UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA CURSO: ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: QUÍMICA ORGÂNICA II – EXA 411 DOCENTE: CARLA MENDES

CROMATOGRAFIA

Feira de Santana-Ba Fevereiro/2009

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA CURSO: ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: QUÍMICA ORGÂNICA II DOCENTE: CARLA MENDES

Trabalho da disciplina de Química Orgânica II do Curso de Engenharia de Alimentos realizado pelo aluno Danilo Freitas, como atividade avaliativa. Orientadora: Carla Mendes

Feira de Santana-Ba Fevereiro/2009

Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre

Parte I: Cromatografia em Camada Delgada

OBJETIVO

INTRODUÇÃO .Verificar a separação de clorofilas e carotenos presentes no extrato de espinafre a partir da análise dos cromatogramas das bandas que correspondem a cada componente após a eluição em um sistema de solvente (fase móvel).

Na escolha do solvente ou da mistura de solventes. todavia. é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque correspondem a compostos incolores. sendo: dc: distância percorrida pelo componente da mistura. alumina.É uma técnica simples e muito importante para a separação rápida e qualitativa de pequenas quantidades de material. os valores de Rf obtidos em uma placa raramente se repetem em outra.4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos). Se os componentes são substâncias coloridas. Depois que o solvente ascendeu pela placa. deve-se considerar a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel. a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e a fase estacionária. A relação entre as velocidades de movimento da substância e da frente do solvente é chamada Rf. . dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura. A placa coberta e seca chama-se “placa de cromatografia em camada fina”. como tamanho da partícula do adsorvente. o suporte utilizado é uma placa de vidro. Quando a placa de CCF é colocada verticalmente em um recipiente fechado que contém uma pequena quantidade de eluente. composição do solvente grau de saturação da câmara de eluição. À medida que o solvente sobe pela placa. as diversas manchas serão claramente visíveis. de: distância percorrida pelo componente da mistura. Um método bastante comum é o uso de vapores de iodo. Outros reagentes para visualização são: nitrato de prata (para derivados halogenados). Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água e deixa-se secar. a fase líquida ascende por uma camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. Na prática. Contudo. espessura da camada do adsorvente. Cada substância se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção. Os valores de Rf são. As substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as substâncias mais polares. etc. Para a visualização deve-se "revelar a placa". os diversos componentes da mistura são separados. esta é retirada da cuba e seca até que esteja livre do solvente. este irá ascender pela camada do adsorvente por ação capilar. Os adsorventes mais utilizados como fase estacionária (FE) são: sílica. Rf = dc / de. celulose e poliamida. Freqüentemente. verde de bromocresol (para ácidos). devido a fatores. Na cromatografia em camada fina. a partir do ponto de aplicação até o meio da mancha. ninhidrina (para aminoácidos). 2. que reage com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor café ou amarela. e é definido como a razão entre a distância percorrida pela substância. ativação e condições de estocagem das placas. importantes quando se faz um estudo comparativo utilizando soluções de substâncias-padrão aplicadas na mesma placa. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original. etc. e a distância percorrida pelo solvente a partir do ponto de aplicação. Durante este processo.

PARTE EXPERIMENTAL Reagentes Folhas de espinafre Água Acetona Acetato de etila Gel de sílica Éter de petróleo Hexano        .

Evitar inalação ou contato com a pele. Irritante para a pele. Nocivo: risco de efeitos graves para a saúde em caso de exposição prolongada por inalação. Evite contato com a pele olhos e vestuários. Evite respirar seu pó muito fino È muito inflamável. . Facilmente inflamável. É tóxico. irritante e muito inflamável. . È muito irritante para os pulmões.TABELA DE TOXIDADE DOS REAGENTES REAGENTES Água Acetona Acetato de Etila Éter de Petróleo Sílica Gel Hexano TOXICIDADE -----------------------------------------------------É tóxico e irritante. Aquecer somente em banho-maria.

