Manual BioAS Desbloqueado

PROTOCOLO DE
DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE DAS ENZIMAS
β-GLICOSIDASE E
ARILSULFATASE
PROTOCOLO DE DETERMINAÇÃO
GUIADA
DO PARTICIPANTE
β-GLICOSIDASE E ARILSULFATASE
Responsáveis
APRESENTAÇÃO
Ieda de Carvalho Mendes, Fabio Bueno dos Reis Junior, Guilherme Chaer
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores mundiais de carnes, e, dentre elas,
a carne suína ocupa posição de destaque gerando desenvolvimento econômico e social
Introdução
para as regiões produtoras. Seu crescimento também vem acompanhado de aumento
na geração de resíduos da produção, sendo os dejetos os mais preocupantes pela
Os protocolos de determinação das enzimas β-glicosidase e arilsulfatase são baseados em Ta-
batabai característica
(1994) e devem de alto
serpotencial
seguidos derigorosamente
poluição de solos e água. Uma
conforme das neste
descrito principais rotas Todos
manual.
os procedimentos
de destinaçãodevem ser padronizados:
dos dejetos é a utilizaçãopreparo das amostras
desse material de solo,damarcha
na substituição analítica e
adubação
apresentação
mineraldos
dasresultados.
culturas e, dessa forma, contribuir para a sustentabilidade da atividade.
As vidrarias (frascos Erlenmeyer de 50 ml, etc..) e as concentrações dos reagentes e/ou das
O curso “Potencial agronômico dos dejetos de suínos” é destinado aos agentes de
soluções não podem ser alterados, sob nenhuma circunstância.
transferência de tecnologia e de assistência técnica (ATER) que desejam adotar as
Com relação ao preparo das vidrarias, ressalta-se que, após lavagem com detergente em água
boas práticas no manejo de dejetos suínos com consequente destinação adequada e
corrente, é necessário que elas permaneçam em solução de ácido clorídrico 10% por 30 minu-
tos. Em uso racional,
seguida devem seguindo critérios técnicos.
ser enxaguadas por no Os conteúdos
mínimo cinco abordados são: composição
vezes em água corrente e por três
dos dejetos de
vezes com água destilada. suínos, impactos ambientais, a influência da água na qualidade dos
dejetos e fertilizantes orgânicos e organominerais com dejetos de suínos.
Utilizar balanças, balões volumétricos e pipetas calibradas.
DuranteEste curso é autoinstrucional,
a realização dos ensaios depermitindo
atividade que você sigaaseu
enzimática, próprio ritmo
manipulação e oferecendo
das amostras e vidra-
rias deveflexibilidade
ser realizada
nos com luvas
estudos. cirúrgicas.
A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
em módulos,
Com relação seusdo
ao preparo objetivos e como
solo para vocêenvolvendo
a BioAS será avaliado.
determinação das atividades das enzi-
mas β-glicosidase e arilsulfatase, deve ser destacado que, no conceito FERTBIO, o solo é seco
ao ar eBonsdepoisestudos!
peneirado usando peneira de 2mm. Importante retirar com pinças todos os
pedaços de raízes, tecidos de plantas e outro materiais orgânicos grosseiros que possam inter-
ferir na determinação da atividade enzimática (podem ser possíveis fontes de enzimas).
As determinações de atividade enzimática são feitas da seguinte forma: duas replicatas (repeti-
ções analíticas) com substrato e uma replicata para o controle (incubação sem substrato) totali-
zando 3 determinações para cada amostra de solo (duas replicatas mais o controle).
Nas repetições analíticas, o substrato da enzima é adicionado a mistura solo/tampão antes da
incubação.
No controle: a adição do substrato é feita após a incubação, depois do CaCl2 e NaOH (nas
determinações de arilsulfatase) e depois do CaCl2 e THAM (nas determinações de β-glicosida-
se). A finalidade do controle é descontar toda coloração basal que não for derivada da atividade
enzimática.
Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 3

