Relatorio 1

UNIVERSIDADE DO MINHO
Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus
Laboratrio de Bioprocessos
Catarina Lobo, Filipa Gomes, Maura Guimares, Pedro Rocha 01-06-2011
Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus June 1, 2011
Sumrio
Os objectivos principais da presente actividade experimental so o estudo da produo da enzima -galactosidase pela Kluyveromyces marxianus e da cintica de crescimento da levedura utilizando diferentes pH. Foram utilizados para isso dois meios de cultura com pH igual a 5,5 e pH igual a 7. Ao longo do tempo foram retiradas amostras de modo a avaliar o crescimento da levedura, atravs da leitura das absorvncias; o consumo de substrato atravs da quantificao da concentrao de lactose pelo mtodo de DNS; a produo de etanol por HPLC; a quantidade de protena obtida aps ruptura utilizando o mtodo de Bradford e doseamento da sua actividade, utilizando o mtodo do ONPG. Para a ruptura foi escolhido o mtodo de sonicao tendo-se procedido sua optimizao. Em relao aos parmetros cinticos de crescimento, para o pH=5,5, foi obtida uma taxa especfica de crescimento, , de 0,086 min-1, um rendimento de converso de substrato em biomassa, YX/S, de 0,0133 gbiomassa/glactose, e em produto, YP/S, de 0,0207 getanol/glactose. Para o pH=7 obteve-se uma taxa especfica de crescimento, de 0,0078 min-1, um rendimento de converso de substrato em biomassa de 0,0114 gbiomassa/glactose, e em produto de 0,0131 getanol/glactose. Concluiu-se que o pH de 5,5 leva ao aumento da taxa especfica de crescimento e aumento do rendimento de substrato em biomassa. Relativamente actividade especfica da -galactosidase determinada ao longo do tempo, esta apresentou-se (tal como a quantidade de protena presente) tanto maior quanto menor o pH, em relao aos dois pH comparados. Pode-se assim dizer que o pH 5,5 ptimo para a produo de -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus.
ndice
1.
Introduo .............................................................................................................................................. 5 Material e procedimento experimental......................................................................................13
2.
2.1 Preparao do inoculo [12] [13] ...................................................................................................13 2.2 Pr-inoculao ............................................................................................................................. 134 2.3 Processo de fermentao [13] [14] ........................................................................................... 134 2.4 Calibrao da biomassa por peso seco [15] ....................................................................... 145 2.5 Quantificao de produo de metabolitos (HPLC) [15] ............................................. 156 2.6 Quantificao de substrato consumido (DNS) [15] ........................................................ 167 2.7 Ruptura da clula ....................................................................................................................... 177 2.7.1 Extraco mecnica: ......................................................................................................... 177 2.7.2 Sonicao ............................................................................................................................... 177 2.8 Quantificao de protena total (mtodo de Bradford) [11]...................................... 188 2.9 Determinao da actividade da beta-galactosidade [11] ........................................... 188 3. Apresentao e Discusso de resultados ............................................................................... 19 3.1 Variao do pH 3.2 Quantidade de Biomassa 3.3 Consumo de substracto 3.4 Produo de metabolitos 3.5 Mtodo da Ruptura Celular 3.6 Quantificao da beta-galactosidase 3.7 Doseamento da actividade enzimtica 4. Concluses e Recomendaes 5. Bibliografia 6. Anexos 6.1 Erros da Curva de Calibrao da Lactose 6.2 Curva de Calibrao para o mtodo de Bradford 6.3 Erros da Curva de Calibrao para o mtodo de Bradford 6.4 Resultados do ONPG 19 20 21 23 25 26 27 29 30 32 33 35 36 37
6.5 Curva de Calibrao do Etanol por HPLC 6.6 Erros da Curva de Calibrao do Etanol por HPLC
40 40
1. Introduo
Os objectivos principais desta actividade laboratorial so o estudo da produo da enzima -galactosidase pela Kluyveromyces marxianus e a avaliao dos parmetros cinticos da levedura utilizando meios com pH diferentes, de modo a ser feita uma optimizao da produo da enzima. Segundo a literatura, o pH ptimo para a produo de -galactosidase pela levedura referida de 5,5. [1] A -galactosidase (lactase EC 3.2.1.23) uma enzima que catalisa a reaco de hidrlise da lactose em glicose e galactose (figura 1), sendo industrialmente importante na preveno da cristalizao da lactose em produtos aucarados, condensados ou congelados tais como gelados e leite condensado; e na fermentao de cacau. [2]
Figura1. Hidrlise da Lactose em Glucose e Galactose [2]
Esta enzima tambm frequentemente utilizada para evitar problemas graves em caso de lacto-intolerncia, deficincia esta que caracterizada pela incapacidade de metabolizar a lactose pela falta da enzima lactase no intestino delgado.[3] Na literatura existe tambm o registo de novas aplicaes para a galactosidase, tais como a produo de galacto-oligossacardeos biologicamente activos, aplicaes estas ainda em desenvolvimento. [2] Na produo industrial de -galactosidase so utilizadas leveduras tais como Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis e Saccharomyces fragilis ou ento bolores como Aspergillus niger e Aspergillus oryzae. [2] Nesta actividade laboratorial foi utilizada a levedura Kluyveromyces marxianus.
5
Esta levedura capaz de utilizar a lactose como nica fonte de carbono, sendo que na natureza existem poucos organismos que o faam.
[7]
Desta forma a K.
marxianus necessita de produzir -galactosidase para o seu metabolismo. Esta levedura escolhida devido elevada taxa de produo desta enzima sendo esta mais elevada no inicio da fase estacionria.
[7]
Depois de degradada a lactose, a
glicose entra na via glicoltica e a galactose na via de Loir. Ambas as vias resultam na formao do piruvato, que dependendo das condies do meio pode ser totalmente oxidado ou reduzido e formar um produto secundrio como o etanol. [7] O crescimento desta levedura caracterizado pela curva tpica de crescimento microbiano. As clulas microbianas que crescem em cultura descontnua atravessam geralmente quatro fases distintas de crescimento. Essas fases so, por sequncia, a fase de latncia, a fase exponencial, a fase estacionria e a fase de morte. Uma representao destas quatro fases pode ser observada na figura 2.[4]
Figura 2: Fases de crescimento microbiano em cultura descontnua [5]
A fase de latncia, ou fase lag, a fase em que as clulas microbianas provenientes de um meio antigo esto ainda a adaptar-se s condies do novo meio e por isso no crescem de imediato. Nesta fase as clulas usam a energia para a sua maturao e no para o seu crescimento. A durao desta fase depende das condies do meio, como arejamento e temperatura, da diferena de composio
entre o meio antigo e o meio novo mas tambm da idade e linhagem das clulas, uma vez que clulas com fentipo ou idade diferente podem adaptar-se de maneira diferente ao novo meio. A fase de latncia , em muitos processos industriais, crtica, uma vez que nesta fase que a cultura est mais sujeita a contaminaes. Quando as clulas esto perfeitamente adaptadas ao meio de cultura inicia-se a fase de crescimento exponencial em que a maioria das clulas se encontra no mesmo estado fisiolgico e cresce rapidamente. Nesta fase, a velocidade de crescimento celular proporcional concentrao de clulas (X) em cada instante, sendo a constante de proporcionalidade igual taxa especfica de crescimento (). Assim, o modelo no estrutural mais simples para descrever o crescimento microbiano o de Malthus, representado pela equao 1. [6][7]
