ferramentas de biologia molecular — jécnicas € enzimas gisele Monteiro de Souza 81 INTRODUCAO Nesse capitulo entenderemos como a descoberta € o.uso de enzimas possibilitou a manipulagao genética de diferentes organismos, possibilitando a producio de proteinas recomnbinantes com as mais -variadas finalida- ties, desde estudos de fungao e estrutura, até a comer Cilizacao de protefnas para alimentos, medicamentos, Cosméticos, entre outros. Uma das mais importantes teenologias adquirida, com os avangos da Biologia Mo- cular, foia produgao de protefnas recombinantes, 2° podem ser definidas como Ur produto géenico isolado € «spresso com ou sem modifieagao, NO mesmo, onganismo éeorigem on em outro. Para definir proteinas de WN" tegen diferente do organismo Hospedeito G45 070" de expressao heterdloga. Asproteinas recombinantes © ‘een uma infinidade de possibilidades ©? Tolencialmente” qualqner bioférmace § ™llzando esas t i : comp ecnologias, Esse pol {Rio complexo é o produto aénica, ou Sel2 5° esto arnuitos éxons e introns, gerando! ‘cdo de ligagses dissulfot0) ou ligagto a cofatores. Essas, @ outras informagdes, quando previamente conhecidas, so necessirias para o sucesso da produgao. 0 exemplo ‘mais clissieo de produgio heteréloga bem-sucedida é 0 da ingulina humana em bactérias £. coli, liberada para ‘comercializagao em 1982. ‘A partir da definigao de protefnas zecombinantes ‘chegamos ao primeiro passo necessario para a manipu> Jago genética de qualquer organismo: eonhecer eisolar gene de interesse Iso implica umarestrigho de genes posstveis para serem utlizados em produgio de enaimas recombinantes. Somente aqueles de sequéncia geromniea ¢oninecid sio passivels de serem isolados e modificado, que enfatizaaimensa importancia dos proetos genoreas sacaracterizagioinilal. ntenderenos essa depen- primeira téonica necessaria para nest dencia exemplificando | ‘isolamento do gene, a PCR. 2, ISOLANDO 0 PRODUTO GENICO - DNA POLIMERASE auto genico & preciso conhecer ‘dé em virvude da necessidade Para isolar um pro cia, Ts80 se ua seaven’| FARMACBUTICA 290 *® BIOTECNOLOG! .g moléculas de DNA eee smos. Bs or dos organi de iniciado de delimit ae detintagh re olieran, a enos reponse PO : ico por meio do processo repleaga0 podemos obte fel por meio do uso reconhecime snto do molde duplicar o material gené! replicagao. Assim, lembremos como se dé do DNA én vivo para compreendermos 0 que na reagio in vitro. acontece As DNAs polimerase mo substrato para a reagao de polimerizagao um mode, iniciadores, deso- xirribonucleotideos (ANTPs, ou seja, dATP, ATTP, dCTP dGTP) e cations civalentes, usualmente magnésio (Co io para que a DNA polimerase 1 do material genético e para fequerem, COM fator). O molde é neces replique uma cépia iden isso precisa de uma sequéncia prévia para “ler”, empareliar 05 AN'IPs e, entao, polimerizar a cadela nascente. Bsse fato remete a uma importante propriedade do processo. de replicagiio de DNA, ser semiconservativa, ou seja, uma. fitanova de DNA ¢ sintetizadaa partir de uma fita pree- xistente e emparelhada com ela. Assim, quando ocorre replicagao, hé necessidade de abrir a dupla hélice de DNA. cromossOmico, formande, assim, a bolha de replicagao & disponibilizando o molde necessario a DNA polimerase. ‘ssa abertura das fitas € catalisada pela enzima DNA helicase e a tens causada por essa abertura € aliviada pela enzima topoisomerase. Assim como na sintese de RNA, a de DNA é direcio- nada no sentido Uma diferenga crucial é quea RNA polimerase 6 capaz de adicionar ribonucleotideos a uma cadeia nascente de RNA a partir do molde, sem a necessidade de um iniciador, 4 as DNAs polimerases necessitam desse iniciador que forneceré a extremidade 8° Ol livre para que ocorra a ligagao fosfodiéster com a. extremidade 5 fosfato do préximo dNTP. Quem sintetiza esses iniciadores in vivo € uma erzima chamada pri- mase, responsével pela produgao de pequenos RNAs de sequéncia aleatéria que servirdo como extremidades 3° Otlivres para as DNA polimetases. No laboratério, com, asequéncia genOmica conhecida, definimos. sequéncia do iniciador, ¢ este ser sintetizado quimicamente por ‘empresas especializadas, Dessa forma, apés ahertura das tas, telhamento dos iniciadores, fornecendo x a 0 substrat DNA polimerase inieiara potimerizagao ates Le Adicionando, assim, 05 ANTPs. Contudo, onita reer dade nao menos importante 6 0 fato de que a. men , Corte Oo empae ‘ue @ DNA pol. iasérie desinas (COMO, Por exemp nas) que recrotam a DNA POlIMeT€Se para sequy cas espectficas chamadas origem deren iaorganismo possul uma origem de replies dpe espeeifica para o7e¢ ecimento de sua DNA lig sndégena, 1350 140 € necessirio Vito i que nyo vento do molde na forma de cromating empacotam pmsuma, a replicagiio de DNA se da por me gan nidos: (1) abertura das fitas molde; seg, nto dos iniciacores;¢ (I ean ie Jo da cadeia de DNA nascente. passos defi > (ID emparelham polimerizag Nas primeiras sinteses de DNA in 2tiro, pesquisaigns