2
GUIADADO PARTICIPANTE
Quadro 1- Comparação dos reagentes das marchas analíticas para a determinação da atividade
APRESENTAÇÃO
da da β-glicosidase e da arilsulfatase
Arilsulfatase
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores mundiais deβ-glicosidase
carnes, e, dentre elas,
Tampão a carne suína ocupa posiçãoAcetato pH 4,8
de destaque MUB
gerando desenvolvimento pH 6,0 e social
econômico
paranas
Substrato as regiões
amostrasprodutoras. 1Seu
ml crescimento
PNS 0,05Mtambém vem acompanhado
1 ml PNG de aumento
0,025M
Incubação 1 hora 37°C 1 hora 37°C
característica de alto potencial de poluição de solos e água. Uma das principais rotas
CaCl 0,5M 1ml 1ml
2 de destinação dos dejetos é a utilização desse material na substituição da adubação
mineral das culturas e, dessa

NaOHforma, contribuir
0,5M 4ml para a sustentabilidade
THAM dapH12 atividade.
4ml
Substrato nos controles
O curso “Potencial agronômico1 ml dos
PNSdejetos
0,05M de suínos” é destinado
1 ml PNG
aos 0,025M
agentes de
Filtragem
Leituraboas práticas no manejo de410nmdejetos suínos com consequente destinação
420nm adequada e
uso racional, seguindo critérios técnicos. Os conteúdos abordados são: composição
dos dejetos de suínos, impactos ambientais, a influência da água na qualidade dos
Este curso é autoinstrucional, permitindo que você siga seu próprio ritmo e oferecendo
flexibilidade nos estudos. A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
em módulos, seus objetivos e como você será avaliado.
Bons estudos!

GUIADA
DO PARTICIPANTE
2. Procedimento para determinação da atividade da enzima β-glicosidase

APRESENTAÇÃO
2.1- Princípio:
Baseia-se na determinação
a carne colorimétrica
suína ocupa posição do p-nitrofenol
de destaque (pnf) liberadoeconômico
gerando desenvolvimento pelas β-glicosidases
e social do
solo, quando o solo é incubado com uma solução tamponada de p-nitrofenil-β-D-glicopiranosí-
deo. para as regiões produtoras. Seu crescimento também vem acompanhado de aumento
Substrato da enzima: p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (PNG) Sigma N-7006 Coloração: INCO-
LOR
de destinação dos dejetos é a utilização desse material na substituição da adubação
Produto: p-nitrofenol (pnf) Coloração: amarela
mineral das culturas e, dessa forma, contribuir para a sustentabilidade da atividade.

2.2. Marcha Analítica
• Peseboas1,00g ± 0,005
práticas nogmanejo
de solode(livre de resíduos
dejetos orgânicos)
suínos com e coloque
consequente num adequada
destinação frasco Erlenmeyer
e
de 50uso
ml.racional,
O solo deve ser seco ao ar e peneirado em malha de 2mm.
seguindo critérios técnicos. Os conteúdos abordados são: composição
• Adicione 4ml de MUB pH 6,0
• Adicione 1ml de PNG 0,025M a todos
dejetos e fertilizantes orgânicos os frascos menos
e organominerais o controle.
com dejetos de suínos.
• Incube por uma hora a 37° C com rolhas de borracha ou silicone (para evitar evaporação).
Este 1ml
• Adicione cursodeé CaCl
autoinstrucional,
0,5M permitindo que você siga seu próprio ritmo e oferecendo
2
flexibilidade
• Adicione 4ml de nos
THAMestudos.
pH 12A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
em módulos,
• Adicione 1ml de PNGseus 0,025M
objetivosnos
e como você será avaliado.
controles
• Filtre através de um papel de filtro Whatman #2 ou Machery Nagel N. 616
• FaçaBons estudos!
a leitura da coloração amarela em espectrofotômetro no comprimento de onda de
420nm.
Obs: Para cada amostra de solo fazer 2 repetições analíticas mais o controle.
A manipulação das amostras e vidrarias deve ser realizada com luvas cirúrgicas.
Quadro 2 - Resumo da Marcha Analítica de determinação da enzima β-glicosidase nas repeti-

