
intensidade relativa é de 33% de M, uma vez que esta intensidade é a probabilidade de
que o átomo de Cloro seja 37 e não 35. Por fim, o sinal referente à M+3 corresponde à

22
13
C212C131H3137Cl, tendo este intensidade relativa de 16% de 33% de M, devido à
probabilidade multiplicativa (deve-se ter um Carbono-13 ao mesmo tempo em que um
Cloro-37 (ou seja, isto representa ou 16% de 33% vistos no espectro);

ii. Para o C20H41Br: vê-se inicialmente M: 360, correspondendo ao pico de

12
C201H4179Br; para o pico de M+1 tem-se que sua intensidade relativa é de
aproximadamente 22% de M, o que revela um número de carbonos igual a vinte - este
12
sinal representa C1913C11H4179Br. Como para o bromo tem-se que suas proporções
isotópicas são de aproximadamente 1:1, o pico em M+2 possui intensidade muito
12
próxima à M, representando a molécula de C201H4181Br. Por sim, como o pico de M+2
possui intensidade muito próxima à M, a probabilidade de se encontrar um Carbono-13
em uma molécula com Bromo-79 é praticamente a mesma de se encontrar este átomo em
uma molécula com Bromo-81. Devido a este motivo o pico de M+1 é aproximadamente
igual ao pico de M+3, correspondente à 12C1913C11H4181Br;

Para os espectros inferiores o que ocorre é a presença de dois átomos de cloro ou dois
átomos de bromo. Para compreender os picos, usa-se a probabilidade. A existência de
dois átomos de Cloro-37 (ou Cloro-37) em dois átomos de cloro é multiplicativa. Já a
presença de apenas um átomo é aditiva. Lembre-se, para o primeiro caso deve-se ter um
átomo de Cloro-35 E outro átomo de Cloro-35. Já para a segunda probabilidade deve-se
ter um átomo de Cloro-35 OU o outro átomo com este isótopo. Assim:

iii. Para o C15H30Cl2: M: 280 – 12C151H3035Cl2;

M+1: 281 - 12C1413C11H3035Cl2;
M+2: 282 - 12C151H3037Cl35Cl, raramente 12C1313C21H3035Cl2;
M+3: 283 - 12C1413C11H3037Cl35Cl;
M+4: 284 - 12C151H3037Cl2, raramente 12C1413C21H3037Cl35Cl;

Devido às proporções isotópicas, vê-se porque ocorre o aumento da probabilidade de

se encontrar um átomo de Cloro-37. Agora M+2 é 66% de M, como esperado.

23
 iv. Para o C20H40Br2: M: 438 – 12C201H4079Br2;
12
M+1: 439 - C1913C11H4079Br2;
M+2: 282 - 12C201H4079Br181Br1;
M+3: 283 - 12C1913C11H4079Br181Br1;
M+4: 284 - 12C201H4081Br2, raramente 12C1813C21H4079Br81Br;

Para o bromo observa-se que a presença de mais de um átomo na estrutura provocará

um padrão isotópico próximo aos vistos para a técnica de RMN (neste caso a
probabilidade de se encontrar dois Bromo-79 é de 25%, um Bromo-81 é de 50% e de
encontrar dois Bromos-81 é 25%, o que resultaria em um triplete – 1:2:1).

Esta dica é unicamente válida para este elemento, pois ele é o único que se apresenta
em uma proporção isotópica tão próxima à 1:1. O cloro, por apresentar proporção
isotópica de 3:1 não desfruta de tal propriedade.

1.3. REGRA DO NITROGÊNIO

Uma propriedade interessante para as moléculas neutras que possuem número ímpar
de nitrogênio é que estas moléculas serão as únicas as quais apresentam massa molecular
ímpar. Isto se deve unicamente ao fato do nitrogênio ser o único elemento com valência
ímpar enquanto possui uma massa par.

NOTA IMPORTANTE: a massa de uma molécula NEUTRA só será ímpar caso esta
tenha um número ÍMPAR de nitrogênios. Caso a molécula não atenda ao mesmo tempo
estas duas restrições, nada se pode dizer a respeito da presença de nitrogênio.

Exemplo: C2H4O: MM – 44 Dalton; C6H4(NH2)2: MM – 108 Dalton;

CH3CONH2: MM - 59 Dalton; C10H21O2+: MM – 157 Dalton;

24
CAPÍTULO III – TÉCNICAS DE IONIZAÇÃO

1. INTRODUÇÃO

Como já visto anteriormente, apenas moléculas que podem formar íons é que serão
analisadas e gerarão de fato um sinal no espectrômetro de massas. Assim, o método para
formação dos íons é essencial para o sinal gerado. As duas principais técnicas que serão
abordadas são a Electron Ionization (EI) e ElectronSpray Ionization (ESI).

2. IONIZAÇÃO POR IMPACTO ELETRÔNICO (EI)

Conhecida popularmente por EI, esta técnica é a

mais clássica para a formação de íons em moléculas.
A EI é utilizada essencialmente para ionização de
moléculas neutras e apolares (até 500 Dalton).

De maneira simplificada a molécula é Figura 13: Representação simplificada

bombardeada por elétrons com elevada energia para a ionização por impacto eletrônico
(próxima a 70 eV), ocorrendo principalmente à retirada de um elétron, transferindo
parcialmente sua energia para a molécula sofrer processos de quebras ou
fragmentações.

A utilização desta energia para o impacto eletrônico é a que promove maior eficiência
na formação dos radicais, sendo um parâmetro determinado experimentalmente. A partir
da reação acima nota-se a transferência ou depósito de energia no íon radical formado.
Esta energia acrescida deve, e será dissipada da molécula. Uma das formas seria a
irradiação, entretanto o processo é particularmente rápido, o que não promove tal
fenômeno. A outra possibilidade é a quebra e/ou formação de novas ligações químicas. O
método EI é altamente eficiente no que se diz respeito à formação de fragmentos
moleculares, que já serão abordados futuramente.

25
 A EI é realizada em uma câmera a vácuo,
extraindo rapidamente os íons que são
formados. Devido à baixa pressão, não há
colisão ou contato entre as moléculas, o que
evita acoplamentos ou dissipação de energia
por estes processos.

A EI é uma técnica muito utilizada no que Figura 14: Representação de uma fonte de
ionização por impacto eletrônico
se diz respeito à sua alta reprodutibilidade.
Devido às condições as quais a EI é realizada, o único fator que poderia interferir e diferir
entre dois espectros de um mesmo composto seria a energia utilizada para o impacto
eletrônico. Sendo esta variável fixa em 70 eV, a EI consegue em dois equipamentos
diferentes produzir dois espectros com alta proximidade e semelhança;

Quando à câmera da Figura 14 é adicionado gás metano ocorre à chamada ionização

química (CI). Neste processo os elétrons são chocados contra as moléculas deste gás e é
este que irá transferir e formar o radical carregado. Assim, tem-se um método mais
brando para ionização, fazendo com que às vezes não ocorram fragmentações.

As rotas de fragmentação, bem como os mecanismos para tais serão futuramente

abordados. Entretanto, deve-se saber que a EI conta com algumas desvantagens:

i. Unicamente útil para soluções puras: uma vez que ocorre a fragmentação do
composto, uma mistura de dois compostos iria um espectro aditivo de toda a
fragmentação para cada um dos analitos, o que gera erro na análise;

ii. Algumas substâncias podem necessitar aquecimento para provocar sua

volatização: entretanto a EI é unicamente utilizada para moléculas voláteis e termo-
estáveis. Assim, restringe-se sua utilização para moléculas essencialmente apolares com
baixa massa molecular (normalmente até 500 Dalton);

iii. Em alguns casos o íon molecular pode não aparecer: uma vez que ocorrem
diversas fragmentações o íon molecular pode ser convertido totalmente para fragmentos,
o que faz com que a informação da massa molecular seja perdida;

26
3. IONIZAÇÃO POR ELETRONSPRAY (ESI)

Para solucionar justamente os obstáculos impostos pela técnica de EI, em 1989 John
Fenn inventou uma nova maneira de ionizar e levar estes íons a modo gasoso.
Denominada de Ionização por Eletronspray, esta promove a ionização das moléculas sem
a necessidade de volatilizar as espécies. Esta técnica atualmente ocupa mais de 90% dos
casos para MS, uma vez que a amostra é inserida ainda em solução. Desta forma, em
2002 John Fenn foi laureado com o Nobel de Química.

A técnica consiste em, inicialmente submeter à solução de interesse em um capilar.

Neste capilar aplica-se uma diferença de potencial de 1-5 kV (podendo este ser de modo
positivo ou negativo). Esta etapa faz com que, se a tensão aplicada no capilar seja
positiva, ocorrerá uma atração pelas cargas negativas presentes na solução, fazendo-se
assim uma reação de oxidação. Caso a tensão aplicada seja negativa, as cargas positivas
em solução serão atraídas a fim de promover reações de oxidação. Esta etapa faz com que
haja uma concentração de íons com determinada polaridade no fim do capilar.

Uma vez que esta concentração é alta, esta repulsão é capaz de ejetar estes íons
solvatados para fora do capilar. No espaço entre a saída do capilar até o inicio do
analisador de massa carga, estas gotas formadas e ejetadas são submetidas a aquecimento
a fim de secagem desta. Este é o momento mais importante do ESI; uma vez que se inicia
a secagem, os íons acumulados na etapa anterior iniciam um movimento repulsivo ao
mesmo tempo em que a gota seca. No limite da conciliação entre secagem da gota –
repulsão eletrostática ocorre o colapso da mesma, se fragmentando em gotas menores. É
através deste processo que, no fim deste têm-se um íon em fase gasosa.
Note que, em termos gerais o ESI não promove a ionização, apenas a secagem dos íons.
O composto já entra no ESI em forma iônica.

Para a formação de íons em fase aquosa se utiliza da química convencional: para a

maior quantidade de funções orgânicas e compostos existentes, estes abrigam sítios
ácidos e/ou ácidos, o que pode promover a formação de íons simplesmente adicionando
ao meio um ácido ou base de Lewis fraco. As únicas classes de compostos que não são
facilmente protonados/ desprotonados são os alcanos e haletos de alquila, entretanto estas
duas classes são as que atendem os requisitos para a ionização por EI.

27
 Figura 15: Processo simplificado de ionização utilizando eletronspray

Os espectros obtidos por ESI são altamente superiores aos de EI tratando-se dos
requistos de pico molecular. A técnica de ESI possui fragmentações muito mais brandas e
menos energéticas que a EI, permitindo que o pico molecular seja preservado.

Entretanto deve-se lembrar

de que, diferente da EI o
valor de m/z para o pico
molecular não representa a
massa molecular do analito.
Isto porque na EI o que
ocorre é apenas a perca de um
elétron, formando um radical
carregado positivamente; Figura 16: Métodos de formação de íons em fase aquosa para ESI
para a ESI a etapa final é a
protonação/ desprotonação, vinculando a perca ou ganho de um próton.

28
 Assim:

- Utilizando ESI (+): ocorre a protonação do analito. Assim o pico molecular é M+1;

- Utilizando ESI (-): ocorre a desprotonação do analito. Assim o pico molecular é M-1;

Não se pode dizer em

nenhum momento que o
método de ionização EI é
menor importante que o ESI.
Polímeros
Cada um dos métodos possuem Alcanos e Proteínas
suas particularidades bem
como aplicações principais.
Hidrocarbonetos, compostos
com baixa massa molecular e
haletos de alquila
podem Figura 17: Demonstração das aplicações dos métodos de
unicamente ser determinados ionização para compostos orgânicos
utilizando EI. Entretanto a ESI
pode ser utilizada para todos os outros casos. Sua utilização é estendida até para
moléculas altamente polares e com alta massa molecular, como proteínas ou polímeros.

4. ACOPLAMENTOS COM CROMATOGRAFIA

A espectrometria de massas pode ser acoplada com diversas técnicas, como a

eletroforese capilar ou as cromatografias gasosa (GC) ou líquida de alta eficiência
(HPLC). Estas permitem que caso a amostra se consista em uma mistura de analitos eles
sejam primeiramente separados pelos princípios destas técnicas, fazendo com que cada
analito chegue com seu respectivo tempo de retenção ao espectrômetro.

Sabe-se de princípio que o método de ionização EI só é realmente útil quando se

analisa uma substância pura, uma vez que uma mistura provocaria picos referentes a
fragmentação dos dois componentes, impedindo a analise exata de apenas um composto.

29
 Como raramente se analisa uma substância pura, o acoplamento entre MS-EI com GC,
gerando GC-MS torna-se uma ótima solução para este problema. Uma vez que a
cromatografia gasosa separa cada substância com alta resolução, fazendo com que o
espectrômetro identifique e analise apenas um composto da mistura de cada vez.