mimetizaram a replicacao que ocorre £7 U0 Utliznig iclos de temperatura, ou seje, alta temperatura para ain as fitas, redugdo da temperatura para o emparelt e diminuicao adicional da temperaturapan dos iniciador polimerizagao das fitas nascentes, usando DNA poling de. coli, No entanto, esse método era extremattens: trabalhoso e caro, pois a DNA polimerase utilizadaen termossensfvel ¢ desnaturava a cada ciclo de abertia das fitas de DNA 2.95 °C, tendo de ser adicionadl toi ‘as vezes, manualmente, apés 0 ciclo de emparelhameni dos iniciadores. Isso foi nudado quando, em 1985, K. Mullis colabary- dores desenvolveram a reagao em cadeia da polimerase,qu: Ihe rendeu o prémio Nobel em 1993. Em meados de 1965, Thomas D. Brock descobriu o organismo Thermus aqua cus, capaz de colonizar “Geysers do Yellowstone Natl Park”, de onde foi isolaco, Hssa bacteria termofiliea était desobreviver em ambientes com temperaturas até", consequentemente, suas enzimas sdo termorressie Assim, Mullis e colaboradores criaram a automatiigi da reago de sintese de DNA in vitro com o uso det polimerase e a denominaram PGR. Posteriormente,.com 4 criagdo de termocicladores, essa técnica passoua = uma das mais amplamente utilizadas como ferramestt® biclogia molecular no mundo inteiro (Figura 8.) Além da Tag polimerase e dos termocicladores,0% ferramenta crucial é a sintese quitnica de oligonae™ «eos, Isso permite que ge tenham iniciadores dese specifica capazes de delimitar o gene de interes? Seestabelecer esse limite, teros de conhocer ote! ® termina o gene, Assim, usando os bancos de die Seauéncias produzidas pelos projetos geromis°8r Pesquisas, deserihamos oiniciador direto ustndos la-de intcio da tradugao, ou seja, do ATG Pal os 0 Teverso usando os eddons de verminagio oe ae | STAG ou TGA) para tras, 1 important® “Aue qualquer sequencia depositada no bane?ee PERRAMENTAS RAMENTAS DE BIOLOGIA MoLgouL “AR—TECNICAS E ENZIMAS © 291 CCAAATTTGGCTCATHAS ONAcromarséncs SaTatemTGccotaarrteg, DWAa ser amplicade nek Desnatrgie datas oc SIATGTEATGCCGTAATIEG, 1 CCARATISSCTEATAAS wen STACAGTACGGCRTTAAAGE, Gorrmanceancrs. Seq dos inadoes ersatz anek DretoSATGICATGCCGTAATTCSS GENEK STINEAGCCANATTICCS aaa SATSTEATECCGTAATTIC.. CEAARTTTGGCTGATAS.. SENTIDO DAFOLMERZAGAO — + SENTIOO DAPOLIVERZACKO {FTACAGTACGCATTAAAGC... 1 GSTTIMAACEGACTT. | ae FINCAGTHCECATTRIIE srmocicladores variam as temperaturas 10 do molde, 55 °C, para anelamento jades da polimerase. Os te cadeia por reagao em °c, para desnaturaca ee + ema da nva cade de DNA. Graas s prop javel), © 72 °C. P DNA In vitro revolucionou & Biologia Molecular. de Faura8.1Isolamento de genes Permitindo que a reagéo ocorra em tres siniciadores (essa temperatura é vari “emoestaveis da Taq polimerase. 2 sintes® ——— tSa_ ©. CA 499 ® BIOTECNOLOGIA FARMACEUT ue A se emparelha cc hemos 4 sngao tem urna implicaga0 arelha com C. Essa cor oe »iniciador reverso dev ee Gs assim como 0 iniciador a i De forma geral, os iniciadores sao repre ntados ta fa até ceren de 4 bases, erminando ern © 04 G (et seguir). No entanto, a sequéncia do iniciaclor lementar d extremidade a sequeneia co ido reverso, daf o seu nome iniciador reverse jementar (ver exemplo na Figura 8.1) Mas, por que 0s iniciadores delimitam e isolam © nico” Em virtude da natureza exponencial da produto, feacao de PCR. No primetro ciclo, para cada molécula de Imiente DNA molde apenas duas fitas novas serao pare Jelimitadias pelos iniciadores e sintetizadas, No entanto, essas jd sero em igual ntimero ao DNA molde inicial servirao também como molde no segundo ciclo de POR c dos cielos, o molde original ficaré insig- no pa nificantemente diluiido no meio de tantas e6pias novas, Para termos uma ideia, apés 30 ciclos de PCR, uma nolécula inieial de DNA gendmico molde dara origem 1 aproximadamente 60 copias “grandes”, parcialmente dupla fita, e cerea de 1 bilhio (1.073.741.770) de cépias: da sequéncia-alvo dupla fita delimitada pelos iniciadores,, Um programa be ico de POR, capaz-de funclonar para a maioria de iniciadores (pois cada um, dependendo do tamanho e do contetido de GG, tera uma tempera- tura de anelamento especifica), pote ser descrito da. seguinte ma wira: * Ciclo de desnaturagio inicial do molde ~ nm cielo inicial de 5 minutos a 95 °C, * — Ciclo de polimerizagao exponencial - de 25 a30 ciclos compostos por: ¢ Desnaturagdo das tas molde: 1 minuto.a96 °C, * _Anelamento (Bmparethamento) dosiniciaoress 45 segundos a 55°C, . * Bxterse danova ta (Sequéncia advo): miny va): por Kba 72°C, a * Ciclo de extensto final — um ci imine a lum ciclo de 7 minutos a Ap6s essa reacto padrao poderey Droduto final por meio de eletroforese.en pranto os Acids nuceteos com oinercaante fe, prometo de eticeo (excitado POF 1U2 UV) e am page ile peso molecular conhectdo (Figura 82) ving “hae cargas negativas do DNA (© RNA), conteridas pan srupos fostatos, ele 4 para o Polo ositivo quan saibmetido aun carmpo elétrico. BS8a Migraeto sera vapid quanto menor taranho dA Mola, iy, mais facil atravessar a malha do gel de agaroge, | Figura 8.2 zacao de, Eletroforese em gel de agarose para visa idos nucleicos. Em virtude das cargasnagatist conferidas pelos grupamentos fosfatos (extremidaé® 51) 05 dcidos nucleicos, quando submetidos @ um n> létrico, migram para o polo positive, Essa migracéos# mais répida quanto menor for o tamanho da molécle de agarose 0,8% em tampao TAE 1X (Tris Acido ae EDTA) corado com brometo de etideo. Visualizagio®? Pot exposicéo do gel & luz ultravioleta, PM.