Equao 1: Equao representativa do crescimento microbiano descrito pelo modelo de Malthus [7]
A equao anterior pode ser integrada em ordem ao tempo obtendo-se a equao que estabelece a variao da concentrao de clulas com o tempo durante a fase exponencial (equao 2).
Equao 2: Equao que descreve a variao da concentrao celular com o tempo na fase exponencial [7]
Na qual X representa a concentrao celular para cada instante t, X0 a concentrao celular inicial e a taxa especfica de crescimento. A taxa especfica de crescimento celular () representativa da variao de biomassa (clulas) formada ao longo do tempo, na fase exponencial. [6] Nesta actividade em que tambm se pretende estudar o crescimento de Kluyveromyces marxianus e os parmetros cinticos de crescimento conveniente ter-se informao sobre a quantidade de substrato que foi usada para o
crescimento de biomassa e para a produo de etanol, o produto final (metabolito) da utilizao de glicose por parte desta levedura. Equao 4, respectivamente.
[5]
Assim, so calculados os
rendimentos de substrato em biomassa e em produto atravs da Equao 3 e da
YX/S
[ ] [ ] [ ] [ ]
Equao 3: Equao para o clculo do rendimento de substrato em biomassa. [7]
YP/S
[ ] [ ] [ ] [ ]
Equao 4: Equao para o clculo do rendimento de substrato em produto (etanol). [7]
Uma outra informao importante no que diz respeito anlise do crescimento de Kluyveromyces marxianus em meio de glicose a produtividade em etanol obtida durante o crescimento. Esta medida da concentrao de etanol no meio por unidade de tempo e unidade de biomassa. [6] A produtividade em etanol calculada atravs da Equao 5.
qp
Equao 5: Equao para o clculo da produtividade em etanol. [7]
Na qual YX/P o rendimento de etanol em biomassa, e que traduz a quantidade de biomassa formada por quantidade de produto. [4] Este rendimento calculado pela Equao 6.
YX/P
[ ] [ ] [ ] [ ]
Equao 6: Equao para o clculo do rendimento de produto (etanol) em biomassa . [7]
tambm importante determinar a taxa especfica de consumo de substrato. Para tal recorreu-se a equao 7, em que substrato consumido por biomassa.
YX/s
o rendimento do
YX/P=
Equao 7: Equao para o clculo da taxa especifica de consumo de substrato
H autores que referem que o aumento da concentrao de lactose no meio leva a uma diminuio do rendimento de biomassa e a um aumento do rendimento de etanol. [8] Na determinao da quantidade de acares redutores, que por sua vez indica a quantidade de substrato consumido, utilizado o mtodo de DNS ou tambm designado por mtodo do cido 3,5 dinitrosaliclico. Este mtodo baseiase na reduo do cido 3,5 dinitrosaliclico a cido 3-amino-5-nitrosaliclico e na oxidao do grupo aldedo ou cetnico a grupos carboxlicos mudando a sua cor de amarelo para laranja forte tanto mais forte quanto maior for a quantidade de acares redutores em soluo. Tais reaces encontram-se esquematizadas na Figura 3. [8]
Figura 3. Representao das reaces envolvidas no mtodo de DNS [8]
O facto da -galactosidase ser uma enzima intracelular leva a um maior custo na sua obteno, visto ser necessrio ruptura celular a qual, tratando-se de
leveduras, pode tornar-se bastante complicada, devido existncia de glucanos e mananos que conferem uma elevada rigidez ao invlucro celular (figura 4). [9]
Figura 4: Esquema da constituio do invlucro celular de uma levedura [11]
Diferentes mtodos mecnicos e qumicos podem ser utilizados para romper e/ou permeabilizar as clulas da levedura utilizada de modo a ser obtida a protena intracelular pretendida. Os mtodos qumicos podem promover a solubilizao da parede celular, fazendo recurso, entre outros, a solventes orgnicos, detergentes, lpidos, cidos e bases ou ruptura por choque osmtico. A aco dos agentes qumicos , em geral, bastante especfica, actuando somente sobre determinados componentes das membranas. Os mtodos mais utilizados neste processo so: adio de isopentanol, adio de SDS. [10] Os mtodos anteriormente mencionados, nem sempre conseguem provocar a lise celular e/ou libertar os produtos de interesse. Contudo, como fragilizam a parede celular, podem ser auxiliares preciosos dos mtodos de desintegrao mecnica. Os mtodos mecnicos de ruptura mais utilizados so: a sonicao e a agitao com vortex das clulas com esferas de vidro. [10] Na sonicao recorre-se a aparelhos que geram energia ultrassnica (sonicadores) que causa reas alternadas de presso negativa e positiva no meio, dando isto origem formao de ondas de choque que levam lise celular. So por vezes adicionadas esferas de vidro ao meio, levando isto a um aumento do atrito slido e por conseguinte a um aumento da eficincia de ruptura. [10] A agitao no vrtex com esferas de vidro um mtodo bastante simples no qual amostra, onde se pretende promover ruptura celular, adicionado um determinado volume de esferas de vidro com um determinado dimetro,
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promovendo-se a agitao da mistura durante um intervalo de tempo definido, processo este que gera atrito slido levando ruptura celular da biomassa. [10] Aps o processo de ruptura celular e obteno da protena intracelular pretendida fundamental a sua quantificao. Isto pode ser efectuado pelo mtodo de Bradford, uma vez tratar-se de um mtodo rpido, com poucas etapas e no requer calor (que pode desnaturar as protenas). Este mtodo baseado na observao da absorvncia mxima de uma soluo cida de Coomassie Brilliant Blue G-250 para comprimentos de onde entre 465 nm e 595 nm aquando da ligao da protena a este. Ambas as interaces inicas e hidrofbicas estabilizam a forma aninica do corante levando a uma visvel alterao de cor. [10] Aps isolamento da protena importante o doseamento da sua actividade. Isto pode ser conseguido atravs da utilizao de -nitrophenol--Dgalactopyranoside (ONPG) como substrato da enzima, sendo que no decorrer da reaco enzimtica libertado o-nitrophenol (ONP) sendo a concentrao deste composto de cor amarelada obtida espectrofotometricamente a 405 nm de comprimento de onda (figura 5). Assim, uma unidade de actividade enzimtica (U) da -galactosidase definida como a quantidade de enzima que liberta 1 mol de o-nitrophenol por minuto e sendo dada especificamente (U.mL-1) pela diviso deste valor pela massa de biomassa (em mL). [2]
Figura 5 Comparao da reaco da -galactosidase utilizando como substrato lactose e ONPG [8]
A actividade pode ser calculada assim da seguinte maneira [11]:
11
Equao 9: Clculo da actividade enzimtica atravs do mtodo ONPG.
Em que:
o declive da recta de A405 vs tempo (min) o coeficiente de extino molar (assumir igual a 6.1 mM-1) d o factor de diluio da amostra (se aplicvel)
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2. Material e procedimento experimental
2.1 Preparao do inoculo [12] [13]
Utilizou-se o seguinte meio YEPD: Composio Extracto de levedura: 5 g/L Peptona: 10 g/L Glucose: 10 g/L
Preparao Pesou-se 5 g de extracto de levedura, 10 g de peptona e 10 g de glicose. Juntou-se os trs componentes num erlenmeyer de 1 L. De seguida, adicionou-se 500 mL de gua destilada e manteve-se a 30C com uma agitao de 150 rpm;
Nota: O meio foi fornecido j preparado.
2.2. Pr-inoculao
Fazer a pr-inoculao 24h antes da inoculao (1 mL).
2.3. Processo de fermentao [13] [14]