O acoplamento entre GC e MS é mais beneficiado uma vez que o método EI trabalha

com a formação de íons já na fase gasosa. Utilizar a HPLC para EI geraria inúmeras
complicações, como a conversão da espécie radicalar positiva em solução.

As maiorias dos GC atuais contam com um espectro de massas acoplado, permitindo a

identificação rápida em termos qualitativos. Estes espectrômetros contam normalmente
com uma grande biblioteca de espectros que podem ser comparados. Lembrando que a
técnica de EI permite resultados com grande reprodutibilidade devido a sua técnica não
ter modificações experimentais as comparações entre os bancos de dados e os espectros
obtidos normalmente garantem grande precisão na identificação.

Pelos mesmos motivos já citados também se chega a conclusão que a melhor técnica a
ser acoplada a ESI é a HPLC. Uma vez que nesta técnica de ionização os íons são
inseridos em meio aquoso, acoplar o espectrômetro com um HPLC garante boa resolução
e identificação dos compostos da mistura. Como no modo ESI ocorre menor chance de
fragmentação, raramente têm-se picos moleculares concomitantes, com exceção de
moléculas com massas isobáricas (casos mais raros).

Figura 18: Representações esquemáticas de acoplamentos GC-MS (acima) e HPLC-MS (abaixo)

30
5. ESPECTROS ESI- MULTIPROTONAÇÕES/MULTIDESPROTONAÇÕES

Uma das maiores vantagens do método ESI é a possibilidade de levar compostos com
massas moleculares elevadas e não voláteis para a fase gasosa. É importante lembrar de
que este método não forma íons, uma vez que a solução que entra no capilar já se
encontra em forma iônica. Análise utilizando este método, quando voltada a estruturas e
moléculas muito grandes (atualmente a maioria dos estudos na área de espectrometria de
massas baseia-se em estudos de moléculas macrobiológicas, como proteínas, lipídeos,
hormônios, entre outros) pode gerar espectros com diversas propriedades únicas.

Como já se sabe também, o modo de ESI utilizado afetará o valor referente ao o pico
molecular de forma que:

- Utilizando ESI (+): ocorre a protonação do analito. Assim o pico molecular é M+1;

- Utilizando ESI (-): ocorre a desprotonação do analito. Assim o pico molecular é M-1;

Quando a análise se baseia em moléculas grandes, observam-se algumas modificações

sofridas no espectro, como pode ser visto no exemplo abaixo:

Figura 19: Espectro de massas para um peptídeo com massa molecular próxima a 1500 Dalton

31
 Aproximando o pico observado é possível enxergar o padrão isotópico para este
composto, que como já anteriormente explicado, refere-se às probabilidades encontradas
para a presença de átomos de carbono na estrutura. Entretanto, notando-se bem o padrão
isotópico desdobrado é possível ver que a diferença entre um sinal e outro e de
aproximadamente 0,5 e não de 1,0 como esperado para qualquer composto. A resposta para
isto encontra-se no eixo x do espectro. O espectrômetro de massas mede de fato a relação
massa/carga do analito. Desta forma, o padrão isotópico que possui a diferença de uma
unidade de massa entre os picos somente seria possível caso o composto estive na forma
monoprotonada (ou monodesprotonada). Para um espaçamento de 0,5 seguindo ao
esperado, sabe-se que este composto apresenta-se na forma com duas protonações ou duas
desprotonações. Assim, seu pico molecular refere-se a M+2 ou M-2.

Diversos exercícios necessitam deste tipo de tratamento inicial. Caso adotasse este pico
como sendo o molecular, o erro em torno da massa molecular do composto seria de 200%
comparado ao valor real (caso a molécula se apresentasse com duas protonações ou
desprotonações). Para determinar a massa molecular nestes casos deve-se avaliar o
espaçamento entre dois picos adjacentes. Sendo dois picos M e M’:

Se: - Δm/z (M-M’) = 0,5, tem-se uma dupla protonação ou dupla desprotonação;

- Δm/z (M-M’) = 033, tem-se uma tripla protonação ou tripla desprotonação;

- Δm/z (M-M’) = 0,25, tem-se uma tetra protonação ou tetra desprotonação;

E assim consequentemente para espaçamentos de 0,20; 0,166 e cada vez menores.

Através desta informação agora se pode calcular a massa molecular do composto. Para isto
deve-se primeiro achar a quantidade de protonações ou desprotonações realizadas. Outra
informação importante antes de se avaliar a massa molecular é saber se o método de ESI
utilizado foi ESI (+) ou ESI (-).

De modo geral as massas moleculares são dadas por:

- Em ESI (+): - Em ESI (-):

32
 Estas fórmulas vão de encontro com o que já se sabe, uma vez que se determina
primeiramente um pico onde se conhece o número de protonações ou desprotonações
ocorridas. Este valor é dividido pelo número de protonações ou desprotonações ocorridas.
Para o valor de m/z pico deve-se adotar o pico molecular. A diferença entre as fórmulas é
que para a ESI (+) ocorreram protonações, então se deve descontar o número de prótons
adicionado. Por motivo análogo, na ESI (-) deve-se adicionar o número de prótons
removidos no processo de formação dos íons em fase aquosa.

Os exemplos a seguir permitem compreender melhor este tópico:

Exemplo:

A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,50.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
di-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:

Exemplo 2:

33
 A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,33.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
tri-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:

Deve-se atentar na escolha de qual pico será utilizado na fórmula – pico molecular.

Exemplo 3:

A partir do espectro de massas acima, vê-se que a diferença entre os picos é de 0,25.
Aliando isto ao fato de que o modo é ESI (+) sabe-se que este composto esta
tetra-protonado. Utilizando a fórmula mostrada na página anterior:

Para os exemplos acima se verifica que a escolha do pico molecular é essencial para
garantir que a massa molecular seja corretamente calculada. Entretanto em compostos
com massas moleculares acima de 5000 Dalton espera-se protonações ou desprotonações
em quantidades acima de 10-15 unidades. Isto resulta em uma diferença dos sinais
massa/carga inferior à Δm/z de 0,10. Nestes casos torna-se impossível calcular através do
padrão isotópico o número de protonações e/ou desprotonações presentes. Desta forma,
outros meios são necessários para determinação de massa molecular em proteínas ou
macromoléculas orgânicas.

34
 A demonstração da fórmula empregada para a determinação da massa molecular nestes
casos é demonstrada junto ao exemplo a seguir:

Exemplo:

Considerando o pico de m/z 845,1. Sabe-se que este pico possui, devido ao método
empregado ser ESI (+), um número de protonações iguais à x. Tomando agora o pico à
sua esquerda com m/z 804,9, sabe-se que este pico possui x+1 protonações. Assim, pode-
se formar um sistema linear a fim de determinar a massa molecular.

A resolução deste sistema linear resulta em uma massa

molecular igual a 16881 Dalton. Neste exemplo, o espectro
mostrado corresponde a proteína mioglobina.

Duas regras muito importantes devem ser seguidas para as equações mostradas:

i. Os picos escolhidos devem ser um adjacente ao outro. A fórmula para um pico à

direita do escolhido é diferente da fórmula para um pico à esquerda;

ii. Além da mudança da fórmula para os picos adjacentes à esquerda e direita, para
os diferentes métodos de ESI tem-se diferentes fórmulas;

35
 O resultado encontrado para a massa molecular da mioglobina seria idêntico caso fosse
utilizado na fórmula o pico à direita do m/z 845,1. Entretanto, deve-se lembrar de que o
pico a direita corresponde à massa molecular com x-1 protonações. Desta forma o sistema
de equações seria diferente para a segunda expressão.
Para dois picos adjacentes têm-se as seguintes fórmulas para calcular massa molecular.
Lembrar sempre de observar o método de ionização utilizado, além das posições relativas
entre os picos escolhidos.

- Método ESI (+): para um pico escolhido e, respectivamente, um pico adjacente à

esquerda ou a direita deste pico tem-se as seguintes fórmulas:

- Método ESI (-): para um pico escolhido e, respectivamente, um pico adjacente à

esquerda ou a direita deste pico tem-se as seguintes fórmulas:

Estes mesmos métodos podem ser utilizados para a determinação de massas

moleculares em complexos organometálicos ou polímeros, onde há a facilidade de ocorrer
um grande número de protonações e/ou desprotonações. Lembre-se sempre que os sítios
devem estar relativamente distantes para facilitar e estabilizar a mutiprotonação ou
multidesprotonação. Outro ponto importante é reconhecer os principais sítios ácidos e
básicos dentro da química orgânica: ácidos carboxílicos e fenóis podem ser facilmente
desprotonados, enquanto aminas e carbonilas tem facilidade quanto a protonação.

36
CAPÍTULO IV – MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E REARRANJOS

1. INTRODUÇÃO

Como já discutido anteriormente, quando se emprega os métodos de ionização para

dada molécula a esta pode ser transferida energia. Esta energia pode ser dissipada (o que
raramente ocorre devido às condições a qual a ionização ocorre) ou utilizada pela
molécula. A utilização desta energia sempre provoca quebra de ligações químicas,
gerando radicais ou íons, denominados fragmentos moleculares. A energia transferida à
molécula, bem como a natureza das ligações presentes é que irão governar as chamadas
fragmentações moleculares. Nesta parte deve-se relembrar das principais regras de
mecanismos iônicos e radicalares já estudados em disciplinas passadas.

Deve-se neste momento introduzir uma importante regra que diz respeito aos
processos de fragmentação em uma molécula. Conhecida como Regra de Stevenson, ela
pode ser simplificadamente transcrita como “entre optar pela estabilidade relativa de um
cátion e um radical, o cátion é quem governará. Estabilizar um cátion é mais favorável
energicamente do que estabilizar um radical”.

A compreensão dos processos envolvendo os íons radicalares são os mais difíceis, pois
envolvem mecanismos radicalares, pouco exploradas até o momento. Pode-se, entretanto,
compreender facilmente os produtos gerados das fragmentações através da regra dos
números de elétrons:

Iniciando com uma molécula de massa par (ou seja, sem número ímpar de nitrogênios):

Figura 20: Demonstração das possibilidades de fragmentação de um íon radicalar 37

 Dessa forma, como fragmentação de um íon radicalar, há duas possibilidades iniciais:
a formação de um novo fragmento de massa par, junto à uma molécula neutra de massa
par ou a formação de um fragmento de massa ímpar junto à um radical de massa ímpar. Já
para processos onde inicialmente tem-se um composto iônico, e não radicalar usa-se os
conhecimentos dos mecanismos já estudados.

2. PRINCIPAIS CLASSES DE FRAGMENTAÇÕES

2.1. CLIVAGEM ALFA (α)

Ocorrem essencialmente em íons radicalares em heteroátomos, realizando uma cisão

em relação à posição alfa do mesmo. Os exemplos mais clássicos são observados para
carbonilas, onde se inicia com a remoção de um elétron do oxigênio. A clivagem-alfa é
induzida unicamente pela presença dos íons radicalares, podendo ocorrer uma ou diversas
vezes. É importante lembrar neste momento que apenas compostos na forma de íons é
que poderão ser detectados pela técnica. Podem gerar moléculas neutras e novos íons
radicais ou radicais e íons moleculares, abrindo possibilidade de uma nova classe de
fragmentação, conhecida como clivagem indutiva.

2.2. CLIVAGEM INDUTIVA (i)

São ocasionadas por íons, não radicais. É observada após fragmentações alfa em íons
inicialmente radicalares ou através de fragmentações em sistemas de ionizações por ESI.
Neste caso a clivagem é induzida pelos íons, normalmente gerado em sítios consistidos
por heteroátomos. Como produtos normalmente gerados encontram-se novos íons e
moléculas neutras, sendo estas não detectadas.

38
 A melhor forma de compreender estes processos é através de exemplos. Os próximos
formam um crescendo de complexidade em termos de estruturas. Observe que para uma
mesma molécula há uma grande quantidade de possibilidades de fragmentações, além de
que, uma pequena mudança na estrutura do composto pode gerar, de dois isômeros, uma
quantidade diferente de fragmentos.

Exemplo 1: Propanona utilizando EI

Exemplo 2: Propanona utilizando ESI-(+)

De primeiro momento nota-se se demonstra que a ESI pode gerar um pequeno número
de fragmentos, uma vez que é mais branda (radicais são espécies mais reativas). Além
disto, o método ESI não pode realizar clivagens-alfa, uma vez que não haverá a formação
de íons. No caso acima a propanona não pode ser analisada por ESI-(-) uma vez que
cetonas não possuem hidrogênios-ácido disponíveis.

