DISSERTAO

MAPEAMENTO GENTICO E DETECO DE QTLs EM UM CRUZAMENTO DE LIMO CRAVO E CITRUMELO SWINGLE

LAURA MACHADO DE FARIA

Campinas, SP 2007

INSTITUTO AGRONMICO CURSO DE PS-GRADUAO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL

MAPEAMENTO GENTICO E DETECO DE QTLs EM UM CRUZAMENTO DE LIMO CRAVO E CITRUMELO SWINGLE LAURA MACHADO DE FARIA

Orientador: Dr. Marcos Antnio Machado Co-orientadora: Dra. Maringela Cristofani-Yaly

Dissertao submetida como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical rea de Concentrao em Melhoramento Gentico Vegetal

Campinas, SP Abril 2007

Ficha elaborada pela bibliotecria do Ncleo de Informao e documentao do Instituto Agronmico F224m Faria, Laura Machado de Mapeamento gentico e deteco e QTLs em um cruzamento de limo Cravo e citrumelo Swingle / Laura Machado de Faria. Campinas, 2007 93 fls Orientador: Dr. Marcos Antnio Machado Co-orientadora: Dra. Maringela Cristofani-Yaly Dissertao - Mestrado em Agricultura Tropical e Subtropical Instituto Agronmico 1. Limo cravo - vrus da tristeza 2. Citros - padro foliar 3. TRAP I. Machado, Marcos Antnio II. Cristofani-Yaly, Maringela III. Campinas. Instituto Agronmico IV. Ttulo CDD. 634.33

 minha me Maria, por me possibilitar, com apoio e amor... concluir este trabalho, DEDICO

Aos alunos; jovens pesquisadores que creditam na pesquisa um amanh melhor, OFEREO iii

AGRADECIMENTOS

Ao pesquisador e orientador Dr. Marcos Antnio Machado pela oportunidade de orientao e crescimento adquiridos com seu nvel de exigncia e estmulo frente aos desafios surgidos;

pesquisadora e co-orientadora Dra. Maringela Cristofani-Yali pelo seu apoio e ensinamentos que foram constantes e igualmente importantes para este trabalho;

pesquisadora Dra. Marins Bastianel por sua importante contribuio nas anlises estatsticas;

Aos pesquisadores Drs. Luis Eduardo Aranha Camargo e Maria Imaculada Zucchi pelas observaes enriquecedoras dissertao como membros examinadores;

Ao meu av pelas canes inspiradas que tocamos e cantamos juntos, s minhas vozinhas pela amizade e histrias que impulsionaram meus sonhos e minhas esperanas;

Lu Faldoni pela divertida companhia e auxlio pontual no desenvolvimento das etapas finais experimentais deste trabalho;

Aos colegas de laboratrio Carol, Fernanda, Flavia, Francineide, Juliana, Keli, Mariana, Marcelo, Paulo, Rafael, Raquel, Thiago e Vandeclei pelos momentos de conhecimentos compartilhados e pela amizade;

s colegas Dras. Andra e Andria e ao Dr. Berghem, pelas discusses cientficas e prazerosa convivncia, principalmente na etapa de finalizao do mestrado;

toda a equipe de pesquisadores, aos funcionrios da administrao e colegas do Centro APTA Citros Sylvio Moreira e aos colegas da PG-IAC pelas preciosas colaboraes e amizade no decorrer do curso;

Ao IAC e ao Centro APTA Citros Sylvio Moreira pela oportunidade oferecida de grande aprendizado;

Ao CNPq pela bolsa de fomento pesquisa concedida. iv

SUMRIO

NDICE DE TABELAS........................................................................................... vi NDICE DE FIGURAS............................................................................................ vii LISTA DE ANEXOS............................................................................................... viii RESUMO................................................................................................................. ix ABSTRACT............................................................................................................. x 1 INTRODUO.................................................................................................... 01 2 REVISO DE LITERATURA............................................................................. 06 2.1 Citricultura no Brasil.......................................................................................... 06 2.2 Gentica e Melhoramento de Citros................................................................... 08 2.3 Mapas Genticos................................................................................................ 14 2.4 Mapeamento Gentico de Citros........................................................................ 21 2.5 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 24 2.6 Padro Foliar, Enraizamento e CTV.................................................................. 26 3 MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 29 3.1 Material Gentico............................................................................................... 29 3.2 Extrao do DNA Total..................................................................................... 29 3.3 Marcadores RAPD............................................................................................. 30 3.4 Marcadores Microssatlites................................................................................ 31 3.5 Marcadores TRAPs (Target Region Amplification Polymorphism).. 32 3.6 Avaliao de Caractersticas Morfolgicas........................................................ 34 3.6.1 Morfologia foliar............................................................................................. 34 3.6.2 Capacidade de enraizamento de estacas.......................................................... 34 3.7 Avaliao de Resistncia ao CTV...................................................................... 34 3.8 Anlise Estatstica dos Dados Morfolgicos..................................................... 36 3.9 Construo dos Mapas de Ligao..................................................................... 37 3.10 Identificao de QTLs...................................................................................... 37 4 RESULTADOS E DISCUSSO.......................................................................... 38 4.1 Caracterizao Morfolgica dos Hbridos......................................................... 42 4.1.1 Padro foliar.................................................................................................... 42 4.1.2 Enraizamento de estacas................................................................................. 44 4.2 Avaliao de Resistncia ao CTV...................................................................... 45 4.3 Mapas de Ligao.............................................................................................. 48 4.3.1 Marcadores moleculares................................................................................. 49 4.3.2 Anlise de ligao........................................................................................... 54 4.4 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 62 5 CONCLUSES.................................................................................................... 67 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................. 68 7 ANEXOS.............................................................................................................. 87

NDICE DE TABELAS

Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 -

Cdigos utilizados para os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators)*............................................ Seqncias dos primers fixos e arbitrrios utilizados para os marcadores TRAPs.................................................................... Resultados mdios obtidos da mensurao das variveis CTV, Enraizamento (E), ndice de morfologia foliar (IF) e tipo de folha em trs plantas de 94 hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle e genitores................................................ Estimativa de parmetros genticos obtidos para as caractersticas nmero mdio de estacas enraizadas, absorbncia (CTV) e ndice de morfologia foliar em uma prognie de 94 indivduos do cruzamento entre limo Cravo vs citrumelo Swingle.............................................................. Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centiMorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de citrumelo Swingle................................................................................... Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centiMorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de limo Cravo....... Detalhes dos QTLs detectados nos grupos de ligao de citrumelo Swingle, pelo mtodo Multiple QTL Maping (MQM) associados s caractersticas estudadas........................

32 33

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Tabela 4 -

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Tabela 5 -

55 55

Tabela 6 Tabela 7 -

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NDICE DE FIGURAS

Figura 1 -

Ilustrao de como os hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle e os genitores foram inoculados com material de laranja Pra infectada com CTV estirpe Baro B............................................................................................... Padro de fololos e folhas em hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle. (G= limo Cravo, H= hbridos, I= citrumelo Swingle)................................................................... Padro de enraizamento de estacas de limo Cravo (A), citrumelo Swingle (C) e hbrido (B).............................................................................................. Teste de primers RAPD (I07 e I10) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8)........................................................................... Teste de primers TRAPs para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7)................................................................................................. Teste de primers SSR (CCSME9) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5 e 6)................................................................................... Mapa de ligao de citrumelo Swingle com 77 marcadores (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) em 8 grupos de ligao........... Mapa de ligao de limo Cravo com 33 marcadores (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) em 7 grupos de ligao................... Grupos de ligao de citrumelo Swingle (A) e limo Cravo (B) mostrando marcadores SSR em comum.............................. Marcador SSR (CCSM19) segregando na proporo 1:2:1. LC = limo Cravo, CS = citrumelo Swingle, 1 a 18 hbridos e M = Marcador de peso molecular Ladder 1 Kb Plus............................................................................................. QTLs associados morfologia foliar (A), resistncia a CTV (B) e enraizamento de estacas (C e D) em mapas de ligao de citrumelo Swingle. * Porcentagem de variao fenotpica que cada QTL pode explicar.......................................................

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Figura 2 -

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Figura 3 -

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Figura 4 -

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Figura 5 -

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Figura 6 -

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Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 -

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Figura 11 -

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LISTA DE ANEXOS

Anexo I -

Distribuio de mdias para as variveis: nmero de estacas enraizadas, absorbncia em ELISA (CTV) e ndice de morfologia foliar mensuradas em 94 hbridos........................... Anlise de varincia para CTV, enraizamento e morfologia foliar, referentes avaliao de uma populao de hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle em experimento completamente casualizado em casa de vegetao (Aplicativo: SASM-Agri, Cantieri et al. 2001)......................... Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana................................................................................ Marcadores Microssatlites obtidos a partir de bibliotecas genmicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetio, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana...................... Marcadores TRAPs, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana................................................................................

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Anexo II -

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Anexo III Anexo IV -

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Anexo V -

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FARIA, Laura Machado de. Mapeamento gentico e deteco de QTLs em um cruzamento de limo Cravo e citrumelo Swingle. 2007. 93f. Dissertao (Mestrado em Agricultura Tropical e Sub-Tropical) Ps-Graduao IAC. RESUMO A presena de inmeros fitopatgenos, entre outros desafios presentes, de natureza gentica e botnica, limitam o melhoramento gentico dos citros por mtodos convencionais. A poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade dificultam grande parte das estratgias empregadas, principalmente aquelas como a hibridao sexual. O objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de mapas de ligao de limo Cravo (C. limonia) e citrumelo Swingle (C. paradisi x P. trifoliata), com vistas ao estudo da herana do vrus da tristeza dos citros (CTV). Ao mapa foram includas ainda caractersticas contrastantes como padro foliar e capacidade de enraizamento de estacas. A estratgia pseudo-testcross foi utilizada para a construo de mapas genticos de ligao, utilizando marcadores moleculares RAPD, SSR e TRAP. Foram genotipados 94 hbridos para constituir a populao de mapeamento. Para tanto, os marcadores foram integrados aos mapas de ligao utilizando o programa JoinMap v 3.0, enquanto que para a deteco e mapeamento de QTLs foram realizadas anlises por meio do programa MapQTL v. 4.0. O nmero mdio de marcadores obtidos por par de primers TRAPs (7,75) foi quase quatro vezes maior que o nmero de marcadores por primer RAPD (2,14). Foi observada a possibilidade de que dois genes complementares e dominantes possam estar envolvidos na caracterstica folha trilobada, sendo cada espcie heterozigtica para um deles. Porcentagens de enraizamento de 70% foram encontradas para citrumelo Swingle, 60% para limo Cravo e de 0 a 90% para os hbridos. Em CTV foi encontrado um controle gentico monognico, com proporo 1:1. As anlises pelo mtodo de Multiple QTL Mapping (MQM) detectaram a presena de um QTL para resistncia a CTV no grupo de ligao 6 (GL 6 - explicando 95,1% da variao fenotpica), um para morfologia foliar (GL 4 - 76,1%) e dois QTLs para a caracterstica enraizamento de estacas (GL 3 e 6 - 50,8% e 37,8%, respectivamente). Embora os genitores possuam gentipos bastante diferentes, a sintenia entre eles foi observada em alguns grupos de ligao. Palavras-chave: vrus da tristeza dos citros, padro foliar, TRAP

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FARIA, Laura Machado de. "Genetic mapping and detection of the QTLs in the crossing of Rangpur lime and Swingle citrumelo". 2007. 93f. Dissertao (Mestrado em Agricultura Tropical e Sub-Tropical) - Ps-Graduao - IAC. ABSTRACT Countless and different phytopathogens among other challenges of genetic and botanical nature, limit conventional approaches for citrus breeding. Poliembryony, sexual incompatibility and long juvenility hinder in a considerable amount of the adopted strategies, mainly the approaches based on sexual hybridization. The main objective of this was to development linkage maps of Rangpur lime (C .limonia) and the Swingle citrumelo (C .paradisi x P. trifoliata), aiming to evaluate the inheritance to citrus tristeza virus (CTV). Contrastive characteristics were included on the map, like the foliar pattern and the rooting capacity of cuttings. The pseudo-testcross strategy was used to build the genetic linkage maps, with RAPD, SSR and TRAP markers. 94 hybrids were genotyped in the map population. In order to achieve that, the markers were integrated to the linkage maps using the software JoinMap v3.0, whereas the software MapQTL v4.0 was used for the detection and mapping of the QTLs. The mean number of markers obtained by pair of primers TRAPs (7.75) was almost four times greater than the number of markers per primer RAPD (2.14). Two complementary and dominant genes seem to be involved in the trifoliate leave characteristic, considering that each species is heterozygote for one of them. Rooting capacities of 70% were obtained for the Swingle citrumelo, 60% for Rangpur lime and from 0 to 90% for hybrids. In CVT, a monogenic genetic control was found, in a 1:1 ratio. The analysis by the Multiple QTL Mapping (MQM) method detected the presence of a QTL for CTV resistance on linkage group 6 (GL 6 - explaining 95,1%
of the phenotypic variation),

one for foliar morphology on linkage group 4 (GL 4 -

76,1%) and two QTLs for rooting of cuttings on the linkage groups 3 and 6 (GL 3 and 6 50,8% e 37,8%, respectively). Although the parents are quite different genotype, sinteny between them was also observed in some linkage groups. Key words: citrus tristeza virus - foliar pattern TRAP

1 INTRODUO

A indstria citrcola uma das principais atividades do agronegcio brasileiro, sendo o suco concentrado congelado sua principal commodity para exportao. O Brasil lidera as exportaes mundiais de suco concentrado de laranja e de sua produo, com participao acima de 70% e de 29% do mercado internacional, respectivamente. Internamente valores expressivos tambm so alcanados, visto que a laranja representa 49% de toda a produo de frutas do pas (NEVES & LOPES, 2005). Com uma rea cultivada em torno de 600 mil hectares e produo de 352 milhes de caixas de 40,8 kg/planta/ano, o setor citrcola conta com uma cadeia altamente organizada desde viveiros at a indstria exportadora e mantm-se h anos na liderana mundial (IEA, 2007). A exportao de suco de laranja concentrado e sub-produtos (pectina, pellet para rao, leos, etc.) movimentam algo prximo de 1,5 bilhes de dlares anuais (OLIVEIRA et al., 2005). importante destacar que o aumento da produo nos ltimos anos explica-se, essencialmente, por um acrscimo de reas de plantio. As condies edafoclimticas tm favorecido a cultura dos citros em vrias regies do Brasil, entretanto, a produtividade mdia ainda muito baixa, quando comparada com outras importantes regies produtoras, como a Flrida, que alcana uma mdia de 6,0 caixas/planta/ano com intensivo uso de irrigao, diferentemente da produo mdia brasileira de 2,0 caixas/planta/ano. Nestes moldes, pode-se afirmar que a baixa produtividade brasileira, associada ausncia de irrigao, deve-se em grande parte a fatores de ordem fitossanitria e s estratgias de manejo do pomar e ps-colheita dos frutos (MACHADO et al., 2005). No entanto, doenas e pragas so os principais fatores limitantes da agroindstria citrcola brasileira, representando mais de 60% do custo de produo. A conseqente vulnerabilidade dos citros a pragas e doenas decorre de uma estreita base gentica ocasionada pela adoo de um sistema de produo considerado monocultural, em que um nmero reduzido de variedades cultivado em grandes extenses. importante salientar que, apesar de o gnero Citrus apresentar uma grande diversidade de espcies, apenas um pequeno nmero

utilizado comercialmente. Como exemplos dos diferentes fitopatgenos de citros que trouxeram graves problemas ao Brasil no sculo XX, podem ser citados o vrus da tristeza dos citros (CTV) e a leprose nos anos 40, o cancro ctrico nos anos 50, o declnio nos anos 70, a clorose variegada dos citros e a pinta preta nos anos 90 (ROSSETTI et al., 1990) e, mais recentemente, a morte sbita dos citros (MSC) e o huanglongbing (HLB) (ex-greening) (GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MLLER et al., 2001; COLETTA-Filho et al., 2004). Uma alternativa racional frente ao usual controle qumico dessas doenas ou de seus vetores a obteno de gentipos com maior resistncia a esses principais patgenos (CRISTOFANI et al., 1999). Sendo assim, os programas de melhoramento gentico e seleo dos citros focam a obteno de novos portaenxertos e variedades copa que sejam resistentes s doenas e pragas, e mais adaptados a condies abiticas adversas. Frente a este cenrio, o melhoramento de citros tem se destacado nas ltimas dcadas, principalmente devido possibilidade de utilizao e incorporao de ferramentas de biotecnologia aos programas tradicionais de melhoramento. Nesse aspecto, a utilizao de marcadores moleculares para a seleo precoce de plantas de origem sexual, oriundas de cruzamentos dirigidos, possibilitou a seleo de um nmero elevado de novas combinaes e, consequentemente, o estabelecimento de um maior nmero de populaes hbridas em condies de campo para seleo de novas variedades e caractersticas agronmicas desejveis. Entretanto, segundo NOVELLI et al. (2006), ROOSE (2003) e CRISTOFANI et al. (2000) algumas limitaes fazem das espcies do gnero Citrus, um desafio para os estudos genticos, especialmente, sua alta heterozigosidade gentica, longo tempo de gerao necessrio para a seleo, recombinao e poliembrionia nucelar adventcia. Podem aparecer, em citros, cerca de trs a doze embries apomticos formados a partir de clulas da nucela. O grau da embrionia nucelar varia entre os porta-enxertos de 100 para menos de 50%. Entretanto, alguns tipos de citros so monoembrinicos, produzindo somente plntulas zigticas (QUEIROZ-VOLTAN & BLUMER, 2005). Embora os desafios na obteno de prognies no cruzamento dentro do gnero Citrus e entre gneros prximos sejam considerveis, existem vrias fontes de resistncia a fatores biticos e abiticos que podem ser potencializadas na 2

obteno de indivduos com caractersticas agronmicas desejveis (MESTRE et al., 1997a). Essa abordagem particularmente importante quando a ela se agregam ferramentas, auxiliando na seleo de indivduos zigticos, na obteno de marcadores, no mapeamento gentico, culminando com a seleo assistida por marcadores, uma etapa ainda em processo de incorporao aos programas de melhoramento de citros. Em se tratando de uma abordagem metodolgica, uma das formas mais eficientes de associar caractersticas fenotpicas com caractersticas genticas por meio de mapas genticos de ligao, no qual essas caractersticas so ordenadas sequencialmente correspondendo de modo aproximado posio dos genes nos cromossomos (ROOSE, 2003). Mapas de ligao tm contribudo de maneira significativa para programas de melhoramento e pesquisa gentica, sendo uma das mais eficientes estratgias para conduo de estudos genticos avanados facilitando a seleo de plantas, o entendimento da herana, estrutura e organizao do genoma. Os citros possuem caractersticas favorveis que auxiliam a construo de mapas genticos. Eles so espcies predominantemente diplides (2n = 18), possuem um genoma pequeno, bom nvel de polimorfismo entre espcies e vrias espcies produzem hbridos frteis (OLIVEIRA et al., 2005). Diferentes marcadores tm sido usados no desenvolvimento de mapas de ligao em vrias populaes de citros. Marcadores dominantes como RAPD random amplified polymorphic DNA (WILLIAMS et al.,1990) e AFLP amplified fragment lenght polymorphism (VOS et al.,1995) so os mais usados, embora apresentem especificidade de populao e sejam mais difceis de serem aplicados em outras populaes por serem biallicos. Marcadores AFLP so capazes de acessar vrios pontos de polimorfismo, com 10 a 20 bandas polimrficas em um nico gel (ROOSE, 2003). Os TRAPs - target region amplification polymorphism (HU & VICK, 2003) so outra classe de marcadores que utilizam primers mais longos que RAPD, melhorando significativamente a reprodutibilidade. Tais marcadores facilitam o desenvolvimento de mapas densos que so efetivos para localizao de caractersticas quantitativas (QTL,quantitative trait loci). A estratgia de mapeamento prioriza o desenvolvimento de um mapa detalhado usando marcadores dominantes de alta resoluo, mas suplementado com marcadores co-dominantes que podem ser mapeados em muitas populaes. Marcadores co-dominantes como SSR - simple 3

