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AULA 5 - ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DE ÁGUAS: determinação de cloro

residual livre e total pelo método colorimétrico

A cloração é um método de desinfecção amplamente utilizado na potabilização de águas,

garantindo a qualidade microbiológica das mesmas. Ainda, contribui para a redução dos
níveis de amônia, ferro e manganês, bem como o controle do crescimento de algas.
O hipoclorito de sódio, comumente utilizado como fonte de cloro na desinfecção, em água
leva a formação de cloro livre, o íon hipoclorito e ácido hipocloroso. Estas reações são
altamente dependentes do pH e da temperatura e a medida do cloro residual permite
monitorar o teor de cloro adicionado. Adicionalmente, o cloro livro pode reagir com
aminas, formando as cloroaminas, podendo esta reação ser intencional (como forma de
desinfecção) ou consequências de uma água contaminada com elevado teor de compostos
nitrogenados. Entre as principais desvantagens do emprego de cloro na desinfecção,
destaca-se a formação de trihalometanos (THM), compostos de toxidade conhecida.
Enquanto o método iodométrico pode ser empregado na determinação de cloro em
amostras com concentração superior a 1 mg/L, o método colorimétrico utilizando DPD
(N,N-dietil-p-fenilenodiamina) é mais sensível (até 10 µg de Cl como Cl2/L), prático e
pode ser utilizado na determinação do cloro total, independente do seu estado (ex.:
cloroaminas).
O método DPD se baseia na sua reação imediata com o cloro livre presente na amostra,
produzindo uma cor avermelhada cuja absorbância máxima se dá em 515 nm. A adição
de excesso de iodeto faz com que a reação seja catalisada para as cloraminas, resultado
na determinação do cloro residual total. No entanto, devido a instabilidade do cloro em
solução, sua análise deve ser feita imediatamente após a coleta, evitando a exposição a
luz solar e agitação do frasco.
A Portaria de Consolidação Nº 5 determina a manutenção mínima de 0,2 mg/L de cloro
residual livre no sistema de distribuição e recomenda um teor máximo de cloro residual
livre no sistema de abastecimento de 2 mg/L. A mesma Portaria, estabelece ainda os
tempos de contato mínimo para a cloração, levando em consideração a temperatura, o pH
e a concentração residual de cloro livre.

MATERIAIS:
o Pipeta volumétrica de volumes variados
o Pipeta graduada de 5,0 mL
o Erlenmeyer de 250 mL e de 50 mL
o Balão volumétrico de 100 mL
o Béquer de 500 mL
o Pisseta de água destilada
o Espátula
o Iodeto de potássio
o Solução estoque de KMnO4 (equivalente a 100 mg/L de cloro livre – 891 mg/L
diluída 1:10)
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o Solução tampão fosfato

o Solução do reagente indicador (DPD)
o Cubetas de quartzo
o Espectrofotômetro (515 nm)

PROCEDIMENTO:
o Obtenção da curva de calibração:
o Preparar os padrões de cloro (0,05 a 4 mg/L):
o Adicionar, com auxílio de pipeta volumétrica, a solução estoque de
KMnO4 (equivalente a 100 mg/L de cloro livre) para cada concentração
que deseja preparar em um balão volumétrico de 100 mL.
o Completar o volume com água destilada.
o Adicionar 5 mL do tampão fosfato e 5 mL da solução do reagente indicador DPD
a um Erlenmeyer de 250 mL (um para cada concentração da curva de calibração).
o Verter a este Erlenmeyer a solução padrão cada concentração preparada e agitar
bem.
o Repetir o procedimento com 100 mL de água destilada para preparar o branco.
o Preencher a cubeta do espectrofotômetro com cada solução preparada e fazer a
leitura em 515 nm.
o Construir a curva de calibração e encontrar a equação da reta.

o Determinação de cloro residual livre em uma amostra de água:

o Em um Erlenmeyer de 50 mL adicionar 1 mL do tampão fosfato e 1 mL da solução
do reagente indicador DPD.
o Adicionar 20 mL da amostra e agitar bem.
o Preencher a cubeta do espectrofotômetro com a amostra preparada e fazer a leitura
em 515 nm.
o Encontrar o teor de cloro residual livre (mg/L de Cl2) a partir da equação da reta
da curva de calibração.

