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Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Engenharia de Alimentos

TA514 – Bioquímica de Alimentos

Relatório da aula prática

Efeito da temperatura na atividade enzimática

Grupo 3:

Patrícia Sacoda 092562 Turma C

Catarina Guimarães de Mello 090732 Turma C

Campinas, 13 de maio de 2011.

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1. Introdução

Enzimas são proteínas com funções catalisadoras, ou seja, são moléculas que
aceleram reações químicas, diminuindo sua energia de ativação. Elas reagem com
determinados constituintes, os substratos, formando complexos. Essa propriedade é
altamente específica e depende da estrutura da proteína, da natureza do substrato,
entre outros (LEHNINGER et al., 2002).

Alguns fatores influenciam a atividade enzimática de uma enzima como, por


exemplo, pH, temperatura, presença de cofatores e inibidores, etc (BOBBIO, 1995). A
atividade enzimática está relacionada à velocidade da reação enzimática.

O aumento da temperatura, em reações catalisadas por enzimas, provoca


inicialmente o aumento da velocidade de reação, devido ao aumento da energia
cinética entre as moléculas e o substrato. Em temperaturas de atividade enzimática
ótima, a velocidade de destruição das enzimas causada pelo calor é equilibrada pelo
aumento na reatividade enzima-substrato e a velocidade da reação é máxima
(MARZZOCO et al., 1999). Todavia, devido à sua natureza protéica, em temperaturas
muito altas, a enzima sofre desnaturação térmica, levando à diminuição de sua
concentração e fazendo com que a velocidade da reação também diminua
(LEHNINGER et al., 2002).

A desnaturação térmica ocorre devido à quebra das estruturas secundárias e


terciárias da proteína que forma a enzima. Portanto, não há quebra de ligações
peptídicas. O aumento da temperatura afeta as pontes de hidrogênio, ligações iônicas
e hidrofóbicas. Para algumas enzimas a desnaturação é irreversível, dependendo do
período de incubação (BOBBIO, 1995).

Na indústria de alimentos, o conceito do efeito da temperatura na atividade


enzimática é de grande importância em processos como inibição de atividade
enzimática em alimentos com a diminuição da temperatura, produção de compostos a
partir do uso de enzimas como o açúcar invertido, etc.

As α-amilases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4


glicosídicas de polissacarídeos, como glicogênio, amido ou seus produtos de
degradação, formando oligossacarídeos e, posteriormente, açúcares redutores como
maltose. Esta enzima pode ser de origem cereal, bacteriana e fúngica.

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Entre as α-amilases bacterianas mais importantes industrialmente, estão as
secretadas pelo gênero Bacillus. Das 48 espécies de Bacillus descritas, 32 produzem
α-amilase, mas poucas destas são capazes de secretar enzimas ativas em altas
temperaturas. Dentro deste gênero, B. subtilis e B. licheniformis são as duas espécies
mais utilizadas freqüentemente na produção comercial de α-amilase (SAJEDI et al.,
2005; CARVALHO, 2008). As vantagens no uso da α-amilase termoestável em pro-
cessos industriais incluem diminuição do risco de contaminação, aumento da taxa de
difusão dos reagentes e diminuição dos custos com refrigeração externa (LIN;
CHYAU; HSU, 1998). Entre as α-amilases fúngicas, destaca-se a produzida pela
Aspergillus niger. As amilases fúngicas são amplamente utilizadas na indústria
cervejeira e de panificação.

2. Objetivos

O objetivo da aula prática consistiu na determinação da faixa de temperatura


ótima de atividade da α-amilase fúngica.

3. Materiais e métodos

3.1. Materiais

- α-amilase fúngica comercial solução 5 µL/200 mL

- Solução de amido pH 6,0. O substrato foi preparado pela mistura de 100 mL


de solução de 1% de amido solúvel em água destilada (previamente aquecido durante
5 minutos em ebulição) + 80 mL de tampão fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0.

- Solução de Iodo-KI (0,3% de e 3% de KI)

- Solução de HCl 0,1 Mol/L

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3.2. Determinação da faixa de temperatura ótima de atividade da α-amilase
fúngica

Pipetou-se 4,5 mL de solução de amido pH 6,0 em 8 tubos de ensaio


numerados (5ºC, 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60º, 70ºC, 80ºC e banho-maria em ebulição).
Anotou-se o número do grupo nos tubos de ensaio.