sequence repeats (LITT & LUTTY, 1989), so polimrficos e transferveis entre espcies/variedades e, portanto, mais apropriados para o uso como ncoras para interligar mapas desenvolvidos em diferentes populaes. Neste contexto, marcadores moleculares, especialmente marcadores baseados em PCR, como TRAP (HU & VICK, 2003), AFLP (VOS et al., 1995) e SSR (LITT & LUTTY, 1989), abrem a possibilidade de construo de mapas genticos de modo mais rpido. O desenvolvimento de mapas de ligao de alta resoluo um pr-requisito para se isolar genes usando estratgias de clonagem baseada em mapas (SCHWARZ, et al., 2000). O uso de marcadores ancorados em seqncias repetidas, os denominados microssatlites (SSR), permite a integrao e seleo assistida por marcadores em um amplo espectro de populaes. Um mapa de referncia com marcadores multiallicos co-dominantes fornece a possibilidade de ligar os mapas dos dois genitores envolvidos e permite mapeamento comparativo (BARKLEY, et al., 2006; ROOSE, 2003; CRISTOFANI, et al., 2000). Nos ltimos 12 anos cerca de 20 mapas genticos foram desenvolvidos para citros. Como exemplos; C. grandis (LURO et al., 1996), C. aurantium, C. latipies (SIMONE et al., 1998), C. volkameriana, C. sunki e Poncirus trifoliata (CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2004b). Todavia, apesar de diferentes grupos de pesquisa no mundo estarem engajados neste processo, tem sido bastante difcil correlacionar e integrar os grupos de ligao identificados nesses mapas devido ao pequeno nmero de marcadores em comum (RUIZ & ASNS, 2003). Em outros casos, um mapa consenso foi obtido para os dois genitores sem levar em considerao a possvel reorganizao cromossmica que deve ter acontecido durante a evoluo da famlia Aurantioideae. Esses mapas possibilitaram o mapeamento do gene de resistncia tristeza e caractersticas como nanismo, acidez do fruto, resistncia a Tylenchulus semipenetrans Cobb, nmero de sementes, apomixia, resistncia a salinidade, macho esterilidade e resistncia gomose causada por Phytophythora (CAI et al., 1994; CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al., 2000; SIVIERO et al., 2001; SIVIERO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005). Caractersticas estas que sero teis em estratgias de seleo assistida por 4

marcadores na conduo de estudos avanos em melhoramento de citros; ainda em fase de implementao. A maior parte dos mapas reportados relaciona-se com estudos de herana da resistncia a doenas, muitas delas com herana simples (genes de resistncia ou R), outras polignicas (quantitative resistance locus ou QRL). A estratgia de BSA (Bulked Segregant Analysis) descrita por MICHELMORE et al. (1991) foi utilizada em alguns desses mapas. Recentemente, com o aparecimento da morte sbita dos citros (MSC) (GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MLLER et a1., 2001), detectou-se a necessidade de obteno de novas combinaes de porta-enxerto que pudessem ser utilizados como uma alternativa ao limo Cravo e que possibilitassem estudos sobre a herana a essa anomalia. Considerando que a morte sbita dos citros uma doena de combinao entre copa e porta-enxerto (limo Cravo e limo Volkameriano), ela altamente preocupante uma vez que o limo Cravo responde por mais 85% dos porta-enxertos no Estado de So Paulo. Portanto, existe grande interesse no desenvolvimento de novos porta-enxertos. Nesse sentido, importante o desenvolvimento de novos hbridos com caractersticas favorveis presentes em genitores contrastantes. Seguindo este raciocnio, seria de grande interesse um porta-enxerto hbrido, com grande nmero de sementes poliembrinicas por fruto, rstico, de induo de produo precoce, com boa tolerncia ao estresse hdrico, que confira boa qualidade aos frutos e produo copa. Todas essas caractersticas esto presentes no limo Cravo e, algumas delas, no citrumelo Swingle (MULLER et al., 2001). Com o surgimento e expanso da MSC, um dos principais objetivos da pesquisa com porta-enxertos passou a ser o desenvolvimento de porta-enxertos que possam substituir o limo Cravo, porm sem perder significativas qualidades dessa espcie, principalmente a tolerncia seca. A hiptese principal desse trabalho que existe suficiente variabilidade gentica dentro dos gentipos dos genitores que permita mapeamento e produo de novos hbridos com tolerncia morte sbita. Uma vez que a avaliao de morte sbita exige experimentao de campo acima de cinco anos, foi feita a avaliao preliminar da tolerncia ao vrus da tristeza, com um dos candidatos associados ao desenvolvimento da doena. Como o patgeno da MSC possui etiologia incerta, trabalha-se com a possibilidade de uma associao do patgeno da MSC com o de CTV. Alm do fato de ambas as doenas serem de combinao copa e porta5

enxerto. Esse projeto faz parte do Programa de Melhoramento de Porta-Enxertos do Centro APTA Citros Sylvio Moreira do IAC. Portanto, o objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de mapas genticos de ligao de limo Cravo e citrumelo Swingle, com vistas ao estudo da herana da resistncia ao vrus da tristeza dos citros e de caractersticas contrastantes como padro foliar e capacidade de enraizamento de estacas. Para tanto, foi utilizada uma populao de mapeamento de hbridos, utilizando-se a estratgia de pseudo-testcross com locos marcadores RAPD, SSR e TRAP. 2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Citricultura no Brasil A citricultura brasileira apresenta nmeros expressivos que traduzem a grande importncia econmica e social que a atividade gera para a economia do pas. Segundo AZEVEDO (2003), a rea plantada prxima a 600 mil hectares, enquanto que no ano de 2006, somente o Estado de So Paulo produziu cerca de 352 milhes de caixas de 40,8 kg, superando 14 milhes de toneladas anuais (IEA, 2007). O parque citrcola no Brasil se iniciou no sculo XX, com citricultores iniciando o plantio de citros em larga escala, quando estimulados pela crise do caf no final da dcada de 1920. Desde o incio da sua fase comercial, a citricultura concentrada, at ento, em So Paulo e Rio de Janeiro, j era planejada para atender ao mercado externo. Estatisticamente, em 1920, o Brasil j era considerado o quinto maior produtor mundial de citros (BOTEON & NEVES, 2005). Mas, somente a partir dos anos 30 do sculo passado, segundo AZEVEDO (2003), a citricultura comeou a ser implantada comercialmente nos Estados de So Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Entre 1940 e 1960, aps uma sucesso de fatos, como a decadncia do caf nos anos 20, a Segunda Guerra Mundial em 1939, disseminao de doenas, como a tristeza na dcada de 40, cancro ctrico em meados dos anos cinqenta, e conseqente baixo incentivo aos produtores, houve um declnio da citricultura no pas, como apontam BOTEON & NEVES (2005). Em meados da dcada de 1960, o parque citrcola retoma o crescimento. Os primeiros investimentos visando industrializao da laranja no Brasil foram 6

incentivados pela queda da produo norte-americana, devido geada que, em dezembro de 1962, destruiu cerca de 16 milhes de laranjeiras na Flrida (AMARO et al., 2005). Impulsionado por uma srie de outros fatos como incentivos fiscais, condies naturais do Brasil, o parque citrcola mudou seu foco comercial de fruta fresca para indstria processadora. Em desenvolvimento, a partir da dcada de 1980, o Brasil se consolida como o maior produtor mundial de suco de laranja. Desde o processo de industrializao at o momento, o foco principal da citricultura paulista tem sido a produo de suco destinado ao mercado externo (ABECITRUS, 2001; BOTEON & NEVES, 2005). Atualmente, um custo de produo competitivo aliado a um parque industrial atuante em escala global so pontos fortes da citricultura brasileira. Por outro lado, o ponto fraco encontra-se no aparecimento de severas doenas nos pomares, tanto para variedades copa como porta-enxerto. Nas ltimas dcadas, o aparecimento de doenas como a tristeza dos citros (CTV) na dcada de 40 (MOREIRA & MOREIRA, 1991) e a clorose variegada dos citros (CVC) na dcada de 90 (ROSSETI et al., 1990), comprometeu o custo e a oferta futura. Entretanto, o aparecimento das novas doenas neste incio de milnio, como morte sbita dos citros (MSC), (GIMENES & BASSANEZI, 2001; MULLER et al., 2001) e huanglongbing (ex-greening) (COLETTA-Filho et al., 2004), um risco econmico muito presente no setor e pode comprometer a produtividade brasileira no futuro. Enquanto isso, segundo AMARO et al. (2005) e BOTEON & NEVES (2005), o aumento do consumo, a reduo das barreiras tarifrias e fitossanitrias, investimentos em qualidade da fruta fresca, modernizao da sua estrutura de beneficiamento e comercializao, produo a custos competitivos, investimentos em diversidades de sucos de laranja e slida retaguarda de pesquisa, so estratgias a se considerar mantenedoras da estrutura citrcola nacional rentvel. No ano de 2004, o seqenciamento gentico, funcional e comparativo dos citros foi concludo e assim foi possvel saber quais so e onde esto localizados os genes responsveis pela resistncia s principais doenas da laranja, assim como quais so os genes existentes nos vrus, virides, bactrias e fungos que provocam as doenas (CARLOS et al., 2007). Com isso se torna possvel disponibilizar no mercado variedades de laranjas resistentes a um ou dois patgenos, gerando economia cadeia citrcola, principalmente levando-se em conta que as doenas 7

o principal fator limitante da citricultura brasileira, representando mais de 60% do custo de produo, segundo MACHADO et al. (2005). A citricultura brasileira detm o maior banco de informaes sobre citros no mundo, com cerca de 300 mil seqncias de genes como discorre AMARAL et al. (2007). Colocando o Brasil tambm na liderana mundial nas pesquisas cientficas do setor, como exemplos o seqenciamento e mapeamento gentico j realizados de Poncirus trifoliata e de pelo menos seis espcies do gnero Citrus (AMARAL et al., 2007). Avaliando o agronegcio citrcola brasileiro, por trs de todo o caminho que percorre a produo da fruta at chegar s mos dos consumidores, h uma cadeia que gera empregos, pesquisa, movimenta economias locais e gera conhecimento global (BOTEON & NEVES, 2005). 2.2 Gentica e Melhoramento de Citros Estima-se que Citrus e gneros correlatos se originaram entre 20 a 30 milhes de anos atrs, nas regies tropical e subtropical da sia e do arquiplago Malaio, de onde se dispersaram para outras regies do mundo. Em se tratando dos sistemas de classificao existentes, o mais utilizado foi o proposto por SWINGLE (1943), que reconheceu 16 espcies verdadeiras de citros e as classificou entre os seis gneros que compunham o grupo subtribal denominado "rvores de citros verdadeiros" (true citrus fruit trees), subtribo Citrinae, tribo Citreae, subfamlia Aurantioideae da famlia Rutaceae (SWINGLE & REECE, 1967). O nmero de cromossomos dos representantes desse gnero foi corretamente estabelecido pela primeira vez por FROST (1925) como n = 9. Assim, segundo GUERRA et al. (2000), a subfamlia Aurantioideae pode ser caracterizada pela dominncia de diplides, sendo que de suas 60 espcies estudadas at ento, a grande maioria 2n = 2x = 18 e, ocasionalmente, ocorrem autopoliplides intra-especficos (3x e 4x). Poliplides comprovadamente estabilizados so raramente encontrados. A estabilidade do caritipo em Aurantioidea est aparentemente ligada alta capacidade de hibridao interespecfica (GUERRA et al., 1997, 2000). Em relao ao sistema de classificao sistemtica, esse grupo de plantas apresenta grande complexidade. A taxonomia da subfamlia Aurantioideae foi marcada pela proposio de novos gneros, segregados de Citrus, como Poncirus, 8

Fortunella e Microcitrus. No entanto, no h fortes evidncias morfolgicas para a manuteno desses gneros, uma vez que caracteres diagnsticos de um deles podem ser encontrados em outros representantes do referido grupo. Seus representantes apresentam grande compatibilidade sexual, o que possibilitou a origem natural de hbridos intergenricos e interespecficos ao longo do processo de evoluo do grupo (ARAJO & ROQUE, 2005). As espcies do gnero Citrus reproduzem-se sexuadamente por autopolinizao e polinizao cruzada, assexuadamente por apomixia nucelar adventcia e agronomicamente por propagao vegetativa. Suas sementes possuem tanto embries zigticos, como apomticos, apresentando, em geral, apomixia facultativa, com nmero varivel de embries entre um a doze. Algumas espcies so monoembrinicas e no aproveitadas como porta-enxertos em funo da alta variabilidade na prognie, conduzindo o plantio com baixa uniformidade. Os mtodos de seleo de embries zigticos e nucelares podem se basear em caractersticas morfolgicas (TEICH & SPIEGEL-ROY, 1972), qumicas e bioqumicas (FURR & REECE, 1946; PIERINGER & EDWARDS, 1967; TATUM et al., 1974; TORRES et al., 1978; ANDERSON et al., 1991) ou moleculares (BASTIANEL et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2002, 2003). Espcies do gnero Citrus e outras de gneros correlacionados como Poncirus e Fortunella apresentam compatibilidade gentica, produzindo hbridos frteis de interesse para o melhoramento. Exemplos tpicos dessa compatibilidade sexual so os hbridos do gnero Citrus com P. trifoliata. Aps as devastadoras geadas ocorridas na Flrida em 1894-1895, pesquisadores do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos iniciaram, em 1897, um programa de produo de cultivares copas resistentes ao frio mediante a hibridao de trifoliata com cultivares de citros. Desse trabalho, surgiram dezenas de hbridos citranges, citrumelos, citrandarinas, citradias, citremons e citrumquats alguns dos quais vieram a se tornar porta-enxertos comerciais em diversos pases, inclusive no Brasil (BOTEON et al., 2005). Aps hibridao com Poncirus, os descendentes denominados citranges, citrandarins, citrumelos, entre outros, apresentam folhas trifoliadas, que uma caracterstica morfolgica governada por um gene dominante, que determina essa caracterstica quando em homozigose e heterozigose. Contudo, vale ressaltar, que o uso de Poncirus como um dos genitores em programas vai muito alm de sua 9

marcante morfologia de folha trilobada, haja visto que esse gnero apresenta inmeras caractersticas agronmicas importantes, como resistncia a doenas e melhor qualidade de fruta na variedade copa enxertada sobre ele. O citrumelo Swingle originado do cruzamento entre o pomelo (C. paradisi Macf.) Duncan e P.trifoliata, sendo utilizado como porta-enxerto devido a muitas caractersticas como tolerncia tristeza, exocorte, xiloporose (GRANT et al., 1961; HUTCHISON, 1974) e ao declnio (BERETTA et al., 1994). Tambm resistente gomose de Phytophthora, ao nematide dos citros (O'BANNON & FORD, 1978) e morte sbita dos citros (GIMENES & BASSANEZI, 2001). Plantas enxertadas em citrumelo Swingle produzem bem em solos arenosos ou argilosos, porm no tm bom comportamento em solos com pH elevado e nos solos mal drenados (WUTSCHER, 1979). moderadamente resistente seca e a geadas. Entretanto, suas plntulas so suscetveis mancha bacteriana dos citros, causada por Xanthomonas axonopodis pv. citri, que causou a queima de milhes de mudas na Flrida nos anos oitenta. As laranjeiras e outras espcies enxertadas no trifoliata (P.trifoliata) ou em seus hbridos apresentam maior dimetro do tronco do porta-enxerto que o da copa, o que no impede que as plantas sejam produtivas e longevas. Poucas cultivares apresentam combinaes denominadas de incompatveis. Como exemplo, a laranja Pra e o tangor Murcott so incompatveis com os trifoliatas e diversos de seus hbridos, entre eles os citranges e os citrumelos (POMPEU, 2005). Em So Paulo, laranjeiras Valncia enxertadas em citrumelo Swingle produziram menos que as enxertadas em limo Cravo (POMPEU Jr. & BLUMER, 2002), porm com frutos de qualidade superior queles obtidos sobre os limes Cravo e Volkameriano. Ele esteve entre os porta-enxertos que induziram maior produo lima cida Tahiti em Bebedouro e Agua (FIGUEIREDO et al., 2001). No Rio de Janeiro, laranjeiras Natal em citrumelo Swingle foram mais produtivas que as enxertadas em limo Cravo, limo Volkameriano, tangerina Clepatra e outros porta-enxertos (GRAA et al., 2001). De acordo com SWINGLE (1967), o limo Cravo um lemandarin, isto , um hbrido natural de limo (C. limon L.) e uma tangerina (C. reticulata Blanco), originado na regio de Canton, no Sul da China, onde conhecido como limo Canton. Na classificao de TANAKA (1954), o limo Cravo considerado uma espcie (C. limonia) nativa da ndia, onde conhecido pelo nome de Jamir. Supe10

se que ele tenha sido levado do sudeste da sia para a Europa e da para as Amricas, tendo sido introduzido no Brasil pelos colonizadores (POMPEU, 2005). A primeira referncia ao seu uso como porta-enxerto no Brasil foi feita por ROLFS & ROLFS (1931), que encontraram em Minas Gerais laranjeiras enxertadas nesse porta-enxerto, plantadas na dcada de 1900. Esses autores ficaram entusiastas com o uso do limo Cravo, considerando-o excelente porta-enxerto. Em So Paulo, vem sendo comercialmente empregado desde a dcada de 1920, porm seu uso foi ampliado a partir dos anos cinqenta, quando veio a substituir a laranja Azeda pela suscetibilidade desta ao vrus da tristeza dos citros. H muitas razes para seu uso por viveiristas e citricultores: tolerncia tristeza, resistncia seca, facilidade na obteno das sementes, grande vigor no viveiro antes e depois da enxertia, bom pegamento das mudas por ocasio do plantio no pomar, rpido crescimento das plantas, produo precoce, altas produes de frutos de regular qualidade, compatibilidade com todas as cultivares copa, mdia resistncia ao frio e bom comportamento nos solos arenosos (POMPEU, 2005). De modo geral, o limo Cravo apresenta mdia resistncia gomose de P. parastica e P. citrophthora, embora existam variaes entre as selees. Segundo MUNTANER et al. (1976), as selees Santa Brbara e EEL so as mais resistentes, e o limo Cravo Periforme e lima Borneo red, as mais suscetveis. Sendo considerado suscetvel aos nematides Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni (CAMPOS, 2002), no tendo sido encontradas referncias sobre o comportamento das suas diversas selees a esses nematides. tolerante ao vrus da tristeza dos citros (COSTA et al., 1954; GRANT et al., 1961), mas mostra caneluras quando infectado por raas severas do vrus, como a variante Capo Bonito (MLLER et al., 1968). Recentemente, com o aparecimento da morte sbita dos citros (MSC) (GIMENES & BASSANEZI, 2001; MLLER et al. 2001), detectou-se a necessidade de obteno de novas combinaes de porta-enxerto que pudessem ser utilizados como uma alternativa ao limo Cravo e que possibilitassem estudos sobre a herana da resistncia a MSC. O interesse no desenvolvimento desses hbridos evidente, uma vez que se pretende associar as caractersticas favorveis que esto presentes nos dois genitores. Segundo CRISTOFANI et al. (2000) e NOVELLI et al. (2005), os citros possuem muitas caractersticas agronmicas que so difceis de selecionar por 11