Composio Lactose: 50 g.L -1 Extracto de levedura: 10 g.L-1 Peptona: 20 g.L-1
13
Material: 2 erlenmyer de 250 mL Bomba de arejamento Material base de laboratrio (pipetas, micropipetas, etc.) Preparao: Esterilizou-se os 5 recipientes no autoclave. Dividiu-se 125 mL de inculo para dois erlenmyer de 250 mL, ambos foram colocados numa incubadora orbital 30C com uma agitao de 150 min-1, diferendo apenas o pH do meio entre 5,5 e 7. Retiraram-se amostras dos dois meios de 125 mL de 1 em 1 hora.
2.4 Calibrao da biomassa por peso seco [15]
A composio usada foi a seguinte: Glicose: 20 g.L -1 Extracto de levedura: 10 g.L-1 Peptona: 20 g.L-1
Material: Estufa a 80C Espectrofotmetro com leitura na regio do visvel Agitador vortex Tubos de ensaio Sistema de filtrao com bomba de vcuo Erlenmayer de 500 mL Cuvetes de vidro Membranas estreis com 47 mm de dimetro e 0.45 m de porosidade gua destilada Inculo de S. cerevisiae
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Preparao: Prepararam-se 150 mL do meio de cultura referido num balo de 250 mL. Este foi esterilizado em autoclave a 121 C durante 20 min. De seguida, inoculou-se o meio com a cultura fornecida e colocou-se o balo numa incubadora orbital a 30 C. Montou-se o sistema de filtrao, filtrando-se individualmente as trs amostras de 20 mL, lavando a biomassa retida no filtro com 15 mL de gua destilada. Preparou-se o branco em duplicado, filtrando 20 mL de gua destilada por cada membrana. Colocou-se as membranas sobre uma folha de alumnio, dentro de placas de Petri e procedeu-se secagem numa estufa a 80 C at peso constante. Com a amostra de 10 mL, fez-se uma leitura preliminar no espectrofotmetro e fez-se pelo menos 5 diluies de modo a possibilitar a construo de uma curva padro medindo-se a absorvncia (densidades pticas a 620 nm entre 0.2 e 0.8). Pesou-se as membranas depois de as deixar arrefecer num exsicador para evitar adsoro de vapor de gua. Descontou-se o peso mdio dos controlos e calculou-se o peso seco (g.L-1) das diluies, com base no valor obtido para a amostra. Por fim, construiu-se uma curva padro tendo em abcissas os valores da absorvncia, e o peso seco (em g.L-1) em ordenadas;
2.5. Quantificao de produo de metabolitos (HPLC) [15]
Material: Etanol absoluto Glucose Agua destilada Balana analtica Pipetas de 1 mL e de 5 mL Bales volumtricos (1x100 mL; 4x50 mL)
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Preparao do eluente: Preparou-se uma soluo 5 mmol.L-1 H2SO4 com gua desionizada. Filtrou-se a soluo com uma membrana de 0.22 m de porosidade. Desgaseificou-se (removeu-se todo o ar) o eluente num banho de ultrasons. Nota: O eluente foi fornecido j preparado. Curva de calibrao Procedimento: Preparou-se uma soluo padro com cerca de: 1500 mg.L-1 de etanol e lactose e anotou-se as concentraes exactas para construir as respectivas curvas de calibrao. Cerca de 1 hora antes de iniciar as injeces de amostras, ligou-se a bomba com um caudal de eluente baixo (e.g. 0.10 mL.min-1). Ligou-se tambm o refractmetro e o forno do HPLC, ajustando-se este a uma temperatura de 60 C. Aps a estabilizao da leitura do refractmetro e da temperatura, ajustou-se o caudal de eluente a 0.70 mL.min-1.
NOTA: Deve aumentar-se o caudal em degraus de 0.10 mL.min-1 at o caudal pretendido (0.70 mL.min-1); As curvas de calibrao foram fornecidas j construdas.
Injectou-se a amostra. Efectuaram-se trs a quatro injeces com a seringa disponvel, para garantir que foram removidas todas as bolhas de ar do loop. O tempo de anlise seleccionado foi de 15 minutos.
2.6.
Quantificao de substrato consumido (DNS) [15]
Preparou-se uma soluo "stock" de glucose 10 g.L-1 (anotando o valor exacto da massa de pesagem). A partir desta, preparam-se solues de glucose at se atingir um valor de 3,5 g.L-1 na curva. Num eppendorf, misturou-se 100 L de DNS com 100 L de cada uma destas solues (fizeram-se ensaios em triplicado). E da mesma forma preparou-se um branco de gua destilada. Mergulharam-se os eppendorf num banho de gua a 100 C, durante 5 min. De seguida, arrefeceu-se a
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mistura num banho de gua fria e adicionou-se 1 mL de gua destilada. Colocou-se 200 l de cada soluo resultante e um branco de gua destilada numa placa de 96 poos. Leu-se a absorvncia das amostras a 540 nm. Preparao do reagente de DNS Dissolveu-se, temperatura de 80C, 5 gramas de cido 3,5-
dinitrossaliclico em 250 mL de gua destilada, deixou-se arrefecer e juntar 100 mL de NaOH 2N. Juntou-se 150 gramas de sal de La Rochelle (tartarato duplo de sdio e de potssio) e perfez-se o volume at 500 mL de gua destilada. Guardouse num frasco escuro.
Nota: O reagente foi fornecido j preparado.
2.7 Ruptura da clula