o Determinação de cloro residual total em uma amostra de água:

o A amostra anterior, adicionar 100 mg de iodeto de potássio e agitar bem.
o Após 2 minutos, preencher a cubeta do espectrofotômetro com a amostra
preparada e fazer a leitura em 515 nm.
o Encontrar o teor de cloro residual total (mg/L de Cl2) a partir da equação da reta
da curva de calibração.

DURAÇÃO APROXIMADA: 100 min

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AULA 6 - ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DE ÁGUAS: determinação de cloretos

O cloreto (Cl-) é um dos principais ânions encontrados em águas naturais, contribuindo

com parcela significativa dos sólidos totais dissolvidos o que se relaciona,
consequentemente, com a condutividade elétrica da água. Quando associado ao cátion
sódio (Na+) em concentrações superiores a 250 mg/L, confere sabor salgado, enquanto
que em associação com Ca2+ e Mg2+, esse sabor não é percebido em concentrações
inferiores a 1000 mg/L (em Cl-). Concentrações elevadas de Cl- estão associadas a
intrusão de água do mar em captações próximas a costa litorânea e, sendo o cloreto de
sódio (NaCl) prevalente na dieta, seus níveis são elevados em efluentes domésticos. A
alta concentração desse íon na água pode acelerar o processo de corrosão de metais, como
a tubulação usada na distribuição, além de prejudicar o crescimento de plantas na
agricultura. Sua remoção requer técnicas especiais como a dessalinização (osmose
reversa) ou eletrodiálise (troca iônica). A Portaria de Consolidação Nº 5 estabelece como
teor máximo 250 mg/L de Cl-, para atendimento ao padrão organoléptico de potabilidade.
O método argentométrico é um método titulométrico utilizado na determinação do teor
de cloretos em águas na faixa de 0,15 a 10 mg de Cl- na alíquota titulada. O método se
baseia na precipitação quantitativa de cloreto de prata (AgCl), utilizando uma solução de
nitrato de prata (AgNO3) como agente titulante. Na presença de cromato de potássio
(K2CrO4) e após a consumo completo do cloreto da amostra, adição subsequente do
titulante leva a precipitação de cromato de prata (Ag2CrO4), de coloração vermelho-tijolo.
Para evitar a precipitação acidental de hidróxido de prata (AgOH) em pH muito alcalino
ou conversão do íon cromato em dicromato em pH ácido, deve-se corrigir o pH da
amostra para a faixa entre 7 e 10. Substâncias em quantidades normalmente encontradas
em águas potáveis não irão interferir na análise, exceto pelo ferro que poderá interferir na
visualização do ponto de viragem quando em concentração acima de 10 mg/L. Outros
ânions podem precipitar com a prata: brometo, iodeto e cianeto.

MATERIAIS:
o Pipeta volumétrica de 10,0 mL
o Pipeta graduada de 2,0 mL
o Proveta de 200 mL
o Béquer de 50 mL
o Erlenmeyer de 125 mL
o Erlenmeyer de 500 mL
o Bureta de 25 mL
o Água destilada
o Espátula
o pHmetro
o Carbonato de cálcio (CaCO3)
o Solução indicadora de cromato de potássio (K2CrO4) 5% p/v
o Solução de padrão primário cloreto de sódio (NaCl) 0,0141 M
o Solução de titulante de nitrato de prata (AgNO3) 0,0141 M
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PROCEDIMENTO:
Padronização da solução de AgNO3 0,0141 M:
o Pipetar, com uma pipeta volumétrica, 10,0 mL da solução do padrão primário
NaCl 0,0141 mol/L e transferir para um erlenmeyer de 125 mL;
o Adicionar 40 mL de água destilada;
o Verificar o pH da solução em um pHmetro e, se necessário, ajustar para a faixa
entre 7-10 adicionando uma ponta de espátula de CaCO3;
o Adicionar 1,0 mL da solução indicadora de K2CrO4 5% m/v;
o Titular com a solução de nitrato de prata ~0,0141 mol/L, sob agitação constante,
até o aparecimento de um precipitado vermelho tijolo;
o Realizar a titulação em duplicata e o branco.
o Calcular a concentração exata da solução de AgNO3 em mol/L pela média das
titulações.