solúvel Solúvel em 0.90 a 20oC -83.79 a 20oC ------água.11 Acetato de CH3COOCH2CH3 Etila Éter de Mistura de -----------Petróleo hidrocarbonetos voláteis Hexano Sílica Gel C6H14 SiO2 86. sólida Miscível em 0.66 a 20oC ------etanol e em clorofórmio Ponto de ebulição (0C) 100o 56.65 a 20oC ------insolúvel. em clorofórmio.cm3 ) (20-1) (g/mol 250C 18. 0o líquida 917 kg·m−3.09 Líquido incolor Sólido branco Pont o de fusão (0C −3 1000 kg·m .08 88.2o 77o 30o a 70o 69o Obs.TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS Compostos Fórmula Química Água H2O Peso Aparência Solubilidade Densidade Molecular (g.0o água.01 Líquido incolor Líquido incolor Líquido incolor Líquido incolor Acetona C3H6O 58. etanol e éter Miscível em 0. etanol e éter Em água: 0.: A sílica usada na cromatografia de camada delgada é a gel de sílica 60G.18 60. .

Erlemeyer. Aro. Pipeta Pasteur. Suporte Universal. Bastão de Vidro. Coluna. Etiquetas. Papel de Filtro . Garra. Balança. Proveta.VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS Béquer. Funil de Vidro.

C e 1.D) Aplicação da amostra na cromatoplaca e desenvolvimento do cromatograma Fazer na placa uma marca de referência com1.5 cm de altura Tampar o béquer com uma placa de Petri 1.C) Preparo da cuba cromatográfica Preparar 20 mL da fase móvel em um béquer de 250 mL A altura do solvente não deve ultrapassar 1.5 cm de distância da borda inferior e 1.D para cada um 1.FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Parte 1: 1.0 da borda superior Aplicar a solução de extrato de espinafre com o auxílio do tubo capilar no centro da marca inferior .B) Seleção da fase móvel Escolher 4 solventes puros ou misturas de solventes Realizar as etapas 1.A) Preparo das cromatoplacas Preparar uma suspensão uniforme 2 g de gel de sílica 60G + 4 a 5 mL de água destilada Espalhar a suspensão de maneira uniforme sobre a placa de vidro Repouso 1.

Introduzir a placa na cuba cromatográfica Esperar que a fase móvel atinja a marca superior Retirar a placa e secá-la na capela Observar as bandas e anotar as distâncias percorridas pela fase móvel e por cada um dos componentes .

CROMATOGRAMAS Placa I  Fase estacionária: Sílica gel 60G  Fase móvel: Mistura de hexano e acetona 8:2 Placa II  Fase estacionária: Sílica gel 60G  Fase móvel: Hexano Placa III  Fase estacionária: Sílica gel 60 G  Fase móvel: mistura de hexano e acetato de etila .

8 cm d(clorofila) = 0.5 cm Rf para a banda amarela: Rf = 4.8/5 = 0.5/5 = 0.10 cm .6/5 = 0. pode-se calcular o Rf para cada banda visível na placa: Placa I: d(eluente): 5 cm d (carotenos): 4 cm d (clorofila): 0.2 cm Rf para a banda verde: Rf = 0/5 = 0 cm Placa III d(eluente) = 5 cm d(carotenos) = 4.CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO A determinação do fator de retenção é obtida pela relação abaixo: Rf = dc/de dc: distância percorrida pelo componente da amostra. Logo.6 cm Rf da banda amarela: Rf = 4/5 = 0.12 cm Placa II d(eluente) = 5 cm d(carotenos) = 1 cm d(clorofila) = 0 cm Rf para a banda amarela: Rf = 1/5= 0. de: distância percorrida pelo eluente.18 cm Rf para outra banda: Rf= 0.8 cm Rf da banda verde: Rf = 0.9 cm d(outros): 0.96 cm Rf para a banda verde: Rf = 0.9/5 = 0.