2.7.1 Extraco mecnica:
A 1 mL de suspenso de leveduras retirado para um tubo de ensaio juntouse um volume de esferas de vidro: 100 L, para a amostra 1 e 200 L, para a amostra 2. A amostra 1, com 100 L de esferas, foi agitada no vortx durante 3 minutos. Um duplicado da amostra 1 foi agitada no vrtex durante 6 minutos. amostra 2 foi realizado o mesmo processo, incluindo o duplicado. Quando a amostra aqueceu devido agitao, foi arrefecida em gelo. Centrifugaram-se as amostras durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e leram-se as absorvncias.
2.7.2 Sonicao
Separaram-se 4 amostras e seus duplicados, cada uma com 2 ml de suspenso de leveduras. Aplicaram-se os seguintes ciclos de impulsos s amostras, respectivamente: 20, 40, 60 e 80 impulsos. Ao final de cada ciclo de impulsos colocou-se em gelo durante 1 minuto. Centrifugaram-se as amostras e retirou-se o
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sobrenadante. Depois dos ensaios realizados optimizou-se o processo, a fim de escolher o melhor mtodo de ruptura. Aps anlise das absorvncias, optou-se por fazer a ruptura das clulas das amostras recolhidas ao longo do tempo de incubao segundo o mtodo de sonicao, aplicando um ciclo de 60 impulsos a cada amostra. Todas as amostras foram arrefecidas em gelo a cada 10 impulsos. Centrifugaram-se as amostras e retirou-se o sobrenadante.
2.8
Quantificao de protena total (mtodo de Bradford) [11]
A cada amostra recolhida ao longo do tempo de incubao, depois de efectuada a ruptura celular, retirou-se 10 L e colocou-se em poos de uma microplaca. Adicionou-se a cada poo preenchido 100 L de reagente de Bradford. Deixou-se reagir 10 minutos com a ausncia de luz, tapando-se com folha de alumnio. Leu-se a absorvncia a 595 nm.
2.9 Determinao da actividade da beta-galactosidade [11]