Determinação de cloreto em uma amostra:

o Medir 200 mL da amostra com o auxílio de uma proveta e adicionar em um
erlenmeyer de 500 mL.
o Verificar o pH da amostra em um pHmetro e ajustar para a faixa de 7-10
adicionando soluções de H2SO4 1 M ou NaOH 1 M, de acordo com o necessário;
o Alternativamente, tamponar a amostra adicionando uma ponta de espátula
de CaCO3
o Adicionar 1,0 mL da solução indicadora de K2CrO4 5% m/v ao erlenmeyer.
o Titular a amostra com a solução previamente padronizada de AgNO3 até o
aparecimento do precipitado vermelho tijolo;
o Realizar a titulação em duplicata;
o Calcular a concentração de cloreto na amostra, em mg/L.

DURAÇÃO APROXIMADA: 100 min

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AULA 7 - ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DE ÁGUAS: determinação de ferro total

O ferro ocorre em águas naturais, geralmente associado ao manganês, por meio de

dissolução de rochas contendo ferro, como a pirita. Possui dois estados de oxidação mais
comuns: a forma reduzida, Fe2+ (íon ferroso) e a forma oxidada, Fe3+ (íon férrico).
Quando em contato com ar atmosférico, a forma reduzida do ferro é oxidada pelo
oxigênio, levando a formação do íon férrico, responsável pela coloração amarelada da
água. Ainda que o homem necessite de ferro em sua dieta, é estabelecido um limite
máximo para concentração de ferro de 0,3 mg/L, principalmente por questões
organolépticas e econômicas, já que o Fe3+, por ser insolúvel, pode aderir a superfícies de
tecidos, por exemplo, ocasionando manchas.
A espectrofotometria é um método baseado na medida quantitativa da absorção da luz
que incide em uma solução, sendo a concentração na solução da substância responsável
pela absorção proporcional à quantidade de luz absorvida. A quantificação de diversos
compostos pode ser realizada por espectrofotômetro, partindo do princípio que o analito
seja capaz de absorver luz em algum comprimento de onda detectado pelo aparelho. É
possível ainda utilizar reações específicas com os analitos para gerar, indiretamente e
proporcionalmente, compostos que absorvam luz em determinado comprimento de onda
conhecido, aumentando a sensibilidade e especificidade do método.
O método da 1,10-fenantrolina se baseia na capacidade desse composto de complexar
com o íon Fe2+, em uma proporção 3:1. O complexo formado, possui colocação alaranjada
com absorção máxima em 510 nm. O pH ótimo para que a complexação ocorra
rapidamente é de 3,2-3,3. Como a fenantrolina complexa apenas com o íon Fe2+, para a
determinação de ferro total em uma amostra deve-se reduzir completamente o Fe3+
presente, utilizando a hidroxilamina como agente redutor.
A interferência de oxidantes fortes por ser reduzida pelo uso de um excesso de
hidroxilamina. Cianeto, nitrito e fosfatos podem ser removidos pelo aquecimento da
amostra em meio ácido. A interferência de outros metais, na ordem 10 vezes superior a
do ferro, pode ser minimizada pelo excesso fenantrolina. A concentração mínima
detectável desse método é de 10 µg/L de ferro, quando utilizado uma cubeta de 5 cm, uma
vez que a absorção de luz é proporcional ao caminho óptico. Um branco deve ser
realizado em paralelo com as amostras e padrões devido aos reagentes utilizados
apresentarem pequenas concentrações de ferro.