tcnicas convencionais de melhoramento, devido maioria delas possurem herana aparentemente quantitativa, com exceo de algumas, como resistncia CTV, leprose e morfologia foliar, que so aparentemente governadas por um ou dois genes. No melhoramento gentico de citros, o estudo do modo de herana de resistncia a doenas e de outras caractersticas importantes, apresenta um determinado grau de complexidade especialmente devido a fatores de ordem gentica, botnica e agronmica. Tais como a heterogeneidade gentica do gnero, poliembrionia natural, recombinao, longo perodo pr-reprodutivo, incompatibilidade, alta heterozigosidade, complexidade dos mecanismos genticos, depresso por autogamia e as longas geraes necessrias para se realizar selees (CRISTOFANI, 1999). O uso de um nmero reduzido de variedades com base gentica estreita e o sistema de produo de citros como monocultura fez com que a indstria citrcola se tornasse vulnervel a pestes e doenas. Como aconteceu com o vrus da tristeza dos citros (CTV) na dcada de 1940, cancro ctrico na dcada de 50, clorose variegada de citros nos anos 90 e mais recentemente morte sbita de citros (MSC) e huanglongbing (greening). Os programas de melhoramento gentico de Citrus focam, principalmente, a obteno de novos porta-enxertos e variedades copa resistentes s doenas, pragas e mais adaptados a condies abiticas adversas. Vale destacar que como os programas de melhoramento de espcies anuais, o melhoramento de plantas perenes lenhosas tambm deve basear-se no conhecimento do controle gentico da herana de caractersticas importantes e no uso e manuteno dos recursos genticos disponveis (POMPEU, 2005). Neste contexto, uma das formas mais eficientes de associar as caractersticas fenotpicas da cultura com as caractersticas genticas por meio de mapas de ligao, no qual essas caractersticas so ordenadas seqencialmente, correspondendo de modo aproximado posio dos genes nos cromossomos (MACHADO et al., 2005). Em se tratando do mtodo mais eficiente de se obter hbridos , sem dvida, mediante hibridao artificial com polinizao controlada. Alm de permitir o controle da identidade de ambos os genitores, reduz significativamente os riscos de cruzamentos indesejveis e de auto-fecundao, o que ocasiona a perda de identidade do genitor masculino (MACHADO et al., 2005). Entretanto, a maioria das pesquisas de melhoramento de Citrus tem pretendido selecionar variedades que so resistentes a doenas. Sendo que poucos estudos genticos, de fato, usando uma 12

prognie controlada, tm sido realizados para entender a herana com relao resistncia a importantes doenas. Embora os desafios na obteno de prognies F1 no cruzamento dentro do gnero Citrus e entre gneros prximos sejam considerveis (NOVELLI, et al., 2006) a introgresso de genes em Citrus por hibridao sexual freqentemente dificultada pela poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade. Essa abordagem particularmente importante quando a ela se agregam ferramentas da biotecnologia, auxiliando na seleo de indivduos zigticos, na obteno de marcadores, no mapeamento gentico, culminando com a seleo assistida por marcadores. No tocante s diferentes estratgias de melhoramento de citros, atualmente, a grande referncia na literatura so as pesquisas envolvendo gentica-genmica. De maneira, que pode-se dizer que estudos de mapeamento genticos completam a genmica funcional que por sua vez completam os de mapeamento. Assim sendo, a gentica-genmica vem surgindo como a nova opo para se observar os fenmenos da herana, determinando o gentipo por anlise direta das seqncias de DNA. Segundo KONING et al. (2005), a genmica funcional tem sido aplicada na dissecao gentica de Citrus em diferentes caminhos; para detectar locos de caractersticas quantitativas (QTLs), no cruzamento experimental entre linhagens que diferem nas caractersticas contrastantes, delineando estas diferenas; mapeamento gentico e fsico; estudos de expresso gnica, na medio dos nveis de expresso ou inferncias de expresso diferencial para milhares de genes usando microarranjos, entre outras inmeras aplicaes. Uma estrutura de mapeamento, chamada mapeamento funcional, tem sido proposta para caracterizar, em um nico passo, os locos de caractersticas quantitativas quantitative trait loci (QTLs) ou mesmo os nucleotdeos de caractersticas quantitativas quantitative trait nucleotide (QTN), segundo WU & LIN (2006). Os QTNs so bastante teis integrando finas estratgias de mapeamento e clonagem posicional de genes localizados. A abordagem fornece uma proveitosa estrutura quantitativa e analisvel para estimar a interao entre aes gnicas e mudanas desenvolvimentais. Outra poderosa abordagem gentica-genmica uma combinao dos mtodos de mapeamento tradicional quantitative trait loci (QTL) com dados de 13

microarray, resultando em uma notvel utilidade em um grande nmero de investigaes recentes biolgicas. Estes estudos de locos associados com variao herdvel na expresso de outros genes no genoma (eQTL) so similares aos estudos tradicionais de QTLs, com um objetivo principal em identificar os locais genmicos aos quais as caractersticas expressas so ligadas (KENDZIORSKI et al., 2006). Neste contexto, a seleo assistida por marcadores, uma etapa ainda em processo de incorporao aos programas de melhoramento de citros (MACHADO et al., 2005), pode combinar todas estas diferentes estratgias. Estas vo desde anlises QTL de fentipos associadas com anlises QTL de nveis de expresso de genes at transformao gentica. KIRST et al. (2004), conduziram um retrocruzamento interespecfico de uma populao de Eucalyptus e observaram que QTLs para crescimento do dimetro estavam co-localizados com eQTLs para genes relacionados com lignina, sugerindo que caractersticas de crescimento e lignina so controladas pelos mesmos locos. Neste sentido, microarrays tm sido usados para determinar nveis de expresso de genes em populaes segregantes e identificar regies genmicas (QTLs de expresso de genes ou eQTLs), explicando variaes do transcrito em genes co-regulados. Portanto, quando os microarrays so correlacionados com dados fenotpicos de uma caracterstica quantitativa, possvel identificar com sucesso genes candidatos posicionais. Desta forma, dados do transcrito, dados fenotpicos e genotpicos podem ser integrados para identificar genes controlando variao no crescimento em diversas espcies. Nos trabalhos de KIRST et al. (2004), as anlises em populaes de Eucalyptus spp revelaram uma reduo coordenada de nveis de transcrito para enzimas codificando genes envolvidos na biossntese de lignina na prognie que mostra um crescimento superior. 2.3 Mapas Genticos Em funo do ciclo de reproduo e da perenidade de muitas espcies lenhosas de polinizao aberta e altamente heterozigticas, o mapeamento gentico, mesmo com marcadores moleculares, ainda no est to avanado quanto o de espcies anuais. A disponibilidade de prognies de cruzamentos entre diferentes espcies e variedades de Citrus, por exemplo, ainda muito rara. Na maioria das vezes, somente prognies do cruzamento entre dois genitores, com 14

certa heterozigosidade, encontram-se disponveis para estruturao de mapas de ligao. Para superar problemas dessa natureza, GRATTAPAGLIA & SEDEROFF (1994) propuseram a utilizao de uma estratgia, por eles denominada de pseudo-testcross", que permite a construo de mapas de ligao com base em prognie F1 de genitores altamente heterozigotos. Nessa abordagem, a configurao do cruzamento no precisa ser planejada a priori, como em um cruzamento teste clssico, mas pode ser inferida a posteriori, aps a anlise de segregao dos marcadores na prognie. O mtodo mais importante e comum de mapeamento utiliza a freqncia de recombinao para determinar a distncia relativa entre duas caractersticas ligadas. STURTEVANT (1913) estabeleceu que a freqncia de quiasmas entre dois genes ligados de certa forma proporcional distncia fsica entre ambos. Esse princpio a base para o mapeamento gentico. Uma unidade de centiMorgan equivale a aproximadamente 1% de recombinao quando os marcadores esto bastante prximos, ou podem diferir da porcentagem de recombinao quando esto mais distantes em vista da ocorrncia de crossing-over duplo, triplo, etc. Diversas funes de mapeamento tm sido utilizadas na correo das distncias calculadas em porcentagem de recombinao para a distncia em centiMorgan (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996). Com base na freqncia de recombinao realizada uma anlise para distribuio independente entre os locos segregantes para identificar pares de caractersticas ligadas. Aps essa etapa, os marcadores ligados so combinados em grupos de ligao. A ordem linear dos marcadores dentro de cada grupo deduzida da distncia gentica relativa a cada um em estimativas dois a dois (RITTER et al., 1990). Outros mtodos utilizando estimativas de mxima verossimilhana da freqncia de recombinao entre os marcadores e algoritmos de ordenao rpida de um grande nmero de marcadores tm sido empregados para a construo de mapas com maior preciso. Existem disponveis diversos programas computacionais com base no mtodo da mxima verossimilhana, tais com Linkage 1 (SUITER et al., 1983), Mapmaker (LANDER et al., 1987), GMendel (LIU & KNAPP, 1992), Joinmap (STAM, 1993), entre outros. O JoinMap baseado em um LOD modificado em funo de um teste de Qui-quadrado independente, permitindo, assim, a integrao de marcadores de diferentes tipos de segregao em mapas genitores e a construo de mapas consensos. 15

Assim como para outras espcies, o mapeamento gentico de plantas perenes requer alguns requisitos, como: i) escolha dos genitores com fentipo contrastante em relao caracterstica de interesse, por exemplo, resposta diferenciada em relao resistncia a alguma doena; ii) polinizao controlada entre os genitores com produo de uma prognie com tamanho mnimo e representativo de eventos meiticos, e iii) obteno de centenas de marcadores com segregao mendeliana clssica. Ao se caracterizar um loco marcador desejvel que os marcadores moleculares sejam polimrficos, que no sofram seleo, sejam co-dominantes para que todos os possveis alelos dos locos marcadores possam ser identificados e contenham maior informatividade que os dominantes. Cada vez mais, mapas genticos de ligao vm sendo utilizados em vrias espcies, principalmente aps o desenvolvimento de diferentes classes de marcadores moleculares, segundo CARNEIRO & VIEIRA (2002). No entanto, os primeiros mapas genticos baseavam-se em marcadores morfolgicos e citolgicos. Estes ltimos eram obtidos a partir de alteraes cromossmicas (aneuploidias, translocaes, delees e inverses), principalmente em culturas de mais fcil observao das alteraes fenotpicas causadas por essas modificaes, como milho, tomate e ervilha. No entanto, esses marcadores so restritos s espcies de amplo conhecimento citolgico. A partir do desenvolvimento de marcadores bioqumicos (isoenzimas) e moleculares (DNA), o mapeamento gentico passou a ser utilizado em vrias espcies, at mesmo naquelas para as quais nem sequer havia ainda estudos de ligao a algum marcador. Portanto, os mapas genticos tm importante papel em muitas reas da gentica: anlise de QTLs, clonagem baseada em posio no mapa, melhoramento por meio da seleo assistida por marcadores (SAM) e, mais recentemente, na genmica comparativa. A seleo indireta, por meio de marcadores genticos, tem sido sugerida para caractersticas de baixa herdabilidade, que requerem grandes populaes para sua mensurao (FERREIRA, 1995). O mapeamento comparativo (comparative mapping ou synteny mapping) constitui outra importante aplicao dos mapas genticos (FEUILLET & KELLER, 2002). A comparao das estruturas genmicas de diferentes espcies, do ponto de vista de homologia de genes e conservao de distncias e da ordem de ligao nos cromossomos, permite melhor compreenso da evoluo dos genomas (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). Outra utilizao do mapeamento comparativo 16

como estratgia de obteno de um mapa nico de referncia para a maioria das espcies vegetais cultivadas, pelo menos ao nvel de famlias taxonmicas (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). Desse modo, um mapa gentico saturado do genoma passou a ser a base para estudos avanados de gentica, incluindo a identificao e isolamento de genes e estudos da estrutura, expresso e funo desses genes, como enfatizam OLIVEIRA et al. (2005) em seus trabalhos. Altas resolues em regies especficas (isto , prximas a genes de interesse) so fundamentais para a identificao, isolamento e clonagem de genes, que vem se tornando uma realidade em espcies com mapas genticos bem definidos (ROOSE et al., 2000). Nos ltimos poucos anos, mapas integrados de muitas espcies tm sido publicados. Devido ao aumento na densidade dos locos e decrscimo no nmero de gaps, estes mapas consensos tm fornecido uma identificao mais precisa de genes principais e/ou QTLs de importncia agronmica. Adicionalmente eles tm auxiliado a conduzir a seleo assistida por marcadores e estudar a estrutura e organizao do genoma, estudos de evoluo e introgresso de genes. O mapeamento gentico se tornou mais freqente, principalmente aps o advento da tecnologia de seqenciamento de alta produo, que tem gerado informaes abundantes sobre seqncias de DNA para os genomas de muitas espcies de plantas. Isto inclui o seqenciamento de seqncias genmicas completas para o modelo de planta Arabidopsis thaliana em 2000 e para o arroz (Oryza spp.) em 2002. Adicionalmente, as Expressed Sequence Tags (ESTs) de outras importantes espcies cultivadas tm sido geradas, e ferramentas poderosas de bioinformtica tm anotado milhares de seqncias como genes funcionais putativos. Neste contexto, marcadores moleculares representam a tarefa de relacionar estas informaes geradas de seqncias de DNA com fentipos particulares. Conseqentemente, h uma forte demanda em melhorar tcnicas de marcadores para se melhor utilizar a informao de seqncias disponveis. Um mapa saturado a base para estudos avanados de gentica, incluindo a identificao, isolamento e estudos da estrutura, expresso e funo dos genes. A clonagem de genes se tornou uma realidade em espcies com mapas genticos bem definidos. Entretanto, a construo de mapas de alta resoluo, vale ressaltar, isto , que permitam encontrar marcadores bastante prximos ou at mesmo completamente ligados ao gene um pr-requisito para a clonagem de genes 17

baseada em mapeamento. Marcadores moleculares, segundo CHEN et al. (2006a) e HU & VICK (2003), realizam um importante papel na genmica estrutural e funcional de animais, plantas e espcies microbianas. A deteco de Quantitative Loci Traits (QTLs) principais em mapas de ligao genticos baseada em marcadores moleculares oferece uma refinada viso da arquitetura gentica de caracteres quantitativos e uma ferramenta potencial para melhoramento efetivo por meio de seleo assistida por marcadores (YOSHIMARU et al., 1998; LING et al., 2000). Os estudos de WILLIAMS et al. (1990) demonstraram que primers curtos com seqncias de nucleotdeos arbitrrias podem ser usados para reproduzir segmentos amplificados de DNA genmico de uma extensa variedade de espcies. Estes marcadores foram denominados de random amplified polymorphic dna (RAPD). Entre os mtodos baseados em DNA, a anlise com RAPD uma das mais utilizadas em programas de melhoramento (BASTIANEL et al., 1998). Estes marcadores utilizam um conjunto de primers universais que podem ser usados para anlise genmica em uma ampla variedade de espcies e so dominantes, visto que segmentos de DNA de mesmo tamanho so amplificados de um indivduo, mas no do outro. Desta forma, no possvel distinguir se um segmento de DNA amplificado de um loco que heterozigoto (1 cpia) ou homozigoto (2 cpias). Outra eficiente tcnica com marcadores inclui os chamados AFLP (amplified fragment length polymorphism), que geram locos dominantes. Eles tm sido utilizados para determinar a localizao cromossomal de fentipos mutantes, por meio de uma estratgia de mapeamento de todo o genoma (PETERS et al., 2004). Recentemente, LI & QUIROS (2001) publicaram uma nova tcnica de marcador molecular denominada sequence related amplification polymorphism (SRAP), em que pares de primers com ncleos ricos em AT ou GC so usados para amplificar fragmentos intragnicos por deteco de polimorfismo. O aspecto comum de SRAP, RAPD e AFLP que fragmentos mltiplos podem ser gerados em uma nica reao de amplificao. Entretanto, estas tcnicas no usam, a priori, informao da seqncia, e os marcadores gerados so distribudos aleatoriamente no genoma. HU & VICK (2003) desenvolveram uma tcnica rpida e eficiente baseada em PCR, que utiliza ferramentas de bioinformtica e dados de EST para gerar 18

marcadores polimrficos ao redor de genes alvo candidatos. Este polimorfismo de amplificao de regies alvo (TRAP) utiliza dois primers de aproximadamente 18 nucleotdeos para gerar marcadores. Um dos primers, o fixo, desenhado a partir de uma seqncia alvo do banco de dados EST, amplificando seqncias parciais do gene candidato. O segundo primer, o arbitrrio, uma seqncia arbitrria, com 3 a 4 nucleotdeos rica em AT e/ou GC (embora deva existir de 40 a 60% de contedo rico em GC para manter a estabilidade adequada do primer), em seu ncleo, para anelar com introns e exons., amplificando as demais regies provveis do gene candidato. Alm desta regio, o primer arbitrrio possui 3 a 4 nucleotdeos seletivos em sua extremidade 3 e seqncias de preenchimento na extremidade 5. Uma reao de amplificao ento realizada e os fragmentos de 50-900 pb so separados em um gel de seqenciamento ou de poliacrilamida. A tcnica tem sido utilizada tendo como alvo genes que governam caractersticas agronmicas de interesse para o melhoramento. Diferenas morfolgicas entre 16 espcies de Helianthus spp obtidas pelo sistema taxonmico de classificao para estas espcies foram confirmadas e bem retratadas quando confrontadas com dados obtidos por marcadores TRAP, em estudos feitos por Hu et al. (2003). Estes autores construram uma rvore filogentica com os dados de um sistema multiplex -, utilizando 6 primers (2 primers fixos, com alvo em seqncias gnicas de genes de resistncia a doena com regies repetidas ricas em leucina ou stios de ligao a nucleotdeos e 4 primers arbitrrios), resultando em mais de 100 fragmentos polimrficos entre estas espcies. Outra classe de marcadores, os microssatlites ou simple sequence repeats (SSR) so de marcadores marcadores codominantes, microssatlites multiallicos, tm permitido altamente aumentar informativos, e de ampla utilizao na maior parte das culturas. A identificao e desenvolvimento significativamente a densidade dos mapas de ligao obtidos com outros marcadores. Em girassol, por exemplo, tm sido utilizados na integrao de diferentes mapas genticos previamente obtidos com marcadores restriction fragment length polymorphism (RFLP) (YU et al., 2003). A utilizao de microssatlites na construo e/ou integrao de mapas genticos em citros tem sido limitada devido falta de um nmero suficiente de marcadores polimrficos disponveis para esta finalidade. Embora tenham ajudado a aumentar a densidade 19

em alguns dos mapas genticos j obtidos (JARREL et al., 1992; GARCIA et al., 1999), eles ainda no tm permitido obter nveis de saturao apropriados (KIJAS et al., 1997; ROOSE et al., 2000; RUIZ & ASNS, 2003, CRISTOFANI et al., 2000). Especialmente em se tratando de microssatlites, segundo LI et al. (2002), estes esto distribudos tanto em regies codificantes como no-codificantes do genoma; sua distribuio no genoma possui significncia evolutiva e dinmica; possuindo funes e efeitos na expresso gnica e desordem gentica, organizao da cromatina, ciclo celular, processos do metabolismo do DNA e contribuio relativa de replicao e mecanismos de reparo associado ao DNA. A distribuio genmica no-aleatria dos microssatlites (SSRs) nos organismos enfatizada nos trabalhos de LI et al. (2004), em que discorrem que numerosas linhas de evidncia tem demonstrado este fato, o que bastante interessante em trabalhos de mapeamento (FALCO et al., 2004). Estes autores enfatizam que a vantagem adicional do desenvolvimento de microssatlites a partir de ESTs o fato de que, ao mapear estes microssatlites, automaticamente so mapeados genes no mapa gentico. Sendo que alguns destes genes mapeados podem constituir potenciais candidatos para funes importantes devido sua co-localizao com QTLs para caractersticas fenotpicas de importncia econmica. Isto, presumivelmente devido aos seus efeitos na organizao da cromatina, regulao da atividade gnica, recombinao, replicao do DNA, ciclo celular, metabolismo de plantas e na evoluo do gene. FALCO et al. (2004) mapearam 1000 microssatlites a partir de ESTs de diferentes espcies e tecidos de Eucalyptus, esperando com isso a cobertura de todo o genoma com uma densidade de marcadores suficiente pra poder fazer mapeamento de QTLs com preciso, bem como a ancoragem com o mapa fsico. Por outro lado, a utilizao de marcadores co-dominantes na construo e saturao de mapas de ligao de fundamental importncia, pois esses tambm permitem resolver as ambigidades existentes na correlao entre as evidncias citogenticas e as caractersticas dos diferentes grupos de ligao (distribuio dos marcadores dentro do grupo). Estes marcadores podem ser usados como ncoras para combinar mapas de ligao obtidos em diferentes laboratrios ou com diferentes populaes, gerando assim um mapa gentico que melhor represente a estrutura e organizao dos diferentes grupos de ligao (KIJAS et al., 1997; 20