sendo então facilmente deslocado pela mistura de solventes.RESUMO Fase estacionária Gel de sílica 60G Gel de sílica 60G Gel de sílica 60G Fase móvel hexano + acetona hexano Rf para banda Rf para banda Rf para outras amarela (cm) verde (cm) bandas (cm) 0. não dessolveu a clorofila por ser um eluente de baixa polaridade. tendo conseqüentemente um deslocamento menor do que o grupo de carotenos.96 etila DISCUSSÃO Tendo-se a fase estacionária comumente utilizada – sílica gel (polar). Pode-se detectar ainda a presença de outros componentes que interagiram muito com a fase estacionária. em que se utilizou a mistura de solventes já estabelecida no roteiro ( hexano e acetona). A visualização só é possível a partir do uso de alguns métodos. em caso de fases estacionárias polares. ou seja. O que confirma sua forte interação com a fase estacionária.2 0. Já o grupo de clorofila interagiu mais com a F. o componente menos polar (caroteno) interagiu mais com a fase móvel( média polaridade) e pouco com a fase estacionária(polar).E. Então.8 0. pois o primeiro é de baixa polaridade e o segundo é de média polaridade. possuindo logicamente desvantagem na competição com os componentes da amostra pelo sítio de ativação na superfície da fase estacionária. por exemplo. uma vez que o Rf para a banda verde foi igual a zero. que não deslocou o grupo de clorofila. obtendo-se essa informação e com auxílio de uma seqüência crescente de polaridade dos eluente. logo atende ao requisito citado anteriormente.0 0. Através do cálculo do Rf para cada banda pode-se comprovar as análises feitas a partir do cromatograma. obtendo-se os seguintes resultados: Na placa I.18 0. É importante frisar que podem ter existindo outros componentes na placa que não eram visíveis.12 0. uma vez que a F. Na placa II. como a banda amarela foi mais deslocada pelo solvente em comparação com as demais.10 --------------------------------------- Hexano + acetato de 0. percebe-se que o deslocamento foi muito menor do que quando o solvente utilizado foi o de média polaridade. Pode-se então fazer análise do comportamento da banda para cada solvente utilizado a partir do estudo das interações entre a fase móvel e fase estacionária e entre essas com os componentes da amostra. é normal utilizar solventes de baixa ou média polaridade. foi incumbida apenas a tarefa da seleção de solventes adequados para a realização do experimento. logicamente seu Rf será maior que o Rf dos componentes analisados. Em suma o grupo de clorofila interagiu muito com a fase estacionária e o grupo de carotenos interagiu mais com a fase estacionária se comparado com o deslocamento da banda verdade. foram utilizados respectivamente os dois solventes julgados como mais adequados: hexano e a mistura de hexano com acetato de etila. porém. . O cálculo do fator de retenção ratificou a análise. uma vez que.QUADRO . o solvente utilizado foi o hexano (apolar).M compete pelo sítios ativos na superfície do adsorvente com os demais componentes da amostra.

foi deslocado até a extremidade superior da placa .Na placa III. È preciso ressaltar que os valores de Rf não são constantes cromatográficas empregadas. interagindo logicamente pouco com a fase estacionária. os componentes do grupo interagiram mais com a fase estacionária que o eluente. etc. sendo conseqüentemente pouco deslocado pelo mesmo. Em relação ao grupo de clorofila. a mistura de solventes possuiu desvantagem na competição pelo sítio de ativação na superfície do adsorvente. variando com as condições cromatográficas empregadas com a natureza e preparação do solvente . o tamanho da amostra . . O que provocou uma forte interação do grupo de carotenos com a fase móvel (média polaridade).Logo os valores encontrados podem sofrido grandes variações. ou seja. a temperatura. ou seja. o eluente utilizado foi uma mistura de hexano com acetato de etila.

Figura 1: Esquema da prática de cromatografia em camada delgada .

Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre Parte II: Cromatografia em Coluna .

