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A TECNOLOGIA DO DNA EXTRAO DO DNA A extrao de DNA de clulas eucariontes consta fundamentalmente de trs etapas: a) ruptura das clulas

para liberao dos ncleos; b) desmembramento dos cromossomos em seus componentes bsicos, DNA e protenas; c) separao do DNA dos demais componentes celulares AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO As enzimas de restrio so endonucleases que clivam o DNA em regies especficas. Existem 3 tipos de enzimas de restrio: Tipo I = corta o DNA aleatoriamente a 1000 pb do stio de especificidade; Tipo II = cortam no stio de especificidade ou perto dele; Tipo III = cortam a 24 26 pb 3 do stio de especificidade. As enzimas tipo II so as mais usadas em engenharia gentica pelo fato de que seu padro de clivagem previsvel e controlado. Elas geralmente cortam regies especficas dentro de tetra, penta ou hexanucleotdios que tem um duplo eixo de simetria rotacional. Tais seqncias so denominadas de palndromos

A ELETROFORESE DO DNA A electroforese em gel de agarose permite estimar a concentrao de uma soluo contendo fragmentos de cidos nuclicos mas, sobretudo, permite separar e purificar estes fragmentos. As amostras so aplicadas no gel e separadas sob aco de um campo elctrico, sendo que os fragmentos de menor massa molecular migram mais rapidamente que os fragmentos de maior massa molecular. Aps a migrao ou corrida, os fragmentos so visualizados por colorao com brometo de etdio, agente intercalante que fluoresce aps excitao com luz ultravioleta (UV). O limite de deteco de cerca de 10 ng/banda de cido nuclico. A distncia de migrao dos fragmentos analisados inversamente proporcional ao log10 de seu tamanho. Com auxlio de marcadores de massa molecular conhecidos, possvel determinar o tamanho de um fragmento. A migrao dos fragmentos de cidos nuclicos em um gel de agarose funo de seu tamanho, da concentrao do gel e da voltagem aplicada. Nas condies de corrida utilizadas, os cidos nuclicos so carregados negativamente, migrando do plo negativo para o positivo. HIBRIDIZAO E SONDAS GNICAS A hibridao de cidos nuclicos, permite o reconhecimento entre seqncias complementares de DNA ou RNA. Assim, um determinado fragmento de DNA pode ser localizado em uma mistura heterogenia, desde que se disponha de uma seqncia complementar ao fragmento. Essa seqncia complementar chamada de sonda e consiste em seqncia de nucleotdeos de DNA ou de RNA que forma clonadas ou sintetizadas in vitro, utilizando-se nucleotdeos marcados com istopos radioativos. Quando o DNA submetido a temperaturas de 90 a 100C, os dois filamentos de polinucleotdeos desnaturam, ou seja, eles se separam. Se esses filamentos desnaturados so incubados em condies apropriadas de temperatura (em torno de 65C), eles renaturam, ou seja, as bases complementares paream, formando-se novamente o duplo filamento. Dessa maneira, formam-se hbridos, entre seqncias complementares de cidos nuclicos. Se a sonda radioativa estiver presente no meio de incubao, ocorrer o pareamento entre a sonda e o fragmento complementar a ela. Esses hbridos podem ser formados entre dois filamentos de DNA, dois filamentos de RNA ou um filamento de DNA com um de RNA A TCNICA DE SOUTHERN E NORTHERN Para detectar quais das muitas molculas de DNA ou RNA em um gel de agarose se hibridizam a uma sonda em particular , so feitas transferncias de Southern (para DNA) ou Northern (para RNA). As molculas de cido nuclico so separadas por eletroforese em gel de agarose e estas transferidas para uma membrana de nilon ou nitrocelulose. Isto geralmente feito por ao capilar, mais pode ser obtido por eletrotransferncia, transferncia a vcuo ou centrifugao. Na transferncia de Southern, antes de ser feita a transferncia, o DNA geralmente desnaturado com lcali, de modo que unifilamentar e esta pronto para hibridizao, Para o RNA, isso no necessrio e iria hidrolisar as molculas. Uma vez feita a transferncia, os procedimentos de Southern e Northern so idnticos. As transferncias Northern do informaes sobre o tamanho do mRNA e quaisquer precursores, e podem ser teis para determinar se um clone de cDNA usado como sonda tem tamanho total ou se ele de uma famlia de transcritos correlatos. As transferncias