39
 Exemplo 3: 3-Heptanona utilizando EI

i
i

Exemplo 4: 3-Heptanona utilizando ESI-(+)

Funções orgânicas como alcoóis, ácidos carboxílicos e aminas são preferencialmente

analisados via ESI, devido a presença de sítios ácidos e básicos.

40
Exemplo 5: Ácido butanoico utilizando ESI-(-)

Exemplo 6: 2,3-Dimetil-propanoamina utilizando ESI-(+)

Exemplo 7: 2,3-Dimetil-Propanoamina utilizando EI

i i

41
 Exemplo 8: 3-Hexanol utilizando ESI-(+)

i i

Exemplo 9: Isopropil, n-propil éter utilizando ESI-(+)

i
i

Para a próxima imagem observa-se a diferença das intensidades de fragmentos obtidos

para isômeros de alcanos de sete carbonos. Todos os picos são modificados, incluindo o
molecular. Isto se deve significativamente as estabilidades e cinéticas para as
fragmentações possíveis. Não apenas a estabilidade do radical iônico, mas a velocidade
da fragmentação influencia nas intensidades relativas finais.

42
Figura 21: Exemplos de espectros obtidos para diferentes isômeros de heptano, junto a seus fragmentos

Provavelmente a classe mais complexa de analisar as principais rotas de fragmentação

são as amidas, uma vez que podem sofrer impacto eletrônico na carbonila ou no
nitrogênio. Naturalmente, devido a maior estabilidade gerada, os fragmentos obtidos a
partir da carbonila são mais abundantes quando comparados com os fragmentos vindos
das fragmentações do nitrogênio.

43
 Exemplo 10: N-benzil-fenilamida utilizando EI

i
i

α
i

De primeiro momento o íon R-NH+ pode causar estranhamento, uma vez que nos
mecanismos conhecidos, R-NH3 possui uma carga positiva, enquanto R-NH possui uma
carga negativa. Entretanto, observe que neste caso, o composto R-NH possui apenas um
par de elétrons livre e não dois como comumente ocorrem. Utilizando a fórmula para
carga formal efetiva, chega-se na carga de +1, concordando com o valor colocado.

44
 Até o momento se estudou duas possibilidades de fragmentações, supondo um
composto com massa inicial par (seguindo assim as regras do nitrogênio).

Clivagem Alfa

Clivagem Indutiva

Figura 22: Esquemas das duas possibilidades de clivagens anteriormente estudadas

Há ainda uma terceira possibilidade de clivagem onde a molécula inicialmente em

estado de íon radicalar pode se fragmentar gerando assim uma molécula neutra, de massa
par e assim um novo íon radicalar de massa par. Estas classes de reações recebem um
nome especial: rearranjos, ou mais especificadamente, Rearranjos de McLafferty.

2.3. REARRANJOS DE McLAFFERTY

Neste momento, para as rotas mostradas será mostrado apenas o mecanismo

envolvendo o rearranjo citado. Lembrando que, para uma molécula, podem ocorrer
simultaneamente clivagens alfa, indutivas e rearranjos. Não há uma ordem de
preferência ou predição de intensidade de fragmentos gerados. Assim, além dos
rearranjos que serão mostrados, deve-se lembrar da possibilidade da existência de
rearranjos. Rearranjos de McLafferty são típicos para carbonilas de maior tamanho.

45
 Para cetonas (ou aldeídos) que apresentam para um dos seus substituintes uma cadeia
igual ou maior do que quatro carbonos dispostos linearmente pode-se realizar um
rearranjo de McLafferty, como mostrado a seguir.

Figura 23: Mecanismo genérico para um rearranjo de McLafferty em cetonas

Observa-se então a eliminação de uma olefina de massa par. Sendo o composto

inicialmente de massa par, a única possibilidade é a formação de um novo íon radicalar de
massa par (afinal, a única combinação de se somar dois números gerando um número par,
sendo um destes par, é a soma de um número par com outro par).

Para compostos onde os dois substituintes são suficientemente grandes o rearranjo

pode ocorrer dos dois lados, gerando assim dois novos íons radicalares.

Exemplo 1: Rearranjo de McLafferty para a n-butil-isopentil cetona

46
 Da mesma forma esquematizada anteriormente, tem-se que:

Rearranjo de McLafferty

Figura 24: Esquema da possibilidade de rearranjo de McLafferty para cetonas

3. FRAGMENTAÇÕES E REARRANJOS EM AROMÁTICOS

3.1. FRAGMENTAÇÕES TÍPICAS

Sendo neste caso aromáticos compostos que apresentam pelo menos um benzeno em
sua estrutura, há diversos íons que são típicos para qualquer aromático e que sempre irão
ser registrados em um espectrômetro de massa, independentemente dos seus substituintes.
São eles, em m/z: 39, 51, 65 e 77. De forma estrutural:

Figura 25: Fragmentos típicos observados para um benzeno utilizando EI

47
 Os mecanismos para obtenção destes fragmentos são demasiadamente complexos para
o momento, sendo assim, deve-se apenas lembrar-se das suas relações massa/carga e
estruturas. O espectro de massas para o benzeno é mostrado a seguir:

Figura 26: Espectro de massas para o benzeno, evidenciando os fragmentos anteriormente citados

3.2. REARRANJOS EM AROMÁTICOS

Para aromáticos há duas possibilidades essenciais para rearranjos. O primeiro deles

ocorre para qualquer aromático que possui como substituinte um grupo alquílico
(qualquer cadeia com pelo menos um carbono), chamado também de rearranjo do íon
tropílio, devido à estrutura genérica do produto gerado.

Figura 27: Mecanismo genérico para um rearranjo do íon tropílio

48
Exemplo 1: Rearranjo do íon tropílio para o p-metil fenol

Nota-se que para o derivado do íon tropílio gerado sua massa deve-se justamente à
massa do íon tropílio (m/z 91) subtraído de um hidrogênio e adicionado 17 unidades
devido ao grupo hidroxila adicionado. O íon tropílio possui uma estabilidade apreciável
devido a atender as regras de Hückel para aromaticidade dos compostos.

Exemplo 2: Rearranjo do íon tropílio para o p-aminobenzil metil éter

Novamente podem-se aplicar as regras quanto a massa do íon tropílio gerada. É

novamente necessário compreender que caso o composto apresente possibilidades,
clivagens alfa ou indutivas ou rearranjos de McLafferty podem ocorrer ao composto.

Entretanto, da mesma forma já analisada para cetonas, caso o substituinte no aromático

seja grande (no mínimo quatro carbonos lineares), pode-se efetuar uma derivação do
rearranjo de McLafferty para aromáticos.

49
 Figura 28: Mecanismo genérico para a derivação do rearranjo de McLafferty em aromáticos

Em um mesmo composto pode ser observado o rearranjo do íon tropílio e a derivação

de McLafferty, podendo-se predizer alguns sinais para aromáticos. Deve-se salientar que
se o composto possui cadeia longa suficientemente para realizar a derivação de
McLafferty ele também tem os requisitos necessários para realizar o rearranjo do íon
tropílio, como mostrado a seguir.

Exemplo 3: Demonstração de alguns fragmentos para o 2-metil-n-pentil benzeno

50
4. PREDIÇÃO DE FRAGMENTOS E ESPECTROS DE MASSA

Por fim podem-se juntar todas as informações obtidas desde o Capítulo II para, a partir
de uma molécula dada, predizer fragmentos esperados. O caminho inverso, de determinar
a estrutura a partir do espectro é um pouco mais complexo e não será objetivo neste
momento. Neste processo serão empregados conceitos como padrões isotópicos,
rearranjos, clivagens e métodos de ionização.

Para os exemplos a seguir é importante notar que, a intensidade relativa dos sinais não
é levada em consideração, pois são dados empíricos. Os fragmentos mostrados são
gerados a partir de todas as classes estudadas anteriormente, ocorrendo simultaneamente
na molécula. O que será feito então não foge da analise empírica de todas as
possibilidades de fragmentação para uma molécula dada levando sempre em consideração
o método de ionização empregado para a mesma.

Os exemplos a seguir não são acompanhados dos mecanismos de fragmentação, uma

vez que estes já foram abordados anteriormente. Compete assim ao aluno identificar os
processos ocorridos para cada um dos fragmentos gerados.

Para simplificar será adotada a seguinte representação a partir do próximo exemplo:

- Seta Azul: indica uma clivagem-alfa;

- Seta Vermelha: indica uma clivagem indutiva;

- Seta Laranja: indica um rearranjo (podendo este ser de McLafferty ou do íon tropílio);

Setas pretas indicam a remoção de algum fragmento ou íon, como já estava sendo
realizado anteriormente. Atente as relações massa carga de todos os fragmentos; como
dito, as intensidades dos sinais não podem ser dadas, entretanto as intensidades relativas
de padrões isotópicos podem como nos casos já estudados.

51
 Moléculas complexas podem gerar uma infinidade de fragmentos, como visto:

Figura 29: Rota sintética para um biocomposto utilizando na detecção de metabólitos em camundongos

Exemplo 1: p-cloro-benzil-metil cetona utilizando EI

52
Exemplo 2: n-butil-isopentil-Cetona utilizando ESI-(+)

Conforme já anteriormente citado, em cetonas com tamanho apropriado uma

infinidade de clivagens e rearranjos podem ocorrer, gerando diversos fragmentos. Em um
espectro experimental pode ser que algum processo seja cineticamente desfavorável.

53
 Exemplo 3: Fragmentos para diferentes tipos de ionização de um aromático substituído

54
CAPÍTULO V – ANALISADORES MASSA/CARGA

1. INTRODUÇÃO

Até o momento já se compreende como uma amostra pode ser ionizada e levada à fase
gasosa através de diferentes métodos, além de como se podem realizar suas
fragmentações, gerando frações da estrutura que podem indicar a presença de
determinados grupos funcionais ou de átomos com padrões isotópicos conhecidos.

Entretanto, remetendo-se à Figura 5 nota-se a presença de um componente ao qual sua

principal função é a separação dos íons formados através da sua relação massa/carga. Este
componente é o analisador massa/carga, podendo ser de diversos tipos, contendo assim
suas particularidades, vantagens e desvantagens.

Diversos parâmetros que mostram a qualidade e eficiência para dado analisador

massa/carga são obtidos da mesma maneira para todos os tipos de analisadores existentes.
São eles a resolução, sensibilidade, discriminação e exatidão do equipamento.
Primeiramente deve-se conhecer cada um destes parâmetros, como são obtidos e o que
mostram a respeito do equipamento utilizado.

i. Resolução no Espectro: é uma medida

numérica da qualidade de separação de dois picos
próximos entre si. Este conceito é muito próximo do
já estudado para a cromatografia, utilizando o
parâmetro FWHM – Full Width Falf Maximum (ou
Largura Total à Meia Altura). A resolução é dada
pela seguinte fórmula:

Figura 30: Interpretação gráfica para cálculo de FWHM

55
 Exemplo: calculando a resolução para o seguinte pico dentro de um espectro

= 1627

Em termos de aparelhos, no mercado há duas classes disponíveis: uma à qual a

resolução é unitária, podendo separar picos com a diferença de uma unidade massa/carga
ou os quais dizem ser de alta resolução. Neste último caso a resolução varia conforme se
altera a massa do composto. Pode-se perguntar: “por que variar a resolução do aparelho
ao longo da análise é necessário?”. Tomemos um exemplo:

Exemplo: calcular a largura do pico para compostos de massa: 10, 300 e 15000 Dalton
supondo uma resolução fixa em 5000 (resolução não possui unidade).

- Para 10 Dalton: 5000 = 10 / FWHM → FWHM: 0,002

- Para 300 Dalton: 5000 = 300 / FWHM → FWHM: 0,06

- Para 15000 Dalton: 5000 = 15000 / FWHM → FWHM: 3

Observa-se assim que com o aumento da massa analisada o pico torna-se mais largo,
podendo chegar a um ponto extremo onde dois picos próximos começam a formar uma
banda (algo próximo a uma co-eluição cromatográfica). Desta forma, para equipamentos
mais modernos deve-se ou modificar a resolução conforme a massa cresce ou possuir
uma grande resolução, porém fixa. Equipamentos modernos contam com resoluções
superiores à um milhão, podendo separar massas de até 120 mil Dalton.

56
 Mais importante que compreender o conceito de resolução é verificar se a resolução
para tal equipamento é a mínima necessária para separar dois picos. Os dois picos mais
utilizados em espectros de massa são justamente o de um padrão isotópico. A fórmula
utilizada para cálculo da resolução mínima do analisador é mostarda a seguir:

Exemplo: considerando uma análise de um composto de massa 3500. Qual a resolução

mínima para garantir a separação do padrão isotópico desde composto?