Material: Microplaca Soluo de ONPG
Reagente de paragem Espectofotmetro Amostra de beta-galactosidade extraida
Procedimento: Colocou-se 200 L de soluo ONPG nos poos necessrios de uma microplaca e de seguida adicionou-se 50 L de cada amostra recolhida ao longo do tempo de incubao, aps se ter aplicado sonicao. Leu-se as absorvncias a 405 nm incluindo um tampo branco, de 2 em 2 minutos at perfazer 15 minutos. Por fim, construiu-se uma curva de calibrao.
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3 Apresentao e Discusso de resultados
Por diante, adopta-se a nomenclatura pH1 para o meio inoculado com o pH inicial igual a 5,5 e pH2 para o meio inoculado com o pH inicial igual a 7.
3.1
Variao do pH
A formao de metabolitos que so excretados para o meio, nomeadamente o etanol e o cido lctico vo diminuir o pH da cultura. O pKa do cido lctico 3,86
[16].
A diminuio do pH um dos factores que levam a que a taxa de morte
iguale a taxa de crescimento e pare o crescimento exponencial da cultura. Depois da inoculao do meio foram retiradas pequenas amostras ao longo do tempo para medies de pH e medio da quantidade de biomassa. Na figura seguinte apresenta-se a variao de pH ao longo do tempo de incubao. Como se pode ver, a variao do pH ocorre para os dois meios de pH inicial diferentes, notando-se uma curva ligeiramente decrescente, decrscimo esse associado produo de cidos pela levedura, durante o seu processo de crescimento. A diminuio do valor de pH mostra-se assim independente do pH inicial, j que ocorre nos dois meios.
8 7 6 5 pH 4 3 2 1 0 0 100 200 300 400 500 tempo (minutos) pH1 pH2
Figura 6: Variao de pH ao longo do tempo de incubao para os dois meios inoculados.
19
3.2
Quantidade de biomassa
Aps a elaborao de uma curva de calibrao de biomassa para peso seco, obtivemos atravs das medies da absorvncia os valores de concentrao celular (g/L) ao longo do tempo. De acordo com a figura 7, ambas as curvas crescem de forma semelhante. A fase de latncia visvel nos dois meios, mas acompanhada de poucos pontos, tornando difcil indicar o incio exato da fase exponencial. No entanto, pressupese que a fase de latncia dura at aos 300 minutos, comeando ento as clulas a crescer, na fase exponencial. O meio pH1 cresce at uma concentrao celular de 0,67 g/l, enquanto que o meio pH2 cresce at 0,51 g/L. Os dois ltimos pontos da curva do meio pH 2 sugerem que este meio j ter entrado na fase estacionria, uma vez que as concentraes celulares esto bastante prximas, no sendo esta afirmativa feita com grande rigor uma vez que no houve possibilidade de recolher amostras aps 500 minutos de incubao. No foi possvel, em 500 minutos de incubao, verificar a fase estacionria do meio pH1. Esta diferena nas duas curvas de crescimento celular prope que nveis de pH diferentes do pH ptimo da levedura (5,5) alteram o comeo da fase estacionria.
0.8 0.7 0.6 Concentrao (g/L) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0 100 200 300 tempo (minutos) 400 500 pH1 pH 2
Figura 7: Curva de crescimento celular, em sistema fechado e descontnuo.
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A partir destes resultados foi calculado o rendimento em biomassa em funo do substrato; a taxa especfica de crescimento() e o tempo de duplicao. Estes resultados encontram-se nas tabelas 1, 2 e 3.
Tabela 1: Rendimento da converso do substrato em biomassa;.
YX/S
pH1 pH2 0,01325246 0,01138713
Tabela 2: Taxa especifica de crescimento e tempo de duplicao para o pH1.
(min) 0,0086 pH1 tempo duplicao (min) 80,59581
Tabela 3: Taxa especifica de crescimento e tempo de duplicao para o pH2-
(min) 0,0078 pH2 tempo duplicao (min) 88,86502
3.3
Consumo de Substrato
Neste ponto apresentam-se os valores da concentrao da lactose ao longo do tempo. Estes resultados foram conseguidos a partir da absorvncia medida pelo mtodo de DNS, posteriormente convertida para concentrao utilizando a curva de calibrao para este substrato. No tempo zero de incubao a concentrao de lactose no de 50 g/L, uma vez que a composio dos meios foi feita com esta concentrao em lactose, mas sim prxima de 80 g/L para ambos os meios. Esta discrepncia de valores deve-se presena de glucose no extracto de levedura, j que a sua composio no
21
conhecida. O mtodo de DNS analisa a presena de acares redutores no meio. Sendo a lactose e a glucose acares redutores ambos tero efeito na reaco de reduo do composto presente no DNS. Na execuo do teste de DNS utilizou-se o vrtex para envolver a soluo contida nos eppendorfs. Isto pode ser visto como mtodo tradicional de ruptura celular
[17].
Considerando ruptura celular, mesmo
que em pequena quantidade, tero sido expostos no meio glucose e galactose que se destinariam actividade metablica da levedura. Assim, justifica-se que nas primeiras horas exista o aumento inesperado na concentrao de acares redutores no meio, devido existncia de uma concentrao de lactose no meio que ainda no foi absorvida e a glucose presente neste mesmo meio mas que devia estar dentro das clulas. A concentrao de lactose nos meios vai diminuindo ao longo do tempo de incubao, uma vez que as clulas, para crescer, necessitam de lactose. A curva de consumo de lactose, figura 8, prxima entre os dois meios, significando que o pH no influencia o consumo de lactose pelas clulas. A concentrao final analisada est prxima de 30 g/L, indicando que o meio ainda teria lactose disponvel para o crescimento das clulas. Isto corrobora, junto com a curva do crescimento celular, que o processo de fermentao no ter chegado ao fim, pois para vrios estudos verificou-se que a lactose era consumida quase na totalidade no final da fermentao.[18] O consumo de lactose mais acentuado nas primeiras horas de incubao, devendo este ser mais acentuado na fase exponencial, j que as clulas crescem mais vincadamente nesta fase. Assim, no possvel associar as fases do crescimento celular curva de consumo de substrato.
Equao da curva de calibrao da lactose:
y = (0,2054 0,388994129)x (0,0186 0,177508185)
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100 90 80 Concentrao (g/L) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 tempo (minutos) pH1 pH 2
Figura 8: Concentrao de lactose, em funo do tempo, para os meios de diferente pH.
O mtodo de DNS tem em conta a presena de acares redutores no meio. Sendo a lactose e a glucose aucares redutores ambos tero efeito na reaco de reduo do composto presente no DNS. Tendo em conta estes valores foi calculado o rendimento do substrato em funo do produto (etanol), enunciados na tabela 4.
Tabela 4: Rendimento da converso do substrato em produto.
YP/S pH1 pH2 0,02006142 0,01305376
3.4
Produo de metabolitos
Dos metabolitos produzidos, adjacentes ao metabolismo da clula, podem ser enumerados o cido lctico, a glicose e o etanol. Neste estudo apenas se analisou a produo de etanol devido pouca resoluo do pico caracterstico do cido lctico e da glicose, nos resultados obtidos com o mtodo HPLC.
23
Pelo mtodo de HPLC obtivemos os valores de absorvncia para o etanol, posteriormente convertidos para valores de concentrao a partir da equao da curva de calibrao:
y = (245,2 12,31244783)x +( 2,0458 143,8291155)
1.2 1 [etanol] (g/L) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 100 200 300 400 500 Tempo de incubao(min)
pH1 pH2
Figura 9: Concentrao de etanol em funo do tempo para os dois diferentes valores de pH inicial.
Como mostra a figura 9, a produo acentuada de etanol comea aproximadamente no incio da fase exponencial, significando que as clulas esto de facto a crescer e que, no seu metabolismo normal, se d a produo deste metabolito. A produo de etanol difere entre meios a partir dos 360 minutos de incubao: no meio pH1 a produo continua a aumentar acentuadamente, enquanto que no meio pH2 a concentrao de etanol parece se deslocar para um valor relativamente constante. Segundo OTTERSTEDT et al., 2004, a produo de etanol est diretamente dependente da concentrao da fonte de carbono, o carboidrato, exposta para S. Cerevisiae. Este trabalho foi realizado com a concentrao inicial de lactose tal que a actividade enzimtica seria mxima. Assim sendo, espera-se que a produo de etanol seja razovel. Porm, no foi possvel comparar rigorosamente com valores
24
de referncia, uma vez que h sempre parmetros a variar nos processos de fermentao. Assim, apenas se pode concluir que efetivamente se deu produo de etanol, diferenciando-se esta no valor mximo obtido, para o tempo de incubao considerado, entre meios. Com estes valores foi possvel calcular o rendimento do produto(etanol) em funo da biomassa assim como a produtividade em etanol (Qp), da tabela 5 e 6, respectivamente.
Tabela 5: Rendimento do produto (etanol) em funo da biomassa.
YX/P pH1 pH2 0,66059408 0,87232507
Tabela 6: Produtividade em etanol.
qp
(h) Qp pH1 pH2 0,0086 0,0077 0,660594079 0,87232507 0,013018585 0,00882698
3.5
Mtodos de ruptura celular
Nesta fase foram estudados dois mtodos de ruptura celular diferentes com o objectivo de os comparar e retirar concluses em relao sua eficcia. No primeiro, a sonificao, foram utilizados intervalos de impulsos diferentes, aos quais foram sujeitos duas amostras. No segundo, ruptura mecnica por esferas, foram utilizados dois volumes distintos de esferas, 100 L e 200 L, para duas amostras, em dois tempos diferentes de permanncia no vrtex, 3 e 6 minutos.
25
Tabela 7: Resultados da D.O. obtida para os diferentes mtodos de ruptura celular e diferentes parmetros utilizados;
Sonicao Impulsos Amostra 1 20 40 60 80 0,205 0,205 0,243 0,217 Amostra 2 0,229 0,199 0,231 0,213 Mdia 0,217 0,202 0,237 0,215 100 mL 0,208 0,214 0,203 0,22 200 mL 0,207 0,194 0,175 0,187
Esferas
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 1 Amostra 2
3 minutos 6 minutos
Concordante com a tabela 1, o mtodo que se mostrou mais eficaz na ruptura celular, baseando-se a aferio na densidade ptica representativa das amostras testadas, foi o mtodo da sonicao, aplicado em 60 impulsos.
3.6
Quantificao de -galactosidase
A eficincia do mtodo de ruptura influencia a actividade da enzima e os baixos valores obtidos podem ser devidos a uma m ruptura das clulas e consequente diminuio de produto intracelular recuperado. Estudos realizados concluem ainda verificar-se um aumento da actividade da enzima durante a fase exponencial e uma diminuio da mesma a partir da fase estacionria . Isto pode ser visvel para o pH2 que, conforme dito anteriormente, parece ter comeado a sua fase estacionria no fim do tempo de incubao analisado. A quantidade de protena superior para o meio pH1, sugerindo, mais uma vez, que este pH ser o mais adequado para a levedura.
26