Southern de fragmento de DNA genmico clonado pode ser sondadas com molculas de cDNA para encontrar quais partes do clone genmico correspondem ao fragmento de cDNA. Se a transferncia de Southern contem fragmentos de DNA genmico de todo o genoma, a sonda dara informaes sobre o tamanho do fragmento onde est o gene no genoma, e quantas cpias de gene esto presentes no genoma. O FINGERPRINT Se as transferncias de Southern do DNA genmico digerido por enzimas de restrio de membros de uma famlia so hibridizados com uma sonda que detecta um destes tipos de repetio, cada amostra apresentar um conjunto de bandas de tamanhos variados. Algumas destas bandas so comuns s da me, e algumas s do pai, e o padro de bandas ser diferente de uma pessoa no aparentada. Os padres diferentes de indivduos em cada um destes tipos simples de repetio significa que, usando um pequeno numero de sondas, a possibilidade de dois indivduos terem o mesmo padro torna-se extremamente pequena. Esta a tcnica de fingerprinting de DNA, que usada na cincias forense para eliminar o inocente e condenar os criminosos. Tambm aplicada para testes de maternidade e paternidade em humanos. Tambm pode ser usada para mostrar heredograma em animais cruzados comercialmente, e para descobrir hbitos reprodutivos em animais selvagens. O Fingerprint pode ser feito com pequenas amostras de DNA tais como mancha de sangue ou folculo de cabelo em uma cena de crime. A SNTESE DE DNA SNTESE DE OLIGONUCLEOTDEOS A sntese de oligonucleotideos tanto de DNA e RNA so feitos por equipamentos automatizados. Os oligonucleotdeos so sintetizados utilizando-se um sintetizador de DNA, que basicamente um sistema computadorizado de liberao de reagentes. A sntese de DNA um processo cclico que rene uma cadeia de nucleotdeos da extremidade 3' para 5'. A primeira base acoplada em um suporte slido e monmeros de nucleotdeos so adicionados um a um, atravs de um ciclo de 4 reaes qumicas. A sntese de oligonucleotideos e oligopeptideos tornou-se uma tarefa laboratorial altamente simplificada. O DNA pode ser sintetizado sob a forma de fita simples, tanto de pequeno tamanho, quanto de tamanho maior. Usando as fitas de pequeno tamanho pode introduzir-se mutaes em genes. As fitas de DNA de grande tamanho (200pb) usam-se tanto como sondas, como para construir genes sintticos (primers) que tm a enorme vantagem de possuir stios de clivagem para as endonucleases de restrio, que no se encontram nos genes naturais, o que torna a manipulao daqueles muito mais facilitada. SINTESE DE cDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde mRNA. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de mRNA isolada da clula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias que no codificam para protenas. A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdeos importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subsequente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente. A REAO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) uma tcnica capaz de obter grandes quantidades de fragmentos individuais de DNA in vitro, isso possvel graas a utilizao da DNA-polimerase que so extradas da bactrias Thermus aquaticus, que vive em fontes de gua quentes, e, por isso, foi denomidada Taq-polimerase. Essas enzimas so utilizadas para adicionar ao desoxirribonucleotdeos a um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige a sntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde o primer se ligar. A PCR pode ser dividida em trs etapas fundamentais. (1) A mistura da amostra de DNA + Taq-polimerase + primers + os quatros nucleotdeos que compem a molcula de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP) submetida a uma temperatura de 92-94C, para que ocorra a separao dos dois filamentos de DNA. (2) Abaixamento da temperatura para que o primers se liguem s extremidades 3 de cada filamento de DNA, que tm as seqncias de nucleotdeos complementares. A Taq-polimerase vai adicionando nucleotdeos s extremidades 3 dos primers, copiando os filamentos de DNA e formando filamentos complementares a cada um deles. (3) A temperatura novamente elevada, fazendo com que os novos filamentos de DNA se separem dos antigos, que foram usados como molde. Ao final, o processo volta a repetir vrias vezes. Em cada ciclo, o nmero de genes (segmento de DNA) duplicado, e, como cada ciclo dura 2-3 horas, em algumas horas o DNA podes ser copiado bilhes de vezes. Alm de rpida, a PCR uma tcnica to sensvel que pode amplificar o DNA de uma nica clula.

