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CROMATOGRAFIA
Feira de Santana-Ba
Fevereiro/2009
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
CURSO: ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DISCIPLINA: QUÍMICA ORGÂNICA II
DOCENTE: CARLA MENDES
Feira de Santana-Ba
Fevereiro/2009
Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre
OBJETIVO
Verificar a separação de clorofilas e carotenos presentes no extrato de espinafre a partir da
análise dos cromatogramas das bandas que correspondem a cada componente após a eluição
em um sistema de solvente (fase móvel).
INTRODUÇÃO
É uma técnica simples e muito importante para a separação rápida e qualitativa de
pequenas quantidades de material.
Na cromatografia em camada fina, a fase líquida ascende por uma camada fina do
adsorvente estendida sobre um suporte. Freqüentemente, o suporte utilizado é uma placa de
vidro. Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água e deixa-se
secar. A placa coberta e seca chama-se “placa de cromatografia em camada fina”. Quando a
placa de CCF é colocada verticalmente em um recipiente fechado que contém uma pequena
quantidade de eluente, este irá ascender pela camada do adsorvente por ação capilar. À
medida que o solvente sobe pela placa, a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e
a fase estacionária. Durante este processo, os diversos componentes da mistura são separados.
As substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as substâncias mais polares.
Cada substância se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção,
dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura.
Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta é retirada da cuba e seca até que esteja
livre do solvente. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original.
Se os componentes são substâncias coloridas, as diversas manchas serão claramente visíveis.
Contudo, é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque correspondem a
compostos incolores. Para a visualização deve-se "revelar a placa". Um método bastante
comum é o uso de vapores de iodo, que reage com muitos compostos orgânicos formando
complexos de cor café ou amarela. Outros reagentes para visualização são: nitrato de prata
(para derivados halogenados), 2,4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos), verde de
bromocresol (para ácidos), ninhidrina (para aminoácidos), etc.
A relação entre as velocidades de movimento da substância e da frente do solvente é
chamada Rf, e é definido como a razão entre a distância percorrida pela substância, a partir do
ponto de aplicação até o meio da mancha, e a distância percorrida pelo solvente a partir do
ponto de aplicação.
Rf = dc / de; sendo: dc: distância percorrida pelo componente da mistura;
de: distância percorrida pelo componente da mistura;
Na prática, os valores de Rf obtidos em uma placa raramente se repetem em outra,
devido a fatores, como tamanho da partícula do adsorvente, composição do solvente grau de
saturação da câmara de eluição, ativação e condições de estocagem das placas, espessura da
camada do adsorvente, etc. Os valores de Rf são, todavia, importantes quando se faz um
estudo comparativo utilizando soluções de substâncias-padrão aplicadas na mesma placa.
Os adsorventes mais utilizados como fase estacionária (FE) são: sílica, alumina,
celulose e poliamida. Na escolha do solvente ou da mistura de solventes, deve-se considerar a
natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Folhas de espinafre
Água
Acetona
Acetato de etila
Gel de sílica
Éter de petróleo
Hexano
TABELA DE TOXIDADE DOS REAGENTES
REAGENTES TOXICIDADE
Água ------------------------------------------------------
Acetona É tóxico e irritante. Evite contato com a pele
olhos e vestuários.
Acetato de Etila É tóxico, irritante e muito inflamável. Evitar
inalação ou contato com a pele.
Éter de Petróleo Facilmente inflamável. Irritante para a pele.
Nocivo: risco de efeitos graves para a saúde
em caso de exposição prolongada por
inalação. .
Sílica Gel È muito irritante para os pulmões. Evite
respirar seu pó muito fino
Hexano È muito inflamável. Aquecer somente em
banho-maria.
TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS
Béquer;
Proveta;
Coluna;
Bastão de Vidro;
Erlemeyer;
Funil de Vidro;
Balança;
Suporte Universal;
Garra;
Aro;
Pipeta Pasteur;
Etiquetas;
Papel de Filtro
FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Parte 1:
1.A) Preparo das cromatoplacas
Repouso
Placa I
Fase estacionária: Sílica gel 60G
Fase móvel: Mistura de hexano e acetona 8:2
Placa II
Fase estacionária: Sílica gel 60G
Fase móvel: Hexano
Placa III
Fase estacionária: Sílica gel 60 G
Fase móvel: mistura de hexano e acetato de etila
CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO
Placa I:
d(eluente): 5 cm
d (carotenos): 4 cm
d (clorofila): 0,9 cm
d(outros): 0,6 cm
Rf da banda amarela:
Rf = 4/5 = 0,8 cm
Rf da banda verde:
Rf = 0,9/5 = 0,18 cm
Placa II
d(eluente) = 5 cm
d(carotenos) = 1 cm
d(clorofila) = 0 cm
Placa III
d(eluente) = 5 cm
d(carotenos) = 4,8 cm
d(clorofila) = 0,5 cm
DISCUSSÃO
Tendo-se a fase estacionária comumente utilizada – sílica gel (polar), foi incumbida
apenas a tarefa da seleção de solventes adequados para a realização do experimento, uma vez
que, em caso de fases estacionárias polares, é normal utilizar solventes de baixa ou média
polaridade. Então, obtendo-se essa informação e com auxílio de uma seqüência crescente de
polaridade dos eluente, foram utilizados respectivamente os dois solventes julgados como
mais adequados: hexano e a mistura de hexano com acetato de etila, pois o primeiro é de
baixa polaridade e o segundo é de média polaridade, logo atende ao requisito citado
anteriormente.