ções analíticas

4
2.3. Reagentes para determinação da β-glucosidase

APRESENTAÇÃO
2.3.1. HCl – solução a 10%
Medir 900a ml de água
carne suínadestilada e adicionar
ocupa posição de vagarosamente
destaque gerando 100 ml de HCl, usando aeconômico
desenvolvimento capela de exaustão.
e social Essa
solução é utilizada na lavagem de vidrarias e também para corrigir o pH do tampão MUB pH=6.0
2.3.2. PNG (0,025M)
Dissolva característica
0,377g de p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo
de alto potencial de poluição (Sigma
de N-7006)
solos e em 40 ml
água. Umade MUB pH 6,0
das principais rotas
Ajuste o de
volume para 50 ml
destinação doscom MUB pH
dejetos é a6,0. Utilize balão
utilização volumetrico.
desse material na substituição da adubação
** Prepare essa solução
mineral momentos
das culturas antes de
e, dessa realizar
forma, o ensaio.para
contribuir Demora mais ou menos 30
a sustentabilidade daminutos para dissol-
atividade.
ver
O acurso
**Observar “Potencial
fórmula agronômico
do reagente dos de
e as moléculas dejetos de suínos”
água nele contidas é destinado
e refazer aos agentes
os cálculos de
de molaridade, se
necessário. CONSERVE NA GELADEIRA PROTEGIDO DA LUZ
Para preparar:
50 ml 0,377 g de PNG emOs 50conteúdos
ml de MUB abordados
pH 6,0
uso racional, seguindo critérios técnicos. são: composição
100 ml 0,754 g de PNG em 100 ml de MUB pH 6,0
150 ml 1,131 g de PNG em 150 ml de MUB pH 6,0
2.3.3. Cloreto de Cálcio CaCl2 (0.5M)
Dissolva 73,5g de CaCl2.2H2O em 700 ml de H2O
Complete o volume para 1L com H2O destilada, utilizando balão volumetrico e conservar em geladeira.
2.3.4. THAM- Solução extratora de Hidróxido de sódio (0,1M THAM pH 12)
Bons estudos!
Dissolva 12,2 g de THAM (Tris-Hydroxymethyl-Amino-Metano) em 700 ml de H2O destilada.
Ajuste o pH para 12, adicionando NaOH 0.5M ( aproximadamente 15ml)
Complete para 1L com H2O destilada, utilizando balão volumetrico, e guarde na geladeira.
2.3.5. Solução estoque MUB (Modified Universal Buffer)
Misture:
12,1g de THAM
11,6g de Acido maleico
14,0g de acido cítrico
6,3g de acido bórico
488 ml de NaOH 1N
Complete para 1L com H2O destilada, utilizando balão volumétrico, e mantenha a solução na geladeira.
2.3.6. MUB pH 6,0
Use 200 ml da solução estoque de MUB

Ajuste o pH para 6,0 usando HCL 10% ( aproximadamente 500 ml)
Complete o volume para 1L usando H2O destilada

GUIADA
DO PARTICIPANTE
2.4. Comentários
APRESENTAÇÃO
Embora seja melhor usar soluções novas, a solução de PNG é estável por alguns dias se
armazenada naégeladeira
O Brasil a 4°C.produtores e exportadores mundiais de carnes, e, dentre elas,
um dos maiores
O THAMaécarne
quem suína ocupa
confere a posição de amarela
coloração destaque agerando
solução,desenvolvimento econômico
ou seja a cor amarela sóese
social
forma após
sua adição (é ele quem libera o p-nitrofenol formado).
na geração
É necessário de resíduos
adicionar CaCl2 parada prevenir
produção,a sendo os dejetos
dispersão os emais
da argila preocupantes
extração pelaorgânica
de matéria
do solo, característica
quando da adição
de altodo tampãode
potencial THAM, para
poluição de asolos
liberação doUma
e água. p-nitrofenol.
das principais rotas
2.5. Valores de referência β-glicosidase
Valores referência de atividade de β-glicosidase para Latossolos argilosos de Cerrado, profun-
transferência
didade 0-10cm, de tecnologia
conceito FERTBIO e (amostra
de assistência técnica
de solo (ATER)
coletada na que
fasedesejam adotar asseca ao
de pós-colheita,
boas práticas
ar e peneirada em malha no manejo
2mm) de dejetos suínos com consequente destinação adequada e
Classe de interpretação
Bioindicador
dos dejetos de suínos,Baixo
impactos ambientais, a influência da água na qualidade dos
Moderado Adequado
dejetos e fertilizantes orgânicos
β-glucosidase ≤66 e organominerais
67 - 115com dejetos de suínos.
>116
TodosEste
os valores
cursode atividade de β-glicosidase
é autoinstrucional, são expressos
permitindo que você em:
siga seu próprio ritmo e oferecendo
mg deflexibilidade
p-nitrofenol/kg
nosdeestudos.
solo/h = Amgseguir
-1
h
pnf kgapresentaremos
-1
a estrutura geral do curso, dividido
ou µg em
de p-nitrofenol/g de solo/h = µg pnf g h
-1 -1
módulos, seus objetivos e como você será avaliado.
2.6. Curva padrão para os ensaios de β-glicosidase