=pad™ eso molecular (em pares de bases, bps). Diversos parametros infiuenciam a eet Teagdo de POR, Comecemos'a analisar opr Recessdrio para se executar a clonagem ce Ul efnigao da sequéncia dos iniciadores. De #°™" ®tamanho e composigao da sequencia ose lero temperaturas de anelamento (Ty = met dle metting) variéweis, Para se estabeleeet® ‘nto para iniciadores quanto para DNAS commie ae Serb liga24°C * (ruimero de @ Sma sequéncia) +2 °¢ x anode Ase Tra seein), lio para DNAS 14 ype s empresas que sintetizam os oligoncleotideos nia. gqestabom dispontbilizam programas on-line gratatog garaesas determinagtes.A temperatura de melting ex sa o ponto no qual metad e das moléculas da sequéncia relhada com seu, DNA complementar : ides de POR, ess iemperatura € uilizada durante © ciclo de empane, sameato (anelamento) da reagHo. Se a temperatura usada jurantea fase de anclamento for maior do que aT. dos iniidores, menos da metade deles estaré emparethada como molde durante a fase de extensao da fita de DNA, dininuindo as chances de se amplifcar o gene-slvo, mas aumentando a especificidade. Se a temperatura formenor doquea T,, mais da mtetade estaré emparelhada podendo serarligagies inespectticas (emparelhamento parcial) em cutras regiGes do genoma; lembre-se que seu DNA: moalde éinicialmente imenso e diverso, \dora estaré em in pomalde e meiade nao. Assim, para as rea Isso um dos pardmetros mais relatives e importantes daefiedcia da reagdo de PCR, Quando se tenta o ciclo jaro endo ha amplifieagao do prodiito génico, altera- sea temperatura de anelamento no ciclo. A primeira tentativa ¢ obedecer aT, dos iniciadores, Iembrando que slo dois, um direto e outro reverso. Assim, como malmente se tem’, diferentes para cada inietador, ustse a menor delas. Como a sequéneia dos inictaclores sera determinada por nds que estamos clonando o gene, éque eles sao sintéticos, o ideal quando se “desenha” iniciadores € procurar manter as T,,, do par proximas, Tarlando no maximo 5 °C entre eles. Outro fator crucial para a eficiéncia da react, ainda ‘om relagio aos nictadores, éa eamposigao da extremidade SLembre-se que essa extremidade emparelliada como ole serén substrato paraa DNA polimerase Assit hhicadores devem preferenctalmente terminar emt ou, ‘sso porque as bases desses nucleots : Pormelo de trés ligagoes de h ENZIMAS © 293 Acima disso, teriamos de reduzir ao a temperatura para que oes aumentando a quantidade de ar essa de dielessita Prase molar i ‘Asequlncia do proto génico-alvo, ad clonamos bases na Porgao 5 do iniciador. Assim, se aT, std muito alta, adicionamos Ae T na porcao 5% se aT. éstiver muito baixa, adicionamos Ce Gnessa extremidade, Essa possibilidade ce manipulactio da extremidade 5 € ¢extremament i para fins de clonagem, como aadigao de adaptarlores com sequéneia de reconhecimento de enzimas: erestricdo (eradiante). Outra maneira de manipulara, € aumentar ou reduzir o tamanho do iniciador, Se estiver ‘muito baixa, podemos incluir mais bases da sequéncia-alvo, aumentando a especificidade; se estiver muito alta, podemos reduzirotamanho colocandomenos bases corespondentes A sequéncia-alvo, Um tamanho médio de iniciadores com boas caraterfsticas de amplificagio fica em torno de 18 80 bases, com, entre 52°C a 65°C. Outro pardmetro imporiante para inielarums clonagem 6 conhecera estrutura génica do DNA alvo eesiabelecera Jonte do molde, Isso porque genes ce cucariotos superiores ‘possuei regides intrOnicas (ver Figura 8.8). Assim, s6 ;podemos utilizar como moide o DNA gendmico se este for aadvindo de organisinos com pouco ou nenbum intron, como procariotos oualevedura S. cerevisiae, em que raros genes ‘880 compastos por éxons e introns, Para organismos com adisposigio gendmica composta por ambos os elementos, realizamos outra estratégia de clonagem, usando uma enzimaDNA polimerase especial, a transcriptase reversa, ssa enaima possui todas as caracteristicas de uma DNA ppolimerase convencional, mas tem a capacidade de usar RNA como molde para sintese de uma ita complementar ‘de DNA, que dessa forma, denominada cDNA. ‘Na Figura 8 vemos queo mRNA sofre processamento, ‘de forma a retirar as regides dos introns e rearranjar os ‘éxons, adicionar cap na extremidade 5° cauda poli-A na extremidade 8 Esse processo € tio rapido que, se MRNA total de uma célula em qualquer fase ente todas as moléculas esta-294 * BIOTECNOLOGIA FARMAGEUTICA sequéneias ie varias desoxitimidinas que se empare! ne 4 coma cauda poli-A, servindo