1 0.9 0.8 Concentrao (g/L) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 100 200 300 400 500 tempo incubao
Figura 10: Evoluo da quantidade da protena -galactosidase com o tempo de incubao
pH1 pH2
3.7
Doseamento da actividade enzimtica
O aumento da actividade enzimtica ao longo do tempo de incubao est evidenciado na figura 11. Com o incio da fase exponencial vem tambm o aumento exponencial da actividade enzimtica, confirmando a teoria de que se esto a produzir protenas no crescimento celular. Obtiveram-se valores superiores de actividade enzimtica para o meio pH1 ao longo de todo o tempo de incubao, coincidindo com o conhecimento anterior sobre o pH ptimo da levedura. O pH de um sistema afecta pelo menos dois aspectos das clulas microbianas: o funcionamento das suas enzimas e o transporte de nutrientes para a clula. Os valores de pH tambm afectam a sntese de RNA e protenas, segundo Klovrychev et al., 1979. Isto vem de encontro ao facto de a actividade enzimtica ser inferior para um pH diferente do ptimo.
27

0.025 Actividade Enzimtica (U/mL) 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0 100 200 300 400 500 tempo (minutos) pH1 pH2
Figura 11: Resultados da actividade enzimtica ao longo do tempo, para os diferentes valores de pH utilizados.
28
4 Concluses e Recomendaes
Segundo o estudo realizado, confirma-se que o pH ptimo da levedura 5.5 e alteraes neste parmetro resultam em diferenas significativas: a converso do substrato em biomassa, apesar da diferena ser pequena (0.0133 e 0.0114 para os meios pH1 e pH2, respectivamente), mostra-se menos eficiente em pH diferente do ptimo; a taxa especfica de crescimento maior quando o pH ptimo (0.0086 min e 0.0078 min, para os meios pH1 e pH2, respectivamente), significando que as clulas crescem mais rpido quando esto no ambiente adequado; o tempo de duplicao tambm corrobora esta afirmao, resultando num tempo maior para que as clulas se dupliquem no meio com pH2 (88.87 min ao invs de 80.60 min para o meio com pH1); a produo de etanol tambm afectada uma vez que a produtividade em etanol foi mais baixa (0.0088) para o meio com pH2 em detrimento de 0,0130 para o meio com pH1, significando estes valores a concentrao de etanol no meio por unidade de tempo (minutos) e unidade de biomassa. No entanto, no foi possvel avaliar a produo efetiva de etanol porque o processo de fermentao no se prolongou at ao fim, deixando-nos sem perceber se a concentrao de etanol final que se obteve foi razovel ou no. De facto, vrios foram os problemas implcitos curta durao do processo de fermentao e consequente falta de amostras representativas. Um processo mais longo de fermentao, provavelmente de apenas 24 horas, seria o suficiente para se poderem verificar as 4 fases de crescimento celular e assim apresentar resultados mais fiis ao metabolismo celular esperado. O nmero de amostras recolhidas foi baixo, implicando a anlise restrita de vrios parmetros, como o exemplo da lactose, que apenas foi analisada pelo mtodo de DNS. A falta de anlise atravs de um mtodo mais especfico (HPLC), que analisasse apenas a quantidade de lactose no meio, trouxe dvidas que de outra forma no existiriam. Contudo, considera-se que este trabalho foi frutfero e bastante interessante, proporcionando a aprendizagem ativa do funcionamento celular.
29
5 Bibliografia
[1] PEREIRA, M., Purificao de uma endo-poligalacturonase, produzida por Kluyveromyces marxianus , utilizando sistemas de duas fases aquosas, Departamento de Engenharia biolgica, Universidade do Minho, 2005
[2] DAGBAGLI, S., GOKSUNGUR, Y. - Optimization of -galactosidase production using Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 by response surface methodology, Ege University, Faculty of Engineering, Department of Food Engineering; 2008 [3] To, C., Intolerncia lactose: uma breve reviso para o cuidado nutricional, Arq. cincias sade, UNIPAR; 2002 [4] LOPES A. , Biologia Microbiana, Universidade Aberta [5] Office of Biothecnology, High Performance Liquid Chromatography, Protein Facility, Iowa State University, http://www.protein.iastate.edu/hplc.html (consultado a 27-06-2011) [6] Grupo de Cincias Biolgicas do IST, Acompanhamento da curva de crescimento, http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=235 (consultado a 27-062011) [7] FONSECA M. M., TEIXEIRA J. A., Reactores Biolgicos - Fundamentos e Aplicaes, Editora Lidel, Lisboa, 2007. [8] PINHEIRO, R., BELO, I., MOTA, M., Growth and b-galactosidase activity in cultures of Kluyveromyces marxianus under increased air pressure, Centro de Engenharia Biologica, IBQF, Universidade do Minho, Largo do Pao, Braga Codex, Portugal; 2003 [9] MARQUEZ L. D. S., Produo de Acar Invertido Pelo Uso de Invertase Imobilizada em Resinas, Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica, Faculdade de Engenharia Qumica - Univ. Federal de Uberlndia, 2007
30
[10] OLIVEIRA, R., Ruptura Celular, Apontamentos tericos de Processos de Separao II, Departamento de Engenharia Biolgica, Universidade do Minho
[11] SOUSA, D., Mtodo de Bradford e betaGal, Apontamentos tericos de laboratrios de biporcessos, Departamento de Engenharia Biolgica, Universidade do Minho [12] SCHULLER, D., Guia de laboratrio, Apontamentos tericos de Laboratrios
de biologia, Departamento de Biologia, Universidade do Minho [13] OLIVEIRA, C., Produo de -galactosidase por Levedura Recombinante Desenvolvimento de um Sistema de Produo Estvel, Departamento de Engenharia Biolgica, Universidade do Minho, 2005 [14] SILVA, N., BARBOSA, R., FILHO, U., CARDOSO, V., Crescimento celular e producao de beta-galactosidase e celulase por aspergillus niger em soro de leite, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Federal de Uberlndia [15] SOUSA, D., Acitividades experimentais Mdulo 1, Apontamentos tericos da de Laboratrios de Bioprocessos, Departamento de Engenharia Biolgica, Uiversidade do Minho [16] http://www.cienciaviva.pt/docs/itqbconservantes.pdf [17] TOYODA, T., OHTAGUCHI, K., Prodution of Ethanol from Lactose by Kluyveromyces lactis NBRC 1903, 2008, Thammasat Int. J. Sc. Tech., Vol. 13 November [18] DAGBAGLI, S., GOKSUNGUR, Y., Optimization of -galactosidase production using Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 by response surface methodology, Departamento de engenharia alimentar, Universidade Ege, Turquia, 208
31
6 Anexos
Nesta seco, sero descritos os resultados auxiliares ou adicionais, obtidos durante o nosso estudo e que permitiram concluir alguns dos pontos descritos no ponto 4. Do presente relatrio.
32
6.1
Erros da curva de calibrao da lactose
Para a curva de calibrao da lactose, aprsentada no ponto 3.3., e tendo em conta os dados presentados na figura 8 do mesmo ponto, foi necessrio proceder ao clculo do erro de um valor de x obtido atravs da recta, dado pela equao 9. ( )
( )
Equao 9: Erro de um valor de x obtido atravs da recta.
Os resultados constituem a tabela 8 para pH1 e na tabela 9 para pH2.