Lembrando que em um padrão isotópico a distância entre dois picos adjacentes é de

uma unidade, justificando o valor utilizado acima. A Figura 31 mostra a diferença de um
espectro de massas para um padrão isotópico utilizando analisadores com diferentes
resoluções, mostrando a ideia da separação dos picos através de sua largura.

Figura 31: Diferentes espectros para analisadores com resolução de 1000 (em preto), de 3000 (em roxo)
e 10000 (em verde) para um composto de massa 1088 Dalton

57
 Figura 32: Diferentes espectros para compostos de diferentes massas utilizando uma resolução fixa de 5000

Outro ponto importante onde a resolução pode ser empregada é na separação e análise
de compostos com massa muito próxima. Como já dito, em aparelhos unitários isto não é
possível de ver visto, mas sabe-se que a massa de uma molécula é única para esta,
levando em consideração os átomos e isótopos presentes.

Exemplo: qual a resolução necessária para separar o gás nitrogênio (m/z 28,0061) do
monóxido de carbono (m/z 27,9949) ?

Ou seja, equipamentos com resolução inferior à 5000 não conseguirão discriminar CO

e N2 caso estejam presentes em uma amostra. Isto é importante, pois os picos
correspondentes a cada um dos compostos serão somados, gerando um erro na análise.

58
ii. Exatidão de Massa (Erro): é uma estimativa da precisão da análise, vista pela
diferença de massa experimental e a esperada. Equipamentos nominais não apresentam
erro uma vez que o erro mínimo seria de uma unidade, coincidindo com a possível massa
de outro íon. Espectrômetros modernos alcançam um erro na casa de ppm - partes por
milhão, o que significaria um erro de um grama à cada tonelada.
Diferente da resolução, o erro de massa é dado pela análise, dependendo da
calibração e do operador, devendo ser realizados anteriormente à análise. A fórmula para
o erro, em ppm, é mostrada a seguir:

OBS.: a exatidão, ou erro, não pode ser maior do que a distância entre dois picos, pois
deste modo os dois picos iriam concomitar. Assim, nota-se que a resolução de nada
importa caso a exatidão contida na análise seja baixa.

Exemplo: qual o erro máximo permitido para diferenciar uma massa de 10 e 11 Dalton?

Além destas duas características principais serão avaliadas para cada um dos
analisadores estudados suas possibilidades de acoplamento, o tipo de feixe utilizado
(contínuo ou pulsado), sua discriminação (vinculada à analise simultânea de íon), a
sensibilidade para cada método, entre outras características.

Também serão estudadas as técnicas de acoplamento de MS/MS e MS/MS/MS, suas

aplicações, particularidades e recomendações principais.

59
 2. ANALISADOR POR SETOR MAGNÉTICO (S.M.)

Primeiro analisador projetado tem seu funcionamento inteiramente compreendido

através de fenômenos eletromagnéticos. Sua representação simplificada consta na Figura
33 mostrada abaixo. Observe que o analisador está diretamente acoplado ao final de um
dos métodos de ionização já estudados; assim, logo após a formação dos íons em fase
gasosa, estes são direcionados para o analisador.

Figura 33: Representação simplificada de um analisador por setor magnético

Admitindo-se um íon com determinada massa/carga definida caminhando pelo

analisador. Utilizando a regra da mão direita sabe que quando este entrar em um campo
magnético ele realizará uma curva dentro do espaço, como mostrado na Figura 33. Agora,
admitindo-se quaisquer outros íons, com outras razões massa/carga, estes se chocarão
com as paredes do equipamento devido as suas diferentes razões massa/carga, garantindo
assim que a análise possa ser executada. Fisicamente a relação entre a razão massa/carga
selecionada e o campo magnético aplicado responde à equação:

Sendo: Raio – raio de saída do injetor de íons (fixo)

B – campo magnético aplicado

V – velocidade de saída do íon

60
 Assim, regulando-se o campo magnético pode-se fazer uma chamada “varredura de
íons”; ou seja, a análise de uma massa/carga por vez é chamada de análise
discriminatória de íons, sendo esta uma característica típica para o setor magnético.

Entretanto, analisando a equação

anterior percebe-se a presença de uma
variável “V”, que responde a velocidade
de saída do íon. Sabe-se também que os
íons estão essencialmente na forma de
plasma – um gás carregado com cargas
elétricas. Assim, a velocidade de saída
não é única para todos os íons, havendo Figura 34: Gráfico para a distribuição de velocidade
de Boltzmann para um íon em fase gasosa
uma distribuição de velocidade seguindo
a distribuição de velocidade de Boltzmann.

Isto implica que para um íon de dada razão massa/carga “M” haverá íons com uma
massa/carga inferior, mas com velocidade superior ao dos íons “M”, atendendo assim o
campo “B” aplicado. Também haverá íons com uma razão massa/carga inferior à “M”
que possuirão menor velocidade, também atendendo a equação citada. Isto significa que
não somente os íons com razão “M” serão detectados, ocasionando erros à análise.
Devido a Lei de Distribuição de Velocidades não há capacidade de completa separação
dos íons utilizando unicamente um campo magnético.

A solução encontrada é acoplar além de um campo magnético um campo elétrico,

fazendo com que após a discriminação dos íons quanto sua “razão massa/carga” estes
sejam submetidos à uma separação de acordo com suas energias cinéticas. Como a
energia cinética esta associada à velocidade os íons podem ser separados utilizando este
parâmetro. Utilizando a explicação anteriormente dada, agora os íons com razão
massa/carga inferior à M, mas com maiores velocidades e os íons com razão massa/carga
superior M, mas com velocidades menores podem ser separados.

Fisicamente as leis que descrevem estes fenômenos são dadas por:

61
 Atualmente os equipamentos que utilizam estes dois setores são conhecidos como
dupla focalização, uma vez que inicialmente é aplicada a focalização magnética e logo em
seguida a focalização elétrica. O esquema para representar estes equipamentos é muito
semelhante ao visto na Figura 33, sendo mostrada logo a seguir:

Figura 35: Representação simplificada de um analisador de dupla focalização

Resumindo a operação de um analisador de setor magnético (mesmo com a presença

de um setor elétrico, o nome popular utilizado é setor magnético):

- Setor magnético: separa os íons devido à sua relação massa/carga;

- Setor elétrico: separa os íons devido à sua energia cinética ou velocidade de saída;

O analisador de setor magnético conta com as seguintes características principais:

- Alta resolução (R ~ 50.000);

- Alta exatidão (Erro ~ 5-10 ppm);

- Analise discriminatória (menos para razão isotópico, que será vista posteriormente);

O setor magnético foi o primeiro analisador produzido para espectrometria de massas,

sendo o único aplicado até a década de 80. Entretanto é utilizado até hoje para técnicas de
razão isotópica e exploração espacial.

62
2.1. APLICAÇÕES DO SETOR MAGNÉTICO

2.1. O Início da Espectrometria de Massas – Descoberta dos Isótopos

O setor magnético surge junto com a espectrometria de massas e a descoberta dos

isótopos dos elementos químicos. Na realidade, estes feitos foram realizados todos em
conjunto. Tudo se inicia com o famoso físico Thomson, quando este determina a carga de
um elétron, ganhando o prêmio Nobel de física. Entretanto, suas pesquisas estavam muito
mais voltadas à área de estrutura atômica, abrindo espaço para que um aluno seu de
doutorado, Aston, idealizasse a utilização das tecnologias disponíveis para determinação
da massa de diferentes compostos.

O método proposto por este era

simples: incidir feixes de elementos em
placas fotográficas, captando padrões para
os elementos avaliados. Entretanto ao
avaliar o Neônio-20 em sua chapa
fotográfica foi visualizado uma mancha
correspondente também à uma massa 20.
O que poderia ser? Era a descoberta dos
isótopos a partir do Neônio-22. Na
ocasião o equipamento projetado era o
primeiro espectrômetro de massas feito,
utilizando um setor de magnético com
resolução de 130. Posteriormente Aston
constrói um novo espectrômetro de
resolução 2000, descobrindo no total, 212 Figura 36: Placas fotográficas utilizadas por Aston
dos 287 isótopos existentes, ganhando o na descoberta dos isótopos
prêmio Nobel por suas contribuições.

Além da grandiosa contribuição histórica para o avanço no conhecimento da estrutura

atômica dos elementos, o setor magnético está presente no enriquecimento de urânio, em
viagens espaciais e análise de dopping em atletas.

63
 2.1.2. A Exploração Espacial e o Setor Magnético

Uma das melhores vantagens de

um espectro de setor magnético é a
simplicidade e facilidade de sua
miniaturização, o que significa que
este pode ser incorporado dentro de
sondas espaciais, possibilitando uma
análise muito confiável dos
componentes principais junto a
abundância de diferentes formadores
do solo de outros planetas. Através de
outras técnicas já havia a capacidade
de determinação da composição da
“atmosfera” de outros astros;
entretanto unicamente com a
Figura 37: Representação esquemática da sonda enviada à
revolução trazida
pelos Marte junto ao espectro do solo deste planeta
espectrômetros de massa é que a
exploração dos solos foi possível. Na Figura 37 pode-se notar a presença de CO2 (m/z
44), N2 (m/z 28), Ne (m/z 40) e CH4 (m/z 16) em grandes quantidades e O2 (m/z 32) em
pequena quantidade relativa.

Além de Marte, já se conhece as composições da Lua, de satélites de Júpiter, de Vênus

e diversos outros planetas terrosos dentro do sistema solar.

2.1.3. Calutrons – Enriquecimento de Urânio

Durante a Segunda Guerra Mundial diversas instalações foram construídas recrutando

essencialmente mulheres para a simples função de: sentar a frente de um grande painel
com um marcador analógico. Quando este marcador chega-se à marca zero estas

64
deveriam chamar o superior, que
apertaria dois botões e o processo se
repetiria por longas jornadas de trabalho.
Estas instalações de segurança máxima
escondiam atrás do painel grandes
espectrômetros de massa que faziam a
separação quantitativa dos isótopos de
urânio através de um setor magnético. A
utilização de mulheres pode ser Figura 38: Esquema de um calutron construído no
Reino Unido na década de 40
explicada pela época em que se vivia:
uma tentativa do governo de delegar “funções importantes às mulheres do país” além da
crença de que mulheres iriam manter o sigilo de seus serviços, dada importância e
confidência do projeto envolvido.

Para a Figura 38 mostrada acima, observa-se o emprego da separação de componentes

para uma chamada “Tuballoy” - codinome para o projeto secreto do governo da Grã-
Bretanha e Canadá mantido de 1942 à 1952 a fim da construção de ogivas nucleares a
partir do enriquecimento de urânio.

2.1.4. Padrão Isotópico – Dopping e Análises Elementares

Atualmente o principal emprego do analisador por setor magnético reside em

determinações por padrões isotópicos. Resumidamente este método reside numa
modificação do setor magnético conhecido, realizando a determinação simultânea dos
íons 44, 45 e 46, além dos detectadores de razão massa/carga 2 e 3. Assim, tem-se um
equipamento com cinco detectores, aos quais respondem unicamente para dada relação
massa/carga, excluindo quaisquer outros íons formados. A análise simultânea é
necessária para diminuição do erro. O padrão isotópico tem como principal objetivo o
rastreamento da origem e histórico da amostra.

65
 Figura 39: Esquema de um espectrômetro a à base de setor magnético para análises de padrão isotópico

A compreensão de como este processo se dá é mais fácil com exemplos:

- H2O/ HDO: como há diferentes massas entre estes dois compostos, pode-se rastrear a
origem e histórico de dada amostra de água, uma vez que a quantidade de HDO presente
em rios é lagos é diferente da presente em nuvens (uma vez que a evaporação do HDO é
mais lenta devido a maior massa do composto). Neste caso se utiliza os detectores de
razão massa/carga 2 e 3, necessitando antes uma conversão química da amostra.

- 14C/ 13C/ 12C: de maneira semelhante pode-se determinar a presença de carbono em suas
três formas isotópicas possíveis utilizando para isto os detectores de 44, 45 e 46
(respectivo aos isótopos 12, 13 e 14 do carbono). Como o decaimento do carbono
presente em seres vivos tem meia vida de 10 mil anos, pode-se realizar datações através
da determinação de abundância relativa deste isótopo. Em questões de dopping o
processo é o mesmo, uma vez que a quantidade de dado hormônio nada pode informar,
entretanto a porcentagem relativa de Carbono-14 presente em esteroides sintéticos é
diferente do produzido pelo metabolismo, podendo ser fonte de análise.

66
3. ANALISADOR POR QUADRUPOLO (Q)

Atualmente é o analisador massa/carga mais utilizado em equipamentos, possuindo

uma montagem instrumental relativamente simples (quatro barras paralelas junto a um
circuito elétrico), mas com um princípio de funcionamento de relativa complexidade.