SANKAR & MOORE, 2001). ROSTOKS et al. (2003), baseando-se em anlises de seqncias genmicas e mapeamento gentico, encontraram quatro diferentes genes de reao-induzidahipersensitivos (HIR), relacionados com a hipersensibilidade putativa em cevada, uma das mais eficientes formas de defesa de plantas contra patgenos biotrpicos. Neste trabalho de mapeamento, estes autores retratam uma importante contribuio na caracterizao de mecanismos moleculares de resposta hipersensitiva em plantas. O primeiro mapa gentico para seringueira (Hevea spp.) foi feito por LESPINASSE et al. (1999) utilizando a estratgia pseudo-testcross para saturao com marcadores RFLP, AFLP, SSR e isoenzimas. Mapeamento molecular do gene da macho-esterilidade nuclear em girassol (Helianthus annuus L.) usando marcadores TRAP e SSR foi realizado por CHEN et al. (2006B). Sendo que os marcadores que foram ligados mais firmemente com o gene ms9, que controla a macho-esterilidade, sero teis na seleo assistida por marcadores de plantas macho-estreis entre populaes segregantes, o que facilitaria o isolamento deste gene pelo uso da abordagem de clonagem baseada em mapa. 2.4 Mapeamento gentico de Citros At o ano de 2003, 14 mapas genticos de Citrus foram publicados (RUIZ & ASINS, 2003). Neste mesmo ano, estes mesmos autores inovaram e publicaram o primeiro mapa de ligao gentico comparando grupos de ligao de espcies intergenricas de Poncirus e Citrus. Contudo, mapas genticos em especial dolimo Cravo, ainda no foram relatados na literatura. Os primeiros mapas de ligao de citros foram desenvolvidos com locos isoenzimticos e RFLP utilizando famlias de retrocruzamento intergenrico de Citrus e P. trifoliata, de tangerina com pomelo e uma famlia F2 intergenrica de Citrus e Poncirus. Vrios mapas de citros j foram publicados, embora nenhum ainda seja consensual, isto , represente efetivamente todo o gnero (LIOU, 1990; DURHAM et al., 1992; JARREL et al., 1992; RUIZ & ASINS, 2003). A saturao com mais marcadores em alguns desses mapas possibilitou o mapeamento do gene de resistncia tristeza e caractersticas como nanismo, acidez do fruto, resistncia a T. semipenetrans Cobb, nmero de sementes, apomixia, resistncia salinidade, macho-esterilidade e resistncia gomose de Phytophthora (CAI et al., 1994; 21

CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al., 2000; SIVIERO et al., 2001, 2006). A maior parte dos mapas relaciona-se com estudos de herana da resistncia a patgenos, algumas delas monognica, outras polignicas (quantitative resistance loci ou QRL). GUERRA (1984) ressalta que o gnero Citrus e correlatos tm caractersticas vantajosas que facilitam a construo de mapas genticos, visto que so diplides (n = 9, 2n = 18), altamente heterozigticos, permitindo, a produo de hbridos inter-especficos e inter-genricos. Muitos projetos de mapeamento gentico de muitas espcies de Citrus tm sido conduzidos com o propsito de identificar genes e/ou locos de caractersticas quantitativas (QTL) para resistncia/tolerncia para sal e frio (MOORE et al., 2000), vrus da tristeza dos citros (CRISTOFANI et al., 1999), dormncia, juvenilidade e vigor (ROOSE et al., 1992), peso da planta e acidez do fruto (GMITTER et al., 1996). Em 2004, por exemplo, OLIVEIRA et al. (2004a, b) elaboraram mapas de ligao de laranja Pra e tangerina Cravo utilizando marcadores RAPD e a estratgia pseudo-testcross, sendo, este trabalho, de importante relevncia para estudos posteriores da herana ao CVC, cancro ctrico e leprose. Estudos de mapeamento gentico de locos de resistncia oligognica relacionados resistncia ao Citrus tristeza vrus (CTV) so predominantes (GMITTER Junior et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; CRISTOFANI et al., 1999). Trabalhos de mapeamento para resistncia tristeza, conduzidos no Centro APTA Citros Sylvio Moreira (CRISTOFANI et al., 1999), determinaram o loco de resistncia a esse vrus no grupo de ligao I do mapa de P. trifoliata. Por sua vez, dois trabalhos de mapeamento de resistncia quantitativa de citros a patgenos foram reportados (LING et al. 2000; SIVIERO, 2001, 2006). O primeiro deles determinou a localizao de QRLs de citros para o T. semipenetrans (LING et al., 2000), herdada do genitor P. trifoliata como nico loco gnico dominante, responsvel por 53,6% da variao fenotpica do carter. CRISTOFANI et al. (1999) relatam o uso de RAPD e BSA (MICHELMORE et al., 1991) para construir mapa de ligao gentico e mapear a resistncia gentica ao vrus da tristeza dos citros (CTV) presente em P. trifoliata usando estratgia pseudo-testcross. Em seus trabalhos OLIVEIRA et al. (2005) 22

construram um mapa gentico integrado entre C. sinensis (L.) Osbeck cv. Pra e C. reticulata Blanco cv. Cravo usando dois tipos diferentes de segregao de marcadores. A saturao dos mapas com a incluso de novos marcadores aumenta o nmero de grupos de ligao com marcadores de ambos os genitores, fazendo com que o nmero destes grupos seja o mesmo do nmero haplide cromossmico da espcie. Ademais, vale mencionar que segundo OLIVEIRA et al. (2005) pequeno o conhecimento sobre a herana gentica das principais caractersticas agronmicas de Citrus. A identificao de QRLs para Phytophthora parasitica Dastur, fungo responsvel pela gomose de citros (SIVIERO, 2001, 2006), tambm conduzido no Centro APTA Citros Sylvio Moreira, constitui o primeiro trabalho de mapeamento gentico de citros de resistncia a esse patgeno e no qual se identificou, inequivocamente, herana quantitativa. SIVIERO et al. (2001, 2006) identificaram QTLs associados resistncia gomose de P. parasitica em citros a partir de um cruzamento entre C .sunki e P. trifoliata. Foram detectados 3 QTLs ligados resistncia gomose em P.trifoliata cv. Rubidoux e 1 QTL em C. sunki. Os QTLs detectados e denominados Ppr-Pt1, Ppr-Pt2 e Ppr-Pt3 (resistncia a P.parasitica em P.trifoliata) so responsveis por 26, 27 e 38% da variao fenotpica para resistncia gomose em P.trifoliata cv. Rubidoux respectivamente. O QTL PprCs (resistncia a P. parasitica em C. sunki) responsvel por 14% da variao fenotpica total para a resistncia gomose. A deteco de vrios locos controladores associados resistncia gomose em P. trifoliata cv. Rubidoux e a reao dos indivduos da prognie em relao resistncia a P. parasitica indicam que esse carter de natureza quantitativa, concordando com as hipteses defendidas por FURR & CARPENTER (1961) e HUTCHISON (1985). LING et al. (2000) verificaram que um marcador molecular ligado ao gene de resistncia ao CTV, descrito por DENG et al. (1997), encontra-se mapeado a 10,8 cM do gene de resistncia ao T. semipenetrans, podendo tratar-se de uma regio com diferentes genes de resistncia no genoma de P. trifoliata (HAMMOND-KOSAK & JONES, 1997; LING et al., 2000). Evidncias experimentais suportam a hiptese de que o grupo de ligao I de P. trifoliata do mapa descrito por CRISTOFANI et al. (1999) possa tambm apresentar uma regio rica de genes de resistncia, em face da associao estatstica de determinados marcadores desse grupo ligados ao gene de resistncia ao CTV a eventos de 23

resistncia de citros gomose (SIVIERO, 2001, 2006). A estratgia de clonagem baseada em mapa j vem sendo utilizada para genes de resistncia de citros. O primeiro patossistema de citros a ser contemplado com esse tipo de abordagem fina de mapeamento foi o gene Ctv (resistncia tristeza) a partir de P. trifoliata, tendo sido construdos mapas de alta resoluo para o loco Ctv (DENG et al., 2001; YANG et al., 2003). BASTIANEL et al. (2005), estudaram a herana de resistncia do citros leprose e localizao de QTLs no mapa de ligao usando marcadores AFLP e RAPD desenvolvidos de 143 hbridos obtidos do cruzamento entre o genitor resistente, tangor Murcott com um genitor suscetvel laranja doce Pra, sendo que estas plantas foram estabelecidas em campo, infectadas com o vrus e a incidncia e severidade da leprose avaliada por trs anos consecutivos. Segundo SIVIERO et al. (2006), mapas de ligao gentico de P. trifoliata cv. Rubidoux e C. sunki foram construdos previamente usando marcadores moleculares RAPD (CRISTOFANI et al., 1999), explorando a estratgia de mapeamento pseudo-testcross. Dois conjuntos de dados separados foram gerados, uma para cada genitor. Uma anlise de ligao preliminar foi realizada com um modelo de retrocruzamento de fase desconhecida em LOD > 4.0 e mximo

= 0,30. Setenta e oito primers mostraram combinao pseudo-testcross, onde

o marcador estava presente em um dos genitores, ausente em outro e segregando na prognie. Anlises de ligao revelaram que 125 desses locos RAPD se ligaram em 18 grupos de ligao (10 grupos com 63 marcadores RAPD para P. trifoliata. O comprimento total desses mapas foi 732,32 cM para C.sunki e 866.88 cM para P. trifoliata, com a distncia entre marcadores variando de 0 a 43,8 cM. 2.5 Mapeamento de QTLs Pouco se sabe sobre a base gentica envolvendo o controle de caractersticas fenotpicas de citros, tais como, morfologia foliar e capacidade de enraizamento de estacas, ou mesmo a tolerncia a patgenos, como o vrus da tristeza dos citros. Provavelmente isso deve ao fato dos estudos quase sempre se direcionarem para o estudo da resistncia de gentipos especficos. A maior parte das caractersticas agronmicas de citros deve ser controlada por locos quantitativos, com exceo de poucas como; CTV, leprose e,

24

aparentemente, morfologia foliar. O estudo desses locos dever permitir a identificao, mapeamento e quantificao de seus efeitos. Porm, a deteco eficiente de QTLs depende do seu nmero, magnitude de seus efeitos, caractersticas de herdabilidade, interaes entre genes, freqncia de recombinao entre os QTLs e os tipos de marcadores e grau de saturao do mapa (TANKSLEY, 1993; YOUNG, 1996; LIU, 1998). A maioria dos mtodos comumente usados para se detectar a associao entre marcadores QTL e traos fenotpicos, envolve anlises de marcadores individuais, utilizando-se teste t simples, regresso linear, anlise da varincia, razo de verossimilhana e estimao da mxima verossimilhana; mapeamento por intervalo usando novamente a abordagem de verossimilhana, regresso e uma combinao das abordagens verossimilhana e regresso (LIU, 1998). Finalmente, o mapeamento por intervalo-composto; uma combinao de mapeamento de intervalo simples e regresso linear mltipla (ZENG, 1993, 1994). QTLs podem ser detectados considerando-se ambientes separadamente ou em grupos, por meio de uma anlise integrada dos dados em diferentes ambientes. SIVIERO et al. (2003) detectaram QTLs associados a marcadores moleculares para a capacidade de enraizamento de estacas em prognies hbridas do cruzamento entre C. sunki e P. trifoliata Rubidoux. Os autores relataram o primeiro estudo de mapeamento de QTL para enraizamento em Citrus e gneros relacionados e concluram que a presena de marcadores moleculares e QTLs associados a enraizamento de estacas de citros distribudas em grupos de ligao de P. trifoliata Rubidoux indicam que estas regies so de interesse para seleo de gentipos que enrazam facilmente. Deve ser destacado que a capacidade de enraizamento uma importante caracterstica para a multiplicao clonal de indivduos que sero avaliados como porta-enxertos. De outra forma seria necessrio aguardar por vrios anos para que esses indivduos floresam e frutifiquem para ento serem avaliados como porta-enxerto. O baixo conhecimento de como marcadores so associados com QTLs economicamente importantes, gera inmeros fatores limitantes na pesquisa de melhoramento gentico, como QURESHI et al. (2004) exemplificaram no caso das pesquisas com algodo (Gossypium spp). Segundo CRISTOFANI et al. (2000), um mapa de referncia com marcadores multi-allicos co-dominantes identificam locos e funciona como ponte entre os mapas dos genitores, fazendo com que um 25

determinado nmero de locos ncoras se tornem disponveis para uma mapeamento refinado de locos de caractersticas quantitativas (QTL), permitindo, o que se pode denominar de mapeamento comparativo. 2.6 Padro Foliar, Enraizamento e CTV Em se tratando de hbridos de citros com P. trifoliata, embora exista alta variao morfolgica, so poucas as informaes relativas ao estudo da herana dessas caractersticas, como, por exemplo, morfologia foliar e enraizamento. O carter folha trilobada conhecido como mostrando dominncia em cruzamentos sendo que alguns hbridos mostram uma mistura de folhas bifoliadas e monofoliadas. Em um cruzamento entre C. sunki e Poncirus trifoliata, 100% dos hbridos obtidos apresentavam folha trilobada indicando a dominncia e provvel homozigose do gene ou genes que controlam o carter em P. trifoliata (CRISTOFANI, 1997). Em plntulas de tangor Temple e tangerina Clementina polinizadas com citrange Troyer, um retrocruzamento para folha tipo monofoliada, cerca de 20 a 30 % das plntulas eram monofoliadas (CAMERON E FROST, 1968). Segundo os autores, estes dados indicam que o carter folha trilobada condicionado por dois genes dominantes. TOXOPEUS (1962) relatou que entre 50 plntulas do cruzamento entre C. grandis (L.) Osbeck x C. hystrix (ambos monofoliados) cerca de 1/3 eram trifoliata. Ele sugeriu que dois genes complementares e dominantes podem estar envolvidos, sendo cada espcie heterozigtica para um deles. Segundo SIVIERO et al. (2003) a propagao de plantas por meio de enxertia e enraizamento de estacas pode favorecer a reduo de juvenilidade. Embora sejam tradicionalmente propagadas por enxertia, a estaquia pode ser um mtodo alternativo e eficiente na propagao de algumas espcies como lima Tahiti (C. latifolia) (PRATI et al., 1999). Os estudos de enraizamento de estacas de Citrus e gneros correlatos procedem geralmente a estudos do potencial genotpico, porcentagem de estacas enraizadas e as diferenas de hbridos diferentes em enraizar, especialmente com a induo por reguladores de crescimento. Contudo, pouco conhecido sobre a base gentica envolvendo o controle dessas caractersticas. O enraizamento de estacas depende de fatores tais como idade, vigor da planta, lenhosidade, reguladores de crescimento, meio ambiente, localizao da 26

estaca, nutrio e fatores genticos relacionados ao gnero ou espcies de interesse. (FERGUSON et al., 1986; ABOU-RAMASH et al., 1998). Segundo PIO et al. (2005), a umidade um dos fatores externos que mais contribuem para que ocorra enraizamento das estacas. Outros estudos demonstram que os fatores que afetam a iniciao e o desenvolvimento de razes so relacionados prpria planta (estado hdrico, condies fitossanitrias, balano hormonal e nutricional) e/ou relacionados com condies ambientais (temperatura, luminosidade e umidade relativa) (MAUAD et al., 2004; NORBERTO et al., 2001; PASQUAL et al., 2001). Em se tratando do efeito de reguladores de crescimento no enraizamento de estacas, segundo ROCHA et al. (2004), a induo de enraizamento para muitas espcies dependente da aplicao de reguladores vegetais de natureza auxnica, principalmente cido indolbutrico (IBA), com ao na atividade das clulas de cmbio e na formao de razes adventcias. Este pr-tratamento com auxinas tem proporcionado em algumas espcies, rapidez e uniformidade de enraizamento, alm de aumento do nmero de razes adventcias. Alm da necessidade da adio de auxinas existem outros fatores que influenciam no enraizamento como o potencial do gentipo da cultivar, as condies ambientais, a posio da origem das estacas, assim como, a participao de substncias como auxinas. SHAZLY et al. (1994) estudaram o efeito de trs destes reguladores em diferentes concentraes para enraizamento de estacas de lima e lima cida. Concluram que IBA promoveu a melhor porcentagem de enraizamento, maior nmero e maiores razes para ambos os gentipos. Segundo PRATI et al. (1999) o efeito benfico dos reguladores de crescimento (IBA e NAA) foi observado no enraizamento de lima cida Tahiti e laranja doce. Enquanto que RAKESHKUMAR et al. (1995) relatam que estacas de limo verdadeiro (C. limon) tratadas, antes de serem plantadas, com cido indol-3-butrico associado com cido phidrobenzico mostraram um melhor enraizamento nas concentraes de 2g/L IBA e 2 g/L de pHBA. Ao lado de caractersticas morfolgicas ou fisiolgicas, caractersticas associadas tolerncia a determinados patgenos so to importantes quanto o estudo da resistncia. Sabe-se que o gnero Citrus tolerante ao Citrus tristeza vrus (CTV), enquanto alguns gneros afins, como P. trifoliata, podem apresentar resistncia ou imunidade, representada pela incapacidade do vrus de se replicar em seus tecidos. Hbridos entre Citrus e Poncirus apresentam segregao mendeliana 27