MATERIAIS:
o Pipeta volumétrica de 1,0, 2,0 e 5,0 mL
o Balão volumétrico de 100 mL (7)
o Pipeta graduada de 2,0 mL (2)
o Pipeta graduada de 5,0 mL (2)
o Erlenmeyer de 250 mL (7)
o Proveta de 50 mL
o Proveta de 10 mL
o Água destilada
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o Luva térmica
o Chapa aquecedora
o Espectrofotômetro visível
o Ácido clorídrico PA
o Solução de hidroxilamina 10% p/V
o Solução padrão de sulfato ferroso amoniacal 200 mg/L de ferro

PROCEDIMENTO:
Construção da curva de calibração com padrões de Ferro:
o Preparar as soluções padrões de 0,2, 0,5, 1, 2 e 5 mg/L de ferro em balões
volumétricos de 100 mL, a partir da solução padrão de ferro de 200 mg/L;
o Transferir 50 mL de cada solução preparada para um erlenmeyer de 250 mL;
o Em capela, adicionar a esse erlenmeyer 2 mL de ácido clorídrico PA e 1 mL da
solução de hidroxilamina;
o Levar a ebulição em uma chapa aquecedora até redução do volume para 15-20
mL;
o Após resfriamento, transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100
mL e adicionar 10 mL da solução tampão e 2,5 mL da solução de fenantrolina;
o Completar o volume com água destila e homogeneizar bem;
o Aguardar pelo menos 10 minutos para desenvolvimento completo da cor e
proceder com leitura no espectrofotômetro a 510 nm;
o A partir dos resultados obtidos, construir uma curva de calibração e encontrar a
equação da reta.

Determinação de ferro em uma amostra:

o Homogeneizar a amostra e transferir 50 mL para um erlenmeyer de 250 mL;
o Prosseguir conforme procedimento descrito para os padrões;
o Para amostras com turbidez ou cor, realizar um branco sem a adição da solução
de fenantrolina;
o A partir da equação da reta determinada com os padrões, encontrar o teor de ferro
na amostra.

DURAÇÃO APROXIMADA: 100 min

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AULA 8 - ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DE ÁGUAS: determinação de sulfato

O ânion sulfato (SO42-) é formado pelo enxofre no estado de oxidação +6 ligado a quatro
átomos de oxigênio e seu ácido correspondente é o ácido sulfúrico (H2SO4), muito
utilizado em processos industriais.
Na natureza, rochas contendo sulfato, como a gipsita e a barita, servem como fonte de
sulfatos na água por dissolução dessas. Outra fonte desse ânion na natureza consiste na
oxidação de enxofre elementar por bactérias. Água oceânicas possuem uma elevada
concentração de sulfato, e sua intrusão leva a aumento da concentração deste ânion em
lençóis próximos ao litoral. Fontes antrópicas também podem alterar a concentração de
sulfato nas águas: efluentes industriais, resíduos de mineração por meio da oxidação da
pirita (FeS2), lixiviação de solos de agricultura com fertilizantes, precipitação de chuva
ácida pelo lançamento de trióxido de enxofre (SO3) na atmosfera e uso de coagulantes
como o sulfato de alumínio no tratamento da água para consumo.
O íon sulfato é de fundamental importância à manutenção da vida, servindo como fonte
de enxofre em aminoácidos, proteínas, e atuando em processos biológicos como no
metabolismo. O valor máximo permitido pela Portaria de Consolidação Nº 5 é de 250
mg/L e, quantidades elevadas de sulfato de sódio e magnésio, possuem propriedades
laxativas, além de conferir salinidade à água.
Um dos métodos quantificação de sulfato é o método turbidimétrico que se baseia na
medida da turbidez da amostra causada pela precipitação de cristais de tamanho uniforme
de sulfato de bário (BaSO4) pela adição de cloreto de bário (BaCl2). A correlação entre
turbidez e concentração de sulfato é linear na faixa de 1-40 mg/L de sulfato e a
concentração em uma amostra pode ser determinada a partir da construção de uma curva
padrão.
Águas potáveis normalmente não possuem outros ânions em quantidades significativas
capazes de precipitar como sais de bário sob condições ácidas. Entre os interferentes do
método pode-se citar a presença de sílica em concentrações acima de 500 mg/L e amostras
com grandes quantidades de material orgânico. A interferência pela turbidez e a cor
aparente da amostra podem ser removidas pela realização de um branco.