Para o momento unicamente será importante a compreensão de seu funcionamento de

modo qualitativo (uma vez que quantitativamente falando seria necessário diversas
divagações sobre cálculos diferenciais e física avançada).

A montagem segue a representação da Figura 40. Os motivos para os diâmetros e

distancias entre as barras são complexos, sendo uma necessidade para o funcionamento
do equipamento. Nos polos são aplicados dois tipos de pulsos que podem ser
desconhecidos até o momento: um DC e um RF.

Figura 40: (À Esquerda) - Esquema de diâmetros e distância entre polos. Deve-se atender que D/d = 1,148

(À Direita) – Esquema de disposição de polos e circuitos elétricos pelo quadrupolo

DC e AC se referem respectivamente à correntes direta e alternada. Enquanto isto RF

se refere à um pulso de radiofrequência. Por exemplo, a luz é uma radiação
eletromagnética que possui sua componente elétrica e magnética ortogonais entre si.
Agora, em primeiro momento eu aplico a um par de barras uma corrente direta. Isto gera

67
 dois polos (um positivo e negativo) conforme já se sabe. Devido a ser uma corrente direta
as voltagens destes dois polos não se alteram, gerando uma voltagem constante.
Entretanto, acima desta DC aplica-se uma RF. A grande ideia por trás do quadrupolo
encontra-se aqui: ao aplicar um campo de RF acima de um campo DC cria-se assim um
campo oscilante. Os íons que acabaram de sair do ionizador entram neste campo,
começando assim a oscilar de maneira a procurar um equilíbrio.

Regulando-se minuciosamente a RF e DC consegue-se uma situação de equilíbrio na

ressonância para um íon de dada razão massa/carga. Todos os outros íons irão colidir
com as barras, filtrando assim o íon de interesse.

3.1. DESCRIÇÃO QUALITATIVA

Primeiro deve-se adotar uma nova representação

para a eletrônica envolvida em um quadrupolo. A
representação mais fiel à utilizada está mostarda na
Figura 41. Nesta é importante ressaltar que para a
voltagem DC é oposta para cada par, enquanto na
RF há uma defasagem de 180º entre cada um dos
pares.

Isto pode ser visto em um gráfico de voltagem

em relação ao tempo, mostrado na Figura 42.
Aplicando-se uma DC de 500 Volts, sabe-se que Figura 41: Esquema representando os
inicialmente uma das barras possuirá voltagem de circuitos elétricos presentes em um
quadrupolo
+500 V enquanto a oposta terá voltagem de -500V.
Entretanto, ao introduzir a RF ocorrerá mudança das voltagens seguindo o conhecido
movimento senoidal. Assim, o máximo e o mínimo são dados pelo conhecido
Vpp – Tensão pico-a-pico. Para a Figura 42 se tem uma tensão de 2800 V entre os dois
máximos. Compreender estes gráficos é a primeira etapa para compreender como o
quadrupolo separa íons de diferentes razões massa/carga.

68
 Assim, nota-se que para uma das
barras esta sempre permanecerá com a
voltagem positiva. Já para a outra barra
ocorre o contrário.

Supondo agora que um íon positivo

com dada massa/carga entra no
quadrupolo. Para minimizar os efeitos
repulsivos o íon tende a permanecer em
movimento ressonante no centro do Figura 42: Gráfico de voltagens para barras do
campo (uma vez que quanto mais quadrupolo relacionado com o tempo
próximo da barra maior o campo uma vez que a relação é B ~ 1/r²). Quando por este
período curto de tempo a barra torna-se negativa o íon é atraído. Agora, os com maior
massa carga não se movimentam muito, fazendo com que o tempo ao qual a barra de
torne negativa não seja suficiente para elimina-los. Entretanto para os íons com baixa
razão massa/carga, com maior energia cinética, ocorre uma atração rápida, fazendo com
que estes se choquem com a barra. Assim, neste caso ocorre a eliminação dos íons com
razão massa/carga inferior a desejada.

O processo praticamente oposto ocorre para a outra barra. Como esta tem uma
polaridade negativa, ocorre a atração dos íons. Os únicos íons que não se chocam seriam
os que conseguem ser levados ao centro do campo no curto espaço de tempo ao qual a
barra permanece com polaridade positiva, configurando justamente aos íons com baixa
razão massa/carga. Para íons com maior razão massa/carga o tempo ao qual a barra
permanece positiva não é suficiente, fazendo com que o processo de atração culmine no
choque do íon contra a barra metálica, filtrando assim o íon desejado.

Para um íon carregado positivamente:

- Barra carregada com DC positiva: separa os íons com m/z inferior ao desejado;
chocando as massas mais altas por não conseguirem voltar ao centro do campo;

- Barra carregada com DC negativa: separa os íons com m/z superior ao desejado;
chocando as massas mais baixas pela rápida atração pela voltagem negativa;

69
 O espectro é obtido justamente discriminando qual razão massa/carga deseja-se
detectar, excluindo todas as outras possibilidades através das ressonâncias instáveis de
quaisquer outros íons que cheguem ao analisador.

Exemplo: para a análise de um íon com m/z 200. As imagens abaixo mostram secções do
quadrupolo, mostrando diferentes íons e suas ressonâncias instáveis, ocasionando seus
respectivos choques, filtrando-se apenas o íon desejado.

Sendo neste caso o plano YZ formado pelas barras negativas e o plano XZ formado
pelas barras positivas (choque da massa mais alta que desejada).

Assim, a análise pode ser realizada primeiramente analisando uma determinada razão
massa/carga e posteriormente modificando as condições de RF e DC para novos íons
desejados, caracterizando assim uma análise discriminatória de íons.
O quadrupolo possui diversas características únicas:

- Simples e Barato;

- Análise discriminatória;

- Resolução Unitária (único ponto negativo);

70
3.2. APROVEITAMENTO DO QUADRUPOLO (Q aprov.)

Para a análise discriminatória envolvida em um quadrupolo tem-se que para os íons

formados, enquanto um é “escolhido” para serem analisados, todos os outros são
descartados. Deste modo a intensidade relativa do sinal reduz muito, já que não são todos
os íons formados que serão aproveitados pelo equipamento.

A expressão que informa o aproveitamento do quadrupolo é dada por:

Exemplo: qual o aproveitamento do quadrupolo em uma varredura de íons de m/z 101 à

110 sendo que todos os íons possuem a mesma intensidade de geração.

O que significa que a intensidade relativa de um pico nesta análise será dez vezes
menor do que o esperado caso se monitorasse unicamente este íon. Assim, o
aproveitamento de um quadrupolo quase sempre é baixo para análises envolvendo a
varredura de uma determinada de faixa de íons. Normalmente, analises envolvem
varreduras com mais de 200 unidades, resultando em um aproveitamento de 0,05%. Para
o momento tenha em mente que em análises de varredura o quadrupolo apresenta baixo
aproveitamento, podendo variar com outras classes de análises.

Entretanto o quadrupolo é um dos analisadores mais utilizados atualmente, incluindo

nas áreas de genômica e proteômica. De fato, existem pequenos truques possíveis para
fazer com que seu aproveitamento seja de 100%. Estas técnicas serão estudadas no
Capítulo VI – Análises Sequenciais e Aplicações MS/MS.

71
 4. ANALISADOR POR TEMPO DE VOÔ (TOF)

É o exemplo mais antigo de analisadores de alta resolução, baseado justamente no

tempo de voo e percurso de um determinado íon. Diferentemente do quadrupolo, o TOF
apresenta além de uma montagem extremamente simples um princípio de funcionamento
simples. Observe sua representação clássica abaixo:

Figura 43: Representação simplificada de um analisador TOF

Assim, os íons que acabam de sair do ionizador são projetados através da área de
aceleração (que contem eletrodos que impulsionam o íon). Assim, caso os íons sejam
positivos deve-se polarizar os eletrodos de modo positivo a fim de garantir a ejeção dos
íons chegados. O próximo passo é fazer com que estes íons de fato voem através de uma
câmera de vácuo, chegando ao detector. O tempo de voo para cada íon é diretamente
relacionado à sua razão massa/carga dada pela seguinte equação:

O maior problema antigamente encontrado pelo TOF estava justamente na parte

eletrônica. Como a massa do elétron é muito reduzida, a diferença entre o tempo de voo
de massas diferentes é extremamente pequeno. Necessitando assim de detectores que
consigam responder a esta variação de estímulo com dada confiabilidade.

72
4.1. TOF LINEAR E TOF CONTÍNUO

São duas classes diferentes para o analisador TOF, sendo que entre estes o princípio de
funcionamento é o mesmo. Começando com o TOF linear, mais clássico e simples de ser
compreendido, observam-se as seguintes características:

- Analisador pulsado (Não-contínuo);

- Grande sensibilidade (garantida pela vantagem de Fellgett – não discriminatório);

- Baixa resolução (300-400);

Por analisador pulsado e contínuo compreende-se quanto ao meio à qual os íons são
introduzidos no analisador. Um analisador contínuo tem como o próprio nome já informa
uma injeção contínua e interrupta de íons. Já um analisador pulsado não disponibiliza
uma nova rodada de íons até que o último (sendo neste caso o íon mais pesado) chegue
ao detector. Assim, como o método ionizante teoricamente não interrompe a formação
dos íons de alguma forma ocorre a supressão do feixe de íons, sendo mandados por um
sistema de drenagem, até o momento aonde o último íon chega ao detector, onde os íons
formados podem novamente ser introduzidos no sistema.

Já a grande sensibilidade do TOF se deve ao fato de analise não ocorrer em modo

“varredura” como realizado no quadrupolo. Lembrando que no último apenas um
determinado íon com sua razão massa/carga é aproveitado enquanto todos os outros são
rejeitados, se ganha muito em sensibilidade para um analisador que não rejeita nenhum
íon. Todos os íons introduzidos são analisados e detectados. Fellgett descreve que um
sistema onde se analise todas as variáveis de uma vez em vez de uma por vez terá sua
sensibilidade elevada (o mesmo ocorre com sistemas de analise por infravermelho-
próximo onde se retira diversas informações do sistema em uma única análise).

Entretanto todas as vantagens do TOF são postas em balanço devido a sua baixa
resolução. Isto se deve ao problema cinético causado gerado pela utilização de íons em
fase gasosa (problema semelhante já foi anteriormente discutido para o analisador por
setor magnético). Desta forma, devido a lei de distribuição de velocidades de Maxwell, há
uma determinada janela de velocidade possíveis para os íons de uma mesma razão
massa/carga, vinculando um erro na análise.

73
 4.1.2. A Utilidade do Refletor

Para solucionar os problemas trazidos pela distribuição de velocidade de Maxwell-

Boltzmann pode-se acoplar um segundo instrumento ao TOF, conhecido como refletor.
Observe que a montagem do analisador é muito pouco modificada.

Figura 44: Esquema representativo de um analisador TOF acoplado com refletor

Observando a Figura 44 nota-se que a primeira mudança fundamental é exatamente no

tempo de voo do analisador, praticamente sendo dobrado. Mas o mais importante é
justamente o funcionamento do refletor. Sendo o íon analisado positivo, aplica-se no
refletor uma diferença de potencial positiva, fazendo com que os íons sejam
desacelerados, mudando sua trajetória. Com isto, corrige-se a dispersão de velocidade dos
íons, uma vez que os íons mais rápidos demoram mais à ser desacelerados, percorrendo
um caminho mais longo na ida.

Uma maneira simples de compreender isto é imaginar uma pista de atletismo: sem a
correção nas marcações, um corredor na raia mais “central” iria percorrer uma distância
menor do que um corredor na raia mais “afastada”. Agora, supondo que todos comecem
do mesmo ponto, mas adotando o corredor mais lento na raia mais “central” e o corredor
mais rápido na raia mais “afastada”, todos chegariam ao mesmo tempo, uma vez que o
corredor mais lento seria beneficiado por correr menor distância. Já o corredor mais
rápido seria prejudicado por ter que percorrer uma distância maior.

Neste momento o aumento da distância de tempo de voo é essencial, uma vez que
como já visto no setor magnético, íons com uma maior razão massa/carga mas com uma

74
menor velocidade, ou íons com menor massa/carga e velocidade maior também poderiam
entrar na faixa de íons analisados. Mas como o tubo é muito comprido, diferentes razões
massa/carga podem ser separados de acordo com suas energias cinéticas sem a
necessidade de se utilizar um setor elétrico.

Para compreender todas as vantagens do refletor a Figura 45 pode ser uma boa ajuda
ilustrativa de tudo o que foi comentado até o momento.