para a resistncia, que deve ser governada por um gene ou por um gene de efeito principal (MESTRE et al., 1997b; BORDIGNON et al., 2003). Devido alta eficincia do T. citricidus como um vetor, praticamente impossvel eliminar o vrus dos pomares. Estratgias vm sendo conduzidas para introduzir resistncia, seja com abordagens tradicionais (hibridao, mapeamento, etc.) ou com transformao gentica. Entretanto, vale a pena ressaltar que estratgias de melhoramento gentico, com uma abordagem moderna para resistncia tristeza, geralmente, envolvem o uso de P. trifoliata (HEARN et al., 1993), inclusive com mapeamento desta caracterstica. Segundo BORDIGNON et al. (2003), uma das maneiras de se controlar a tristeza usar variedades de copas e de porta-enxertos que interajam conforme a capacidade de multiplicar as partculas virais em suas clulas e de tolerar sua presena nos tecidos do floema. Portanto, a tolerncia de citros ao CTV parece estar associada a uma menor ou maior capacidade de multiplicao dos vrus em seus tecidos. Embora no exista nenhuma relao entre ttulo do vrus e sua severidade, tem sido observado que em variedades mais sensveis, como laranja Pra e limo Galego, o vrus apresenta-se em alta titulao (MACHADO et al., 1997). Os mtodos de deteco e caracterizao do vrus baseiam-se em sintomas em variedades indicadoras (ensaios biolgicos), mtodos sorolgicos associados ou no a microscopia eletrnica (determinao de partculas virais) e mtodos moleculares (determinao de genoma viral). Diferente do mtodo biolgico de deteco, vrios outros testes comearam a ser usados a partir de 1978 para a deteco do vrus, medida que anticorpos mono e policlonais produzidos contra a protena do capsdeo do CTV tornaram-se disponveis. BAPTISTA et al. (1996) purificaram partculas do CTV de lima cida Galego que foram utilizadas como antgeno para produo de anticorpos policlonais. Estes apresentaram ttulo e especificidade elevados, e no ocorreu reao cruzada com protenas da planta hospedeira em ELISA, dot immunoprint assay (DIBA), Western blot e tissue immunoprint. A protena do capsdeo do CTV expressa em Escherichia coli T. Escherich tambm foi utilizada como antgeno para a produo de anticorpos mono e policlonais (TARGON, 1997; TARGON et al., 1997. STACH-MACHADO et al. 2002). Esses anticorpos tambm vm sendo adotados rotineiramente, para deteco do CTV por intermdio das tcnicas citadas. 28

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 Material Gentico Os genitores limo Cravo [Citrus limonia Osbeck], resistente seca, suscetvel morte sbita dos citros e s estirpes mais severas do vrus da tristeza do citros e citrumelo Swingle [Citrus paradisi Macf. cv. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.], suscetvel seca, resistente morte sbita dos citros e ao vrus da tristeza dos citros, pertencentes ao banco de plantas matrizes do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC, Cordeirpolis/SP, foram utilizados em hibridao controlada como genitores feminino e masculino, respectivamente. Foram genotipados 94 hbridos zigticos para constituir a populao de mapeamento. As plantas de origem zigticas j haviam sido previamente selecionadas daquelas nucelares por meio de marcadores moleculares RAPD e seleo visual, nas quais os hbridos com morfologia foliar idntica ao genitor feminino foram descartados para as anlises. 3.2 Extrao do DNA Total O DNA total foi extrado de folhas frescas de acordo com a metodologia descrita por MURRAY & THOMPSON (1980), com adaptaes introduzidas por MACHADO et al., (1996). Cerca de 200mg de folhas frescas foram lavadas e trituradas em almofariz com nitrognio lquido at a obteno de um p fino. Aps transferncia do macerado para tubos de polipropileno de 1,5 mL, foram adicionados 750 L de tampo de extrao (1% CTAB; 100 mM Tris-HCI pH 7,5; 10 mM EDTA; 0,7M NaCl; 2% sarcosil; 2% mercaptoetanol) 60C. Os tubos foram mantidos por 40 min sob agitao peridica para completa homogeneizao. Aps o resfriamento, foi adicionado ao extrato o mesmo volume de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1), e feita uma incubao por 5 min a 60 C e, em seguida, uma centrifugao por 8 min a 2.449 xg. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo e homogeneizado com o mesmo volume de CTAB 10% (10% CTAB; 0,7M NaCl), aps o que, igual volume de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1) foi novamente adicionado e centrifugado por 8 min a 2.449 xg. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo e ele, adicionado igual volume de tampo de precipitao (1% CTAB; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 10mM 29

EDTA)

misturado

gentilmente,

permanecendo

40

min

em

repouso

e,

posteriormente, centrifugado por 6 min 12.096 xg. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi descartado e o sedimentado ("pellet") formado, dissolvido em 400 L de TE, com alta concentrao de NaCI (10 mM Tris-HCI pH 7,5; 1 mM EDTA; 1M NaCl) 65C, at completa dissoluo. Posteriormente, aps resfriamento, o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol 100% e centrifugado por 6 min 12.096 xg e em seguida precipitado novamente com 1,8 volumes com etanol 70%. O DNA obtido foi dissolvido em 60 L de H2O milliQ contendo 10 g/L de RNAse para a eliminao completa de contaminao por RNA. O rendimento foi de 60ng de DNA/L. 3.3 Marcadores RAPD Os primers (80) avaliados nas reaes de amplificao de fragmentos de DNA foram de seqncias arbitrrias de 10 nucleotdeos dos kits da Operon Technologies Inc. As reaes de amplificao foram preparadas em um volume total de 13 L e constitudas de: H2O milliQ (4,4 L), Tampo 10X (Invitrogen) (1,3 L), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP - Pharmacia (1L), 0,2 mM de primer de 10 nucleotdeos (15 ng) - Operon (3 L), Taq DNA polimerase (1,5 unidades), (Invitrogen) (0,3 L) e de uma soluo de 3L de DNA (5ng/L). A amplificao foi conduzida em termocicladores MJ Research Thermocycler programados para 36 ciclos de 1 min a 92 C, 1 min a 36 C e 2 min a 72 C. Ao final do ltimo ciclo, foi feita uma extenso final de 10 min a 72 C. Os produtos da reao foram visualizados em gel de agarose (1,6%) preparado em tampo TAE (0,04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA) e corados com brometo de etdio (0,5 g/mL). A corrida eletrofortica foi feita em tampo TAE 1X a 80 V, por aproximadamente 3h e os gis fotografados no sistema Eagle Eye (Stratagene), sobre luz ultravioleta. Para a seleo de primers foram inicialmente preparadas reaes para seis indivduos da prognie, escolhidos ao acaso e ambos os genitores. Primers que geraram polimorfismo entre os genitores e segregao dos marcadores em pelo menos um indivduo da prognie foram ento genotipados em todos os indivduos da populao mapa. O polimorfismo entre os gentipos foi estimado por meio da presena ou ausncia de bandas amplificadas por PCR. O tamanho dos fragmentos RAPD foi 30
o o o o

estimado por comparao com o marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Gibco). Os marcadores RAPD de boa intensidade e reprodutibilidade foram analisados quanto segregao mendeliana esperada (1:1 ou 3:1) nos 94 indivduos da prognie. Marcadores RAPD foram analisados de forma que os marcadores com presena de bandas no genitor limo Cravo (ou citrumelo Swingle) tiveram os gentipos na populao de mapeamento codificados para lm, quando presente, ou ll, quando ausente. Para os marcadores provenientes de citrumelo Swingle (ou limo Cravo), os gentipos foram codificados como np, quando a banda estivesse presente, e nn quando ausente. 3.4 Marcadores Microssatlites Marcadores microssatlites ou SSR (Simple Sequence Repeats) foram amplificados a partir de seqncias de microssatlites obtidas tanto do banco de dados do genoma citros (CitEST) (57) como de DNA genmico (171), previamente obtidas no laboratrio. As reaes de amplificao foram preparadas em um volume total de 25 L e constitudas de: H2O milliQ (13,95L), Tampo 10X (Invitrogen) (2,5 L), MgCl2 1,5 mM (1,25), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP Pharmacia (1L), 0,1 M de cada primer (2 L), Taq DNA polimerase (1,5 unidades), (Invitrogen) (0,3 L) e de uma soluo de 2,0 L de DNA (50ng/L). A amplificao foi conduzida em termocicladores MJ Research programado para 30 ciclos de 94C por 30s, 65-56C por 30s e 72C por 5s. A temperatura de anelamento se inicia a 65C, decrescendo at 0,3C a cada ciclo seguido por 3 ciclos de anelamento a 56C. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose 4% com brometo de etidio (0,5 ng/mL) e fotografados sobre luz ultravioleta. Os marcadores encontrados apresentaram todos os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators). Os cdigos utilizados para a construo do arquivo mapa esto apresentados na tabela 1.

31

Tabela 1. Cdigos utilizados para os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators) *.
Cdigo <abxcd> <efxeg> <hkxhk> <lmxll> <nnxnp> Descrio loco heterozigoto em ambos os genitores, quatro alelos loco heterozigoto em ambos os genitores, trs alelos loco heterozigoto em ambos os genitores, dois alelos loco heterozigoto em um genitor loco heterozigoto em outro genitor

* cdigos do programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001), de uma populao caracterizada como cross pollinators. Que so aquelas provenientes de genitores heterozigotos com fase de ligao dos locos originalmente desconhecida.

3.5 Marcadores TRAPs (Target Region Amplification Polymorphism) As combinaes de primers fixos e aleatrios (6) foram avaliadas nas reaes de amplificao de fragmentos de DNA (2 fixos: P1 e P2 e 3 aleatrios: R1; R2 e R3). O primer fixo (gene alvo) foi desenhado de um banco de dados de seqncia EST, enquanto o segundo primer, o arbitrrio (18 a 20 pb), possui em sua extremidade 3, 3 a 4 nucleotdeos seletivos, 4 a 6 nucleotdeos no centro da seqncia (rica ou em AT ou GC), amplificando as demais regies provveis do gene candidato e seqncias de preenchimento na extremidade 5 relacionadas com o desempenho do primer. A amplificao por PCR foi feita por cinco ciclos iniciais com uma temperatura de anelamento de 35C, seguida por 35 ciclos com uma temperatura de anelamento de 50C. Os fragmentos, com tamanhos variando de 50 a 900pb, foram separados em um gel de seqenciamento de poliacrilamida 6,5%. Primers Fixos - Os primers fixos foram desenhados a partir seqncias parciais de genes diferencialmente expressos detectados nos trabalhos com hibridao in silico a partir da identificao da seqncia no CitEST. Seqncias estas com homologia aos genes que codificam duas enzimas (Cinnamoyl-CoA reductase e Caffeic acid-O-Methyltransferase) envolvidas na rota metablica de biossntese da lignina (CRISTOFANI et al., in press). As seqncias dos primers esto apresentadas na tabela 2. Um mecanismo de defesa contra o ataque de patgenos uma rpida deposio de compostos fenlicos, como a lignina em paredes primrias nos stios de infeco, ligando-se a polissacardeos, para bloquear o avano do patgeno

32

(MENZIES et al.,1991).

Tabela 2. Seqncias dos primers fixos e arbitrrios utilizados para os marcadores TRAPs.
Primers Primers Fixos Forward Gene Cinnamoyl-CoA reductase Caffeic acid-OMethyltransferase Nomenclatura P1 P2 R1 Primers Arbitrrios Reverse * R2 R3 Seqncia (53) GCCCGTGCTGCCTGATGATT ACAGGGCCAAAGGTAAACACA GACTGCGTACGAATTAAT GACTGCGTACGAATTTGC GACTGCGTACGAATTGAC

*Os primers arbitrrios foram desenhados de acordo com Li & Quiros (2001).

Reaes de amplificao - As reaes de amplificao foram conduzidas a um volume final de 15 L com os seguintes componentes: 2 L da amostra de DNA (40 ng/mL), 1,5 L do tampo de reao 10 X, 1,5 L de MgCl2 (25 mM), 1 L de dNTPs (5 mM), 10 nmol dos primers arbitrrios e 10 nmol dos primers fixos e 1,5 U de Taq DNA polimerase. A PCR foi realizada com temperatura de desnaturao do DNA a 94C por 2 min. A seguir, 5 ciclos a 94C por 45 s, 35C por 45 s, e 72C por 1 min, seguidos de 35 ciclos a 94C por 45 s, 50C por 45 s, e 72C por 1 min e um passo de extenso a 72C por 7 min. Eletroforese dos produtos amplificados - Aps a reao de amplificao, 7 L de tampo da amostra 5X [0,313 M Tris-HCl (pH 6.8)] a 25C, 10% SDS, 0,05% azul de bromofenol, 50% glicerol) foram adicionados s reaes. Uma alquota de 1 L foi aplicada no gel de seqenciamento (poliacrilamida 6.5%) conforme recomendaes do fabricante. A eletroforese foi conduzida a 1500 V por 3,5 h em cuba vertical para eletroforeses de cidos nucleicos, tipo Sequi-Gen System da Bio Rad, sendo o gel corado com prata. Os marcadores TRAPs de boa intensidade e reprodutibilidade foram analisados quanto segregao mendeliana esperada (1:1 ou 3:1) nos 94 hbridos, de forma idntica anlise adotada para os marcadores RAPD descritos

33

anteriormente. 3.6 Avaliao de Caractersticas Morfolgicas As caractersticas morfolgicas, como morfologia foliar, capacidade de enraizamento de estacas e avaliao de resistncia a CTV foram avaliadas e includas ao mapa de ligao. 3.6.1 Morfologia foliar A morfologia foliar foi avaliada em 90 hbridos e seus 2 genitores, como monofoliada ou trifoliada. As determinaes foram realizadas em plantas juvenis mantidas em casa-de-vegetao em trs repeties. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado. A avaliao da morfologia das folhas foi realizada em trs folhas de cada repetio, coletadas em uma posio mediana em relao altura das plntulas, estimando-se um ndice (comprimento/ largura) das folhas monofoliadas (simples) e trifoliadas (englobando as folhas mistas bifoliadas e suas variaes) Estes dados foram includos como caractersticas fenotpicas no mapa de ligao. 3.6.2 Capacidade de enraizamento de estacas A capacidade de enraizamento de estacas foi avaliada em 94 hbridos e seus 2 genitores. Dez estacas com cinco gemas axilares de cada gentipo foram imersas por 10 min em soluo contendo 5% de etanol, 1g/L de IBA (cido indol-butrico) e 1g/L de NAA (cido naftaleno actico) em tubetes (100cm3) contendo vermiculita e mantidos em casa de vegetao sob nebulizao. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com cinco repeties com duas estacas por parcela. A avaliao foi realizada contando-se o nmero de estacas enraizadas em cada repetio e estimando-se a porcentagem de estacas enraizadas, que foi includa como caracterstica fenotpica no mapa de ligao. 3.7 Avaliao da Resistncia ao CTV A avaliao da tolerncia (capacidade de multiplicao do CTV) ou resistncia (incapacidade de multiplicao do vrus nos tecidos) foi avaliada em 85 hbridos e seus dois genitores e conduzida determinando-se o ttulo do vrus por meio de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay Sandwich). Plantas 34

originadas das plntulas originais livres de CTV foram multiplicadas por enxertia sobre limo Cravo e inoculadas por enxertia com borbulhas infectadas com a estirpe Baro B do vrus (Figura 1). Todos os ensaios foram conduzidos em casa de vegetao com trs repeties para cada indivduo. A avaliao da presena de CTV foi feita aos 60 e 120 dias aps a enxertia com as borbulhas contaminadas. A presena do vrus foi avaliada em nervuras de folhas jovens e cascas de ramos apicais. Nervuras centrais das folhas e cascas foram trituradas com nitrognio lquido at a obteno de um p fino, o qual foi ressuspendido em tampo de extrao numa concentrao final de 100 mg da amostra por ml de tampo. A deteco do CTV foi realizada por meio de ELISA, segundo a metodologia descrita por CLARK et al. (1986). Placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100 L/poo de antissoro policlonal (BR 1006) (BAPTISTA et al., 1996) de coelho anti-CTV diludo a 1:10.000 em tampo carbonato 0,2 M pH 9,6 e incubadas a 4C por um perodo de 2 h. As placas foram bloqueadas com 200 L/poo de PBS-T pH 7,2 (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KH2PO4, 29 g/L Na2HPO4.12 H2O (1,15 anidro) e 0,2 g/L KCl) e 2% de leite em p desnatado e incubadas por 30 min a 37C. As placas foram lavadas trs vezes com PBS-T. Em seguida foram adicionados 100 L/poo das amostras, mais uma amostra positiva e outra negativa como controles do imunoensaio. A incubao foi feita noite a 4C, repetindo em seguida as trs lavagens com PBS-T. Posteriormente, foram adicionados 100 L/poo de uma mistura dos anticorpos monoclonais 3DF1 e 3CA5, universais para isolados de CTV produzidos na Espanha (ROMAN et al., 2004) a uma diluio de 1:5.000 e incubados por 1h a 37C, repetindo-se as lavagens das placas conforme j descrito. Foram adicionados 100 L/poo do anticorpo anti-mouse IgG conjugado a fosfatase alcalina diludo 1:15.000 em PBS e incubadas por 1h a 37 C. Aps as lavagens, foram adicionados 100 L/poo do substrato pNPP (p-nitrofenil fosfato) na concentrao de 1 mg/mL diludo em tampo substrato dietanolamina pH 9,8 (9,7 mL/L Dietanolamina e 0,2 g/L NaN3). As amostras foram ensaiadas em duplicata. As placas foram incubadas no escuro por 1h temperatura ambiente e a leitura da absorbncia foi efetuada a 405 nm em leitor de ELISA (3550 BIORAD). As plantas foram consideradas positivas se as mdias das leituras de absorbncia em leitor de ELISA (baseadas em trs repeties para cada um dos 94 35

hbridos e seus genitores) foram significativamente maiores (pelo teste ScottKnott a 5%) que o controle negativo.

Local de enxertia da P. trifoliata laranja Pra

Laranja Pra Local de enxertia do hbrido

Limo Cravo (porta-enxerto) Figura 1. Ilustrao de como os hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle e os genitores foram inoculados com material de laranja Pra infectada com CTV estirpe Baro B.