Os tubos foram, então, incubados nas respectivas temperaturas em banho-


maria, durante 10 minutos, para equilibrar a temperatura. Adicionou-se exatamente 0,5
mL de solução de α-amilase (5 µL/200 mL) em cada tubo de ensaio contendo
substrato amido, agitou-se os tubos e continuou-se incubando durante 5 minutos em
cada temperatura.

Foi adicionado aos tubos 4,5 mL de HCl 0,1 Mol/L aos tubos de ensaio para
paralisar a reação enzimática.

Retirou-se 1,5 mL de amostra de cada tubo de ensaio incubado a diferentes


temperaturas, transferiu-se para novos tubos de ensaio numerados (5ºC, 30ºC, 40ºC,
50ºC, 60º, 70ºC, 80ºC e banho-maria em ebulição), adicionou-se exatamente 0,1 mL
de solução de Iodo-KI e completou-se o volume para 15 mL com água destilada.

O tubo “branco” foi preparado pipetando-se 0,1 mL de solução de iodo e 14,9


mL de água destilada em tubo de ensaio numerado.

O tubo “controle” foi preparado misturando-se 4,5 mL de solução de amido pH


6,0, 0,5 mL de água destilada e 4,5 mL de HCl 0,1 Mol/L em tubo de ensaio.
Transferiu-se com pipeta 1,5 mL da mistura para tubo de ensaio, adicionou-se 0,1 mL
de solução de iodo-KI e completou-se o volume para 15 mL com água destilada.

O espectrofotômetro foi calibrado com a solução do tubo “branco” e mediu-se a


absorbância das amostras dos tubos teste e da solução do tubo “controle” a 620 nm.

Os valores de atividade enzimática e de porcentagem de atividade relativa


foram, então, calculados.

4. Resultados e discussão

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Após as devidas incubações das amostras preparadas, o valor da absorbância a 620
nm foi lido em espectofotômetro. Os valores encontrados estão expressos na tabela
abaixo:

Temperatura Abs 620 nm


5ºC 0,646
30ºC 0,420
40ºC 0,218
50ºC 0,112
60ºC 0,111
70ºC 0,399
80ºC 0,750
97ºC 0,812
Tubo controle 0,775

Tabela 1: Absorbâncias obtidas para as amostra

Para os cálculos da atividade de α-amilase primeiramente subtrai-se o valor da


absorbância da amostra do valor da absorbância do controle e divide-se o valor
encontrado por 3 fatores. Esses fatores são: o tempo de incubação (tempo em que a
enzima agiu: 5 minutos), o volume de α-amilase adicionado ( 0,5 mL), e o valor
equivalente a uma unidade ativa em termos de diminuição de absorbância por minuto
(no caso, esse valor é 0,001). O valor encontrado é então multiplicado pela diluição
realizada (1:40000), como mostrado a seguir:

Segue-se, então, os cálculos para todos os valores de temperatura da tabela1.

A atividade relativa é a porcentagem de atividade enzimática em cada


temperatura medida, em relação à maior atividade observada. Neste caso, temos:

Os resultados encontrados estão expressos na tabela abaixo:

Temperatura Abs 620 nm Unidade de Atividade

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atividade de α- Relativa (%)
amilase (U/ mL)
5ºC 0,646 2,064.106 19,42%
30ºC 0,420 5,680.106 53,46%
40ºC 0,218 8,912.106 83,88%
50ºC 0,112 1,0608.107 99,84%
60ºC 0,111 1,0624.107 100%
70ºC 0,399 6,016.106 56,62%
80ºC 0,750 0,4.105 0,37%
97ºC 0,812 0 0
Tubo controle 0,775 0 0

Tabela 2: Efeito da temperatura na Atividade da α-amilase bacteriana

Com os resultados obtidos e expressos na tabela acima, plotou-se um gráfico


da atividade de α- amilase, mostrado a seguir:

Gráfico1: Atividade de α-amilase

Analisando o gráfico acima, podemos supor que a faixa de temperatura ótima


da α-amilase fúngica está entre 50˚C e 60˚C. Miller et al (1953) estudaram a
estabilidade da enzima com o aumento da temperatura até 80ºC. As amilases fúngicas
perderam sua atividade e em 80ºC somente alcançaram 1% de sua atividade.