Pode-se então fazer análise do comportamento da banda para cada solvente utilizado a
partir do estudo das interações entre a fase móvel e fase estacionária e entre essas com os
componentes da amostra, obtendo-se os seguintes resultados:
Na placa I, em que se utilizou a mistura de solventes já estabelecida no roteiro ( hexano e
acetona), o componente menos polar (caroteno) interagiu mais com a fase móvel( média
polaridade) e pouco com a fase estacionária(polar), sendo então facilmente deslocado pela
mistura de solventes, uma vez que a F.M compete pelo sítios ativos na superfície do
adsorvente com os demais componentes da amostra. Já o grupo de clorofila interagiu mais
com a F.E, tendo conseqüentemente um deslocamento menor do que o grupo de carotenos. O
que confirma sua forte interação com a fase estacionária.
Pode-se detectar ainda a presença de outros componentes que interagiram muito
com a fase estacionária. Através do cálculo do Rf para cada banda pode-se comprovar as
análises feitas a partir do cromatograma, por exemplo, como a banda amarela foi mais
deslocada pelo solvente em comparação com as demais, logicamente seu Rf será maior que o
Rf dos componentes analisados.
É importante frisar que podem ter existindo outros componentes na placa que não eram
visíveis. A visualização só é possível a partir do uso de alguns métodos.
Na placa II, o solvente utilizado foi o hexano (apolar), que não deslocou o grupo de
clorofila, ou seja, não dessolveu a clorofila por ser um eluente de baixa polaridade, possuindo
logicamente desvantagem na competição com os componentes da amostra pelo sítio de
ativação na superfície da fase estacionária. Em suma o grupo de clorofila interagiu muito com
a fase estacionária e o grupo de carotenos interagiu mais com a fase estacionária se
comparado com o deslocamento da banda verdade, porém, percebe-se que o deslocamento foi
muito menor do que quando o solvente utilizado foi o de média polaridade.
O cálculo do fator de retenção ratificou a análise, uma vez que o Rf para a banda verde foi
igual a zero.
Na placa III, o eluente utilizado foi uma mistura de hexano com acetato de etila. O que
provocou uma forte interação do grupo de carotenos com a fase móvel (média polaridade), ou
seja, foi deslocado até a extremidade superior da placa , interagindo logicamente pouco com a
fase estacionária. Em relação ao grupo de clorofila, a mistura de solventes possuiu
desvantagem na competição pelo sítio de ativação na superfície do adsorvente, ou seja, os
componentes do grupo interagiram mais com a fase estacionária que o eluente, sendo
conseqüentemente pouco deslocado pelo mesmo.
È preciso ressaltar que os valores de Rf não são constantes cromatográficas empregadas,
variando com as condições cromatográficas empregadas com a natureza e preparação do
solvente , o tamanho da amostra , a temperatura, etc.Logo os valores encontrados podem
sofrido grandes variações.
Figura 1: Esquema da prática de cromatografia em camada delgada
Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre
Na cromatografia em coluna, o sólido utilizado na fase fixa deve ser um material insolúvel
na fase móvel associada (eluente); sendo que os mais empregados são a sílica gel (SiO2) e
alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó finamente dividido. A mistura a ser separada é
colocada na coluna com um eluente pouco polar e aumenta-se gradativamente a polaridade do
eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais polares.
Uma seqüência de eluentes de polaridade crescente é a seguinte: éter de petróleo, hexano,
tetracloreto de carbono, cloreto de metileno, éter etílico, acetato de etila, etanol, metanol,
água e ácido acético.