MATERIAIS:
o Sistema de filtração: kitasato de 500 mL, funil sinterizado, bomba de vácuo, filtro
de papel de porosidade < 2 µm
o Pipeta volumétrica (5, 10, 20 e 25 mL)
o Balão volumétrico de 100 mL
o Erlenmeyer de 250 mL
o Béquer de 100 mL
o Proveta de 100 mL
o Espátula
o Cronômetro
o Agitador magnético
o Nefelômetro ou espectrofotômetro UV (leitura a 420 nm)
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o Cloreto de bário (BaCl2), cristais de 20-30 mesh

o Solução padrão de sulfato de potássio 100 mg/L em SO42-
o Solução tampão para determinação de sulfatos

PROCEDIMENTO:
Construção da curva de calibração:
o Preparar as soluções padrões de 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg/L de SO42- em balões
volumétricos de 100 mL, a partir da solução padrão de sulfato de potássio de 100
mg/L em SO42-;
o Transferir as soluções preparadas para um Erlenmeyer de 250 mL e adicionar 20
mL da solução tampão;
o Sob agitação, adicionar a cada solução preparada uma ponta de espátula de cloreto
de bário (BaCl2) e manter a agitação à velocidade constante por 60 ± 2 s;
o Medir a turbidez em turbidímetro em até 5 minutos;
o Construir uma curva padrão e encontrar a equação da reta.

Determinação da concentração de sulfato em uma amostra:

o Medir 100 mL da amostra, previamente filtrada, em uma proveta e transferir para
um Erlenmeyer de 250 mL;
o Adicionar 20 mL da solução tampão e manter sob agitação magnética;
o Sem interromper a agitação, adicionar uma ponta de espátula de cloreto de bário
e aguardar 60 ± 2 s, mantendo a agitação;
o Realizar a leitura da turbidez em até 5 minutos e calcular a concentração de sulfato
na amostra utilizando a curva padrão construída;
o Em paralelo, realizar um branco, sem a adição de cloreto de bário, para corrigir
possíveis interferentes de cor e turbidez presentes na amostra.

DURAÇÃO APROXIMADA: 100 min

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AULA 9 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS: coliformes totais pelo

método dos tubos múltiplos – ensaio presuntivo

O grupo de bactérias coliformes é utilizado como indicador microbiológico para avaliar

os padrões de potabilidade da água. Sua presença é um indicativo de contaminação fecal,
o que pode significar a presença de microrganismos patogênicos. Esse grupo inclui
gêneros de bactérias encontradas também fora do ambiente intestinal, limitando sua
aplicação como indicador específico de contaminação fecal. As bactérias do grupo
coliformes se caracterizam como bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios
facultativos, não formadores de esporos, capazes de fermentar a lactose, produzindo
ácido, gás e aldeído a 35,0 ± 0,5 oC em 2448 horas, mesmo na presença de sais biliares.
Os principais gêneros desse grupo são Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e
Enterobacter.
O método dos tubos múltiplos é um método probabilístico que permite determinar o
número mais provável (NMP) em uma amostra de água, baseando-se na frequência de
resultados positivos em diferentes diluições. O ensaio para coliformes pelo método dos
tubos múltiplos requer a realização de um ensaio em presuntivo e um confirmativo.

MATERIAIS:
o tubos de ensaio com tubo de Durham (15);
o estante para tubo de ensaio;
o pipeta graduada de 1 e 10 mL;
o bico de Bunsen;
o caldo Lactosado de concentração tripla* e simples;
o água de diluição;
o álcool 70%;
o estufa bacteriológica.