Bons estudos!
2.6.1. Reagentes específicos da curva
2.6.1.1 Solução estoque ou Solução padrão de p-nitrofenol
Dissolva 1,0 g de p-nitrofenol (Sigma 104-8) em 700 ml de H2O destilada.

Complete o volume para 1L utilizando balão volumétrico e guarde em geladeira.
Para preparar:
1,0 L Use 1,0 g de p-nitrofenol
2.6.1.2. Solução padrão diluída
No momento de preparo da curva dilua 5 ml da solução estoque de PNF em 100 ml de água destilada utilizando
um balão volumétrico.

6
2.6.2. Modo de preparo:

APRESENTAÇÃO
• Pipete alíquotas de 0, 0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 ml da “solução padrão diluída” em erlenmeyers de 50
ml, complete
O Brasil épara 5mlmaiores
um dos e proceda comoese
produtores fosse umamundiais
exportadores amostradedecarnes,
solo (ou seja adicione
e, dentre elas, 1 ml
de CaCl2 0,5M; 4ml de THAM pH 12, misture e filtre).
• Fazerpara
a leitura de absorbância
as regiões em espectrofotômetro
produtoras. Seu crescimento também(420nm)
vem acompanhado de aumento
• Essas naalíquotas
geração de resíduos da 0,
representarão produção, sendo150,
25, 50, 100, os dejetos os mais
200 e 250 µg depreocupantes
p-nitrofenol. pela
Detalhamento do preparo da curva
µg de p-nitrofenol Agua destilada
mineral das culturas (ml)forma,
e, dessa Solução padrão diluída
contribuir para a(ml) CaCl2 (ml) da atividade.
sustentabilidade THAM (ml)
0 5 0,0 1 4
O25 curso “Potencial agronômico
4,5 dos dejetos
0,5de suínos” é destinado
1 aos agentes de 4
50
transferência 4
de tecnologia 1,0 técnica (ATER) que
e de assistência 1 desejam adotar as 4
100 3
boas práticas no manejo de dejetos suínos2,0 1
com consequente destinação adequada4e
150 2 3,0 1 4
200 1 4,0 1 4
dos
250 dejetos de suínos,
0 impactos ambientais,
5,0 a influência da água
1 na qualidade dos
4
Observações importantes:
• Se asEste curso é excederem
amostras autoinstrucional, permitindo
o ponto quepadrão
da curva você siga seu próprio
referente ritmo
a 250 µg ede
oferecendo
p-nitrofenol, de-
vem ser diluídas com THAM 0,1 M, pH=12 ou com água destilada, até quedividido
flexibilidade nos estudos. A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, a leitura fique
dentro
emdos limitesseus
módulos, da curva de calibração.
objetivos e como você será avaliado.
• A escolha dos pontos de preparo da curva padrão varia em função do espectrofotômetro uti-
Bons
lizado. estudos!
Na curva descrita nesse protocolo cada 1ml de solução padrão diluída contem 50 µg
de p-nitrofenol. Em função do aparelho, se houver necessidade de um intervalo com concen-
trações menores (ex: 10, 20, 30, 40 e 50), pode-se optar pelo preparo da curva padrão da
seguinte maneira: faça a solução padrão diluída usando 1ml da solução estoque em 100ml
de agua, ao invés de 5ml da solução estoque em 100 ml de agua. Assim cada ml da solução
padrão diluída terá 10 µg de p-nitrofenol e não 50 µg de p-nitrofenol.