3.8 Anlises Estatstica dos Dados Morfolgicos Histogramas de distribuio das mdias de todas as variveis foram obtidos pelo aplicativo Statistica v. 6.0 (Anexo I). A anlise de varincia e teste de comparao de mdias foram realizadas utilizando o aplicativo SASM-Agri (CANTERI et al., 2001). Para comparao de mdias foi utilizado o teste ScottKnott (SCOTT & KNOTT, 1974) a 5% de probabilidade, que separa as mdias por meio de comparaes entre grupos de mdia de dados. O aplicativo SELEGEN REML/BLUP (RESENDE, 2002) foi utilizado para calcular os parmetros genticos (herdabilidade, varincia, coeficiente de variao) para todas as variveis. 36

3.9 Construo dos Mapas de Ligao Os marcadores foram integrados aos mapas de ligao utilizando o programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001). Este programa permite anlise conjunta de marcadores segregando nas propores 1:1, 3:1, 1:2:1 e 1:1:1:1. De acordo com as instrues contidas no programa, a populao foi caracterizada como CP (Cross Pollinators) proveniente de genitores heterozigotos com fase de ligao dos locos originalmente desconhecida. Os grupos de ligao foram formados e ordenados utilizando-se LOD 3,0 e mximo de 40% de recombinao. As freqncias de recombinao, estimadas em anlises multiponto foram convertidas em distncia gentica (centiMorgans) por meio da funo de Kosambi. O teste qui-quadrado [
2

(P 0,05, GL=1)] (STELL &

TORRIE, 1980) foi utilizado para testar as hipteses de segregao Mendeliana 1:1, 3:1, 1:2:1 e 1:1:1:1 para cada um dos marcadores SSR, RAPD e TRAP. 3.10 Identificao de QTLs Os dados fenotpicos utilizados (ndice para morfologia foliar, absorbnciaCTV e nmero de estacas enraizadas) foram obtidos por meio das mdias ajustadas dos clones. Para a deteco e mapeamento de QTLs na populao derivada de limo Cravo x citrumelo Swingle, foram realizadas anlises por meio do programa MapQTL v. 4.0 (VAN OOIJEM et al., 2002), utilizando-se os testes paramtricos Interval Mapping (LANDER & BOTSTEIN, 1989; VAN OOIJEN, 1992) e Multiple QTL Mapping (MQM) (JANSEN, 1994). A deteco dos QTLs foi realizada pelo mdulo Interval Mapping (IM), com fator de significncia de 95% (P > 0,05) para identificar QTLs com efeitos principais significativos. O mdulo MQM foi ento utilizado para detectar possveis QTLs mascarados pelos QTLs identificados pelo IM. A estratgia MQM recorre-se ao uso dos marcadores que flanqueiam os QTLs identificados pelo IM como co-fatores, por meio da opo automatic cofator selection do aplicativo. O LOD crtico de cada QTL foi calculado usando-se o teste de permutao randmica (1000 repeties), (CHURCHILL & DODGE, 1994) disponvel no MapQTL. O teste para verificar se um QTL est ligado ao marcador, baseado na estatstica da razo de verossimilhana (utiliza logaritmos naturais): LR= -2ln [Max L(Ha)/MaxL(H0)], em que Ha refere-se hiptese da presena de um QTL

37

ligado a esse marcador, com a pressuposio de que a distribuio dos fentipos normal. No mapeamento de QTLs muito comum o uso do LOD score (logaritmo das probabilidades, na base 10). Um LOD score igual a 3 indica que a hiptese alternativa 103 ou 1000 vezes mais provvel de ocorrer do que a hiptese nula. A diferena entre o LD score e estatstica LR a base do logaritmo usada no teste (SILVA, 2002). 4 RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados obtidos da mensurao de todas as variveis estudadas no presente trabalho: absorbncia a 405 nm aps 60 min de reao com substrato no ELISA (avaliao para CTV), enraizamento de estacas, ndice de morfologia foliar e tipo de folha nos respectivos hbridos e os genitores esto apresentados na tabela 3. As estimativas de parmetros genticos para estas variveis esto apresentados na tabela 4. Analisando as freqncias de distribuio das mdias das caractersticas estudadas (Anexo I), as variveis associadas ao nmero de estacas enraizadas e leitura da absorbncia em ELISA (CTV) mostram distribuio em classes distintas, enquanto que o ndice de morfologia foliar mostra uma distribuio contnua, aproximadamente normal.

38

Tabela 3. Resultados mdios obtidos da mensurao das variveis: ttulo de CTV (CTV), enraizamento das estacas (E), ndice de morfologia foliar (IF) e tipo de folha em trs plantas de 94 hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle e genitores. (Continua)...
Planta/ Hbrido
L. Cravo

CTV [1] 1.40 1.12 1.11 1.10 1.09 1.07 1.05 1.04 1.01 1.00 0.99 0.96 0.95 0.93 0.92 0.91 0.89 0.87 0.79 0.79 0.78 0.75 0.74 0.72 0.71 0.71 0.71 0.67 0.66 0.64 0.62 0.61 0.61 0.61 0.57 0.57 0.56 0.56 0.55 0.54 0.46 0.45 0.45 0.43 0.41 0.40 0.40 0.39 0.39 0.39 0.38 0.37

54 70 86 93 72 56 64 91 40 1 76 32 4 59 84 71 8 28 37 45 61 5 18 17 47 81 48 12 9 87 82 42 2 57 21 43 67 10 65 33 20 78 63 25 74 26 41 39 60 49 62

a a a a a a a a a C. Swingle a L. Cravo a 41 a 13 a 81 a 2 a 11 a 7 a 86 a 54 a 33 a 27 a 25 a 21 a 20 a 75 a 55 a 30 a 88 a 74 a 69 a 47 a 10 a 1 a 76 a 32 a 5 a 91 a 83 a 46 a 40 a 31 b 28 b 19 b 8 b 6 b 4 b 79 b 68 b 59 b 39 b 38 b 17 b 94

Planta/ Hbrido 18 29 61 58 56 9 57 14

E [%] 90 80 80 70 70 70 60 60 70 60 50 50 50 50 50 50 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 30 30 30 30 30 30 30 30 30 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 10

E[2] 1.8 1.6 1.6 1.4 1.4 1.4 1.2 1.2 1.2 1.2 1 1 1 1 1 1 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 a a a a a a a a a a a a a a b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b c c c c c c c c c c c c c c c c c

Planta/ Hbrido 40 58 35 33 64 13 59 76 93 8 60 4 51 49 72 87 62 69 36 44 37 14 20 56 19 91 66 61 29 52 34 30 83 65 92 23 11 12
L. Cravo

IF[3]] 3.94 3.53 3.46 3.30 3.24 3.22 3.19 3.18 3.16 3.16 3.09 3.04 3.03 3.00 2.99 2.98 2.96 2.92 2.91 2.89 2.89 2.89 2.89 2.87 2.86 2.81 2.81 2.80 2.79 2.77 2.77 2.77 2.76 2.76 2.75 2.73 2.70 2.68 2.66 2.64 2.64 2.64 2.62 2.59 2.59 2.59 2.58 2.56 2.56 2.55 2.55 2.54 a b b b b b b b b b c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c d d d d d d d d d d d d d d d d

Tipo de folha Mista Monofoliada Monofoliada Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Mista Trifoliada Mista Mista Mista Mista Mista Mista Trifoliada Mista Monofoliada Monofoliada Monofoliada Monofoliada Mista Mista Monofoliada Mista Mista Mista Mista Mista Monofoliada Mista Monofoliada Mista Mista

54 79 28 63 86 7 5 27 42 16 68 75 48

39

Tabela 3. Resultados mdios obtidos da mensurao das variveis: ttulo de CTV (CTV), enraizamento das estacas (E), ndice de morfologia foliar (IF) e tipo de folha em trs plantas de 94 hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle e genitores. (Continuao)
Planta/ Planta/ E [%] E[2] IF[3]] Tipo de folha Hbrido Hbrido 0.37 b 92 10 0.2 c 25 2.53 d Monofoliada 0.36 b 89 10 0.2 c 15 2.52 d Monofoliada 0.30 b 85 10 0.2 c 39 2.51 d Monofoliada 0.30 b 70 10 0.2 c 74 2.50 d Monofoliada 0.29 b 66 10 0.2 c 70 2.50 d Trifoliada 0.25 b 65 10 0.2 c 26 2.50 d Monofoliada 0.24 b 62 10 0.2 c 31 2.49 d Monofoliada 0.21 b 50 10 0.2 c 84 2.48 d Monofoliada 0.15 b 36 10 0.2 c 57 2.48 d Mista 0.11 b 35 10 0.2 c 24 2.48 d Mista 0.10 b 34 10 0.2 c 1 2.48 d Monofoliada 0.10 b 26 10 0.2 c 18 2.48 d Mista 0.10 b 16 10 0.2 c 94 2.47 d Mista 0.10 b 15 10 0.2 c 45 2.47 d Mista 0.08 b 12 10 0.2 c 2 2.45 d Monofoliada 0.07 b 93 0 0 c 71 2.45 d Monofoliada 0.07 b 90 0 0 c 47 2.45 d Mista 0.07 b 87 0 0 c 17 2.44 d Mista 0.06 b 84 0 0 c 41 2.44 d Monofoliada 0.06 b 82 0 0 c 53 2.43 d Monofoliada 0.05 b 80 0 0 c 89 2.43 d Monofoliada 0.04 b 78 0 0 c 38 2.43 d Monofoliada 0.04 b 77 0 0 c 50 2.40 d Monofoliada 0.04 b 73 0 0 c 81 2.40 d Mista 0.04 b 72 0 0 c 85 2.38 d Monofoliada 0.04 b 71 0 0 c 90 2.33 d Monofoliada 0.04 b 67 0 0 c 6 2.32 d Monofoliada 0.03 b 64 0 0 c 9 2.30 d Mista 0.03 b 63 0 0 c 32 2.29 d Mista 0.03 b 60 0 0 c 43 2.27 d Mista 0.02 b 53 0 0 c 88 2.26 d Mista 0.02 b 52 0 0 c 21 2.26 d Mista 0.02 b 51 0 0 c 82 2.24 d Mista 49 0 0 c 80 2.19 d Mista C. Swingle 0.01 b 68 0.01 b 48 0 0 c 78 2.19 d Mista 3 45 0 0 c 55 2.15 d Mista 16 44 0 0 c 10 2.13 d Mista 19 43 0 0 c 46 1.81 e Mista 22 42 0 0 c 67 1.73 e Monofoliada 36 37 0 0 c C. Swingle 1.33 f Trifoliada 73 24 0 0 c 3 77 23 0 0 c 22 79 22 0 0 c 73 83 3 0 0 c 77 [1] mdia de trs medidas de absorbncia a 405 nm aps 60 min de reao com substrato no ELISA [2] mdia de 5 repeties [3] mdia de 3 repeties Mdias seguidas de letras iguais no diferem significativamente entre si pelo teste ScottKnott a 5%. Vale ressaltar que o teste de Scott Knott empregado, no utilizada DMS (diferena mnima significativa) entre um tratamento e outro. CTV [1] Planta/ Hbrido 30 75 23 46 58 13 6 11 50 80 52 24 31 34 27 51 29 14 94 69 90 92 15 85 53 89 66 7 44 35 55 38 88

40

Tabela 4. Estimativa de parmetros genticos obtidos para as caractersticas nmero mdio de estacas enraizadas, absorbncia (CTV) e ndice de morfologia foliar em uma prognie de 94 indivduos do cruzamento entre limo Cravo vs citrumelo Swingle.

Caracterstica Nmero mdio de estacas enraizadas Absorbncia (CTV) ndice de Morfologia Foliar Legenda: mdia;

2 hg

2 hmc

Acclon 0,81 0,84 0,91

CV gi (%)
83 64 120

CVe (%)
129 72 100

CVg / CVe
0,64 0,88 1,2

Mdia 0,44 0,47 2,63

0,29 0,44 0,62

0,67 0,70 0,83

2 2 hg : herdabilidade individual no sentido amplo, ou seja, efeitos genotpicos, hmc : herdabilidade

CVe (%) : coeficiente de variao ambiental em porcentagem; CV gi (%) : coeficiente de variao

genotpica em porcentagem; Acclon: acurcia da seleo; Mdia: mdia geral do experimento.

Os coeficientes de herdabilidade individual no sentido amplo ( hg ) para todas as caractersticas estudadas variaram de 0,29 a 0,62. A variabilidade genotpica, expressa pelo coeficiente de variao genotpica ( CV gi ) foi alta para todas as variveis (83 a 120) (Tabela 4). A preciso experimental, inferida pelo coeficiente de variao experimental em associao com o coeficiente de variao genotpica, por meio da razo CV g / CVe (VENCOVSKY, 1987), variou de 0,64 a 1,2 (Tabela 4).
2 A herdabilidade em nvel de mdia de clone ( hmc ) (RESENDE, 2002)

variou de moderada a alta para as variveis (0,67 a 0,83). A acurcia na avaliao genotpica (Acclon), que se refere correlao entre o valor genotpico verdadeiro e aquele predito pelo mtodo estatstico (BLUP, no caso) (RESENDE, 2002), foi alta para todas as caractersticas.

41

4.1 Caracterizao Morfolgica dos Hbridos 4.1.1 Padro foliar

Figura 2. Padro de fololos e folhas em hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle (G = limo Cravo, H = hbridos, I = citrumelo Swingle).

P. trifoliata (L.) Raf. apresenta folhas subdividida em trs fololos (Figura 3), carter considerado dominante sobre folhas simples de citros (CAMERON & FROST, 1968). Dos 94 hbridos, em 4 indivduos houve perda de material foliar. Portanto foram avaliados 90 hbridos e seus 2 genitores (Tabela 3). Quando se considera a quantidade de hbridos com folhas trilobadas (englobando as folhas mistas bifoliadas e suas variaes), o experimento resultou em uma taxa de 3:1 de folhas trilobadas para folhas simples (65:29; 2 = 1,70, segregao consistente com dois genes = 0,05 ). Esta taxa de dominantes segregando

independentemente. notvel a grande variao no padro da morfologia foliar (Figura 2) nos hbridos com folhas trilobadas. O ndice de morfologia foliar (comprimento/largura foliar) foi de 2,66 para o limo Cravo e 1,33 para o citrumelo Swingle, indicando que as folhas de citrumelo Swingle apresentam uma relao comprimento/largura menor que as folhas de limo Cravo. Alguns hbridos apresentam folhas com relao

42

comprimento largura semelhantes ao do limo Cravo e alguns apresentam esta relao superior, com folhas com largura menor e comprimento maior. De qualquer forma, parece que todos os hbridos apresentam folhas mais estreitas que o genitor citrumelo Swingle. O ndice utilizado representa um marcador morfolgico, como anlise suplementar, para avaliar o quanto estatisticamente os hbridos e os genitores podem ser diferentes entre si por uma abordagem comprimento dividido pela largura. Este ndice foi contrastado com um outro ndice que multiplica essas medidas, que se aproxima rea foliar. Contudo, foi observado que o ndice obtido por multiplicao no aplicvel para a anlise em questo. Porque, considerando o fator juvenilidade das plantas em estudo, as diferenas morfolgicas, neste ltimo caso, so supra-estimadas, por apresentarem, nesta fase, tamanhos variados de folhas com distribuio aleatria em diferentes locais da planta. As mdias estatisticamente diferentes dos ndices no tiveram correlao com a morfologia trilobada e monofoliada, possivelmente, por apenas o lobo central foliar ter sido considerado para as medidas dimensionais comprimento e largura. Bianco et al. (2005) utilizaram-se das mesmas medidas dimensionais, multiplicadas, para estudar a rea foliar na avaliao de crescimento vegetal de Brachiaria plantaginea. Isto, por meio de equaes de regresso entre a rea foliar real e os parmetros dimensionais lineares de suas folhas.

43

4.1.2 Enraizamento de estacas

Figura 3. Padro de enraizamento de estacas de limo Cravo (A), citrumelo Swingle (C) e hbrido (B).

No presente trabalho foram avaliadas 94 plantas hbridas e seus 2 genitores, com cinco repeties e duas estacas por parcela. O citrumelo Swingle e o limo Cravo apresentaram as mesmas mdias (1,2) de enraizamento de estacas, considerando mdias de duas plantas por parcela e cinco repeties, sendo que alguns hbridos mostraram mdias de enraizamento semelhantes aos dos genitores, sem apresentar diferena estatstica significativa. Grande parte dos hbridos apresentou enraizamento de estacas menor que os genitores e vrios gentipos mostraram dificuldade em enraizar (Tabela 3). A estaquia um mtodo de propagao em que segmentos destacados de uma planta, sob condies adequadas, emitem razes e originam uma nova planta, com caractersticas idnticas quela que lhe deu origem (MELETTI, 2000). Em citros, a propagao vegetativa ou clonal de porta-enxertos realizada por meio do uso das sementes devido existncia da apomixia e embrionia nucelar. Entretanto, a estaquia um mtodo interessante de propagao para os trabalhos de melhoramento, quando se pretende avaliar uma prognie hbrida sem a necessidade de esperar que os hbridos produzam frutos para a obteno de repeties.