de iniciador para todos . mostra molde, todos os mRNAs presentes naa ‘ gerando hfbridos mRNA-cDNA. Essa amostra é, entao, featada com uma ribonuclease, a RNAse H, capa de re .shbridos RNA-DNA, degradando apenas ‘A fita simples. Esse DNA fita cDNAs de conhecer RNA e deixando 0 cDN simples pode ser usado como molde para DNA polime- rase, que se utilizara dos pequenos fragmentos de RNA deixados pela RNAse H, como iniciadares para a sintese de cDNA dupla fita, Agora temos uma biblioteca de cDNA pla fita, compativel para ser usado na reagiio de PCR ‘como molde para isolar o gene-alvo pelos iniciadores sintéticos espectficos para ele (Figura 8.8). ohare Sneaks > Snel ’ BRAN _ nanan preetaS W cea evermentee DMN e Seana ae in a 4 mise mote NOK imme Aansananaans ianeees undies ¥ — Maidepan SP OCOSOICOS fue! congen ones Figura 8.3 Estratégia de obtencio de molde para i Para iso- lamento de genes de estrutura génica, complexa. Quand um produto génico desejado advém de organismos com om o gene-alvoisolado © em quantidade gia mos iniciar as proximas etapas da clonager, gy 1 insorgo do gene ert vetores de clonagem e gypyt8 ;, porém, vamos corihecer algumas téenjay = Ant w cag obtengio de sequéncias do DNA, usadas nos py Bo genomas ©e7 varias OUtTAS aPiC¥EDeS, como egy bs ‘a0 longo do capitulo. 8.2.1 Sequenciamento Inicialmente, os pesauisadores comegaram acum, conhecimentos @ respeito da sequéncia exata dos Tide. tideos cle uma regiao génica, Isso foi expandid pay genes intelros, depois cromossomos e,finalmente, paras genoma completo, 0 primeiro genoma a ser decifais 5; oda hactéria Haemophilus tnflaenca em 1985, Noany seguinte, foi publicado o primeiro genoma completa den eucarioto, o da levecura Saccharomyces cerevisiae ce 14.de abril de 2008 foi anunciado o término do sequenci. ‘mento do genoma humano com uma cobertira de 93994, ‘No Brasil, o primeiro organismo a ter seu genomacam. pletamente sequenciado foi a bactéria Xylella fastidias, ‘agente causador da clorose variegada dos citrus, Bsseprie {oj realizado por meio de urn consGreio de 84 laboratfis de Biologia Molecular e por se tratar do genoma dopprimein fitopatégeno a ser sequenciado no mundo, o manuserito Tesultante foi capa da revista Natzre, em julho de 200). Na década de 1970, 0 pesquisador Frederick Sang propés 6 método de sequenciamento que é usado (com modificagdes) até os dias atuais. Hssa técnica se utili de uma das propriedades mais importantes das DNA polimerases, o fato de essas enzimas reconhecerem cat substrato apenas uma extremidade 80H livre empit Thada'no molde de DNA. A partir dessa premissa, Sng desenvolveu o método de sequenciamento baseadon0 ls! ‘de didesoxirribonucleotidieos ou dideoxirribomucleoti® | (GQNTPs) (Figura 8.48). Sema extremidade 3OHLiTem Tealizar a ligagao fosfodiéster com o préximo nucedti® Imifosfatado na posicao 5%, a polimerizagao da cadela™ Cente € interrompida sempre na posigao em que od fiineorporado,Pe qn tubos distintos cada. um com um day jaaT? ou dd0'Tp ou €dOTP on aagny sporar esses fragmentos gerados pela TP diferente P), € possive) si ee Teaco em um, slaepolicrilamitla.com resoleao eapas, de distinguir cis comabenas ua base de diferenga de tamanhs svsalzagao pode ser feta com initadores mareadoe vndicativamente (Figura 8.41) Atvalmente, aida usamos 0 sequenciamento de San. aeumas com algumas modificagdes, A mais importante sess € flo de podermos realizar apenas uma reagan iesequenciamento, por meio da mareaciio dos daNTPs om fuor6foros diferentes, sendo assim denominada de 2 lorminator sequencing, Com isso,no mesmo tbo colacamos 08 quatro dNTPs e os quatro ddNTPs mar cats, de forma que, quando na reagao for inesrporado unddATP, 0 leitor éptico identificaré nesse fragmento uma luorescéneia azul, quando ineorporar um ddTTP «fragmento apresentard uma fluorescéneia vermelha, undo incorporar um ddGTP uma fluorescéncia verde ese incorporar um ddCTP uma fluorescéncia amarela & SOSH oH, -OV 8s SOHoer, K A A y [eal [oa % erorritonuceotides ais bonucleotideo NTPs @ FositoN= AC GOUT RRAMENTAS Dy BIOLOGIA See OLECULAR-THCNICAS B ENZIMAS © 295 {exemplo apenas itustrative), © método de separagao jutitua sendo eletroforético por tamanho com reso. lugao de uma base de diferenga, mas néio mais em géis de poliacrilamida e sim por capilares contendo resinas (Bor exemplo, agarose). Nao ha mais necessidade de usar iniciadores marcados radicativamente, pois os leitores detectam os fluorétoros e, portanto, dispensam essa mareacao, Umu observacdo importante, nesse momento é que © sequenciamento se da por polimerizacao e leitura de simples fitas (apesar de o molde ser dupla fita, ele é desnaturado nareacao de sequenciamento) ¢, portanto, Apenas umn iniciador é colocado na reacao. Normalmente, Parase confirmar e ter uma duplicata da reacao, fazemos Sequenciamento da fitadireta, usando assim iniciador Teverso e em outro tubo fazemos 0 sequenciamento da fita reversa, usando o iniciador direto, Os tampoes de amostra