Tabela 8: Erro do valor x obtido a partir da curva de calibrao da lactose para os dados de pH1:
Concentrao Absorvncia g/L (xi) (yi) 0 0,1 0,5 1 2 3 4 10,6 1,514285714 0,2054 7 2 0,117468129 0 -0,0005 0,06 0,1675 0,4225 0,615 0,783 2,0475 0,2925
(xi - xmdio) 1,514285714 1,414285714 1,014285714 0,514285714 0,485714286 1,485714286 2,485714286
(xi - xmdio)2 2,293061224 2,000204082 1,02877551 0,264489796 0,235918367 2,207346939 6,17877551 14,20857143
(yi-ymdio) -0,2925 -0,293 -0,2325 -0,125 0,13 0,3225 0,4905
(yi-ymdio)2 0,08555625 0,085849 0,05405625 0,015625 0,0169 0,10400625 0,24059025
y (pH1) 0,87 0,739 0,6205 0,55 0,5065 0,475
S(x) 0,72481198 0,673703625 0,623875752 0,592245686 0,57185716 0,556627052
Somatrio Mdia Declive (b) Nmero de pontos (n) Repeties (m) Erro padro na regresso linear (S(y))
33
Tabela 9: Erro do valor x obtido pela curva de calibrao da lactose para pH2
Concentrao Absorvncia g/L (xi) (yi) 0 0,1 0,5 1 2 3 4 10,6 1,514285714 0,2054 7 2 0 -0,0005 0,06 0,1675 0,4225 0,615 0,783 2,0475 0,2925
(xi - xmdio) 1,514285714 1,414285714 1,014285714 0,514285714 0,485714286 1,485714286 2,485714286
(xi - xmdio)2 2,293061224 2,000204082 1,02877551 0,264489796 0,235918367 2,207346939 6,17877551 14,20857143
(yi-ymdio) -0,2925 -0,293 -0,2325 -0,125 0,13 0,3225 0,4905
(yi-ymdio)2 0,08555625 0,085849 0,05405625 0,015625 0,0169 0,10400625 0,24059025
y (pH1) 0,8095 0,6405 0,5615 0,5255 0,4985 0,4605
S(x) 0,701671273 0,632560902 0,597519497 0,580850527 0,568027882 0,549474501
0,117468129
34
6.2
Curva de Calibrao para o mtodo de Bradford:
Durante o nosso estudo, foi tambm necessrio construir a curva de calibrao do mtodo de Bradford, representada na figura 12.
0.8 0.7 0.6 Absorvncia 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 Concentrao (g/L)
Figura 12: Curva de Calibrao para o mtodo de Bradford.
y = 0.4543x + 0.2746 R = 0.9842
0.8
1.2
35
6.3
Erros da Curva de Calibrao do mtodo de Bradford
Tal como para a curva de calibrao da lactose, tambm foi calculado o erro do valor x obtido atravs da curva de calibrao do mtodo de Bradford, usando igualmente a equao 9, a tabela 10 para pH1 e a tabela 11 para pH2.
Tabela 10: Erros do valor x obtido pela curva de calibrao de Bradford para os valores pH1
Concentrao Absorvncia g/L (xi) (yi) 1 0,8 0,5 0,4 0,25 0,05 Somatrio Mdia Declive (b) Nmero de pontos (n) Repeties (m) Erro padro na regresso linear (S(y)) 3 0,5 0,4543 6 1 0,022561974 0,723 0,637 0,5375 0,4295 0,3865 0,297 3,0105 0,50175
(xi - xmdio) 0,51428571 0,71428571 1,01428571 1,11428571 1,26428571 1,46428571
(xi - xmdio)2 0,264489796 0,510204082 1,02877551 1,241632653 1,598418367 2,144132653 6,787653061
(yi-ymdio) 0,4305 0,3445 0,245 0,137 0,094 0,0045
(yi-ymdio)2 0,18533025 0,11868025 0,060025 0,018769 0,008836 0,00002025
y (pH1) 0,39 0,395 0,463 0,478 0,475 0,48
S(x) 0,051775987 0,051860928 0,053002618 0,053251166 0,053201549 0,053284218
36

Tabela 11: Erro do valor x obtido pela curva de calibrao do mtodo de Bradford para os valores de pH2
Concentrao Absorvncia g/L (xi) (yi) 1 0,723 0,8 0,637 0,5 0,5375 0,4 0,4295 0,25 0,3865 0,05 0,297 Somatrio Mdia Declive (b) Nmero de pontos (n) Repeties (m) Erro padro na regresso linear (S(y)) 3 0,5 0,4543 6 1 0,022561974 3,0105 0,50175
(xi - xmdio) 0,7075 0,5075 0,2075 0,1075 -0,0425 -0,2425
(xi - xmdio)2 0,50055625 0,25755625 0,04305625 0,01155625 0,00180625 0,05880625 0,8733375
(yi-ymdio) 0,723 0,637 0,5375 0,4295 0,3865 0,297
(yi-ymdio)2 0,522729 0,405769 0,28890625 0,18447025 0,14938225 0,088209
y (pH2) 0,39 0,395 0,463 0,478 0,475 0,48
S(x) 0,03671997 0,037640063 0,048448537 0,050522422 0,050114511 0,050792543
6.4
Resultados do ONPG
Depois de registados os resultados obtidos, foram construdos grficos para cada um dos tempos de incubao e para o branco, de modo a obter o declive de cada um deles, permitindo calcular a actividade enzimtica pela equao 8, e conseguindo o grfico da figura 11 do ponto 3.7.. De seguida, seguem-se os referidos grficos, nas figuras de 13 a 18.
37
0.21 0.205 Absorvncia 0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0 5 10 15 20 25 intervalos de tempo ONPG (minutos)
Figura 23: Resultados do ONPG para o tempo de incubao de 120 minutos.
pH1 pH2
1.4 1.2 Absorvncia 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 intervalos de tempo ONPG (minutos)
pH1 pH2
1.6 1.4 1.2 Absorvncia 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 intervalos de tempo ONPG (minutos)
Figura 15:Resultados do ONPG para o tempo de incubao de 360 minutos.
pH1 pH2
38
2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25 intervalos de tempo ONPG (minutos)