44

PIO et al. (2004) obtiveram porcentagens de enraizamento de 2,5 a 58% em diferentes variedades de marmeleiros. Em citros, estudos conduzidos por SABBAH et al. (1991) mostraram que 44 e 77% das estacas de tangerina Cleopatra e P. trifoliata, respectivamente, enraizaram aps tratamento com cido indol butrico. SIVIERO et al. (2003) encontraram 10% de enraizamento para C. sunki, 70% para P. trifoliata e 50 a 100% de enraizamento entre os hbridos do cruzamento entre ambos. No presente trabalho foram observadas porcentagens de 70% para citrumelo Swingle, 60% para limo Cravo e de 0 a 90% para os hbridos. 4.2 Avaliao de Resistncia ao CTV O ELISA tem sido utilizado em outros estudos para medidas quantitativas de populaes de fungos, bactrias e vrus (ADLERLIESTE & VAN EEUWIJK, 1992; IKUTA et al., 2000; MEYER et al., 2000). Em estudos realizados por ALBAR et al (1998), a tcnica foi utilizada para quantificar acmulo de vrus em tecidos de plantas com a finalidade de mapear QTLs para resistncia a vrus em arroz. Em uva, o uso do ELISA no estudo da quantificao do nmero clulas de Xylella fastidiosa, bactria causadora da Pierce s disease, nos tecidos dos vasos condutores provou ser um instrumento efetivo para a deteco de QTL associado resistncia. (KRIVANEK et al., 2006) No presente trabalho, as 94 plantas hbridas e seus genitores limo Cravo e citrumelo Swingle, com trs repeties cada, foram inoculadas com o isolado severo do vrus da tristeza mantido na variedade de laranja Baro B [C. sinensis (L.) Osbeck] por meio da enxertia de borbulhas contaminadas. Em nove hbridos no houve pegamento das borbulhas utilizadas como fonte de inculo, assim sendo, foram avaliadas 85 plantas hbridas e os 2 genitores. Os resultados mdios obtidos da mensurao desta varivel encontram-se resumidos na tabela 3. A anlise pelo teste ScottKnott das mdias de trs leituras de absorbncia do ELISA, resultou na separao da populao de hbridos em plantas com mdias de leitura de absorbncia que no diferiram estatisticamente da mdia do genitor limo Cravo (mdias acima de 0,5), e plantas com mdias que no diferiram estatisticamente da mdia obtida para o genitor citrumelo Swingle (mdias abaixo de 0,5). At 60 dias de inoculao poucas plantas multiplicaram o vrus, com a maior parte das amostras apresentou resultados negativos (dados no 45

apresentados). De modo geral, a presena do vrus aps inoculao com borbulhas infectadas pode ser detectada por RT-PCR cerca de 20 a 30 dias aps enxertia e 60 a 90 dias por ELISA (FREITAS-ASTA et al., 2005). Aps 120 dias de inoculao, o vrus se replicou suficientemente para ser detectado em ELISA e a avaliao de 85 plantas resultou em uma taxa de 1:1 de hbridos resistentes e suscetveis (46: 39;
2

= 0,56, = 0,05), caracterizando

que, possivelmente, apenas 1 gene est controlando a resistncia a CTV. As estirpes de CTV, segundo Bordignon et al. (2003), se classificam genericamente em fracas, mdias e severas. No caso do porta-enxeto limo Cravo, este apresenta tolerncia em relao s estirpes fracas e severas de CTV denominadas normais, com exceo quela denominada extremamente severa, como o complexo Baro B e apenas tolerada pelas tangerinas, P. trifoliata e alguns outros tipos de citros (Muller et al., 1990; Bordignon et al., 2003). Deve ser destacado que a inoculao por enxertia considerada uma forma intensa de infeco pelo fato de a planta receptora estar sob contnua exposio ao vrus que est sendo gerado no tecido utilizado como fonte de inculo (Garnsey et al., 1987). Muitos autores apontam duas classes fenotpicas ocorrendo na tolerncia a CTV, mas com propores de 3:1 e 2:1, diferentemente da que pode ser encontrada no presente trabalho (1:1); onde foram considerados aqueles indivduos com mdias que no diferiram estatisticamente do genitor masculino citrumelo Swingle. Esses gentipos destes indivduos podem ser considerados resistentes, pelo fato de no permitirem a replicao do vrus, sendo que os resultados do ELISA poderiam ser atribudos a vrus residual do inculo (borbulha) que no foi retirado posteriormente; ou representar um um atraso na infeco e replicao do vrus em relao s plantas suscetveis. Portanto, o limo 'Cravo' considerado tolerante ao CTV, enquanto o citrumelo 'Swingle', resistente sendo essa caracterstica herdada do genitor P. trifoliata. Esta resistncia de Poncirus ao vrus da tristeza dos citros foi corroborada, por exemplo, por Mestre et al. (1997c), em que os autores testaram a resistncia de cultivares de Poncirus para trs isolados severos de CTV e todos mostraram resistncia aos isolados do vrus, no desenvolvendo a doena em qualquer situao (Yoshida et al., 1983; Garnsey et al., 1987; Yoshida, 1996; Mestre et al., 1997b; Bordignon et al., 2003). Os dados de segregao de prognies

46

resistentes e suscetveis analisadas por Mestre et al. (1997a) so consistentes com um controle monognico da caracterstica de que o alelo de resistncia dominante, permitindo que hbridos resistentes a CTV possam ser obtidos entre P. trifoliata e Citrus spp. Demais pesquisadores, como Bar-Joseph et al. (1989); Gmitter et al. (1995), tambm encontraram semelhantes resultados. Entretanto, em anlises posteriores, Mestre et al. (1997b) observaram que CTV hbil para se mover passivamente com o fluxo do floema quando inoculados em prognies autopolinizadas de P. trifoliata 'Flying Dragon' possuidoras de gentipos resistentes Ctr-Rr e Ctr-RR. Diferenas com relao acumulao de CTV prximas ao inculo foram encontradas em indivduos Ctr-Rr da prognie, indicando que Ctr no o nico loco responsvel por resistncia a CTV em P. trifoliata, e que, pelo menos um outro gene est envolvido. Somandose a isso, os autores observaram desvios nas taxas de segregao Mendeliana, abrindo possibilidades de interao entre Ctr e Ctm, apontando, inclusive, para uma possvel dominncia incompleta e Ctr-R, em que doses diferentes de Ctm-M possa ser ou no efetiva no controle da resistncia. Contudo, diante do fato de isolados de CTV hbeis para se multiplicassem em P. trifoliata nunca terem sido encontrados, os resultados de Mestre et al. (1997b) deixam margens para dvidas sobre a atuao de dois genes no mecanismo de resistncia a CTV, uma vez que um largo espectro de resistncia pode ser devido interao de muitos domnios virais conservados com Ctr, ou devido inabilidade do CTV de se sobrepor a dois ou mais genes de resistncia diferentes supostamente presentes em P. trifoliata. Seguindo esse raciocnio, trs genes independentes foram identificados segundo Bordignon et al. (2003), conferindo resistncia ou imunidade ao CTV, que se manifestam nas plantas como a incapacidade de multiplicar o vrus: Ctv1 (Gmitter et al., 1996; Cristofani et al., 1999) presente em P. trifoliata; Ctv2 (Fang e Roose, 1999) encontrado em C. maxima; ambos dominantes, no permitindo a multiplicao do vrus, e Ctm (Mestre et al., 1997a) que restringe a movimentao do vrus na planta. Bordignon et al. (2004) divergem nas hiptese/teorias quanto a tolerncia/resistncia apresentada por Mestre et al. (1997a,b), quando estes afirmam a resistncia tristeza do P. trifoliata, os primeiros propem um modelo de epistasia dominante-recessiva para tolerncia CTV. Assim, anlises de diferentes hbridos realizadas por Bordignon et al. (2004) sugerem que tolerncia 47

uma caracterstica dominante, inclusive sugerindo que P. trifoliata e limo 'Cravo' so tolerantes. Anlises cuidadosas desse mecanismo gentico realizadas pelos mesmos autores e propores modificadas de locos segregantes observadas, indicam que nenhuma hiptese testada baseada em herana quantitativa ou na ao de um nico gene ou dois ou mais locos poderia ser aceita sem considerar a epistasia. Anlises de muitos sistemas interagindo conhecidos, demonstram uma alternativa de que um modelo de epistasia dominante-recessiva esteja ocorrendo, envolvendo dois locos, designados como Az e t, que controlam a tolerncia de plantas de CTV. Desta forma, gentipos intolerantes poderiam ser azaz T_, enquanto que aqueles tolerantes poderiam ser Az_ _ _ e _tt. Assim, o gentipo da laranja 'Azeda' intolerante seria azaz TT, enquanto 'Sunki' e 'Cravo' tolerantes poderiam ser Azaz tt e trifoliata Azaz TT. Bordignon et al. (2004) ressaltam ainda que anlises adicionais de cruzamentos e anlises de QTL dessas populaes poderiam auxiliar a explicar diferenas genticas entre indivduos com graus diferentes de intolerncia. Ademais, um outro aspecto a ser considerado pelos mesmos autores para explicar alteraes nas propores observadas de indivduos tolerantes/intolerantes, diz respeito no a modelos de epistasia, mas sim a desvios de segregao de razes teoricamente esperadas. Uma razo para isso poderia ser seleo pr-zigtica de indivduos e uma desigual viabilidade de embries, particularmente quando se considera a natureza de cruzamentos inter-genricos e inter-especficos. Outra possvel fonte de distoro na segregao nos trabalhos de Bordignon et al. (2004), poderia ser a transmisso diferencial de alelos como um resultado de meiose irregular, passvel de ser considerada quando se trata de hbridos interespecficos. Contudo, tais observaes no influenciam sobremaneira nas concluses concernentes ao controle gentico monognico encontrado no presente trabalho, com proporo 1:1. 4.3 Mapas de Ligao A possibilidade de identificar, mapear e medir os efeitos dos genes controladores dos caracteres quantitativos, utilizando-se marcadores moleculares, uma importante contribuio para o melhoramento dos citros. A relativa facilidade com que se obtm hbridos entre espcies e/ou gneros de citros, sua condio predominantemente diplide, reduzido nmero cromossmico (2n = 9) e pequeno 48

tamanho do genoma (2C = 0,62 pg de DNA por ncleo) (GUERRA, 1993), favorecem a construo de mapas genticos para esse grupo (JARREL et al., 1992; CRISTOFANI et al., 1999). 4.3.1 Marcadores moleculares Para a seleo de primers na anlise de RAPD um total de 80 primers com seqncia arbitrria de 10 nucleotdeos (kits C, F, I, R e Y da Operon Technologies Inc.) foram avaliados utilizando-se os dois genitores (limo Cravo e citrumelo Swingle) e uma amostra de seis indivduos da prognie (Figura 4). Nas condies em que os experimentos foram realizados as reaes possibilitaram a amplificao de 7,2 bandas em mdia, bem detectadas em gel de agarose 1,6%. Com este formato (os dois genitores e seis a oito indivduos da prognie), a origem dos locos polimrficos assim como seu estado allico (homozigoto ou heterozigoto) foram diretamente inferidos a partir da presena em um genitor, ausncia em outro e pelo menos uma presena/ausncia na amostra da prognie. Dos 80 primers analisados 23 no produziram qualquer produto de amplificao, 30 no detectaram polimorfismo na prognie e 27 mostraram polimorfismo com bandas com pesos moleculares variando entre 0,4 a 4,5 Kb, gerando um total de 58 marcadores. O nmero mdio de marcadores por primer selecionado foi de 2,14.

M LC CS h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 LC CS h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7

Figura 4. Teste de primers RAPD (I07 e I10) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8). 49

Por intermdio da tcnica TRAP foram avaliadas 6 combinaes de primers (2 fixos: P1 e P2 e 3 aleatrios: R1; R2 e R3) e uma amostra de 7 indivduos da prognie (Figura 5). Duas combinaes (P2R1 e P2R3) no apresentaram produtos de amplificao do DNA aps PCR. Quatro combinaes (P1R1; P1R2; P1R3; P2R2) resultaram em 31 marcadores TRAPs com uma mdia de 7,75 marcadores por par de primer avaliado. Portanto, o nmero de marcadores por par de primers TRAPs foi quase quatro vezes maior que o nmero de marcadores por primer RAPD. MIKLAS et al. (2006) estudaram a aplicao de marcadores TRAPs para mapeamento e localizao de marcas associadas a genes de resistncia s doenas em feijo (Phaseolus vulgaris). Grande parte dos TRAPs desenvolvidos a partir de genes de resistncia mapearam prximo ou dentro de clusters de genes relacionados resistncia a doenas. Outros, mapearam prximos a QTLs relacionados resistncia a doenas. Os autores encontraram de 1,3 a 20 marcadores TRAPs por reao PCR e atriburam o alto nvel de polimorfismo ao tipo de populao de mapeamento. Os cruzamentos entre genitores mais distantes foram os que apresentaram maior polimorfismo para os TRAPs.

50

CS LC 1

6 7

Figura 5. Teste de primers TRAPs (P1R1) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7).

Desde que marcadores TRAP foram desenvolvidos por HU & VICK (2003), suas aplicaes foram direcionadas para acessar variabilidade gentica entre girassis (Helianthus annuus L.) (HU et al., 2003), em fingerprint em cultivares de alface (Lactuca sativa L.) (HU et al., 2005), em mapeamento de QTLs (LIU et al., 2005), entre outras. Na anlise RAPD, os 27 primers randmicos validados, geraram pelo menos um fragmento polimrfico na etapa pr-seletiva realizada com os genitores e

51

seis indivduos da prognie. Os primers selecionados (OPC9, 0PC19, OPI7, OPI10, OPR1, OPR2,OPR5, OPR6, OPR7, OPR9, OPR10, OPR13, OPR14, OPR15, OPY14, OPI1, OPR12, OPF3, OPF1, OPF4 OPI13, OPC10, OPI14, OPF13, OPC6, OPR7, OPC7 ) possibilitaram a amplificao de 58 fragmentos, sendo 36 e 22 com padro de segregao heterozigoto para o citrumelo Swingle e limo Cravo, respectivamente. Em mapas de ligao de tangor Murcott, BASTIANEL (2005) encontraram uma alta porcentagem (50%) de fragmentos AFLP com mesmo tamanho em ambos genitores, e que segregaram na proporo 3:1 na prognie, sugerindo uma elevada similaridade gentica entre os genitores tangor Murcott e laranja Pra. Isso estaria de acordo com a origem hbrida do tangor Murcott, que tem na laranja doce um dos genitores (HODGSON, 1967; ARAJO et al., 2003). Neste trabalho, nenhum marcador RAPD foi encontrado apresentando segregao 3:1. Enquanto que para os marcadores TRAPs, dois marcadores foram encontrados apresentando esta proporo de segregao. O nmero de marcadores SSR avaliado foi de 57 pares de primers obtidos de seqncias de ESTs e 171 obtidos a partir de DNA genmico, totalizando 228 pares de primers avaliados utilizando-se os dois genitores uma amostra de seis indivduos da prognies (Figura 6).Vinte e cinco pares de primers foram selecionados com base no polimorfismo entre os genitores e segregao na prognie para os primers SSR provenientes de seqncias de ESTs e 40 pares de primers foram selecionados das bibliotecas genmicas.

52

LC

CS

h1

h2

h3

h4

h5

h6

Figura 6. Teste de primers SSR (CCSME9) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5 e 6).

A porcentagem de pares de primers polimrficos selecionados a partir dos SSR de bibliotecas de ESTs foi maior (43,85%) do que os pares de primers selecionados das bibliotecas genmicas (23,39%). Segundo a literatura, os SSR derivados de bibliotecas de ESTs tm se mostrado menos polimrficos que aqueles derivados de seqncias genmicas (SCOTT, 2001). Assim, era de se esperar maior polimorfismo de primers de bibliotecas genmicas, no presente trabalho. Entretanto, para o desenho dos primers a partir de seqncias ESTs do CitEST foi realizada uma seleo in silico de primers que apresentassem maior polimorfismo (PALMIERI et al., in press). Para esta seleo, um PCR virtual foi simulado com vrias espcies de citros; o primer sintetizado foi aquele polimrfico para uma ou mais espcies. In silico uma expresso usada no mbito da simulao computacional e reas correlatas para indicar algo ocorrido por intermdio de uma simulao computacional que modelam um processo natural ou de laboratrio (DANCHIN, et al., 1991). Esta seleo, provavelmente, contribuiu para o desenvolvimento de marcadores SSR mais polimrficos nas bibliotecas ESTs quando comparados aos das bibliotecas genmicas. Em uma anlise reunindo os marcadores selecionados RAPD, SSRs e TRAPs, a hiptese nula de segregao foi testada (2, p < 0,05 ) para as propores mendelianas esperadas (1:1; 1:2:1, 1:1:1:1 e 3:1), empregando-se o teste estatstico do Qui-quadrado individualmente para todos os marcadores selecionados. Os resultados encontram-se nos anexos III, IV e V. Uma freqncia de 31% dos 53

marcadores apresentou segregao distorcida em relao s propores mendelianas de segregao esperada. A literatura relata desvios de segregao em marcadores em mapas de ligao gentica em vrios nveis em hbridos intergenricos e interespecficos com valores entre 3,9% (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF , 1994) e 100% (NIENHUIS et al., 1987). OLIVEIRA et al. (2005) observaram 61,5% de desvio de segregao em marcadores de laranja Pra e 25,5% em tangerina Cravo, quando comparado com a segregao mendeliana esperada de 1:1 (p < 0,05), sendo que marcadores heterozigticos em ambos os genitores mostraram 40% de desvio de segregao esperada de 3:1 (p < 0,05). Em P.trifoliata cv Rubidoux RUIZ & ASINS (2003) encontraram 39,7% dos marcadores com desvio de segregao. TANKSLEY et al. (1992) sugeriram que rearranjamentos cromossmicos, seleo gamtica, zigtica e/ou ps-zigtica podem causar desvios de segregao em vrias espcies. Segundo RUIZ & ASINS (2003), a presena de fatores letais recessivos e o favorecimento de alguns alelos na seleo gamtica ou aborto do embrio, por exemplo, so possveis causadores de segregao distorcida em citros em nvel gamtico e zigtico. 4.3.2 Anlise de ligao Os 65 pares de primers SSR, 27 primers RAPD e 4 pares de primers TRAP selecionados, resultaram em 154 marcadores. Os marcadores polimrficos e segregantes foram avaliados em um total de 94 indivduos da prognie. Uma matriz de dados foi ento gerada onde as colunas representavam os diferentes indivduos da prognie e as linhas constituem os marcadores moleculares. As relaes de ligao dos marcadores segregantes foram estabelecidas utilizando-se o programa JoinMap. Com base na anlise de ligao, 77 marcadores dos 154 encontrados se agruparam em 8 grupos de ligao de citrumelo Swingle (Figura 7) e 33 marcadores se ligaram em 7 grupos de ligao de limo Cravo (Figura 8). 44 marcadores no se ligaram em nenhum dos mapas. Contudo, com um grau de saturao maior do mapa, alguns destes marcadores poderiam estar ligados, alm de poderem ser utilizados em outras anlises empregando-se ANAVA para encontrar associaes significativas com outras caractersticas. A distncia entre os marcadores nos grupos de ligao variou de 0 (isto , 54

dois marcadores que co-segregam completamente ligados) a 45 cM, com mdia de 9,9 cM entre marcadores para o citrumelo Swingle. Para o mapa de limo Cravo, a distncia entre marcadores de 2 a 45 cM, com mdia de 13,78 cM entre marcadores. Os tamanhos individuais dos grupos de ligao variaram de 54 a 129 cM para citrumelo Swingle e 32 a 105 cM para o limo Cravo. O comprimento total dos mapas foi de 765 cM para citrumelo Swingle (Tabela 5) e 455 cM para o limo Cravo (Tabela 6).

Tabela 5. Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centimorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de citrumelo Swingle.
Grupo de ligao* GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 GL6 GL7 GL8 Total Nmero e tipo de marcadores 3 RAPD, 4 SSR e 1 TRAP 9 RAPD e 1 SSR 2 RAPD, 4 SSR e 3 TRAP 8 RAPD e 2 TRAP 3 RAPD, 8 SSR e 6 TRAP 7 SSR e 4 TRAP 6 RAPD 5 RAPD e 1 SSR 77 Distncia (cM) 129 118 116 105 90 80 73 54 765

* Os grupos de ligao foram numerados seqencialmente do mais longo para o mais curto.

Tabela 6. Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centimorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de limo Cravo.
Grupo de ligao* (cM) GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 GL6 GL7 Total Nmero e tipo de marcadores 12 RAPD 3 SSR e 1 TRAP 5 RAPD e 1 SSR 1 RAPD e 1 SSR 4 RAPD 2 SSR 3 SSR 33 Distncia 105 85 82 68 45 38 32 455

* Os grupos de ligao foram numerados seqencialmente do mais longo para o mais curto.

Um mapa com menor nmero de marcadores foi obtido para o limo

55

Cravo. Em estudos realizados por RUIZ & ASINS (2003), mapas de ligao gentico construdos para os cruzamentos C. volkameriana x P. trifoliata e C. aurantium x P. trifoliata, o genitor da espcie Citrus foi heterozigoto em mais locos que P. trifoliata, fazendo com que a densidade dos mapas de Citrus spp fossem maiores do que qualquer mapa com P. trifoliata. No presente trabalho, o genitor citrumelo Swingle, por se tratar de um hbrido entre C. paradisi x P. trifoliata, apresentou maior nmero de locos em heterozigose e, portanto, um mapa mais denso em marcadores pode ser obtido para este genitor. Considerando o tamanho do genoma de citros estimado, utilizando o programa Mapmaker (LANDER et al., 1987) como sendo entre 1.500 cM e 1.700 cM (JARREL et al., 1992), os mapas de ligao construdos no presente trabalho, utilizando o aplicativo JoinMap, cobriram de 45 a 51% o mapa de citrumelo Swingle e 27 a 30% o mapa de limo Cravo. No caso de mapeamento utilizando pseudo-testcross, a ocorrncia de marcadores comuns aos dois genomas em um mesmo grupo de ligao depender da presena do mesmo marcador em ambos os genomas e do seu estado allico. Enquanto em nvel interespecfico, a sobreposio muito baixa, em nvel intraespecfico, ir aumentar medida que indivduos da mesma populao forem utilizados (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF, 1994). Para integrar mapas de ligao construdos com a estratgia pseudotestcross, marcadores codominantes multiallicos com alelos de ambos os genitores segregando so mais eficientes, fornecendo um conjunto de locos que podem ser utilizados como ponte (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF, 1994).

