Tcnica de Gram

Procedimento
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Com uma ala de platina, retirar uma alquota da placa e confeccionar o esfregao; Corar com o corante cristal violeta por 60 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Descorar com lcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Corar com safranina por 60 segundos Lavar com gua destilada, secar e observar ao microscpio.

Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) cor de rosa As caractersticas estruturais da parede bacteriana esto na base da tcnica de Gram que funciona da seguinte forma. O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolvel em gua, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano maior em bactrias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e so coradas pelo vermelho de safranina.

Mtodo da Catalase
A produo de catlase pode ser determinada adicionando uma poro de bactrias, previamente colocadas numa lmina, umas gotas de perxido de hidrognio. Se a bactria produzir esta enzima (catlase positiva) ocorre o desdobramento do perxido de hidrognio com libertao imediata de bolhas de gs (oxignio); a ausncia deste borbulhar uma prova negativa.

Tcnica de Ziehl-Neelsen (BAAR)

H bactrias que so resistentes colorao, mas que uma vez coradas vo resistir fortemente descolorao, mesmo por cidos fortes diludos e lcool absoluto. s bactrias que possuem esta propriedade dizemos que so cidolcool resistentes (gneros Mycobacterium e Nocardia). Esta caracterstica devida ao elevado teor de lpidos estruturais (ex. cido miclico) na parede celular destas bactrias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ao dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos. A tcnica de ZiehlNeelsen evidencia esta cido-lcool resistncia. Segue o seguinte protocolo: 1. Confeccionar o esfregao seguindo as tcnicas atuais de biossegurana; 2. Cobrir a lmina com fucsina fenicada (o mordente o cido fnico); 3. Aquecer a lmina at emisso de vapores ( importante no deixar ferver); 4. Aguardar 5 a 8 minutos; 5. Lavar com gua corrente; 6. Cobrir a lmina com lcool-cido 3% at descorar totalmente o esfregao; 7. Lavar com gua corrente; 8. Cobrir a lmina com azul de metileno durante 1 minuto; 9. Lavar com gua corrente; 10.Secar; 11.Observar. A fucsina fenicada, atuando a quente, vai corar todas as clulas bacterianas e outras estruturas presentes no esfregao de vermelho (o calor vai derreter os lpidos de membrana, tornando-a permevel). O cido diludo em lcool aplicados vo descorar todas as bactrias exceto as cidolcool resistentes, que permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas aps colorao e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactrias: cido-lcool resistentes: coradas de vermelho. No cido-lcool resistentes: coradas de azul.