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Segundo SMITH (1991), a temperatura ótima da α-amilase produzida por A.
niger é entre 50˚C e 60˚C. Já a α-amilase produzida por Bacillus licheniformis possui
faixa de temperatura ótima de 90˚C a 100˚C e a produzida por Bacillus Subtillis entre
65˚C e 70˚C, segundo Maldonado & Lopez (1995).

Tendo em vista os dados da literatura e o obtido em aula prática, observamos


que a enzima utilizada está na faixa de temperatura ótima da A. niger.

As α-amilases fúngicas e bacterianas tem grande importancia industrial. A


produzida por Bacillus subtilis é importânte por produzir enzimas termoestáveis que
permitem a sacarificação em temperaturas elevadas, o que acelera o processo e
minimiza a ação de possíveis contaminantes (BEZERRA et al, 2004).

Amilases fúngicas normalmente obtidas a partir de Aspergillus oryzae,


Aspergillus niger, Aspergillus awamori ou espécies de Rhizophus têm sido utilizadas
como suplemento na atividade amilolítica. Enzimas desta origem têm como finalidade
o aumento dos níveis de monossacarídeos e dissacarídeos fermentáveis, promovendo
uma melhor condição ao fermento (NAGODA WITHANA; REED, 1993).

Já a α -amilase de Bacillus licheniformis é uma enzima termoestável. Estas


enzimas, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação na indústria, visto
que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas têm o risco de
contaminação por microorganismos mesófilos, que são a maioria em um ambiente
industrial, significativamente reduzido (GOMES et al, 2005).

5. Conclusão

Conclui-se, observando os valores obtidos em aula prática e os valores encontrados


na literatura citada, que a enzima utilizada é a Aspergillus niger.

6. Referencias bibliográficas

BEZERRA, R. P.; BORBA, F. K. S. L.; MOREIRA, K. A.; LIMA J. L.; PORTO A. L. F.;
CHAVES A. C., Extração líquido-líquido da amilase produzida pelo Bacillus Subtilis no
sistema de duas fases aquosas, Instituto de Ciências Biológicas - UPE, Recife – PE,
2004.

BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A.. Introdução à Química de Alimentos. Livraria Varela


Ltda. São Paulo. 1995. 2ª edição.

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CARVALHO, R. V. et al. Otimização das condições de cultivo para a produção de
amilases pelo termofílico Bacillus sp. e hidrólise de amidos pela ação da enzima.
Ciência e Tecnologia de alimentos. Campinas, 2008. Disponível em:
http://www.scielo.br/pdf/cta/v28n2/a17v28n2.pdf. Acessado em: 11/05/2011.

GOMES, E.; GUEZ, M. A. U.; MARTIN, N.; SILVA, R.,Enzimas termoestáveis: fontes,
produção e aplicação industrial,Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista, 2005.

LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., e COX, M. M., Princípios de bioquímica. 3ª ed.


Trad. A. A. Simões e W. R. N. Lodi. São Paulo: Savier, 2002.

LIN, L. L.; CHYAU, C. C.; HSU, W. H., Production and properties of a raw starch-
degrading amylase from the thermophilic and alkalophilic Bacillus sp. TS-23.
Biotechnology Applied and Biochemistry, v. 28, n. 1, p. 61-68, 1998.

MALDONADO, H.G.; LOPEZ, O.P. Amylolytic enzymes ans products derived from
starch: a review. Critical Reviews in Food Science and nutrition, v.35, n.5, p373-403,
1995

MARZZOCO, A., TORRES, B. B. Bioquímica básica. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara


Koogan, 1999.

NAGODAWITHANA, T.; REED, G., Enzymes in Food Processing. 3 ed. Academic


Press Inc., 1993;

SAJEDI, R. H. et al. A Ca-independent α-amylase that is active and stable at low pH


from the Bacillus sp. KR-8104. Enzyme Microbiology Technology, v. 36, n. 7, p. 666-
671, 2005.

SMITH, J. Food Additive User’s Handbook. New York: Blackie and Son Ltd., 1991.p.
131, 144.