GUIADA
DO PARTICIPANTE
3. PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA

APRESENTAÇÃO
ARILSULFATASE
3.1. Princípio:
Baseia-se na determinação colorimétrica do p-nitrofenol que é liberado pelas sulfatases encon-
tradas nopara asquando
solo regiões oprodutoras. Seu crescimento
solo é incubado com umatambém
soluçãovem acompanhado
tamponada de aumento
de p-nitrofenil sulfato.
Substrato: p-nitrofenil sulfato (PNS) Sigma N3877 Coloração: INCOLOR
Produto: p-nitrofenol Coloração: amarela
3.2- Marcha Analítica
• Pesetransferência
1,00g ± 0,005 de gtecnologia e de de
de solo ( livre assistência
resíduos técnica (ATER)
orgânicos) que desejam
e coloque adotarErlenmeyer
num frasco as
de 50boas
ml. práticas
O solo deve ser seco
no manejo ao ar e suínos
de dejetos peneirado
com em malha dedestinação
consequente 2mm. adequada e
• Adicione 4ml de tampão
uso racional, seguindoacetato pHtécnicos.
critérios 5,8. Os conteúdos abordados são: composição
dos dejetos
• Adicione 1ml de dePNS suínos,
0,05M impactos
a todosambientais, a influência
os frascos menos da água (testemunha,
os controles na qualidade dos
branco).
• Agitedejetos e fertilizantes
os frascos, coloqueorgânicos
a rolha de e organominerais com adejetos
borracha e incube de suínos.
37°C por uma hora.
• Adicione
Este 1ml
cursodeé CaCl 2
0,5M
autoinstrucional, permitindo que você siga seu próprio ritmo e oferecendo
• Adicione 4ml de nos
flexibilidade NaOH 0,5M.A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
estudos.
• em módulos,
Adicione 1ml de PNSseus aos
objetivos e como você será avaliado.
controles.
• Agite o frasco para misturar e filtre através de um papel de filtro Whatman # 2 ou Machery Nagel
Bons estudos!
N. 616
• Determine a intensidade da coloração amarela num espectrofotômetro a 410 nm.
OBS: Para cada amostra fazer 2 repetições analíticas mais o controle.
A manipulação das amostras e vidrarias deve ser realizada com luvas cirúrgicas.
Quadro 3 - Resumo da Marcha Analítica de determinação da enzima arilsulfatase para as repe-

tições analíticas

8
3.3. Reagentes para determinação da arilsulfatase

APRESENTAÇÃO
3.3.1. HCl – solução a 10%
Medir 900 ml de água destilada e adicionar vagarosamente 100 ml de HCl, usando a capela de exaustão. Essa
solução é utilizada na lavagem de vidrarias
para (para-nitrofenil
3.3.2. PNS as regiões produtoras. Seu0,05M
sulfato) crescimento também vem acompanhado de aumento
Dissolva 0,644g de p-nitrofenil sulfato, sem molécula de água (Sigma N3877) em 40 ml de tampão acetato.
Ajuste o volume para 50 ml com esse mesmo tampão. Utilize balão volumétrico. CONSERVE NA GELADEIRA
PROTEGIDO DA LUZ.
Obs: Verificar a fórmula do reagente e a quantidade de moléculas de água. Fazer ajustes quando necessário.
3.3.3. Cloreto
O cursode Cálcio CaCl
“Potencial (0,5M)dos dejetos de suínos” é destinado aos agentes de
agronômico
2
Dissolva transferência
73,5g de CaCl2de
.2H2tecnologia
O em 700 mle de
de Hassistência
2
O técnica (ATER) que desejam adotar as
Completeboas práticas
o volume para no manejo
1L com H2O de dejetosutilizando
destilada, suínos com
balãoconsequente
volumétrico, e destinação adequada e
guarde em geladeira.
uso racional,
3.3.4. Tampão seguindo
Acetato 0,5M critérios
pH 5,8 técnicos. Os conteúdos abordados são: composição
Dissolva 68g de acetato de sódio trihidratado (observar a quantidade de moléculas de água) ou 41,015g de
acetato de sódio anidro (C H N O ) em 700 ml de água destilada; adicione gotas de ácido acético glacial (99%)
2 3 8 2
até atingir o pH desejado e complete o volume para 1L em água destilada, utilizando balão volumétrico.
3.3.5. NaOH 0,5M
Dissolva em
20g módulos,
de NaOH em 700
seus ml de H2O
objetivos destilada.
e como você será avaliado.
Complete para 1L com H2O destilada, utilizando balão volumétrico.
Obs: Preparar essa solução o mais próximo possível do momento de sua utilização
Bons estudos!
3.4. Comentários:
Procure sempre usar soluções novas, principalmente do substrato

