2) Centrifugação: Distribuir para cada microtubo/
eppendorf 2 mL de cultura. A densidade celular na
Segunda atividade laboratorial
Extração de DNA plasmídico (minipreps) GF-1 KIT
↪ Os passos da purificação de DNA genómico são
praticamente os mesmos (exceto a separação do DNA
plasmídico do DNA genómico).
⚠ É fundamental a separação do DNA plasmídico do
DNA genómico (existe em grandes quantidades), pois a
ínfima contaminação pelo DNA genómico pode levar a
resultados indesejados.
Os plasmídeos de maior tamanho não alcançam senão 8%
das dimensões do DNA genómico bacteriano. O DNA
genómico, durante a preparação do extrato celular,
degrada-se ficando numa forma linear ⇨ permite obter
DNA plasmídico por técnicas que separam DNA linear de
DNA circular super-enrolado.
O método de lise alcalina e o método da ebulição (Holmes
e Quigley, 1981) são os métodos mais comuns para a
preparação de DNA plasmídico a partir de células
bacterianas em pequena escala (minipreps).
O método da ebulição permite que o DNA genómico
permaneça ligado à membrana citoplasmática (diminui o
risco de contaminação e facilitando o isolamento do DNA
plasmídico), combinando métodos físicos (calor) com
métodos enzimáticos de lise das células (lisozima).
Método alcalino/SDS ⇨ para preparar um lisado límpido.
Após a neutralização, o lisado é aplicado diretamente
numa coluna com membrana de vidro, onde seletivamente
o DNA plasmídico se liga por adsorção. Uma lavagem
chega para remover o RNA, proteínas e todas as
impurezas. O DNA plasmídico purificado é eluído da coluna
de centrifugação com água ou tampão TE.
Procedimento experimental
1) Preparação da cultura stock: No dia anterior incubar
uma cultura de células de E. coli em 10 mL de meio
LB + Amp + tet (respetivos antibióticos) a 37ºC ON
(over night) (12 a 16 horas) com agitação orbital. (Obs.
Tem de ter prata no topo do erlenmyer);
recolha deve ser de 1-2x 109 células/mL LB (1-1,5
A600 unidades/mL). Recolher as células por
centrifugação a 6000 x g durante 2 mins. Decantar
o sobrenadante completamente por inversão do
tubo;
⚠É importante remover todos os vestígios do meio
das paredes do tubo (os sais podem influenciar as
etapas seguintes). Não centrifugar as células a uma
velocidade elevada ou por muito tempo ⇨ ficam
demasiado compactadas para ressuspender.
3) Ressuspensão do pellet: Adicionar 250 μL de tampão
S1 ao sedimento e ressuspender as células com uma
micropipeta, até a suspensão ficar homogénea (se
não estiverem ressuspensas ⇨ quebra na produção,
a lise não ocorre se existirem aglomerados de
bactérias resultantes de uma ineficiente
ressuspensão)
4) Lise alcalina: Adicionar 250 μL de tampão S2 e
misturar suavemente por inversão do microtubo 5
vezes. Incubar à temperatura ambiente ou no gelo
durante 5 mins (não mais que isso porque o hidróxido
de sódio vai começar a degradar o DNA).
⚠ S2 deve ser imediatamente tampado após o uso.
Misturar cuidadosamente ⇨ não quebrar o DNA
genómico. A incubação em gelo pode reduzir a
contaminação de plasmídeos não super-.enrolados. A
precipitação de SDS e detritos celulares no seguinte
passo de neutralização será ligeiramente mais eficaz no
frio.
5) Neutralização: Adicionar 400 μL de tampão NB (vai
neutralizar o pH básico da solução) e misturar
imediatamente por inversão suave o microtubo 6 a
10 vezes, até formar um precipitado floculado
branco. Centrifugar a mistura à temperatura
ambiente e à v. máx durante 10 mins;
6) Carregamento da coluna: Transferir 650 μL de
sobrenadante obtido para a coluna (tubo de recolha
limpo). Centrifugar a 10000 x g durante 1 min ⇨
eluir o sobrenadante pela
membrana. Descartar o
eluído e voltar a colocar o
tubo recetor na coluna
de centrifugação. Não
 transferir qualquer precipitado branco para a coluna!
(separa 2 fases – a que está 1ª é o que nos
interessa: sobrenadante com plasmídeos, o pellet
tem tudo o resto);
7) Lavagem da coluna: Adicionar à coluna, 650 μL de
tampão de lavagem (Wash Buffer) e centrifugar à
velocidade 10000 x g durante 1 min. Deitar fora o
eluído e recolocar a coluna de centrifugação no
mesmo tubo recetor.

8) Secagem da coluna: Centrifugar a coluna à velocidade

de 10000 x g durante 1 min para remover o etanol
residual que ainda possa existir dentro da coluna.
Colocar a coluna de centrifugação dentro de um novo
microtubo de 1,5 mL. (centrifuga-se “a seco” para
retirar todo o eluído)
⚠A presença de etanol residual pode não só afetar a
qualidade do DNA como também pode inibir as reações
enzimáticas subsequentes.
9) Eluição do DNA: Adicionar diretamente no centro sem
tocar na membrana da coluna, 75 μL de tampão de
eluição (Elution Buffer) / tampão TE / H2Oup estéril
e incubar a coluna por 1 min à temperatura ambiente.
Eluir o DNA por centrifugação a 10000 x g durante
1 minuto. Guardar o DNA a 4ºC ou -20ºC.
⚠O Elution Buffer tem de ser distribuído diretamente
no centro da membrana para a eluição completa. O
tampão TE pode também eluir o DNA, embora o EDTA
possa inibir reações enzimáticas subsequentes. Se for
usada a água o máximo de eficiência da eluição é
alcançada entre pH 7,0 e 8,5. Quando se usa a água,
deverá se guardar a -20ºC.