para sequenciamento usar agentes desnatu- antes, de forma que nos capilares apenas fitas simples de DNA sao separadas por tamanho. aoe 0, at em iets ‘as_“"~—r—_—sS<——sh 296 * IOTECNOLOGIA FARMACEUTICA promete, pelomenas, competi > 60 pirosequenciamento. com o metodo di lor 0 pirosea! ‘paseado emdetectar a atividade da DNA ao do nucleotideo na do Umma téenica recente que minal Bese método ¢ poliimerase durante a incorporag cadeia nascente, liberando PP,. Esse PP, é detect ‘a encima ATP sulfurilase que converte PP, em ATP; pe se que converte usadlo pela lucifera por sua vez iuciforina em oxiluciferina emitindo luz. Em seguica, tama quarta enzima, a apirase, degrada os dNTPs que no foram incorporados e um novo ciclo pode ser iniciado ‘Sio encontradas vars diferengas dessa téeniea para 0 nto por terminaglo da reagao, Uma delas é que dom una matri2, quent oDNAaser sequenciado esti imobi incorporada em uma placa. O iniclador € um adaptador co- mum inserido nas diferentes sequéncias. serem decifradas de forma a permit 0 inicio da sintese conforme a aligao dos nucleotideos, Cada ciclo corresponde aincubagio com somente um nucleotideo de cada vez; assim, apenas quando aquela sequéncia possuir 0 nucleotideo cornplementar a0 que foiadicionado naquele cielo ha ineorporacao pela DNA polimerase, iberagio de PP, ereagdes subsequentes, emi- tind luz. No pr6ximo ciclo outro nucleoticleo ¢ adicionado assim, sucessivamente (Figura 8.5), Em virtude de todas essas caracterfsticas o pirosequerciamento é chamado *sequenciamento por sintese”. 8.2.2 Clonagem de produtos amplificados por PCR Quando isolamos um gene ou um produto génico (mRNA — eDNA) corremos 0 riseo de que sejam in- seridos erros pela Taq polimerase durante a sintese. A taxa de erro dessa enzima, podendo gerar uma mutagio no produto de PCR, é de 1 erroa cada 9 mil nucleotideos: incorporados. A enzima Taq polimerase nao possui « atividade revisora exonucledsica 3° —+ 5, portanto, nao corrige erros incorporados, apés certa distancia enzima tem menor processividade, levando de typ werizar 1,000 pares de bases, 4 dots mimutos para poli priedade da enzima Taq potimerase, ¢ a capacidade de adicionar o nucleot{deo desoxiade nosina na extremidade 3” da fila recém-sintetizada de idependente, por meio de uma atividade terminal transferase. Dessa forma, todos os Produtos de POR obtidos por melo de reacao com a Taq polimerase fa extremidade 3° uma desoxiadenosing Uma prot forma molde int possuem em su a mais, nao emparelhada. Dessa caracteristica surgin uma gerago de vetoresde clonagem de produtos de PGR, semanecessidade de usar cerimas de restri¢ao (ver adiante). Esse tipo de clonagem, é chamada TA, em virtude do emparelhamento entre A da extremidade 3’ do produto de PCR e T da extremid de 5’ incorporada nos vetores, normalmente plasmideos (DNAs circulares extra cromossomais, comuns em micro- -organismos) (Figura 8.6). ‘Apéso emparelhamento das extremidades TA do vetor edo produto de PCR, a ligaca fosfodiéster tem de ser realizada para selar esses pedagos de DNA tornando-os um s6. Para isso, duas enzimas podem ser utilizadas atualmente: a DNA ligase € a topoisomerase. ADNA ligase comumente usada em Biologia Molecular 6a 74 DNA ligase isolada do bacteriéfago T4. As DNA ligases catalisam a reagao de ligacdo entre duas fitas de DNA por meio da formagdio da ligagao fosfodiéster. Para isso é necessfrio que os dois pedacos de DNA dupla ita se encontrem € que as regibes complementares entre duas fitas, por exemplo, uma do produto de POR e outta ovetorde clonagem se emparelhe por ligagdes de hidro- genio, gerando assim 0 substrato para a enzima realizata gacio, Existem reagdes de ligacao que independem do emparelhamento de sequéncias cormplementares (extze- ‘Midades cegas ou abruptas) e essas sao menos eficientes. Dest Bours) No exemplo da Figura 8.6, quatro l-OO PERRAMEN AMENTAS: AS DE BIOLOGIA MoLECUL AR ~ Tit UECULAR—THCNIGAS E 9 BE ° 297 er sure 89 tea Ss sem —— ap — y Va ontucsina cena 5 eee nw Sota: x | toi CO ecereranars MNP + ORM +fsoro ' Fim do pret cclo sesh Segundo cle seaode eT? STECTGAGGEG. 5 Siccacencs’ ok Tempe Dobro dines do peodsiue {Quatro enzimas so necessatias para esse a eae socxccces’ :, * = | sali 4 pane tea fgua8'S qérodo de sequenciamento por siies pirosequenciamento Juciferase e apirase. ‘bode saquenciamento: DNA polimerase, APE SuMuTI=S "Tatrizincorporada em uma placa (um chip”). Um oligonue shears ‘sergio de um adaptador a sequencias-alves: Apen@#s nul \TP ser incorporado nas! ‘ : rcnhecdo pela ar suifurlase que oalse 2 Te a em oxiucitering = ela luciferase que converte luciferin & a serd posteriormente interpretade = 'ado no inicio da reagao, @ mesmo é * "icone pela DNA polimerase e degt™ i leos nao incorporados. Assim: tt preporconal a quantdade Lg 2 sequenciane molde possd como prese! mud por aarPos cue nga de dTTP no motdle- io 6 substrato dessa et ‘5 término do primelro ciclo, ie outro dNTP, no caso do exemplo dCTP. O polimerase, produzindo