Figura 45: Princípio de funcionamento para um refletor idealizando a chegada simultânea dos íons

De fato a utilização do refletor em um TOF faz com que sua resolução salte de
300-400 para mais de 10 mil à 60 mil. Vinculando isto com sua alta exatidão (erro de
massa menores do que 3 ppm) isto torna este analisador excelente para análises
estruturais uma vez que, diferente do quadrupolo, uma análise de varredura não diminuirá
a eficiência do analisador já que todos os íons formados são detectados (como já
informado antes pela sua característica não discriminatória).

4.1.3. Pusher – TOF em Modo Contínuo

Até o momento apenas estudou-se os princípios de funcionamento para um TOF no

modo pulsado, onde um “pacote de íons” chega de maneira pulsada para ser analisado
pelo TOF, entretanto, as fontes estudadas (EI e ESI) têm natureza contínua.

75
 Figura 46: Esquema de utilização de um GC-TOF de pulso contínuo

O que se tem na Figura 46 é um cromatógrafo a gás acoplado com uma fonte de

ionização. A peça diferente neste esquema é exatamente o “Pusher” presente no primeiro
momento da câmera de TOF. Os íons acelerados chegam ao pusher, também chamado de
“empurrador” onde são depositados. Aplicia-se inicialmente uma diferença de potencial,
fazendo com que os íons sejam acelerados e percorram o TOF. No momento em que
último íon é detectado, outro pulso é liberado, acelerando uma nova “rodada” de feixe de
íons. Assim, acopla-se um ionizador de modo contínuo com um analsiador que
inicialmente só responderia à um feixe linear em íons.

5. ANALISADORES – REVISÃO

Tabela 1: Principais analisadores e suas características comparadas

Erro Sensibilidade Sensibilidade

Analisador Resolução Faixa m/z Varredura
(ppm) Monitoramento Varredura

Set. Mag. 50 mil 4000 <3 Discrim. +++ +

Quadrupolo Unitário 4000 Nominal Discrim. +++++ +

TOF 20 – 60 mil > 10000 <3 Não Discrim. - ++++

76
CAPÍTULO VI - ANÁLISES SEQUENCIAIS E APLICAÇÕES MS/MS

1. INTRODUÇÃO

Atualmente com o avanço das tecnológicas podem-se realizar análises cada vez mais
complexas, com compostos nunca antes imaginados e que serão estudados neste
momento. Entretanto para possibilitar tais analises os analisadores estudados não são
capazes de chegar aos resultados esperados.

O que será introduzido neste capítulo é conhecido como análise ou experimento de

massas sequencial. A maioria esmagadora das publicações atuais utilizam estas técnicas
para as mais diferentes análises de compostos. Os equipamentos modernos contam com
dois, três ou até mais analisadores massa/carga, podendo estes ser utilizados de maneira
combinada, gerando diversos tipos de análises.

Adota-se como uma análise MS/MS ou MS² os experimentos sequenciais que utilizam
dois analisadores massa/carga. Neste curso unicamente serão estudados estes casos (como
será visto adiante, se utilizará de fato três câmeras analisadoras, porém apenas duas é que
de fato serão empregadas como analisadoras). De modo análogo, experimentos
MS/MS/MS ou MS³ utilizam três analisadores.

Como já comentado antes, com um único analisador há duas possibilidades de

experimentos à serem realizados: varredura ou monitoramento.

- Varredura: analise onde ocorre a determinação dos íons para determinada faixa
selecionada, importante para análises estruturais, onde se coleta informações dos
fragmentos gerados. O melhor analisador para isto é o TOF;

- Monitoramento: ocorre a determinação de apenas um íon por analisador. Ou seja,

todos ou outros íons são excluídos, sendo aproveitado unicamente o íon ao qual se deseja
obter informações. O melhor analisador para isto é o Quadrupolo;

77
 Os motivos para a escolha destes analisadores para cada experimento já foi
anteriormente citado, lembrando-se das propriedades de aproveitamento em um
quadrupolo e capacidade não discriminatória do TOF.

Para o Quadrupolo pode-se efetuar os dois tipos de experimentos, enquanto ao TOF

pode-se executar unicamente o modo varredura. Entretanto, como já se sabe, raramente
utiliza-se um Quadrupolo para realizar varreduras, devido ao decaimento da
porcentagem de aproveitamento de íons gerados.

O modo de monitoramento recebe o nome oficial de Monitoramento Seletivo de Ions

(SIM, ou Selective Ion Monitoring). A partir do compreendimento dos dois modos
possíveis para um analisador, pode-se ampliar o conhecimento para dois, três ou quantos
analisadores se desejar.

2. EXPERIMENTOS MS/MS

Neste momento é importante realizar uma discriminação: o nome MS/MS se dá

unicamente para experimentos onde se utilizam dois analisadores massa/carga. Como será
exposto, existem experimentos onde se utiliza mais de um quadrupolo, entretanto o
mesmo encontra-se desligado, sendo utilizada unicamente como uma câmera de
preparação ou câmera de reação, como será explicado. Assim, há casos onde se podem
ter três quadrupolos executando um experimento MS/MS, por exemplo.

Utilizando dois analisadores, sendo que cada um pode operar em dois modos, chega-se
a um valor de quatro possibilidades de experimentos MS/MS. Neste curso serão
estudados três destas quatro técnicas, sendo que a última possui uma maior complexidade,
não sendo abordada. As quatro possibilidades lógicas são:

- Analisador I e Analisador II em Modo Varredura ou Modo SIM;

- Analisador I em Modo Varredura e Analisador II em Modo SIM ou vice-versa;

78
 Cada um destes experimentos possui nome próprio, visto na Figura 47.

Figura 47: Tipos de experimentos MS/MS e respectivas configurações dos analisadores massa/carga

Pela Figura 47 veem-se as configurações para cada um dos analisadores massa/carga.

Além disto, nota-se a presença de uma “Collision Cell” que terá sua função discutida
posteriormente. Para o momento é importante sabe que esta pode ser uma cela como o
próprio nome diz ou mesmo um quadrupolo desligado, o que é comumente utilizado, já
que estando este desligado podem-se realizar experimentos MS/MS. Ligando-o pode-se
utiliza-lo efetivamente para experimentos MS/MS/MS.

79
 3. DISSOCIAÇÃO INDUZIDA POR COLISÃO – CID

Do inglês, Collision Induction Dissociation, é um terceiro método de ionização que

alia algumas características da utilização de EI e ESI.

A primeira consideração à ser feita é que este método não é normalmente empregado
para a primeira ionização realizada, diferente da EI ou ESI. Pela Figura 47 nota-se que a
CID é uma técnica utilizada apenas na cela de colisão, podendo ser considerada uma
técnica de preparo para o segundo analisador massa/carga.

Note que, caso não se utilize a técnica CID, o segundo analisador fará a mesma
analise do primeiro, ou seja, desligando a cela de colisão tem um experimento MS. É
desta forma que compensa a utilização de um aparelho com três analisadores, pois se
podem realizar desde experimentos MS (dois analisadores desligados) à MS³.

A técnica baseia-se, de maneira simplificada, na introdução de um gás de inerte

(normalmente metano ou argônio) na cela de colisão. Este gás é bombardeado de elétrons
em alta velocidade (semelhante aos provenientes da EI) gerando espécies de metano ou
argônio com alta energia potencial. O choque destas moléculas com a molécula gera
fragmentos por mecanismos semelhantes aos já apresentados.

A vantagem principal desta técnica é a suavidade à qual a fragmentação ocorre.

Como já citado, utilizar a EI vincula a obtenção de um espectro rico em fragmentos e,
portanto informações estruturais. Entretanto, com isto o pico molecular é quase
imperceptível, não restando qualquer informação quanto a massa do composto.

Para a técnica de ESI o que ocorre ao contrário. Tratando-se de um método sem

praticamente nenhuma adição e energia potencial ao composto o pico molecular
normalmente é o mais intenso. Entretanto informações estruturais são perdidas.

Utilizar a CID junta as vantagens das duas técnicas, permitindo a fragmentação do

composto sem perca do seu pico molecular. Observe que a formação de fragmentos se
deve ao choque de uma molécula de alta energia com o composto e não com elétrons
como visto para a técnica de EI. Observe na Figura 48 uma representação da CID.

80
 Figura 48: Representação de uma cela de colisão e fragmentação via CID

Por exemplo, a utilização de metano como gás de colisão promove as seguintes reações:

As duas primeiras etapas são necessárias para formação de uma espécie iônica de alta
energia potencial, que pode gerar o íon molecular e assim levar à sua fragmentação.
Semelhante à EI a CID promove não apenas ionização, mas transferência de energia
potencial, sendo esta liberada na forma de fragmentação.

Entretanto, diferentemente da EI, a CID não é uma técnica reprodutível uma vez que
há diversas variáveis que podem ser alteradas, como por exemplo, a energia de colisão,
o gás inerte utilizado, a pressão do mesmo, entre outras.

Para iniciar as diferentes técnicas de espectroscopia de massas sequencial é preciso

conhecer as vantagens e desvantagens dos analisadores de massa TOF e Quadrupolo,
junto a utilização da técnica CID como principal método de fragmentação, sendo
considerada como preparativa para a segunda análise com relação à massa/carga.

81
 Figura 49: Espectros de massa com diferentes energias de colisão para o gás de arraste em um mesmo
analito

A partir da Figura 49 nota-se que com o aumento da energia de colisão ocorre cada vez
mais à fragmentação do composto, aproximando-se de uma analise utilizando EI. Já para
energias mais baixas o pico molecular é mais intenso, evidenciando uma menor taxa de
fragmentação, aproximando-se assim de uma análise via ESI.

4. VARREDURA DE ÍONS PRODUTOS

Primeiramente explicitando uma representação genérica deste experimento MS/MS:

Figura 50: Representação genérica de um equipamento utilizado para experimento de varredura de íons
produtos junto aos modos operantes em cada analisador

82
 Assim, tomando um exemplo comum: Inicialmente tem-se uma amostra com íons em
razões massa/carga de 200, 300 e 400 e apenas o estudo do íon de m/z 200 é o desejado.
O que se faz é programar o primeiro quadrupolo (Q1) (lembrando-se que regular o
quadrupolo envolve diretamente em sua RF e DC) a fim de se passar unicamente o íon
com desejada – no caso, m/z 200. Assim, no primeiro quadrupolo todos os outros íons são
rejeitados, passando unicamente o íon de razão massa/carga desejada.

Note que, em experimentos MS/MS a preocupação com contaminações reduz

drasticamente. Como comentado, dois compostos que saiam juntos da cromatografia
poderiam gerar grandes problemas quando se utilizava EI, uma vez que os fragmentos dos
dois compostos sairiam misturados. Já neste experimento, o primeiro quadrupolo faz o
papel de filtrar apenas o íon do analito desejado (podem-se ter casos de dois íons de
mesma razão massa/carga, mas isto será abordado posteriormente).

Fazendo com que o segundo quadrupolo esteja desligado (q2) ocorre sua conversão a
uma cela de colisão. O importante é entender que apenas dos íons originários, apenas o
com m/z 200 é que será fragmentado. O terceiro quadrupolo (Q3) atua em modo
varredura, gerando um espectro de massas dos fragmentos obtidos. A técnica recebe este
nome justamente por ser uma varredura dos fragmentos gerados a partir de um íon
original escolhido por sua razão massa/carga.

Resumidamente, através da técnica VIP:

1º - Seleciona-se um único íons para ser filtrado (Q1 em modo SIM);

2º - Segundo Quadrupolo funcionando unicamente como câmera de colisão (CID);

3º - Varredura dos fragmentos gerados a partir do terceiro quadrupolo (Q3);

4.1. VARREDURA QqQ e QqTOF

Como pode ser pensado, não necessariamente têm-se equipamentos que operam
unicamente com quadrupolos, como o utilizado para demonstração da técnica. Além do
Quadrupolo já se foi apresentado o TOF, podendo ser empregado neste experimento.

83
 O aparelho mostrado na Figura 50 recebe popularmente o nome de QqQ, por empregar
três quadrupolos. Já o QqTOF é um equipamento híbrido, contando com dois quadrupolos
seguidos de um TOF.

Neste ponto é importante notar-se que, para a técnica de varredura de íons produtos
em hipótese alguma se pode utilizar um TOFqQ, uma vez que primeiramente é necessário
um analisador que filtre apenas um íon. Apenas o segundo analisador é que estará
operando no modo varredura. Como o TOF é empregado apenas para varreduras, utiliza-
lo em primeiro momento resulta em um erro total ao experimento.

Mesmo com esta limitação (afinal um QqQ substitui simultaneamente um QqTOF e

um TOFqQ) a utilização do aparelho híbrido mostra-se em alguns momentos muito
importante, principalmente para análises mais precisas e com maior resolução.