Absorvncia
pH1 pH2
3 2.5 Absorvncia 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25 intervalos de tempo ONPG (minutos)

pH1 pH2
0.17 0.169 0.168 0.167 0.166 0.165 0.164 0.163 0.162 0.161 0.16 0 5 10 15 20 25 intervalo de tempo ONPG (minutos)
Figura 18: Resultados do ONPG para o branco.
Absorvncia
39
6.5
Curva de Calibrao do Etanol do HPLC
Esta curva de calibrao, embora construda no trabalho prtico anterior, foi importante para o estudo descrito no ponto 3.4. do presente relatrio.
7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.000 y = 245.2x + 2.0458 R = 0.9962
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
30.000
Figura 19: Curva de calibrao do etanol por HPLC.
6.6
Erros da Curva de Calibrao do Etanol por HPLC
Tal como feito para as outras duas curvas de calibrao deste trabalho prtico, foi necessrio proceder ao estudo dos erros pela equao 9, descritos na tabela 12 para pH1 e 13 para pH2.
40

Tabela 12: Erros do valor x obtido pela curva de calibrao do etanol por HPLC.
Concentrao g/L (xi) 24,832 19,866 14,899 9,933 4,966 2,483 1,242 0,497 0,248 0,000 70,27456 7,027456 245,2 10 1 145,3466055
rea(yi) 6371 4629 3560 2378 1205 572 311 241 116 0 17295 1729,5
(xi - xmdio) 17,805 12,838 7,872 2,905 -2,061 -4,544 -5,786 -6,531 -6,779 -7,027
(xi - xmdio)2 317,001787 164,8179414 61,9643536 8,441023758 4,247951835 20,65026259 33,47612965 42,65155763 45,95668491 49,38513783 640,8333483
(yi-ymdio) 4642 2900 1831 649 -525 -1158 -1419 -1489 -1614 -1730
(yi-ymdio)2 21543522,25 8407100,25 3350730,25 420552,25 275100,25 1339806,25 2012142,25 2215632,25 2603382,25 2991170,25
y (pH1) 31,7 65,9 212 280
S(x) 0,621687 0,621688 0,621689 0,621689
41

Tabela 13: Erros do valor x obtido pela curva de calibaro do etanol por HPLC.
Concentrao g/L (xi) 24,832 19,866 14,899 9,933 4,966 2,483 1,242 0,497 0,248 0,000 70,27456 7,027456 245,2 10 1 145,3466055
rea(yi) 6371 4629 3560 2378 1205 572 311 241 116 0 17295 1729,5
(xi - xmdio) 17,805 12,838 7,872 2,905 -2,061 -4,544 -5,786 -6,531 -6,779 -7,027
(xi - xmdio)2 317,001787 164,8179414 61,9643536 8,441023758 4,247951835 20,65026259 33,47612965 42,65155763 45,95668491 49,38513783 640,8333483
(yi-ymdio) 4642 2900 1831 649 -525 -1158 -1419 -1489 -1614 -1730
(yi-ymdio)2 21543522,25 8407100,25 3350730,25 420552,25 275100,25 1339806,25 2012142,25 2215632,25 2603382,25 2991170,25
y (pH2) 37,9 62,3 171 184
S(x) 0,621687 0,621688 0,621688 0,621689
42

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UNIVERSIDADE DO MINHO

Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus

Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus June 1, 2011

Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus June 1, 2011

Introduo .............................................................................................................................................. 5 Material e procedimento experimental......................................................................................13

Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus June 1, 2011

Produo -galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus June 1, 2011

Figura1. Hidrlise da Lactose em Glucose e Galactose [2]

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Depois de degradada a lactose, a

Figura 2: Fases de crescimento microbiano em cultura descontnua [5]

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rendimentos de substrato em biomassa e em produto atravs da Equao 3 e da

Equao 3: Equao para o clculo do rendimento de substrato em biomassa. [7]

Equao 4: Equao para o clculo do rendimento de substrato em produto (etanol). [7]

Equao 6: Equao para o clculo do rendimento de produto (etanol) em biomassa . [7]

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Figura 3. Representao das reaces envolvidas no mtodo de DNS [8]

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Figura 4: Esquema da constituio do invlucro celular de uma levedura [11]

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A actividade pode ser calculada assim da seguinte maneira [11]:

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Equao 9: Clculo da actividade enzimtica atravs do mtodo ONPG.

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2. Material e procedimento experimental

2.1 Preparao do inoculo [12] [13]

Fazer a pr-inoculao 24h antes da inoculao (1 mL).

2.3. Processo de fermentao [13] [14]

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2.4 Calibrao da biomassa por peso seco [15]

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2.5. Quantificao de produo de metabolitos (HPLC) [15]

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Quantificao de substrato consumido (DNS) [15]

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2.7 Ruptura da clula

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Quantificao de protena total (mtodo de Bradford) [11]

2.9 Determinao da actividade da beta-galactosidade [11]

Reagente de paragem Espectofotmetro Amostra de beta-galactosidade extraida

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3 Apresentao e Discusso de resultados

A diminuio do pH um dos factores que levam a que a taxa de morte

Figura 6: Variao de pH ao longo do tempo de incubao para os dois meios inoculados.

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Figura 7: Curva de crescimento celular, em sistema fechado e descontnuo.

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Tabela 2: Taxa especifica de crescimento e tempo de duplicao para o pH1.

(min) 0,0086 pH1 tempo duplicao (min) 80,59581

Tabela 3: Taxa especifica de crescimento e tempo de duplicao para o pH2-

(min) 0,0078 pH2 tempo duplicao (min) 88,86502

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Considerando ruptura celular, mesmo

Equao da curva de calibrao da lactose:

y = (0,2054 0,388994129)x (0,0186 0,177508185)

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Figura 8: Concentrao de lactose, em funo do tempo, para os meios de diferente pH.

YP/S pH1 pH2 0,02006142 0,01305376

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YX/P pH1 pH2 0,66059408 0,87232507