um ‘Omolde simples fita € imobilizado em uma Jeotideo iniciador cor leotideo é adicionado em intese pela DNA peli tre adenosina 5'tosfosul emitindo luz. Essa luz 6 2 mum é utilizado para toda a placa por meio cada ciclo, no exemplo o dATP. jimerase, produzindo PP, © pirofosfato Ifato (APS) e PP, gerando ATP. 0 ATP é jptada pelo detector, gerando um para que a luciferase nao reconheca o dATP ,, mas é reconhecido a apirase degradaré os pico 2X mais998 © BIOTECNOLOGIA FARMAGBUTICA ae eee Late ou Topoisomerase Figura 8.6 Clonagem TA. A Taq polimerase possui ativi- dade adenosina transferase que adiciona esse nucleotideo as extremidades 3° nos produtos de DNA resultantes da sintese catalisada por essa enzima (produtos de PCR), Dessa caracteristica, foram desenvolvidos vetores de clonagem que possuem em sua extremidade 5’ um nucleotideo timidina ‘no emparelhado. Assim, ao adicionarmos o produto de PCR a esses vetores haverd o emparelhamento TA, que pode ser selado pela adicéo de DNA ligase ou topoisomerase. Com isso, para se ter uma reacao de ligacdo deve ha- ver um balango entre a temperatura 6tima de atividade da ligase a T,, das fitas complementares. Isso pode ser melhorado por una temperatura intermediéria, por volta de 16 °C, e por um tempo longo de incubagio, ao redor de 16 horas (também denominado nos laboratérios como overnight). Tempos muito longos de reagao de ligacao favorecem a concatenacao de plasmideos, em contrapar- tida aos tempos curtos que reduzem a possibilidade de encontro emparelhamento estavel das fitas. Outra caracteristica importante para a reagio de ligacdo é a depencléncia da enzima DNA ligase de Mg’? e ATP. As DNA ligases posstiem como sitio ativo a cadeia lateral de um residuo de lisina. O grupamento amina dessa cadeia lateral hidrolisa 0 ATP e fica ligada ao AMP ¢ s6 assim, a enzima consegue se ligar a extremidade 5PO,, transferindo 0 AMP para essa extremidade do DNA. Dessa forma, a hidroxila da extremidade 3° € capaz de atacar :PO,-AMP, liberando AMP e formando a ligagao fosfodiéster (Figura 87), ‘Um mecanismo de ligagao de DNA independente de ATP pode ser obtido com o uso das topoisomerases, Essas enzitnas in. vivo, como citado anteriormente, sao esponsdvels por aliviara tensio nas fitas de DNA, causada Pelaabertura das héices durantea formaglo da bolha de covalente cor o DNA por uma ligacao fosfotirosina, 4 do DNA clivado possui uma hidroxitg mantida dentro da estrutura enzimg outra extremidad livre e ¢ fortement tica, O relaxamento € feito torcendo uma das ftas pela sitio de chivagem ea hidroxila, da outra extremidade, ina, liberando a enzima igagio fosfotir agora ataca 2 : bra da ligagao fosfodiéster liberady A energia da quel durante a clivagem € mantida pela ligaga e liberada durante o ataque da hidroxila a essa ligarag fitas de DNA. Assim, as topoisomerases realizar ligagies fosfodiésteres sem a 0 fosfotirosina para religar as sao capazes de necessidade de ATP. Usando as propriedades das enzimas topoisomerases, foram desenvolvidos os vetores de clonagem TOPO-TA, Esses vetores possuem extremidades 57 com uma de- soxitimidina desemparelhada (para emparelhar com 0 A deixado na extremidade 3’ dos produtos de PCR da Tag) ligada covalentemente com a topoisomerase Ido virus Vaccinia, por meio da ligacao fosfotirosina, Assira, quando adicionamos 0 produto de PCR ea desoxiadenosina emparelha com a desoxitimidina do vetor, ha a aproximagao de um grupamento hidroxila que 6 capaz de atacar a ligacao fosfotirosina, liberando energia para que a enzima topoisomerase catalise a ligagdo fosfodiéster. A transformagao de baetésrias pode ser feita por algi- mas técnicas, entre elas a eletroporagao ou o choque térmico usam o mesmo principio: gerar poros na parede membrana plasmatica bacteriana, permitindo a passa- gem do DNA exégeno. O proceso ¢ ineficiente, contudo, conseguimos obter com facilidade milhdes de células para a transformagdo, aumentando a probabilidade de esse evento raro ocorrer. Assim, quando obtemos ura coldnia na placa com meio seletivo, ela representa uma célula bacteriana que recebeu um plasmideo ¢ fol Capaz de sebreviver a todo o processo, Essa célula se proliferou e deu origem a varios clones que replicaram © mantiveram o plasm{deo, consequentemente, 0 DNA de interesse, Essas bactérias podem ser estocadas &™ Ieezer -80 °C com crio protetor (por exemplo, 8% a2 Slicerol) por cerea de 20 anos, Em virtude do fato de o proceso de isolar 0 gen © manté-lo sem mutagdes ser dispendioso e pouco ciente, se esse Processo for realizado apenas én vit?