O fluxo de eluente deve ser contínuo. Os diferentes componentes da mistura mover-se-ão
com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos
polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. Assim, a capacidade de
um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase
diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto.À medida que os compostos
da mistura são separados, bandas ou zonas móveis começam a ser formadas; cada banda
contendo somente um composto. De um modo geral, os compostos apolares atravessam a
coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm
menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com
todos os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um
solvente muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Com uma
escolha cuidadosa das condições (adsorvente, eluente, tamanho da coluna, velocidade de
eluição), praticamente qualquer mistura pode ser separada.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Folhas de espinafre
Acetona
Gel de sílica 60
Hexano
TABELA DE TOXICIDADE DOS REAGENTES
REAGENTES TOXICIDADE
Acetona É tóxico e irritante. Evite contato com a pele
olhos e vestuários.
Hexano È muito inflamável. Aquecer somente em
banho-maria.
Sílica Gel È muito irritante para os pulmões. Evite
respirar seu pó muito fino
TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DOS REAGENTES
Parte II:
2.A) Separação por cromatografia em coluna
Questionário
2) Por que foi utilizado uma mistura de acetona e hexano no preparo de extrato?
Por ser utilizada uma mistura de um componente polar (acetona) e um componente (apolar),
pode-se dessolver o extrato já que na amostra existem grupos de carotenos (apolar) e grupo de
clorofilas (polar). Então, modulando a polaridade, o solvente orgânico extrator, pode extrair
os componentes desejados.
4) Por que o extrato foi aplicado sobre as placas previamente preparadas e não sobre as
placas preparadas durante o experimento?
Porque as placas preparadas durante o experimento necessitariam de mais tempo de
exposição ao ar para que ocorresse uma secagem efetiva que implicasse na aderência do
adsorvente sobre as mesmas.
É importante ressaltar que apesar das placas fabricadas terem um custo maior, elas são mais
confiáveis, pois dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas. E
as placas preparadas em laboratório estão mais sujeitas a ausência de aderência do adsorvente
e a uniformidade. Problemas estes que implicam na realização do experimento.
7) O que é Rf?
Rf é o fator de retenção, que é obtido a partir da relação da distância percorrida pelo
componente da mistura(dc) e a distância percorrida pelo eluente ( de).
Obs.: Os cálculos do Rf para cada banda foi realizada durante o desenvolvimento do
relatório.
8) Considerando a natureza química das substâncias separadas , a polaridade da fase
estacionária e da fase móvel, comparar e explicar os cromatogramas obtidos no
experimento I.
O estudo dos cromatogramas foi realizado na discussão.
10) Por que a coluna não deve possuir bolhas e não deve secar?
Se o adsorvente secar ou tiver bolhas de ar, a obtenção da separação completa de uma mistura
será provavelmente impossível,pois os dois fatores causam inclinação das bandas resultando
em separação parcial.
11) Qual grupo de compostos eluiu primeiro da coluna? Qual do grupo de compostos
ficou mais retido?
O componente que eluiu primeiro foi o caroteno, pois por ser apolar interagiu com mais com
a fase móvel, sendo facilmente deslocado. E a clorofila ficou retida, sendo eluida apenas
quando se realizou uma eluição por polaridade através da escolha da acetona como o solvente,
uma vez que o hexano é um solvente polar, não podendo conseqüentemente arrastar a
clorofila.
13) Qual é o mecanismo de separação dos dois grupos de compostos neste experimento?
O mecanismo de separação é dado pela interação da fase estacionária e da fase móvel com
os componentes da mistura, no caso do experimento, o mecanismo de separação é o processo
físico, que é denominado de processo de adsorção, que é baseado principalmente em atrações
eletrostáticas ou dipolares (forças de Van Der Waals), incluindo a formação de ponte de
hidrogênio.
A adsorção se dá na interface entre o sólido e a fase móvel, devido à presença de grupos
ativos na sua superfície.
ANEXO II
Classificação científica
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Ordem: Caryophyllales
Família: Amaranthaceae
Gênero: Spinacia
Espécie: S. oleracea
Nome binomial
Spinacia oleracea
ANEXO III
As clorofilas são os pigmentos verdes que atuam como as principais moléculas foto
receptoras das plantas. Elas são capazes de absorver certos tipos de comprimentos de onda da
luz visível que então são convertidos em energia pelas plantas. Duas formas diferentes destes
pigmentos são as clorofilas a e b. Os carotenóides são pigmentos amarelos que também estão
envolvidos no processo fotossintético; a estrutura do -caroteno está representada na figura
2.6. O 〈-caroteno difere do isômero na posição da dupla ligação no anel cicloexano (C4-C5
ao invés de C5-C6).Adicionalmente, os cloroplastos também contêm vários derivados de
carotenos contendo oxigênio chamados de xantofilas.
Referências Bibliográficas
VOGEL, Artur, Análise Química Quantitativa, 5a ed., Rio de Janeiro, Ed.Guanabara Koogan.