OBJETIVO Separar e obter as clorofilas e carotenos presentes no extrato de espinafre. .

Assim. sendo que os mais empregados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3). Por outro lado. De um modo geral. tetracloreto de carbono. os compostos apolares atravessam a coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares. metanol. o sólido utilizado na fase fixa deve ser um material insolúvel na fase móvel associada (eluente). bandas ou zonas móveis começam a ser formadas. cloreto de metileno. Com uma escolha cuidadosa das condições (adsorvente. todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. se for escolhido um solvente muito polar. acetato de etila. geralmente na forma de pó finamente dividido. eluente. . praticamente qualquer mistura pode ser separada.À medida que os compostos da mistura são separados. tamanho da coluna. a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto. etanol. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura.INTRODUÇÃO Na cromatografia em coluna. O fluxo de eluente deve ser contínuo. éter etílico. ela não se moverá. velocidade de eluição). A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente pouco polar e aumenta-se gradativamente a polaridade do eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais polares. água e ácido acético. porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. hexano. Uma seqüência de eluentes de polaridade crescente é a seguinte: éter de petróleo. cada banda contendo somente um composto. Os diferentes componentes da mistura mover-se-ão com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente.

PARTE EXPERIMENTAL Reagentes     Folhas de espinafre Acetona Gel de sílica 60 Hexano .

Evite contato com a pele olhos e vestuários. È muito irritante para os pulmões. Evite respirar seu pó muito fino .TABELA DE TOXICIDADE DOS REAGENTES REAGENTES Acetona Hexano Sílica Gel TOXICIDADE É tóxico e irritante. Aquecer somente em banho-maria. È muito inflamável.

18 Aparência Solubilidad e Acetona Líquido incolor Sólido branco Líquido incolor Densida de (g.08 60.TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DOS REAGENTES Reagentes Fórmula Peso Química Molecular (g/mol-1) C3H6O 58. etanol 20oC e éter Solúvel em 0.2o Gel de SiO2 sílica Hexano C6H14 a ------- 69o .79 a água.cm3 ) (20-250C Miscível em 0.66 etanol e em 20oC clorofórmio Ponto de fusão (0C ------- Ponto de ebulição (0C) 56.09 86.

B) Aplicação da amostra e eluição Abrir a torneira da coluna até que a camada de solvente se aproxime da sílica Sem deixar a coluna secar Sem tocar nas paredes Aplicar a solução de extrato de espinafre com uma pipeta Pasteur. espalhando de maneira uniforme sobre a fase estacionária Abrir a torneira até o extrato atingir o nível do recheio Colocar uma camada de sílica sobre o extrato .A) Separação por cromatografia em coluna Fixar a coluna verticalmente Manter um béquer abaixo da coluna Preparar uma suspensão com hexano e 8 g de gel de sílica 60G Colocar a suspensão dentro da coluna A torneira deve está aberta e a coluna deve está com 1/3 de sua capacidade preenchida com hexano Deixar o material assentar Não deixar a coluna secar durante o enchimento 2.FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Parte II: 2.

iniciando a eluição Coletar a 1ª banda num frasco rotulado Mudar a fase móvel para acetona Coletar a outra banda. em outro frasco rotulado Observar a coloração das bandas .Adicionar o hexano.

Figura2: Esquema da prática de cromatografia em coluna .