™ * estratégia do uso de vetores de clonagem seranecessiti- {sso porque os vetores sto plasmideos que podem se Inseridos por transformagao em bactérias, que, et Teplicartio o DNA de interesse sem modificé-lo, poise” das céhulas as DNA polimerases sao altamente especansmos de reparo de DNA, Pata iggp eteralgumas caracteristicas que veremog mais importante 6 ter uma origem de ny © Yetor tem Adiante, mas epic otra. BEMAS COM 58 Sequercia a DNA p ee 3 e wcteriana ser eebaz de reconhecer 6 plasmiden eon yn DNA “seu” e, assim, replicé.to, B Para recuperar o DNA de interesse da bactéia sam. a diversas técnicas de preparagao plasmid, a male anbecida 6a lise alcalina, Nesse process as eulas a Jsadas em tampfo com detergente e hidréxido de S6dio; enseguida uma solugdo concentrada de acetato deamdniy p40 €adicionada, voltando rapidamente o pH para ‘70 Isofazcom que os écidos mucleicos de grande viscosidade (¢tamanho) arrastem outras biomolécutas de alto peso noecular para um precipitado que pode ser sepatado por centrifugacao. Como o DNA plasmidial é pequeno, ele fica temsolugao e pode ser precipitado com a adigéo de etanol Aptsa secagem do etanol, 0 plasmideo pode ser ressuspenso «enégua ou tampdo e ser usado para qualquer manipulacao. Hévdrios kits comerciais de extragdo plasmidial, todas em sa essincia baseados nesses principios, 299 oe petits 0 bacteriana ¢ obrigatoria deremenne a aaeimentos de cloagen, indepen- lestino do plasmideo. Por exemplo, um Plasmideo de expressaa em leveduras, deve ter duas origens de Teplicagdo: uma de levedura, mas também. Zina em bacteria, Isso porque o processo de ligagio no € 100% eficiente, ‘Nem todos 0s plasmideos receberao © anserto (produto de POR ou de restrigdo/digestao), alguns ligarao as Proprias extremidades ¢ voltarao a ser cireular, sem incorporar 0 gene-alvo, Além disso, nao haveria como SeParar os vetores fechados sem Inserto dos que possuem inserto, jd que a quantidade é muito baixa, Dessa forma, apds toda reagao de ligagao ‘Ad necessidade de clonagem em bactéria para se obter Quantidades suficientes de plasmfdco isolado para uso Posterior. Outro procedimento importante a ser reali- zado apds obter o plasmideo (¢, consequentemente, 0 Produto génico-alvo) é sequeneiar o inserto para ter certeza de que nao houve erros incorporados durante © procedimento de clonagem, mesmo usando enzimas DNA polimerases de alta fidelidace. ae! so éne- NEAL eee & as — pets | ae es , i et are lisina dessa enzima reage com pode ser atacado pela hidroxila900. © RROTRONOLOGIA FARMACRUTICA $3. ENZIMAS DE RESTRICAO E VETORES © ano 1970 é um dos marcos dos trabalhos com a wo da des tecnologia do DNA recombinante, pois fol 0 a caberta de uma classe de endonucleases (enzimas que proenovem cortes no DNA), sitio espectticas, denominadas cenzimas de restrigio. Hamilton Smith e Daniel Nathans e ganharam o prémio foram os autores dessa descobert Nobel de Medicina em 1986. As enzimas de restrigao 880 ‘endonucleases que reconhecem sequéncias muito espe- cificas de DNA, normalmente de seis pares de bases © palindrémicas, ou seja, a leitura do sitio de reconhecimento {eita no sentido 5' —+ 3 das duas fitas ¢ idéntica. Essas sequéncias sto alvos da forma dimérica das enzimas de restrigdo, tornando 0 reconhecimento mais especitico e /permitindo 0 corte das duas fitas de DNA ao mesmo tempo, As enzimas de restrigho estao presentes em diferentes especies ¢ linhagens de bactérias, Sua fungi bioldgica std relacionada & defesa das bactérias contra infecgbes virais. O DNA viral, ao entrar em uma bactéria pode ser reconhecido por uma enzima de restrigto que 0 corta- ra, impedindo que o virus se multiplique e acabe por ‘matar a céhila bacteriana, O DNA bacteriano esti livre da aco das enzimas de restrigio por diversos tipos de mecanismos, seja por meio da protegdo por proteinas ‘estabilizadoras que enwvolvem o cromossomo bacteriano, ‘seja pela metilacdo de bases nitrogenadas da sequéncia ‘de DNA nos sitios de reconhecimento, Em laboratério,essas enzimas podem peoduzir diferentes pte cas oes Os Ya es Se DNA em locais muito especificos do vetor, por exer, ijacente ¢ jusante a uma regio promotora neceasérig : > produto génico inserido. para a expresso nplo uso da clonagem por PCR, 08 genes Antes d ‘eramisoladas do ge cenzimas de restrigg srtavamn o DNA de forma a delimitar mais ou mens produto génico de interesse, que essas sequéncias ext distribuidas de forma aleatéria nos genomas. Atualmenge ‘coma facilidade na obtengo de oligarucleotidleos inicladores sintéticos, esses sitios especificos sho adicionados na pore 5° do iniciador, sem alterar em nada o quadro de leitura do produto génico amplificado ¢ clonado, Dessa forma, a9 desenhar os iniciadores podemos escolher as enzimas de restrigdo que serao posteriormente utilizadas para cortar ‘as pontas do produto de PCR e produzir extremidades, ‘coesivas com o vetor de interesse (Figura 89). Usando essa estratégia, podemos optar por dois tipos de clonagem: a direcional e a niio direcional. Na clonagem ndo direcional usamos uma tnica enzima para cortaro vetor e as extremidades do inserto. Isso pode ser feito também por meio do uso de enzimas diferentes que produzem extremidades coesivas compativeis, como a Sall e a Xhol, por exemplo (Figura 8.8). 