O SEQENCIAMENTO DO DNA O sequenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra. Existem vrios mtodos disponveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizado o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de terminadores de cadeia ou de Sanger; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratgia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reao devero tambm portar uma marca que permita detecta-los na etapa de anlise. Resumidamente, o processo realizado a partir de uma cadeia simples (no dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servir de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hlice. Isto obtido pela desnaturao da molcula nativa. OS ARRAYS Microarranjo, uma tcnica experimental da Biologia Molecular que busca medir os nveis de expresso de transcritos em larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente. O termo microarranjo uma traduo natural e aceita para o termo em ingls microarray pelo qual esta tcnica mais conhecida. Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pr-definido de molculas de DNA (fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou oligonucleotdeos) quimicamente ligadas uma superfcie slida, usualmente lminas de microscpio revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarrays tambm podem ser preparados em membranas de nylon positivamente carregadas. Os microarrays so utilizados na deteco e quantificao de cidos nucleicos (mRNA na forma de cDNA ou DNA genmico) provenientes de amostras biolgicas, as quais so postas para hibridar com o DNA fixado no array (hibridao por complementariedade de bases). A deteco possvel pois as amostras so "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) quando utiliza-se microarrays em vidro ou com o istopo 33-P quando os arrays so preparados em membranas de nylon. Para a preparao dos microarrays, utilizam-se robs altamente precisos que aplicam as diferentes amostras de DNA em diminutos pontos (spots) no centro de uma lmina de microscpio com a superfcie quimicamente preparada (densidade aproximada de 10.000 pontos/cm2). Nota-se que cada ponto representar um segmento gnico em particular. Quanto mais pontos no microarray, mais abrangente ele ser na anlise do trancriptoma. Tambm so preparados oligo-microarrays pela tecnologia de sntese in-situ (mais apropriadamente referidos como DNA-chips). Neste caso, os oligonucleotdeos so sintetizados na prpria lmina numa densidade de 30-50.000 pontos/cm2. A tecnologia dos microarrays tem impulsionado de maneira importante a pesquisa de genmica funcional dos diferentes organismos, desde bactrias at o homem, incluindo situaes normais e patolgicas (cncer, doenas autoimunes, doenas degenerativas entre outras). GLOSSRIO Adenilato Ciclase Enzima ligada membrana celular que catalisa a sntese de AMP (adenosina monofostato) cclico ou cAMP, a partir de ATP. O cAMP um componente importante de diversas vias intracelulares transmissoras de sinais recebidos pela clula. AMP cclico Adenosina monofosfato cclica, uma molcula importante na transmisso intracelular de sinais. Anticdon Os trs nucleotdeos, na molcula do RNA de transferncia, que reconhecem o cdon do RNA mensageiro. A complementaridade entre o anticdon e o cdon serve para inserir, na molcula protica, o aminocido transportado pelo RNA de Transferncia. ATPase Enzima muito abundante nas clulas, que rompe a ligao qumica do grupo fosfato terminal do ATP, liberando energia e gerando ADP e fosfato inorgnico. ATPsintetase Complexo enzimtico encontrado na membrana interna das mitocndrias, na membrana dos cloroplastos e na membrana plasmtica das bactrias. Catalisa a sntese de ATP a partir de ADP e fosfato inorgnico. cDNA O mesmo que DNA complementar; molcula de DNA sintetizada como uma cpia de um RNA mensageiro, que constituda somente por xons, sem ntrons. Usado para determinar na seqncia de aminocidos numa protena, pela determinao da seqncia de nucleotdeos no cDNA ou para produzir grandes quantidades de protena. Cinases Enzimas que transferem um grupo fosfato de um nucleosdeo trifosfato, como ATP, para outra molcula. Cdon Seqncia de trs nucleotdeos, na molcula do RNA mensageiro, que representa a instruo para a incorporao de um determinado aminocido no polipeptdeo em formao.