pois acontecendo isso. que possibilitou o deslocamento dos componentes das clorofilas(polar). ou seja adicionou na coluna um solvente polar ( acetona). foram eliminadas. que possuiu desvantagem na competição pelo sítio de ativação na superfície do adsorvente. que logicamente interagiu menos com a fase estacionária. tendo dificuldade assim. método este. foi necessária a realização de uma eluição por polaridade. a qual supostamente é menos polar que a fase estacionária. implicaria em uma separação incompleta já que haveria irregularidades na coluna.Já a banda verde (polar) continuou imóvel na parte superior da coluna devido a sua maior interação com a FE. Obtendo-se a primeira fração ( banda amarela) e vendo que a banda verde continuava imóvel. logo. foi necessário o uso de alguns métodos a fim de evitar irregularidades na coluna. pode-se supostamente deduzir que não houve tempo suficiente para que nenhum composto fosse deslocado pelo solvente. devido à baixa polaridade do eluente. . tais como o auxílio de um método empírico para eliminação de bolhas. que consistiu no uso de um solvente volátil( acetona). inicialmente. resfriando as bolhas que conseqüentemente conseguiram migrar. ou seja. de arrastar os componentes. O outro método foi encher a coluna de forma que evitasse a secagem. recolheu-se o denominado volume morto. que foi posto no algodão e envolto na superfície da coluna onde continha as bolhas. pode-se obter a primeira banda (amarela) que por ser apolar interagiu mais com a fase móvel do que com a fase estacionária (polar). à medida que se colocou o eluente( hexano). Então.DISCUSSÃO A separação do grupo de carotenos e clorofilas foi obtida a partir do uso da cromatografia em coluna. devido ao constante acréscimo do solvente. É importante destacar que o deslocamento do grupo de carotenos até a extremidade inferior da placa demorou. A retirada das bolhas foi possível porque a acetona retirou calor da superfície da coluna. Para a realização de uma efetiva separação dos componentes da amostra. Nesse experimento.

5)Qual a finalidade do uso da CCD nesse experimento? A cromatografia em coluna tem como finalidade a separação e a obtenção dos compostos (clorofilas e carotenos).ANEXO I Questionário 1)Por que as folhas foram moídas? As folhas foram moídas a fim de se obter o extrato. pode-se dessolver o extrato já que na amostra existem grupos de carotenos (apolar) e grupo de clorofilas (polar). 3) Após a preparação do extrato de folhas de espinafre observa-se a presença de duas fases. a clorofila permaneceu no centro da placa.: Os cálculos do Rf para cada banda foi realizada durante o desenvolvimento do relatório. Então. . 2) Por que foi utilizado uma mistura de acetona e hexano no preparo de extrato? Por ser utilizada uma mistura de um componente polar (acetona) e um componente (apolar). a clorofila permaneceu imóvel na parte superior da mesma. pois dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas. Problemas estes que implicam na realização do experimento. aumentando-se assim a superfície de contato com os solventes para a extração dos componentes da amostra e possibilitando a retirada da fase aquosa do extrato. e que a o grupo de clorofila interagiu mais com a FE . uma vez que a CCD só verifica a separação dos componentes. à medida que o caroteno atravessou a coluna facilmente. pode extrair os componentes desejados. E as placas preparadas em laboratório estão mais sujeitas a ausência de aderência do adsorvente e a uniformidade. pois foi menos deslocada pela fase móvel. elas são mais confiáveis. 6) Qual dos dois componentes é mais polar? Explique. 7) O que é Rf? Rf é o fator de retenção. o solvente orgânico extrator. que é obtido a partir da relação da distância percorrida pelo componente da mistura(dc) e a distância percorrida pelo eluente ( de). É importante ressaltar que apesar das placas fabricadas terem um custo maior. Pode-se confirmar que o componente mais polar é a clorofila. Sabendo-se a fase estacionária é polar. modulando a polaridade. 4) Por que o extrato foi aplicado sobre as placas previamente preparadas e não sobre as placas preparadas durante o experimento? Porque as placas preparadas durante o experimento necessitariam de mais tempo de exposição ao ar para que ocorresse uma secagem efetiva que implicasse na aderência do adsorvente sobre as mesmas. enquanto o caroteno foi facilmente arrastado pelo solvente para a extremidade superior da placa. Na CCD. Obs. Explicar. As duas fases correspondem à fase orgânica extraída pelo solvente e à fase aquosa proveniente da umidade natural da planta. Na CC.