0 problema desse tipo de clonagem em vetores de expressio € que ‘© inserto pode entrar na posigao correta, com 0 quadro de leitura disposto no mesmo sentido do sitio de inicio da transcrigo, ou, a0 contrario, levando a:nio expressiodo produto génico (Figura 8.10). 0 mesmo problema acontece ‘em clonagens do tipo TA. Além disso, a clonagem nao direcional gera muitos falsos positivos, ou sea, vetores Que apenas uniram suas pontas coesivas, ficando circu ares e sem inserto, Pode-se determinar se a sequéncia 7 _detaterease fo introduzida e no sentido correo pormeeFERRAMBN: 1 dereconhecimento da mesma, também jpinielador (@58iM Como na Figura g 9). TAS DE BIOL na pore 5. apés © POR, essa sequencia Ginserto) pode gor inse- transformados DNA bor minipreparagig Cortar 6 vetor de clonagem gee X com as enzimas de restrigts. Para se oberg inerto cortado Puro, separa-se © mesmo do vetor de donagem apés a digestio, por eletroforese em gel deagarose. Por melo do corante brometo de et ideo visua- Jiamosas bandas no gel e, usando um mateador de massa ida em velores de clonagem tipo ‘TA @ i mbactéria, Recupera-se o @ gasmidial e, ent, pode-se Hal 0G ICNICAS B py . eee eleréneia, corta-se a banda do gel que Correspondente ao gene_X e purifica-se 0 DNA da agarose. O mesmo procedimeno 6 realizado com Fen exDresaH0, Depois da restrigao e ovelore do insert digerts, faze areaca & Rovamente, transformamos bactérias pa Plasinideos e, apés, selecionaros que possuem oinsorto igura 8.11), Contudo, eomo Nadel e Bart produzem exttemilades coesivas diferentes e incompativess, a taxa Ae religncao do vetor sent minima, produzida em razo ‘unicamente das falas de corte de uma das enzimas de estriedo em algunas moléculas do veter. urificagao io de ligacao ra clonar os eri sal : set Baremidaes cogs semis cosas ‘tenis cota cong me Late rece clress en cme occrte cert obs ocoe at ott sat : et temidads cogs itemidades oshas Eerie coatar comps 6, team cj THe Bee, cm #6 awa eae te cma cn toe * luzidas. Figura8.8 Enzimas de restricao, tipos de corte ¢ extremidades prod Stones cars oe dea Sar ‘Sequencia dos inicodoresa se sitetizds: ‘oni ee rests dees Stioonis cusarce adapts para Bore st302 * BIOTECNOLOGIA PARMACRUTICA coarce arto Gonrce cera Serna eoreonado comune Srseramaaanst Seng © %, ~ sia ineagae ‘dense sate + af care eae ie om cons # vetor Fesga do predito ‘Senseo Sar ee a Figura 8.10 Clonagem nao .cional em vetores. Caso o vetor seja destinado nao apenas a manutengao do gene isola- do, mas também a expressdo do produto génico, o inserto tera de estar posicionado corretamente, com seu quadro de leitura aberto no mesmo sentido da transcricSo, ou seja, adjacente e a jusante ao promotor contido no vetor. Como as extremidades coesivas so compativels entre sino vetor (pelo uso de uma unica enzima de restricéo) a possibilidade de recircular 0 vetor vazio 6 alta. Para confirmar a presenga do inserto no vetor, apés ‘a ligago e clonagem (direcional ou nao), extraimos a construgao vetor + gene_X da bactéria (por minipre- paragdo plasmidial) e, usando iniciadores comerciais que emparetham em sequéncias adjacentes ao sitio de insergio do produto génico no vetor, fazemos uma reagho de POR usando diferentes clones plasmidiais como molde da reagao (Figura 8.12). Esses iniciadores, indicados na Figura 8.12 como T7 promoter primor (assim deneminado por estar localizado na regisio do Promotor T7) e 27 terminator primer (assim deno- _Caracteristicas importantes sfio mantidas entre eles * iniciadores comerciais, ou seja, entre 100 ¢ 200 pares de bases, Bsses iniciadores também siio usados part sequenciar @ construgao antes de inseri-la no hospe- deiro de expressao. Como vimos até agora, todos os procedimentos adotads dependem da sequéncia e do tipo de vetor que se desea inserir o gene, Como nosso exemplo é a produgao de pro- teina recombinante, considerarernos que 0 plasmideo um" ‘Vetor de expressao em bactérias. Assim, vamos coniece ositio de clonagem de um vetor de expressao coin suas prineipais caracteristicas (Figura 8.12). Aprimeira delas ¢ a regio promotora que controlaré ‘uando € quanto a protefna de interesse serd express elo organismo hospedeiro, no caso uma bactéria. Ess regidio pode variar de vetor para vetor, mas algurm’s “optomotor deve ser "forte", oust de forma eficiente a transers®™ itidades de mRNA e, conseauel™ “A segunda, enaomen’® de forma. astFBI em condigde jenas em condig: dey enga de um indutor. Iss ‘erminadas, por exerpio, © Pogue aalta map aproteind, QUE Ma maior parte dos: eid (producao heterdloga, como insulina humana OF pactéria), pode levar a um desbalango enersétieo soreerutar grande parte da maquinaria Celular para a mroaugao de uit tinieo produto, que Nem 6 itil parag feetéla(PelO MENOS NAO em to grange uantidade) (pile acerconsidermcban, Producto heterdtoga ee oproduto, no caso a.proteina, nao pertencendo Producaio ‘A808 nfo DA mokie SitioNde Cavan Gratsxc Sitio @ami eicatee ccacig Verorde exoreseto crt ‘om Neale oar O68 . Oe RRAMENTAS Dp. BIOLOGIA MOLECULAR TBONICAS EENZIMAS * 303

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