PROCEDIMENTO:
Ensaio presuntivo
o Ordenar 3 fileiras de 5 tubos de ensaio contendo tubos de Durham (5 com caldo
lactosado de concentração tripla e 10 contendo caldo lactosado de concentração
simples), identificando-os;
o Dilua a amostra (1:10) tomando 1 mL da mesma e 9 mL de água de diluição em
um frasco esterilizado;
o Nos primeiros 5 tubos, (concentração tripla) inocular, com pipeta esterilizada, 10
mL da amostra em cada tubo (diluição 1:1);
o Nos 10 tubos restantes (caldo lactosado de concentração simples), inocular nos 5
primeiros 1 mL da amostra (diluição 1:10) e nos 5 últimos tubos, inocular 1,0 mL
da amostra em diluição 1:10 (diluição final 1:100);
o Misturar e incubar a 35 ± 0,5 ºC durante 24-48 horas;
o Observar a formação de gás dentro do tubo de Durham e prosseguir com o teste
confirmativo.
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AULA 10 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS: ensaio confirmativo para

coliformes totais e coliformes termorresistentes

O grupo dos coliformes termotolerantes é um subgrupo dos coliformes totais, capazes de

fermentar a lactose a 44,5-45,5°C com produção de ácido e gás. Muitas vezes são
chamados de coliformes fecais, pois inicialmente acreditava-se que abrangia somente
bactérias de origem fecal, porém hoje sabe-se que bactérias de origem não fecal são
inclusas (ex.: Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii). Ainda
que a presença de coliformes termotolerantes não necessariamente signifique
contaminação de origem fecal, sua presença serve como indicativo de falha no processo
de desinfecção e/ou contaminação na distribuição da água tratada.

MATERIAIS:
o tubos de ensaio com tubo de Durham;
o estante para tubo de ensaio;
o bico de Bunsen ou lamparina a álcool;
o caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%;
o meio EC;
o alça de platina com cabo de Kolle;
o álcool 70%;
o estufa bacteriológica

PROCEDIMENTO:
Ensaio confirmativo
o Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo
do teste presuntivo (em cada diluição) uma porção de amostra e inocular em um
tubo correspondente contendo o meio verde brilhante bile a 2% (repicagem);
o Identificar os tubos e incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5 º C;
o Se houver formação de gás dentro do tubo de Durham o teste é considerado
positivo. A partir de dados tabelados encontrar o NMP.
Coliformes termorresistentes
o Paralelamente, tomar os tubos positivos no ensaio presuntivo e os tubos negativos
em que houve crescimento após 48 horas, nas 3 diluições (1:1; 1:10 e 1:100);
o Transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de ensaio
contendo o meio EC e tubo de Durham;
o Misturar e deixar todos os tubos em banho de água durante 30 minutos;
o Incubar a 44,5 ± 0,2 ºC durante 24 ± 2 horas;
o Determinar o NMP.
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AULA 11 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS: detecção de E. coli por

cultura em placa e por substrato cromogênico/fluorogênico

A Escherichia coli é uma bactéria do grupo coliforme capaz de fermentar a lactose, com
produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2 ºC em 24 horas. Produz, ainda, indol a partir do
triptofano e apresenta atividade das enzimas β-galactosidase e β-glucoronidase.
Atualmente, é aceita como o indicador de contaminação fecal mais específico.
O meio Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) é um meio seletivo e diferencial que possui
em sua composição os corantes eosina Y e azul-de-metileno, responsáveis por inibir o
crescimento de bactérias gram-positivas e diferenciarem microrganismos em resposta à
fermentação da lactose. Enquanto coliformes produzem colônias pretas-azuladas, as
colônias de Salmonella e Shigella apresentam-se incolores ou âmbar transparente. Já as
colônias de E. coli são facilmente observadas por apresentarem um reflexo verde
metalizado característico, devido à rápida fermentação da lactose.
Para diferenciar coliformes e E. coli rapidamente em uma amostra, diversos kits
comerciais estão disponíveis. Esses kits se baseiam na atividade enzimática de β-
galactosidase (coliformes totais e E. coli) e β-glucoronidase (E. coli específico) que esses
microrganismos possuem. A fonte de carbono dos kits é constituída por substratos
galactosídeos e glucoronídeos que liberam compostos cromogênicos/fluorogênicos ao
serem clivados especificamente por essas enzimas, permitindo a identificação da
presença/ausência desses microrganismos na amostra.
A Portaria de Consolidação Nº 5/2017 não admite a presença E. coli na água para
consumo humano.