Isto se deve ao aproveitamento dos íons pelo quadrupolo. Acompanhe:

- Para o primeiro analisador: deve-se ser obrigatoriamente um quadrupolo. Entretanto,

como este filtra apenas um íons de todos os que chegam, seu aproveitamento, dado por
dos íons que são analisados é de 100%.

Um erro comum é adotar que a faixa de íons para calcular-se o aproveitamento é dada
por toda a janela de razão massa/carga dos íons que chegam ao analisador. O erro é
justamente este: a fórmula se diz para os íons que serão de fato analisados; como o
quadrupolo está “travado” em uma única razão massa/carga, seu aproveitamento é de
100%. Como já dito anteriormente, o quadrupolo em modo SIM é altamente sensível.

- Para o segundo analisador: neste caso, empregar um TOF ao invés de um Quadrupolo

é mais aconselhável, já que agora o analisador deve estar em modo varredura. Neste
momento a sensibilidade do Quadrupolo cai assustadoramente seguindo a fórmula
, enquanto o TOF se mantém em 100%.

Um híbrido QqTOF possuirá maior sensibilidade do que um QqQ unicamente devido a

diferença do aproveitamento de íons trazidos pelo segundo analisador massa/carga.

84
Exemplo: neste caso tem-se um lipídeo de massa 1002 Dalton analisado inicialmente por
ESI-(-) gerando o pico molecular de m/z igual a 1001. Neste primeiro espectro nenhum
fragmento foi notado devido à natureza da técnica utilizada.

No segundo momento utiliza-se uma técnica de experimento MS². Agora, ao primeiro

quadrupolo utiliza-se um modo SIM selecionando exatamente como massa/carga 1001. O
segundo quadrupolo fragmenta exatamente o analito de interesse, gerando um espectro
que mantém o pico molecular, mas ao mesmo tempo informa sobre a estrutura do
composto. Destaca-se neste ponto a importância da CID: a utilização da ESI não permite
a fragmentação do composto, ao mesmo tempo em que a EI permite tantas fragmentações
que o espectro estaria sobrecarregado de fragmentos. Assim, como o método CID é mais
brando, é permitido que apenas as desconexões mais importantes fossem rompidas,
informando as principais características estruturais.

A interpretação dos fragmentos é nítida: tratando-se de um lipídeo, sabe-se que estes

são formados basicamente de ácidos graxos e gliceróis. Assim, como pode ser visto
abaixo, as desconexões sugerem justamente o rompimento nestas ligações.

85
 Exemplo 2: abaixo se tem espectros para um polipeptídeo de baixa massa molecular.

O primeiro espectro mostra justamente todos os componentes que chegam ao mesmo

tempo do cromatógrafo. Ou seja, nestes casos nem mesmo a otimização da parte
cromatográfica é suficiente para separar todos os compostos presentes. Mas sabendo-se
que apenas o pico de m/z próxima a 550 é a importante, pode-se realizar um experimento
MS/MS onde o primeiro quadrupolo filtra apenas esta razão massa/carga. Note que no
primeiro espectro o pico de interesse é praticamente imperceptível, mas ao filtra-lo como
único de interesse, sua intensidade é muito aumentada.

OBS: no segundo espectro existem picos com maios massa/carga que o molecular uma
vez que o composto apresenta-se inicialmente com duas protonações (comprovado
através de seu padrão isotópico de Δm/z 0,5).

Tratando-se de um polipeptídeo, tem-se que cada um dos picos no último espectro

corresponde às unidades formadoras deste composto, ou seja, aminoácidos. Neste caso é
importante notar como este experimento é capaz de filtrar apenas o íon de interesse.

86
5. VARREDURA DE ÍONS PRECURSORES

Praticamente o inverso da técnica anteriormente mostrada. Neste caso, tem-se que o

primeiro analisador operará no modo varredura, enquanto o segundo, em modo SIM
detectará unicamente um íon com massa/carga especifica. Representando:

Figura 51: Representação genérica de um equipamento utilizado para experimento de varredura de íons
precursores

Seguindo o raciocínio realizado na Seção 4.1, para este experimento a utilização do

aparelho híbrido TOFqQ possuirá melhores resultados em termos de sensibilidade do
que um QqQ. Atentando-se ao fato de que nesta classe de experimentos a utilização de
um equipamento QqTOF é proibida devido ao modo ao qual o primeiro analisador deve
estar. Para este curso, o experimento de varredura de íons precursores é unicamente útil
para uma finalidade: um preparo necessário para o experimento de monitoramento
seletivo de reações, que será visto na Seção 6. Assim, para o momento, deve unicamente
compreender como este primeiro experimento funciona em linhas gerais:

Para uma amostra inicial com diversas fragmentações possíveis, gera-se um espectro
com diversos sinais, para diferentes razões massa/carga. Assim, admite-se um íon dentre
todos os possíveis fragmentos gerados, escolhido para ser analisado. Este fragmento
passa por uma nova fragmentação via CID. No segundo analisador escolhe-se um destes
fragmentos para ser analisado utilizando o método SIM.

A importância desta técnica reside em conhecer como o íon originário se comporta em

relação à fragmentações e como um destes fragmentos comporta-se, gerando assim uma
informação de quais íons são mais abundantes. Compreender esta etapa é decisiva para
assimilar as informações que serão passadas na Seção 6.

87
 6. MONITORAMENTO SELETIVO DE REAÇÕES (SRM)

Até o momento as técnicas mostradas têm como principal função a investigação de

fragmentos estruturais ou informações como precursores ou massa molecular de um
analito. Esta será diferente, tendo aplicações quantitativas, também sendo uma saída para
utilização em casos como o dopping, anteriormente analisado via razão isotópica. Esta
técnica possui sua sigla SRM (ou, do inglês, Selective Reaction Monitoring).

A espectrometria de massas é utilizada para a maioria das determinações anteriormente

realizadas em cromatografia. Isto porque espectrometria de massas conta com inúmeras
vantagens, sendo rápida, altamente confiável, muito sensível e robusta, além de ser
aplicada para praticamente qualquer analito. Quando acoplada com um simples HPLC
suas vantagens são ainda mais exacerbadas quando comparada à uma analise unicamente
realizada por cromatografia, uma vez que a primeira tem resolução muito maior do que
as técnicas cromatográficas, além de não necessitar de derivatizações (mudanças na
forma química do analito à fim de facilitar sua detecção) e diminuir em enorme escala os
possíveis interferentes.

Para melhor compreender o poder da técnica de SRM, inicialmente, com um exemplo,

será analisado todo o processo de determinação de um composto, junto com as possíveis
complicações e singularidades da técnica via HPLC e via SRM.

Exemplo: comparação da determinação do composto FK-506 via HPLC e via SRM.

88
 Sendo a matriz ao qual o composto se encontra o sangue, a maior dificuldade será os
interferentes presentes. O sangue, mais precisamente o plasma, é uma das matrizes mais
complexas possíveis, constituída por mais de mil proteínas diferentes, além de
carboidratos, lipídeos, sais minerais e outros compostos biológicos. Dentre as matrizes
orgânicas o plasma só perde em termos de quantidade de constituintes do petróleo.

- via HPLC: o protocolo oficial para preparo de plasma para determinação do

imunossupressor FK-506 é mostrado a seguir. Avalie em termo de etapas, tempo e
possibilidade de erros instrumentais todo seu procedimento.

A etapa final, a corrida

cromatográfica, possui como
tempo padrão 30 minutos. Ou seja,
somente a última etapa faz com
que a análise seja de meia hora. Já
o resultado para tal é visto no
cromatograma-laudo ao lado.
Todo o preparo de amostra é
necessário devido a possibilidade
de co-eluição dos picos próximos
ao do analito. Além disto, a
quantidade de possíveis compostos
que podem ser detectados no

89
 mesmo comprimento de onda (note que o detector utilizado para tal análise é UV-VIS
fixo em 276 nanômetros) é enorme. Imagine que qualquer composto orgânico pode
absorver radiação na região do ultravioleta. Assim, o método HPLC além de não
minimizar os interferentes (entenda que há sim uma diminuição, mas o número final de
interentes ainda é muito grandioso) é um método lento e pouco confiável.

Antes de entrar na análise via SEM, pode-se pensar em utilizar apenas um analisador
em modo SIM, como já visto e utilizado em exemplos anteriores. Avaliando:

- via SIM: neste caso, o preparo inicial da amostra é um pouco diferenciado:

As três primeiras etapas são necessarias para as protéinas que estão presentes no
plasma precipitem. Posteriormente centrifuga-se a mistura, pipetando-se unicamente o
sobrenadante. Esta fase é constituída basicamente do analito e outros componentes do
plasma que não precipitaram nas primeiras etapas.

Agora a amostra é introduzida em um MS-LC, fazendo com que o quadrupolo esteja

regulado justamente para a razão massa/carga do analito quando ionizado (no caso,
821,5). Este é um caso de experimento MS, com montagem mostrada abaixo.

90
 Assim, unicamente os compostos que possuem a razão massa/carga selecionada é que
sairão do espectrômetro de massas e serão introduzidos no cromatógrafo. O resultado
obtido é mostrado a seguir, para duas concentrações diferentes de amostra.

O resultado é lógico: para uma matriz

tão abundante, há mais de um composto
com a massa/carga do analito (entenda que
o que se está utilizando é um quadrupolo
com resolução unitária. Os compostos
possuem diferentes razões massa/carga,
mas o quadrupolo não consegue determina-las com tamanha exatidão. Além disto, para
uma massa/carga de 821,5 há a possibilidade de se ter um analito de massa molecular
820,5 monoprotonado e outro de massa molecular 1641 com duas protonações).

Desta forma, observa-se que o método SIM em modo MS consegue minimizar os

interferentes em grande quantidade, mas não suficientemente para uma análise precisa.
Introduz-se assim o método de Monitoramente Seletivo de Reações.

- via SEM: neste método o primeiro analisador encontra-se regulado da mesma forma que
no método SIM: fixo para a razão massa/carga de 821,5. A maior modificação é
justamente no segundo analisador. Relembrando do método de Varredura dos Íons
Produto, a razão massa/carga selecionada no primeiro quadrupolo é a única que será
enviada à câmera de colisão. Esta fragmentará o íon de razão massa/carga selecionada,
gerando, através do segundo analisador em modo varredura, um espectro dos
fragmentos gerados deste íon selecionado no primeiro analisador.

Observe na imagem seguida na página ao lado justamente o explicado: um espectro

geral para a matriz já tratada, seguida do espectro de fragmentos do íon selecionado.
Agora, o que ocorre se se tem um segundo analisador fixo para uma determinada razão
massa/carga determinada a partir do espectro de fragmentação? A montagem seria:

91
 Ou seja, resumidamente e simplificadamente, o método SRM é um método SIM onde,
em vez de apenas o primeiro analisador estar fixo para dada razão massa/carga, o
segundo também está fixo para outra razão massa/carga (que deverá corresponder à um
dos picos observados para os fragmentos deste composto).

A vantagem disto é enorme e lógica: agora, para um composto ser considerado

interferente, ele deverá, além de possuir mesma razão massa/carga do que o analito, um
fragmento que tenha também mesma massa/carga. As chances disto são mínimas, mas
podem ocorrer, entretanto, há ainda uma última barreira: não se pode esquecer que
todos os íons que sobrevivem à estas duas barreiras iniciais ainda terão que percorrer o
cromatógrafo líquido, podendo ser separadas devido ao tempo de eluição.

O resultado para este método é o cromatograma a seguir:

Observe que além da

minimização completa de
interferentes o tempo de
corrida reduziu de trinta
minutos para menos de dois
minutos – uma redução de
mais de dez vezes.

92
 Antes de compreender como este método pode quantificar um analito, deve-se fazer
uma revisão de como o mesmo funciona.

1º - Primeiro analisador: um quadrupolo fixo para determinada razão massa/carga

especifica para o analito em questão;

2º - Fragmentação deste íon selecionado via CID;

3º - Segundo analisador: um quadrupolo fixo para outra razão massa/carga selecionada

através dos fragmentos gerados;

Sendo os dois quadrupolos fixos para determinada razão massa/carga tem-se que o
aproveitamento dos quadrupolos para a técnica de SEM ser extremamente alto. Cria-se
assim um método universal, mas extremamente seletivo, confiável e rápido. Ao mesmo
tempo em que qualquer composto pode ser analisado, somente ele será analisado.
Há raras técnicas que conseguem unir estas duas características.

A técnica de SEM ainda aguarda duas surpresas pra possíveis interferentes na amostra.
O primeiro é simples: caso se saiba que, por azar, exista um componente com mesma
razão massa/carga, forme o mesmo fragmento e possua o mesmo tempo de eluição, pode-
se simplesmente escolher outro fragmento dos formados na fase de CID. Logicamente
prefere-se escolher o fragmento mais intenso, mas não podendo este ser o escolhido, nada
prejudicará a análise em escolher outro fragmento.

