©Antioxidante - ABTS

Janeiro 2016|1

Ensaio antioxidante: captura do radical livre ABTS

Baseado em Rufino & Alves (2007) e Yang et. al. (2011)
Priscila B. Torres, Janaína Pires, Ana Maria Amorin, Déborah Y.A.C. dos Santos, Fungyi Chow
Janeiro 2016

 O ensaio antioxidante pela captura do radical livre ABTS é um dos mais utilizados para fazer um
screening geral do potencial antioxidante. É baseado na captura do radical 2,2–azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS•) gerado através de uma reação eletroquímica ou
enzimática. Esta metodologia permite medir o potencial antioxidante de substâncias de natureza
hidrofílica e lipofílica (Rufino & Alves, 2007).

Preparo de soluções

1) Solução ABTS 7,38 mM: dissolver 0,0038 g de ABTS (MM = 514,62 g.mol-1; 2,2’-azinobis(3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico; Armário A30; Sigma A1542) em 1 mL de água ultrapura
(usar microtubo). Guardar sob refrigeração e protegida da luz. Validade 1 mês.

2) Solução de persulfato de potássio 140 mM: dissolver 0,0378 g de persulfato de potássio (MM
= 270,322 g.mol-1; Armário; Synth P1015.01.AE) em 1 mL de água ultrapura (usar microtubo).
Guardar em RT. Validade 1 mês.

3) Radical ABTS: misturar 1 mL da solução ABTS (item 1) com 17,6 µL da solução de persulfato
de potássio (item 2). Manter a mistura no escuro por 16 horas a RT. Diluir esta mistura em
metanol (razão de 1:60 – começar em 1:50) até obter absorbância de 1 - 0,9 em 734 nm. Usar
no dia da análise. (ANEXO I)

Preparo das amostras

1) Extratos:

1.1) Diluir cada extrato ou fração em DMSO 10% (6 mg.mL-1; dependendo da solubilidade do
extrato, pode ser adicionado primeiro o DMSO e depois a água para atingir a
concentração final de 10%). Alternativamente, pode ser diluído em metanol, metanol 80%
ou maior concentração de DMSO. A porcentagem de DMSO não deve ultrapassar 8% no
volume final de reação.

1.2) Testar concentrações de 350 - 25 µg.mL-1 (concentração final na microplaca).

2) Amostras fisioquímicas:

2.1) Triturar 300 mg MF congeladas em nitrogênio líquido e suspender em 1000 µL de metanol

(300 mg.mL-1) ou 200 mg MF em 667 µL de metanol.

2.2) Extrair por 3 h a RT e protegido da luz.

2.3) Centrifugar a 14000 rpm por 15 min a RT e recolher o sobrenadante em um tubo novo.

2.4) Testar concentrações de EB: 0, 4, 8, 12, 16 e 20 mg. mL -1. Podem ser testadas concentrações
maiores de EB alterando a proporção de extração biomassa/solvente.

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Curva de calibração

 Solubilizar os padrões em metanol.

 Ácido gálico (sol. mãe = Talissa 0,05 mg.mL-1; MM = 170,12 g.mol-1; ácido 3,4,5-
triidroxibenzoico; Armário A29; Sigma G7384-100g): 0 – 1,75 µg.mL-1; R² = 0,9886.

 Trolox (sol. mãe = Talissa 0,5 mg.mL-1; MM = 250,29 g.mol-1; 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-

2-ácido carboxílico; Geladeira 1; Sigma 238813-1g): 0 – 5 µg.mL-1; R² = 0,9979. Vanessa, Talissa:
0 – 18 µg.mL-1. Falta incluir o R2.

 Quercetina (sol. mãe = 1 mg.mL-1; MM = 302,24 g.mol-1; quercetin-3-O-rhamnoside; Armário

Q01; Sigma Q4951): 0 – 5 µg.mL-1; R² = 0,9955.

 BHA (sol. mãe = 1 mg.mL-1; MM = 180,25 g.mol-1; butylated hydroxyanisole; Armário H4;
Sigma B1253): 0 – 5 µg.mL-1; R² = 0,9983.

 Rutina (sol. mãe = 1 mg.mL-1; MM = 610,52 g.mol-1; quercetin-3-rutinoside hydrate; Armário

R02; Sigma R5143): 0 – 150 µg.mL-1 ; R² = 0,9912.

Montagem da microplaca (volume final 300 µL)

1) Branco = 20 µL de metanol + 280 µL de água ultrapura.
2) Branco amostra = 20 µL de extrato ou amostra + 280 µL de água ultrapura.
3) Amostra/extrato/padrão = 20 µL de amostra/extrato/padrão (ou volume necessário para
obter a concentração desejada de amostra/padrão e completar com metanol) + 280 μL do
radical ABTS (misturar logo após de adicionar a solução ABTS).
4) Incubar por 20 min em RT no escuro.
5) Ler a 734 nm.
OBS. Fazer a leitura também do Branco e dos Brancos Amostras, não calibrar o equipamento
com esses brancos.

Cálculos
 % de inibição.
 µg de equivalente padrão.g-1 MF/MS (precisa de curva padrão).
 EC50 (precisa de diferentes concentrações de EB).

Referências

Rufino, M. & Alves, R. (2007). Metodologia científica: determinação da atividade antioxidante total em
frutas pela captura do radical livre DPPH. Embrapa, 3–6. Retrieved from
http://agris.fao.org/agris-search/search.do?f=2012/BR/BR2012102700027.xml;BR20071426953.

Yang, H., Dong, Y., Du, H., Shi, H., Peng, Y., & Li, X. (2011). Antioxidant compounds from propolis
collected in Anhui, China. Molecules (Basel, Switzerland), 16(4), 3444–55.

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Anexo I

Teste com o ABTS

A curva de absorbância alcançava ~0,7 utilizando o ABTS do LAM, marcado sem data.

Para tentar aumentar a absorbância para 0,9~1,0 foram feitos os seguintes testes com o ABTS sem
data e o de 2014, aumentando o peso de ambos os reagentes.