MATERIAIS:
o placas de Petri com o meio Agar Eosina Azul de Metileno (EMB);
o flaconete de substrato cromogênico/fluorogênico;
o alça de platina;
o bico de Bunsen;
o álcool 70%;
o estufa bacteriológica.

PROCEDIMENTO:
Cultura em placa EMB
o Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo
para coliformes termotolerantes uma porção de amostra;
o Inocular a placa de Petri contendo o meio EMB por estrias até o esgotamento da
alça de platina.
o Obedecer às condições de assepsia e esterilidade do local de trabalho.
o Identificar os tubos e incubar durante 24 horas a 35 ± 0,5 º C;
o Colônias típicas de E. coli aparecerão escuras com brilho verde-metálico.
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Substrato cromogênico/fluorogênico – Colilert® ou similar

o Coletar a amostra (100mL) em um frasco estéril contendo tiossulfato de sódio a
10% para água tratada;
o No próprio frasco da amostra adicionar o conteúdo de 1 (um) flaconete contendo
o substrato cromogênico/fluorogênico;
o Fechar o frasco e agitar levemente;
o Incubar a 35-37 ºC durante 24 horas.
o Observar se houve mudança de coloração para verde-azulado (coliformes totais).
Examinar se há fluorescência na luz UV - 365 nm (E. coli).
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AULA 12 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS: contagem total de

bactérias heterotróficas

Bactérias heterotróficas são aquelas que não produzem o próprio alimento e, portanto,
dependem de moléculas orgânicas produzidas por outros seres vivos para se
desenvolverem, podendo ser patogênicas ou não. A contagem de bactérias heterotróficas
pode ser realizada pelo método de inoculação em profundidade (Pour Plate), capaz de
produzir colônias compactas e pequenas na subsuperfície de um ágar nutritivo (Ágar
Padrão de Contagem - Plate Count Agar – PCA). O método consiste na adição da amostra
(0,5-2,0 mL) ao fundo de uma placa estéril, seguida da adição do meio fundido.
Movimentos circulares são empregados para garantir a homogeneização da amostra,
favorecendo o crescimento de colônias dispersas. Após solidificação do meio, a placa é
incubada invertida e as colônias contadas após determinado período.
A Portaria de Consolidação Nº 5/2017 estabelece que a contagem de bactérias
heterotróficas deva ser realizada em 20% das amostras mensais de coliformes totais nos
sistemas de distribuição, recomendando que a contagem não deva exceder a 500
UFC/mL. Essa determinação serve como parâmetro para avaliar a integridade do sistema
de distribuição e também da eficiência da desinfecção.

MATERIAIS:
o Placas de Petri esterilizadas
o Tubos de ensaio com o meio Ágar Casoy ou Plate Count Agar fundido
o Pipetas graduadas de 1 mL
o Bico de Bunsen
o Álcool 70%
o Estufa bacteriológica

PROCEDIMENTO:
o Transferir, com uma pipeta estéril, 1 mL da amostra para uma placa de Petri
previamente esterilizada;
o Entreabrir a placa e adicionar o meio de cultura, previamente fundido e
estabilizado em banho-maria a 44-46 ºC, contido no tubo de ensaio;
o Homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares moderados em
forma de (∞), em torno de 10 vezes consecutivas;
o Aguardar o meio de cultura se solidificar e incubar a placa em posição invertida a
35 ± 0,5 ºC durante 4 dias;
o Fazer a contagem das colônias e registrar o resultado como UFC/mL da amostra.
o Valor Máximo Recomendado: 500 UFC/mL (Portaria de Consolidação Nº 5)
o Água purificada: 100 UFC/mL (Farmacopeia Brasileira 5 ed)
o Água ultrapurificada: 1 UFC/mL (Farmacopeia Brasileira 5 ed)
o Realizar o ensaio em duplicata e, em contagens superiores a 300 UFC/mL, fazer
a diluição da amostra.