O NaOH é quem confere a coloração amarela a solução, ou seja a cor amarela só se forma após
sua adição (é ele quem libera o p-nitrofenol formado).
É necessário adicionar CaCl2 para prevenir a dispersão da argila e extração de matéria orgânica
do solo, quando da adição do NaOH, para a liberação do p-nitrofenol.
Precipitação de NaOH tem sido reportada. Quando o reagente é de boa qualidade esse processo
pode ser revertido com uma pequena agitação. Em alguns casos pode ser necessário filtrar a
solução para que não ocorra interferência na leitura da absorbância.

GUIADA
DO PARTICIPANTE
3.5. Valores de referência

APRESENTAÇÃO
Valores referência de atividade de arilsulfatase para Latossolos argilosos de Cerrado, profundi-
dade 0-10cm,
O Brasilconceito
é um dosFERTBIO (amostrae exportadores
maiores produtores de solo coletada na fase
mundiais de pós-colheita,
de carnes, seca ao ar
e, dentre elas,
e peneirada em malha 2mm)
para as regiões produtoras. Seu crescimento
Classe detambém vem acompanhado de aumento
interpretação
Bioindicador
na geração de resíduos Baixo
da produção, sendo Moderado Adequado
os dejetos os mais preocupantes pela
Arilsulfatase ≤30
característica de alto potencial de poluição31 de- solos
70 e água. Uma das >71principais rotas
Todosdeos destinação dos dejetos
valores de atividade é a utilização
de arilsulfatase desse material
são expressos em: na substituição da adubação
mg demineral das culturas
p-nitrofenol/kg e, dessa
de solo/h = mg pnfforma,
kg-1 hcontribuir
-1 para a sustentabilidade da atividade.
ou µgOdecurso
p-nitrofenol/g de solo/h
“Potencial = µg pnf gdos
agronômico h dejetos
-1 -1
de suínos” é destinado aos agentes de
3.6. Curva
boaspadrão
práticaspara os ensaios
no manejo de arilsulfatase
de dejetos suínos com consequente destinação adequada e
uso racional,
3.6.1. Reagentes seguindo
específi coscritérios
da curvatécnicos. Os conteúdos abordados são: composição
3.6.1.1.dejetos
Solução padrão estoque
e fertilizantes dee p-nitrofenol
orgânicos ( para-nitrofenol)
organominerais com dejetos de suínos.
Dissolva Este
1,0 g curso é autoinstrucional,
de p-nitrofenol permitindo
(Sigma 104-8) em 700 mlque
de Hvocê
2
siga seupróprio ritmo e oferecendo
O destilada.
Completeflexibilidade nos1Lestudos.
o volume para em balãoAvolumétrico
seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
e guarde na geladeira.
empreparar:
Para módulos, seus objetivos e como você será avaliado.
Bons
0,5 L estudos! Use 0,5 g de p-nitrofenol
3.6.1.2 Solução padrão diluída
No momento de preparo da curva dilua 5 ml da solução padrão estoque padrão em 100 ml de água destilada,
utilizando um balão volumétrico.
3.6.2. Preparo da Curva
• Pipete alíquotas de 0, 0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 ml da “solução padrão diluída” em erlenmeyers de

50 ml, complete para 5ml e proceda como se fosse uma amostra de solo ( ou seja adicione
1 ml de CaCl2 0,5M; 4ml de NaOH, misture e filtre).
• Fazer a leitura de absorbância em espectrofotômetro (410nm).
• Essas alíquotas representarão 0, 25, 50, 100, 150, 200 e 250 µg de p-nitrofenol.