Cdon de iniciao o cdom AUG, onde ribossomos se prende ao RNA mensageiro, assegurando a leitura correta do mRNA, e a sntese do polipeptideo com a seqncia correta de aminocidos. Cdon de terminao seqncia de trs nucleotdeos, na molcula de RNA mensageiro, que significa a instruo para o trmino da sntese do polipeptideo. H mais de um cdon de terminao. DNA recombinante molcula de DNA contendo seqncias nucleotdicas provenientes de mais de uma fonte. DNA-polimerase Enzimas que participam da sntese de novos filamentos de DNA, copiando os filamentos antigos. DNA-satlite DNA altamente repetitivo (muitos nucleotideos iguais) que se concentra na heterocomatina constitutiva (no confundir com satlite do cromossomo). Endonuclease de restrio Tambm conhecida como enzima de restrio. Engenharia gentica - conjunto de tcnicas e mtodos que permitem a manipulao do material gentico. Enzimas de Restrio - enzimas que cortam o material gentico em lugares definidos. Estampagem (imprinting) sistema de marcas qumicas agregadas ao cromossomos que servem de indicao sobre quais genes podem ou devem ser transcritos. xons as partes da molculas de um pr-RNA mensageiro (ou seu equivalente no DNA) que vo codificar uma cadeia polipeptdica aps remoo dos ntrons. Helicase enzima que separa as duas cadeias do filamento duplo de DNA, consumindo energia do ATP para romper as pontes de hidrognio entre as bases. Essencial para a replicao do DNA e para a sntese de RNA na transcrio. Hibridizao in situ tcnica para a localizao de gene (DNA) ou de RNA mensageiro. O cido nuclico em estudo conservado no seu local celular, e sobre ele se faz reagir molculas conhecidas e marcadas de DNA ou de RNA (sondas ou probes). A identificao da molcula marcada indica a localizao do gene ou do mRNA procurado. ntrons as partes da molcula de um pr-RNA mensageiro, ou seu equivalente no DNA, que so removidas por splicing, para possibilitar a juno dos xons que iro constituir a molcula de RNA mensageiro. Ligase - enzima usada para a ligao de molculas de cidos nuclicos. RNA heterogneo tambm designados de hnRNAs, um grupo complexo de molculas de RNA intracelulares, algumas muito grandes, e incluindo os pr-RNAs. Este ltimos, depois de processos por splicing do origem aos RNAs mensageiros. RNA mensageiro ou mRNA, a molcula intermediria entre um gene e o polipeptdeo codificado por ele. A molcula do RNA mensageiro sintetizada sobre um filamento de DNA e contm a informao para codificar um determinado polipeptdeo. RNA polimerase I a enzima de transcrio encontrada nas clulas que sintetiza os RNAs ribossmicos. RNA polimerase II a enzima de transcrio encontrada nas clulas eucariontes, que sintetiza os RNAs mensageiros, e a maioria dos RNAs de molculas pequenas. RNA polimerase III a enzima de transcrio encontrada nas clulas eucariontes, que sintetiza os RNAs de tranferncia e o RNA dos ribossomos. SnRNA as letras sn vm do ingls SMALL NUCLEAR. Pequenas molculas de RNA encontradas exclusivamente no ncleo celular, que fazem parte do spliceosomes e participam da remoo dos ntrons das molculas de RNA mensageiro. Tecnologia do DNA Recombinante - a totalidade de mtodos que, atravs de tcnicas de biologia molecular, permitem a manipulao do material gentico. Transcriptase Enzima que participa da fabricao de molculas de RNA copiando um modelo de DNA no processo denominado transcrio. Transcriptase reversa tambm chamada de transcriptase inversa; enzima que sintetiza DNA copiando uma molcula de RNA; importante para a multiplicao dos vrus com genoma de RNA (retrovirus).