É neste ponto que a técnica de Varredura de Íons Precursores (Seção 6) entra: são
necessários antes de partir-se da técnica de SRM realizar uma Varredura dos Íons
Produtos a fim de se saber quais os íons gerados na primeira etapa. A Varredura de Íons
Produtos auxilia na escolha das razões massa/carga apropriadas para a SRM. Conforme
disto anteriormente, neste curso a maior aplicação da técnica de Varredura de Íons
Precursores será no preparo experimental para posterior análise via SRM.

93
 6.1. TRANSIÇÃO DE CONFIRMAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

Considerando agora uma última barreira (e impossível de ser superada) para

interferentes na amostra. Tem-se que no primeiro analisador o quadrupolo está “travado”
para determinada razão massa/carga selecionada.

Agora, para o segundo analisador tem-se a escolha de outro pico, normalmente sendo
feito para o pico mais intenso. Sendo assim, chama-se este par de razões massa/carga
(primeira massa/carga + sinal mais intenso) de Transição de Quantificação. Esta possui
seu respectivo tempo de eluição e área cromatográfica.

Adotando agora um segundo fragmento, tem-se que este possui determinada

porcentagem relativa quando comparado ao sinal mais intenso. Esta relação também é
aplicada à área cromatográfica. A escolha deste segundo par de razoes massa/carga é
chamada de Transição de Confirmação. Esta terá sua área cromatográfica e intensidade de
sinal em mesma porcentagem relativa quando comparada à Transição de Quantificação.
Entretanto, as mesmas terão o mesmo tempo de eluição.

Agora, com o monitoramento de duas

transições eu crio um único método que possui
três barreiras interinas: a relação entre os
picos do espectro entre as razões de massa para
ambas as transições deve ser a mesma das
áreas cromatográficas. Além disto, os tempos de
retenção dos dois devem ser o mesmo. Caso um
destes parâmetros esteja diferente, configura-se
uma interferência, facilmente resolvida com a
escolha de outro pico para ser a Transição de
Confirmação. Para o caso do imunossupressor
tido como exemplo, as escolhas das Transições Figura 52: Representação dos picos
são as mostradas ao lado. cromatográficos comparados para as duas
Transições principais

O método SRM está presente atualmente em

diversas aplicações importantes para a sociedade, duas delas estão mostardas a seguir.

94
6.2. SOBRE GENÉRICOS, DOPPING E SRM

Considerando todo o aprendizado sobre SRM, considere os seguintes exemplos:

Exemplo: atualmente existem mais de 200 compostos que caracterizam dopping para
diferentes esportes oficiais. Monitorar todos estes se tornou cada vez complexo visto as
técnicas utilizadas por atletas. Um dos maiores exemplos disto é a utilização de diuréticos
na alimentação. Tecnicamente um diurético não caracteriza dopping, mas caso o atleta
ingira algo que caracteriza dopping, o diurético dilui o composto na urina, fazendo com
que os níveis analisados estejam dentro do esperado.

Unicamente para compostos que caracterizam o dopping no sistema central, encontra-

se a seguir uma pequena lista de 130 compostos ilegais.

Analisar todos estes compostos de uma única vez, de modo rápido e confiável, para
todos os atletas competidores em um evento é praticamente impossível utilizando os
métodos cromatográficos convencionais. Assim, utiliza-se da SRM.

95
 O método oficial é simples: primeiramente recolhe-se urina do atleta e realiza-se um
teste de DNA para verificar se de fato a amostra é do competidor. Após isto, adiciona-se
padrão interno (em concentração conhecida) e tampão apropriado. Para o primeiro
composto escolhem-se duas transições desejadas. Verificam-se os tempos de eluição e
porcentagens relativas dos picos no espectro e no cromatograma. Comparando com os
valores obtidos para o padrão interno, pode-se determinar, em menos de 5 minutos, a
concentração de tal analito presente na urina do atleta.

Mais do que isto, ao terminar a eluição do primeiro composto, pode-se através do

equipamento mudar a transição desejada para o segundo analito à ser determinado,
fazendo que em uma única corrida consiga-se determinar todos os 130 analitos e suas
concentrações em menos de 15 minutos de corrida. Observe que para o padrão interno as
transições escolhidas e o tempo de retenção não mudam, unicamente devendo mudar as
transições para cada um dos analitos presentes.

Exemplo 2: para testar se determinado fármaco pode ser considerado genérico, um estudo
minucioso deve ser executado a fim de inicialmente verificar os efeitos do fármaco no
organismo do paciente.

Entretanto, para ser tratado como genérico, o candidato à genérico deve seguir com
muita semelhança a conhecida curva de bioequivalência. Ou seja: deve-se garantir que a
concentração do fármaco no organismo do ser seja a mesma do remédio oficial para, no
mínimo, 48 horas de após a dose. No início da dose a concentração cresce muito rápido,
necessitando que a amostra (sangue do paciente) seja recolhida de 15 em 15 minutos,
sendo este tempo modificado conforme se passa o tempo de aplicação.

Agora, supondo que se retire 10 mL de sangue por análise, sendo que estas análises
devem ser duplicata, isto resulta em mais de um litro de sangue do paciente. Lembrando
que o mesmo deve estar em jejum, o método utilizado deve ser extremamente sensível
(devido a pouca concentração do analito), seletivo (uma vez que se está trabalhando com
plasma sanguíneo) e rápido. Um método cromatográfico, além de ser pouco confiável e
demorado demandaria uma quantidade de amostra superior à que o paciente poderia
oferecer, ocasionando na sua possível morte.

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 Considerando o fármaco Minociclina, abaixo consta seu espectro de massas junto à de
um padrão interno escolhido para esta análise.

As transições escolhidas serão, para o fármaco, de 458-441. Já para o padrão interno,

que possui pico molecular de 748 (devido a isto seu pico não aparece no espectro), a
transição escolhida é a de 748-158. Agora, pode-se fazer um cromatograma com estas
duas transições, verificando se os tempos de eluição são os mesmos.

97
 Desta forma pode-se obter a concentração deste composto no plasma sanguíneo,
monitorando-o para cada intervalo de tempo. Por fim pode-se plotar uma curva de
bioequivalência entre a concentração do fármaco ao decorrer do tempo.

A etapa final é comparar

através de métodos estatísticos
as duas curvas geradas (uma
para o medicamente tradicional)
e outra para o candidato à
genérico. Se suas inclinações,
áreas abaixo da curva e demais
parâmetros forem compatíveis o
medicamento poderá ser
considerado um genérico, podendo ser comercializado.

Antes do advento da espectrometria de massas, os testes de medicamentos, executados

em ratos de laboratório, eram acompanhados de erros grosseiros e enormes, uma vez que
a quantidade requerida de sangue era muito grande. Com isto, era comum o rato morrer
durante o experimento, fazendo com que a análise fosse terminada com outro rato. Como
o histórico da amostra era completamente diferente, imagina-se a fonte dos problemas das
análises. Junto à isto encontram-se problemas quanto ao custo e tempo da análise, que
poderiam demorar meses ou anos.

Outros exemplos mais modernos, como as pílulas anticoncepcionais, são ainda mais
drásticos. Suas concentrações mínimas no sangue não permitem que nenhum método
cromatográfico possa determinar sua presença (mesmo utilizando mais de um litro de
sangue por análise). Assim, unicamente com a implementação da espectrometria de
massas é que os ensaios laboratoriais puderam ser executados, possibilitando o início da
pesquisa nesta área de medicamentos. Hoje, os anticoncepcionais são os medicamentos
que mais geram lucros as indústrias, quitando as despesas com equipamentos e análises
em tempo recorde. Um exemplo disto é: na hora seguinte ao fim da patente do primeiro
anticoncepcional, mais de 10 empresas lançaram suas marcas de genérico no mercado.

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CAPÍTULO VII – PLANEJAMENTO DE UM EXPERIMENTO SRM

Este capítulo final esta destino a um exemplo completo, comumente visto em

exercícios, de como realizar-se uma determinação quantitativa para determinado analito
partindo-se unicamente de sua fórmula estrutural.

Exemplo: Considere a molécula ao lado como um

analito presente em uma matriz com a possibilidade
de interferentes. Planeje um experimento SRM para
a mesma, avaliando todas as etapas e discutindo-as,
além de propor fragmentos utilizando método EI como fonte inicial de fragmentos.
NOTA: no laboratório de análise há apenas um espectrômetro de massas, diga qual seria
sua escolha para os analisadores, justificando-os.

Como avaliado, antes de se iniciar um experimento de SRM deve-se avaliar os íons

formados através de outro experimento, a Varredura de Íons Precursores. Sabe-se que
para o método SRM e a Varredura a configuração dos analisadores é, respectivamente,
SIM-CID-SIM e SIM-CID-Varredura, desta forma, a única possibilidade de equipamento
para realizar tais experimentos seria um QqQ, que terá seu aproveitamento diminuído de
forma inversa à janela de varredura. Não se utilizará um QqTOF para realizar a
Varredura de Íons Precursores uma vez que esta configuração não permite o
experimento SRM (caso fosse possível utilizar dois equipamentos, se escolheria o QqTOF
para a primeira etapa devido sua maior sensibilidade).

Assim, a primeira parte do problema, escolher os analisadores que serão utilizados já

foi resolvida. Será um QqQ com aproveitamento de:

- Para Varredura: será de 100% para Q1 e 1/Faixa para Q3;

- Para SRM: será de 100% para Q1 e 100% para Q3;

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 A segunda etapa é justamente escolher os íons que serão utilizados para as transições
de quantificação e confirmação no experimento de SRM. Isto só se torna possível através
da avaliação dos íons gerados da fragmentação do analito. Alguns fragmentos gerados são
mostrados a seguir, iniciando pelos arranjos possíveis no aromático.

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Já para a carbonila à esquerda na molécula e o grupo amino as possibilidades são:

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 E por fim as possibilidades para a carbonila da direita incluem as cisões alfa já
conhecidas e aplicadas para a carbonila à esquerda mas também um rearranjo de

McLafferty, mostrados na imagem a seguir:

Lembrando que para todas as rotas mostradas as colorações das setas seguem os
padrões adotados no Capítulo IV – Seção 4.

- Seta Azul: indica uma clivagem-alfa;

- Seta Vermelha: indica uma clivagem indutiva;

- Seta Laranja: indica um rearranjo (podendo este ser de McLafferty ou do íon tropílio);

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 Como visto há uma infinidade de fragmentos possíveis para a molécula em questão.
Lembrando sempre de que, caso haja bromo em sua estrutura, o padrão isotópico será terá
um pico de M+2 com intensidade praticamente a mesma.

Assim, a segunda etapa, a determinação dos íons gerados para o analito em questão,
está completa. O único passo restante é a escolha de quais razões massa/carga serão
utilizadas. Recordando o que foi feito até o momento:

1º - Escolheu-se como aparelho um QqQ por ser possível realizar neste equipamento
uma Varredura de Íons Precursores, mas também um experimento SRM;

2º - Analisaram-se quais os íons formados a partir da fragmentação do analito;

Assim, para o primeiro quadrupolo, deve-se coloca-lo em modo SIM adotando como
razão massa/carga a massa molecular do analito, ou seja, 367 (ou 369 neste caso, onde a
intensidade do padrão isotópico do bromo é praticamente a mesma). Neste primeiro
quadrupolo a maioria dos interferentes com outras razões massa/carga são eliminados.

Para o segundo quadrupolo pode-s escolher qual um dos fragmentos estudados.

Entretanto, deve-se dar preferência à íons que resguardam informações estruturais
importantes do analito. Por exemplo, não se pode adotar o íon com razão massa/carga
de 15 para quantificação uma vez que a maioria dos compostos orgânicos gera este íon
como fragmento. Assim, adotam-se, por escolha própria as transições 367-246 e 367-282
como as de quantificação e confirmação, respectivamente. A utilização de um padrão
primário, escolhendo para estas duas transições também conhecidas permite sua
quantificação. Relembrando o estudado, para um composto ser tratado como interferente
nesta análise ele deverá conter as seguintes propriedades:

- Possui massa molecular de 367 e fragmentar-se para um íon de massa/carga 246 e 282;

- Ter o mesmo tempo de eluição na corrida cromatográfica;

Desta forma, realizaram-se todas as etapas de planejamento e execução de um

experimento SRM: avaliação do equipamento utilizado e dos íons gerados através de
Varredura de Íons Precursores, seguindo para um planejamento de transições de
quantificação e confirmação para o analito, podendo assim quantifica-lo.

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