10
Detalhamento do preparo da curva

APRESENTAÇÃO
µg de p-nitrofenol
Agua destilada (ml) Solução padrão CaCl2 (ml) NaOH(ml)
diluída (ml)
O 0Brasil é um dos maiores
5 produtores e exportadores
0 mundiais de1 carnes, e, dentre elas,
4
a25 4,5
carne suína ocupa posição 0,5
de destaque gerando 1
desenvolvimento 4
econômico e social
50 4 1,0 1 4
100 3 2,0 1 4
150 2 3,0 1 4
característica
200 de alto potencial
1 de poluição de
4,0 solos e água. Uma
1 das principais rotas
4
de
250 destinação dos dejetos
0 é a utilização desse
5,0 material na substituição
1 da adubação4
mineral
Observações das culturas e, dessa forma, contribuir para a sustentabilidade da atividade.
importantes:
• Se as O
amostras
curso excederem
“Potencialo agronômico
ponto da curvadospadrão referente
dejetos de asuínos”
250µg, devem ser diluídas
é destinado aoscom THAM de
agentes 0.1 M,
pH=12 ou com água destilada, até que a leitura fique dentro dos limites da curva de calibração.
• A escolha dos pontos de preparo da curva padrão varia em função do espectrofotômetro utilizado. Na curva descrita
nesseboas práticas
protocolo no de
cada 1ml manejo
soluçãode dejetos
padrão suínos
diluída com
contem consequente
50 µg destinação
de p-nitrofenol. Em funçãoadequada
do aparelho,ese houver
necessidade de um intervalo com concentrações menores (ex: 10, 20, 30, 40 e 50), pode-se optar pelo preparo
da curva padrão da seguinte maneira: faça a solução padrão diluída usando 1ml da solução estoque em 100ml de
agua, dos dejetos
ao invés de 5ml dedasuínos,
solução impactos
estoque emambientais,
100 ml de águaa destilada.
influência da cada
Assim águamlnadaqualidade dos diluída
solução padrão
terá 10 µg de p-nitrofenol e não 50 µg de p-nitrofenol.
Bons estudos!

11
GUIADA
DO PARTICIPANTE
4. COMO FAZER O CÁLCULO

APRESENTAÇÃO
Para exemplificar o cálculo dos valores de atividade enzimática, vamos usar uma
O Brasil
curva feita paraé uma dos maiores
enzima produtores e exportadores
arilsulfatase (os cálculosmundiais
para dea carnes, e, dentre elas,
β-glicosidase seguem o
mesmo padrão).
Absorbancia Concentração
0 0
característica
0,304 de alto potencial
25 de poluição de solos e água. Uma das principais rotas
de destinação dos dejetos50é a utilização desse material na substituição da adubação
0,616
mineral
1,249 das culturas e, dessa
100 forma, contribuir para a sustentabilidade da atividade.
1,871 150
2,502 200
transferência
3,051 de tecnologia
250 e de assistência técnica (ATER) que desejam adotar as
Essa curva gera o seguinte gráfico, com respectiva equação de regressão.
Curva Arilsulfatase
300
y = 81,087x - 0,4102
250flexibilidade nos estudos. A seguir apresentaremos a estrutura geral do curso, dividido
R² = 0,9996
Concentração (µg pnf)
200
Bons estudos!
150
100
50
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Leitura de Absorbancia

12
Suponha o seguinte exemplo: a amostra (controle e duplicatas) deu a seguinte leitura no

APRESENTAÇÃO
espectrofotômetro
Id Lab Abs
Controle 1.1 I 0,049
Rep 1 1.1 II 0,459
para
Rep 2
as regiões
1.1 III
produtoras.
0,491
Seu crescimento também vem acompanhado de aumento
Utilizando a equação de regressão apresentada no gráfico da curva (y=81,087x-0,4102), e uma
vez que foram utilizadas 1g de solo seco, calculamos a concentração (µg p-nitrofenol por grama
de destinação
de solo seco) dos dejetos
e procedemos é a utilização
a subtração desse
do valor do material
controle,nadas
substituição
replicatasda adubaçãoum -con-
(replicata
trole e replicata doisculturas
mineral das - controle).
e, dessa forma, contribuir para a sustentabilidade da atividade.
A seguir,Ocomcursobase nos valores
“Potencial das replicatas,
agronômico já de
dos dejetos descontado
suínos” é odestinado
controle,aosprocedem-se
agentes de os cál-
culos da média, desvio padrão e coeficiente de variação (CV) = ((desvio padrão/média) x100).
Se o CV for maior que 25% a análise dessa amostra deverá ser repetida. A partir da média, os
boas práticas
valores podem no manejo de dejetos suínos com consequente destinação adequada e
ser arredondados.
Peso Conc/ Desvio
Id Lab dosAbsdejetosConcentração
de suínos, impactos Um-contr
a influênciadois-contr
da água naMédia dos CV (%)
Seco ambientais,
Peso qualidade
padrão
1B .2 I dejetos
0,049e fertilizantes
3,563 orgânicos
1,0 e organominerais
3,563 com dejetos
33,245 de suínos.35
35,759 2 5
1B .2 II 0,459 36,808 1,0 36,808
1B .2 III 0,491 39,322 1,0 39,322
Nesse caso, para essa
em módulos, seus amostra
objetivos edecomo
solo,você
o valor de atividade enzimática foi de: 35 µg de
será avaliado.
p-nitrofenol. g de solo hora .
-1 -1
Bons estudos!