9) Se os componentes não fossem coloridos como poderiam ser identificadas as bandas na cromatografia em camada delgada? Os métodos mais comuns para visualização de uma placa são:  Vapores de iodo. no caso do experimento. O estudo dos cromatogramas foi realizado na discussão. sendo eluida apenas quando se realizou uma eluição por polaridade através da escolha da acetona como o solvente. a mesma posicionou-se no centro da placa. que é denominado de processo de adsorção. . No segundo método. o mecanismo de separação é o processo físico. 11) Qual grupo de compostos eluiu primeiro da coluna? Qual do grupo de compostos ficou mais retido? O componente que eluiu primeiro foi o caroteno. a polaridade da fase estacionária e da fase móvel. a obtenção da separação completa de uma mistura será provavelmente impossível. 13) Qual é o mecanismo de separação dos dois grupos de compostos neste experimento? O mecanismo de separação é dado pela interação da fase estacionária e da fase móvel com os componentes da mistura. Na CC o caroteno ficou na extremidade inferior da coluna por ter interagido mais com a fase móvel. os vapores de iodo regiram com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor marrom ou amarela. sendo. No primeiro método. sendo pouco deslocada pela FM. incluindo a formação de ponte de hidrogênio. Outro método consiste na adição de um indicador de fluorescência ao adsorvente usado para cobrir a placa. então separado. não podendo conseqüentemente arrastar a clorofila. comparar e explicar os cromatogramas obtidos no experimento I. 10) Por que a coluna não deve possuir bolhas e não deve secar? Se o adsorvente secar ou tiver bolhas de ar. sendo facilmente deslocado. devido à presença de grupos ativos na sua superfície. E a clorofila ficou retida. a mesma ficou retida na extremidade superior da placa por não interagir com a fase móvel (hexano). já na CCD. A adsorção se dá na interface entre o sólido e a fase móvel. na CC. 12) Comparar o comportamento observado das bandas na CC com o observado na CCD.8) Considerando a natureza química das substâncias separadas .pois os dois fatores causam inclinação das bandas resultando em separação parcial. que é baseado principalmente em atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de Van Der Waals). Em relação à clorofila. já na CCD foi facilmente arrastado até a extremidade inferior da coluna. pois por ser apolar interagiu com mais com a fase móvel. sob a luz UV os compostos geralmente como manchas brilhantes de prata. uma vez que o hexano é um solvente polar.  Lâmpada ultravioleta.

ANEXO II Spinacia oleracea na época de floração Classificação científica Reino: Divisão: Classe: Ordem: Família: Gênero: Espécie: Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Caryophyllales Amaranthaceae Spinacia S. oleracea Nome binomial Spinacia oleracea .

Adicionalmente. Elas são capazes de absorver certos tipos de comprimentos de onda da luz visível que então são convertidos em energia pelas plantas. Os carotenóides são pigmentos amarelos que também estão envolvidos no processo fotossintético.ANEXO III As clorofilas são os pigmentos verdes que atuam como as principais moléculas foto receptoras das plantas. O 〈-caroteno difere do isômero ® na posição da dupla ligação no anel cicloexano (C4-C5 ao invés de C5-C6).6. os cloroplastos também contêm vários derivados de carotenos contendo oxigênio chamados de xantofilas. . Duas formas diferentes destes pigmentos são as clorofilas a e b. a estrutura do ®-caroteno está representada na figura 2.

2001. Rio de Janeiro.br/pdf/abmvz/v59n5/a20v59n5. Ed.pdf acessado às 13:00 do dia 19 de fevereiro de 2009 . Análise Química Quantitativa...Guanabara Koogan.Referências Bibliográficas VOGEL. Análise Química Quantitativa. 5a ed. Técnicas e Operações Unitárias em química Laboratorial. RJ.scielo. Artur. 4aed. LAVOURRETE. HTTP:// www. 2003. LTC. Aramando.C. HARRIS.. D. 5a ed. 28p.

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