13
GUIADA
DO PARTICIPANTE
5. LITERATURA RECOMENDADA
APRESENTAÇÃO
MENDES, O I.C.;
BrasilSOUSA,
é um dos maiores
D.M.G.; produtores
REIS e exportadores
JUNIOR, F.B.; LOPES,mundiais de carnes,
A.A.C. Bioanálise dee,solo:
dentre elas,acessar e
como
interpretar a saúde do solo. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2018 (Circular Técnica, 38).
MENDES, naI.C; CHAER,
geração de G. M.; SOUSA,
resíduos D. M. G.; sendo
da produção, REIS JUNIOR, F. B.
os dejetos os; mais
DANTAS, O. D. ; OLIVEIRA,
preocupantes pela M. I.
L.; LOPES, A.A.C.; SOUZA, L. M. Bioanálise de solo: a mais nova aliada para a sustentabilidade agrícola.
característica
INFORMAÇÕES de alto potencial
AGRONÔMICAS, de1-11,
v. 8, p. poluição
2020.de solos e água. Uma das principais rotas
MENDES, I.C.; SOUSA, D.M.G.; REIS JUNIOR, F.B.; LOPES, A.A.C., SOUZA, L.M. Bioanálise de solo;
AspectosOteóricos
curso “Potencial Tópicos em dos
e práticos. agronômico Ciência do Solo,
dejetos 2019 a,
de suínos” v. X, p. 399-462,
é destinado 2019a.de
aos agentes
boasM.A.
TABATABAI, práticas no manejoInde
Soil enzymes. dejetos
Weaver suínos
RW, com
editor. consequente
Methods destinação
of Soil Analysis. adequada
Part e
2. Microbiological
uso racional,
and Biochemical seguindo
Properties. critérios
Madison: Soiltécnicos. Os conteúdos
Science Society abordados
of America; são: nº
1994. Book composição
5, p. 778–833.
Bons estudos!

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PROTOCOLO DE

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mineral das culturas e, dessa

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 33

2. Procedimento para determinação da atividade da enzima β-glicosidase

O curso “Potencial agronômico dos dejetos de suínos” é destinado aos agentes de

Quadro 2 - Resumo da Marcha Analítica de determinação da enzima β-glicosidase nas repeti-

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 3

2.3. Reagentes para determinação da β-glucosidase

Use 200 ml da solução estoque de MUB

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 53

2.6. Curva padrão para os ensaios de β-glicosidase

2.6.1.1 Solução estoque ou Solução padrão de p-nitrofenol

Dissolva 1,0 g de p-nitrofenol (Sigma 104-8) em 700 ml de H2O destilada.

2.6.1.2. Solução padrão diluída

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 3

2.6.2. Modo de preparo:

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 73

3. PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA

Quadro 3 - Resumo da Marcha Analítica de determinação da enzima arilsulfatase para as repe-

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 3

3.3. Reagentes para determinação da arilsulfatase

Procure sempre usar soluções novas, principalmente do substrato

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 93

3.5. Valores de referência

3.6.1.2 Solução padrão diluída

3.6.2. Preparo da Curva

• Pipete alíquotas de 0, 0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 ml da “solução padrão diluída” em erlenmeyers de

Material do Curso BioAS - Proibida a reprodução e divulgação 3

Detalhamento do preparo da curva

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4. COMO FAZER O CÁLCULO

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Suponha o seguinte exemplo: a amostra (controle e duplicatas) deu a seguinte leitura no

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