56

1
0 R13-550 0 4

2
R9-3000 C9-700 0 12 22 32 Y14-1650 C9-400 Y14-500 Y14-3000 C9-5500 34 38

3
R1-1750 CCSM57 22 P1R2-2 I10-580 0

4
R5-925 0 1

5
CCSME22 CCSME20 0 1 7 13 R10-1200 19 27 30 38 41 50 51 54 56 63 67 70 85 89 90 P2R2-7 P1R2-1 R14-900 CCSME49 P1R3-9 P1R3-10 CCSM163 P2R2-6 CCSM161 R13-575 CCSM118 P1R2-3 CCSM128 CCSM53 CCSM55 R14-2500 27 34 43 45 49

6
P2R2-5 CCSME102 CCSME92 CCSME109

P2R2-9 CCSME114 CCSME89 CCSME91 P1R1-9

45 49 57

CCSME26 R2-2150 CCSM29

38 43 56

36 44 45 52 64

R5-1325 P1R2-7 P1R2-6 R7-630 R15-750 R14-1500

55 56 69

CCSM40 P2R2-4 CCSM119 P2R2-10

65

P1R1-3

74

P1R2-4 82 I10-1800

76

74

80 89 R1-870

CCSME97

97 102

CCSM147 CCSM17

105 118 I10-1650 116 CCSME50

R6-1100 0 13 26 40 61 73

7
F1-620 CCSM170 C2-610 R12-950 I13-815 C10-540 24 27 30 35 54 0

8
I14-540 F13-990 C6-490 R9-1500 R7-630 C7-900

129

R7-1100

Figura 7. Mapa de ligao de citrumelo Swingle com 77 marcadores (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) em 8 grupos de ligao.

57

1
0 R5-80

2
0 1 CCSME89

0 1 2 2 3 4 5 5 6 8 9 10 R7-57 I10-165 R14-130 R13-57 R5-35 R14-75 R1-35 R7-45 R15-95 R12-60 I10-45 8 CCSM29 5 P2R2-2 5 6 6 8 CCSME107

F4-161

0 2 I1-45 1 2 3 3

CCSM91 CCSM118 Y1 -400 CCSM55 CCSM53 0 0 R12-150 CCSM46 0 CCSME114

R15-35 T14-84 CCSM39 R2-135

F3-49 2 CCSME109

6 6

4 CCSM163 4 CCSM161

I11-93 F10-82

CCSME52

CCSM102

Figura 8. Mapa de ligao de limo Cravo com 33 marcadores (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) em 7 grupos de ligao.

58

Dos 65 pares de primers SSR, 23 provenientes de seqncias de ESTs e 23 provenientes das seqncias genmicas foram includos nos mapas de ligao de citrumelo Swingle e limo Cravo. Destes, 19 pares de primers (Anexo IV) produziram bandas que segregaram de forma informativa em todas as prognies, isto , ambos os pais so heterozigotos e pelo menos trs alelos diferentes esto segregando, de modo que quatro gentipos diferentes podem ser identificados na populao. Isso possibilita o reconhecimento de grupos de ligao homlogos entre os genitores, diferentemente de quando somente um dos pais heterozigoto e o marcador SSR somente mapeado em um dos mapas. Marcadores mapeados em ambos os genitores (configurao completamente informativa), pode ser constatado pelos marcadores CCSM53, 55, 161 e 163 que foram mapeados no grupo 4 de limo Cravo e no grupo 5 de citrumelo Swingle, mostrando marcadores SSR em comum entre estes grupos de ligao (Figura 9). BRONDANI et al. (2006) observaram que dos 234 marcadores SSR utilizados em trabalhos de mapeamento gentico em Eucalyptus, 74 eram informativos para o genitor feminino (E. grandis), 32 eram informativos para o genitor masculino (E. urophylla) e 128 (55%) eram completamente informativos, isto , segregavam em ambos os genitores com um total de trs a quatro alelos. Os autores no observaram nenhum marcador SSR segregando na proporo 1:2:1, isto , igualmente heterozigoto em ambos os genitores. No presente trabalho, foram observados 15 marcadores SSR segregando na proporo 1:2:1 (Figura 10). Assim, locos que foram heterozigotos em ambos os genitores (tipos de segregao hkxhk, abxcd e efxeg) podem ser considerados para a comparao de mapas possibilitando a explorao de relaes de genes colineares (sintenia) por mapeamento comparativo. Mapeamento comparativo trata da comparao da ordem e posio relativa de genes e marcas em mapas de diferentes espcies. Comparaes entre espcies mais prximas revelam alto grau de sintenia e colinearidade dos mapas. Nestes casos, o local de muitos genes pode ser estimado por simulao. Comparaes entre espcies mais distantes revelam perda crescente de sintenia. A colinaridade ocorre quando a ordem dos genes em um grupo de ligao ou no cromossomo preservada entre espcies distintas. O mapeamento comparativo (comparative mapping ou synteny mapping) constitui outra importante aplicao dos mapas genticos. A comparao das estruturas genmicas de diferentes espcies, do ponto de vista de 59

homologia de genes e conservao de distncias e da ordem de ligao nos cromossomos, permite melhor compreenso da evoluo dos genomas (FEUILLET & KELLER, 2002). Outra utilizao do mapeamento comparativo como estratgia de obteno de um mapa nico de referncia para a maioria das espcies vegetais cultivadas, pelo menos ao nvel de famlias taxonmicas (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). GL 5
0 1 CCSME20 CCSME22

GL 4
0 CCSM91

19 27 30 38 41 50 51 54 56 63 67 70 85 89 90

P2R2 -7 P1R2 -1 R14-900CCSME49 P1R3 -9 P1R3 -10 CCSM163 P2R2 -6 CCSM161 R13-575 CCSM118 P1R2 -3 CCSM128 CCSM53 CCSM55 R14-2500

15

CCSM118 CCSM119

27 30 33

Y14-4000 CCSM55 CCSM53

65 68

CCSM161 CCSM163

Figura 9. Grupos de ligao de citrumelo Swingle (A) e limo Cravo (B) mostrando marcadores SSR em comum.

A comparao de mapas importante para se inferir sobre diferenas e observaes pontuais entre as espcies ou variedades em estudo. Como, por exemplo, os trabalhos de RUIZ & ASINS (2003), em que foram comparados mapas de duas variedades de P. trifoliata Flying Dragon e Rubidoux, onde explanaes so feitas sobre a possvel origem mutante da caracterstica peculiar que Flying Dragon apresenta, o de ser um porta-enxerto ananicante. Como dois marcadores distanciados de 7,1 a 8,7 cM no mapa do Flying Dragon no esto 60

ligados em Rubidoux, os autores sugerem ou a ocorrncia de uma translocao ou uma inverso paracntrica envolvendo ambos marcadores.

M LC CS 1

2 3

7 8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M

Figura 10. Marcador SSR (CCSM19) segregando na proporo 1:2:1. LC = limo Cravo, CS = citrumelo Swingle, 1 a 18 hbridos e M = Marcador de peso molecular Ladder 1 Kb Plus.

RUIZ & ASINS (2003), em semelhante anlise, para mapas comparativos de Poncirus e Citrus observaram translocaes afetando a homeologia dos grupos de ligao em marcadores que se caracterizam por uma ordenao diferente em mesmo grupo de ligao, apontando diferenas dos mapas dos dois genitores em estudo. Nestes estudos, essas diferenas podem ser devido a delees, diferenas na frao de recombinao ou ao nmero amostral de indivduos utilizados (RUIZ & ASINS, 2003). Com relao aplicabilidade dos mapas genticos nas anlises de QTLs e seleo assistida por marcadores, diferenas na ordem dos marcadores tm conseqncias mais intensas do que diferenas em suas distncias. Por isso, fatores que afetam a ordem dos marcadores e a colinearidade dos mapas merecem destaque a escolha do critrio LOD, que pode ser mais ou menos estringente, as diferentes fases de ligao dos alelos, distores na segregao e reorganizaes cromossmicas. Devido ao menor nmero de marcadores selecionados para a construo dos mapas de limo Cravo, um critrio de ligao LOD > 3 foi empregado, sendo que um LOD > 4 foi utilizado para o mapa de citrumelo Swingle que possuia maior nmero de marcadores. Esta diferena do critrio LOD pode ter resultado na 61

diferena da ordem dos marcadores nos grupos de ligao 4 de limo Cravo e 5 de citrumelo Swingle (Figura 9). 4.4 Mapeamento de QTLs As anlises de segregao dos marcadores na prognie resultaram em 77 marcadores no mapa de citrumelo Swingle (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) e 33 marcadores no mapa de limo Cravo (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) do total de marcadores mapeados. No mapa de citrumelo Swingle, apenas foram considerados grupos de ligao com mais de trs marcadores. Para a localizao de QTLs, os dados fenotpicos avaliados foram analisados separadamente e associados aos mapas de ligao com a utilizao do programa MAPQTL v.4.0 (Figura 11).

Tabela 7. Detalhes dos QTLs detectados nos grupos de ligao de citrumelo Swingle, pelo mtodo Multiple QTL Maping (MQM) associados s caractersticas estudadas. Grupo de ligao 4 6 6 3 Intervalo (cM) 0,0 22,0 18,4 23,4 0,0 7,0 76,4 91,4 LOD Crtico 3,80 5,80 7,10 7,10 Efeito (%) 76,10 95,10 50,80 37,70

Caracterstica Morfologia foliar CTV Enraizamento de estacas

LOD 3,87 5,94 15,96 7,86

Varincia 0,0140 0,0061 0,0012 0,0260

As anlises pelo mtodo de Multiple QTL Mapping (MQM) detectaram a presena de um QTL para resistncia a CTV no grupo de ligao 6 (GL 6), um para morfologia foliar no grupo de ligao 4 (GL 4) e dois QTLs para a caracterstica enraizamento de estacas nos grupos de ligao 3 e 6 (GL 3 e 6). O teste de Permutao (1000 repeties) detectou um LOD score crtico inferior (P < 0,05) ao LOD gerado e a presena de QTLs com efeitos de 76,1%, 95,1%, 50,8% e 37,8% na variao fenotpica observados para as caractersticas morfologia foliar, resistncia a CTV e enraizamento de estacas, respectivamente (Tabela 7 e Figura 11 ). Trs QTLs de menor efeito foram encontrados para enraizamento de estacas (dados no apresentados). Nenhum QTL foi localizado no mapa de limo Cravo,

62

muito provavelmente devido baixa densidade de marcadores no mapa. Os QTLs para resistncia a CTV e morfologia foliar apresentaram grandes efeitos na expresso fenotpica. Estas caractersticas foram relatadas na literatura como condicionadas por pelo menos dois genes de grande efeito. A tolerncia tristeza dos citros est condicionada por pelo menos dois locos, Az e t interagindo em uma epistasia dominante-recessiva (BORDIGNON et al., 2004). No presente trabalho, foi encontrado um QTL para CTV explicando 95% da varincia fenotpica no grupo de ligao 6, entre os marcadores CCSME109 e P2R2-9, sendo este ltimo marcador um loco marcador TRAP e est relacionado a genes envolvidos com a sntese de lignina. Um aumento na expresso de genes associados com a sntese de lignina foi observado em trabalhos em que houve a comparao de genes diferencialmente expressos em plantas infectadas e no infectadas com vrus (CRISTOFANI et al., in press). Vale ressaltar que ligninas so compostos fenlicos encontrados nas paredes secundrias do sistema vascular vegetal e desempenham importantes papis biolgicos, reduzindo a permeabilidade da parede celular em relao gua, estando tambm envolvidas em mecanismos de defesa contra patgenos. A via metablica da lignina e as enzimas envolvidas na sua sntese vem sendo caracterizadas nos ltimos anos. Uma srie de genes que codificam diferentes enzimas envolvidas na biossntese da lignina foram identificados em diferentes espcies de plantas. A biossntese de lignina est acoplada ao metabolismo dos fenilpropanides, apresentando enzimas compartilhadas com outros processos metablicos tais como cido cafico O-metiltransferase (COMT) assim como enzimas especficas como cinamoil-CoA redutase (CCR) RAMOS et al. (2001), utilizadas no presente trabalho. Um dos mecanismos de ataque dos fitopatgenos a produo de enzimas lignolticas, que atuam sobre a lignina da parede celular, rompendo as barreiras e defesas do hospedeiro e colocando em disponibilidade nutrientes, a partir de substncias constituintes dos tecidos vegetais infectados MENZIES et al. (1991) Nos trabalhos de KUHN (2007), foi observado que na ausncia do fitopatgeno e, aps a aplicao do indutor qumico ASM [induo mediada por acibenzolar-S-metil (ASM), indutor qumico], a induo de resistncia foi associada ao aumento da sntese de lignina e reduo no teor de fenis; aumentos no teor de protenas solveis e de acares redutores nas folhas; reduo do 63

crescimento e da produtividade. Mecanismos genticos de herana simples e oligognica j foram observados para outras doenas e patgenos dos citros, como por exemplo, a resistncia ao nematide T. semipenetrans (LING et al., 2000) e ao vrus da tristeza (MESTRE et al., 1997a, b, c; CRISTOFANI et al., 1999). Um QTL significante associado resistncia a Pierces disease (PD) em uva, causada pela bactria Xylella fastidiosa foi localizado no mapa do genitor resistente explicando 72% da varincia fenotpica (KRIVANCK et al., 2006). Os autores acreditam que a resistncia seja controlada por um alelo dominante em um loco de maior efeito com algumas modificaes fenotpicas causadas pelo ambiente ou por genes de menor efeito. BASTIANEL (2005) obteve resultados semelhantes com as anlises de QTL para resistncia leprose em citros. Encontrou um QTL explicando 80% da variao fenotpica para leprose. No presente estudo, os resultados obtidos pelo MQM mapping sugerem um QTL para a folha trilobada explicando aproximadamente 76,1% da varincia fenotpica (Tabela 3 e Figura 11). Entretanto, a proporo de segregao de 3:1 de folhas trilobadas para folhas simples (65:29;
2

= 1,70 = 0,05%) consistente

com dois genes dominantes segregando independentemente. A alta herdabilidade observada e a distribuio em classes fenotpicas distintas (monofolioladas, mistas ou trifolioladas), corroboram com as anlises de QTL, ou seja, possivelmente, um gene de grande efeito esteja envolvido, embora no exclua a possibilidade de outros genes, de efeito menor, possam estar envolvidos na herana das caractersticas. No presente estudo, os resultados obtidos pelo MQM mapping utilizando as mdias de ndice de morfologia foliar, sugerem a presena de um QTL. A alta herdabilidade observada e a distribuio em classes fenotpicas distintas (folhas simples e mistas ou trifolioladas), corroboram com as anlises de QTL, ou seja, de que possivelmente pelo menos um gene de grande efeito esteja envolvido, embora, no exclua a possibilidade de outros genes, de efeito menor, possam estar envolvidos na herana da caracterstica uma vez que observamos uma grande variao no morfologia tanto nas folhas simple como nas trilobadas (Figura 2) em relao aos genitores. OLIVEIRA et al. (2002) obtiveram um ndice de morfologia

64

do pice foliar onde os hbridos exibiam um nvel intermedirio do ndice em relao aos genitores tangor Murcott e laranja Pra. Os altos valores de coeficientes de herdabilidade individual no sentido amplo ( h 2 g > 0,40), a alta preciso experimental ( CV g / CVe 1 ) e a alta acurcia na avaliao fenotpica ( Acclon > 0,85 ) observados para as caractersticas resistncia a CTV e ndice de morfologia foliar indicam que o prprio fentipo um bom indicador do valor genotpico dos indivduos (VENCOVSKY, 1987; RESENDE, 1995). Caracteres de alta herdabilidade apresentam controle gentico mais simples, sendo provavelmente controlados por um menor nmero de genes, e assim, para esses caracteres existe uma maior probabilidade de deteco de QTLs (REZENDE, 2002).
2 2 Os baixos valores hg ( hg = 0,29) encontrados para a caracterstica

enraizamento de estacas e a deteco de dois QTLs em grupos de ligao de Poncirus trifoliata so indicativos de que esta caracterstica controlada por alguns genes de efeito principal. Em um trabalho visando mapear QTLs associados ao enraizamento de estacas utilizando uma prognie de C. sunki x Poncirus trifoliata, SIVIERO et al. (2003) encontraram dois QTLs no mapa de ligao de Poncirus trifoliata. Os QTLs identificados eram responsveis por 15,8% e 20,9% da variao fenotpica para a caracterstica enraizamento de estacas (Figura 11).

65

ndice de Morfologia Foliar - MQM Mapping

4 6 5

Resistncia a CTV - MQM Mapping

76,1% *

4 3 2 1

95,1% *

CCSME97

P2R2-5 CCSME102

P1R1-9 CCSME91 CCSME89

CCSME92

R7-630 P1R2-7 P1R2-6 R5-1325

R15-750

R6-1100

CCSME109

CCSME114

A
Enraizamento de estacas - MQM Mapping
20
9 8

10

Figura 11. QTLs associados morfologia foliar (A), resistncia a CTV (B) e enraizamento de estacas (C e D) em mapas de ligao de citrumelo Swingle. * Porcentagem de variao fenotpica que cada QTL pode explicar.

R5-925

R14-1500

R10-1200

Grupo de ligao 4 (cM)

R1-870

P2R2-9

P1R1-3

lod lod crtico

lod Grupo de ligao 6 (cM) lod crtico

B
Enraizamento de estacas - MQM Mapping

50,8% *

7 6 5 4 3 2

37,8% *

1 0 I10-580 P1R2-2 P2R2-4 CCSM40 R1-1750 P2R2-10 CCSM119 CCSM57 CCSME50

P2R2-5 CCSME102

P2R2-9

P1R1-3

CCSME109

CCSME92

Grupo de ligao 6 (cM)

CCSME114

CCSME97

CCSME89

CCSME91

P1R1-9

lod lod crtico

Grupo de ligao 3 (cM)

lod lod crtico

66

5 CONCLUSES

Os resultados obtidos permitem concluir que: a) A populao de mapeamento analisada considerada representativa para os estudos das caractersticas apresentadas nos genitores limo Cravo e citrumelo Swingle. b) O polimorfismo obtido pelos marcadores TRAPs, com uma mdia de 7,75 marcadores por par de "primers, foi superior aos RAPDs (2,14 por primer), permitindo aumentar de forma significativa a densidade dos mapas de ligao. c) A configurao completamente informativa com 19 marcadores SSR mapeados em ambos os genitores, permite um maior poder de deteco de grupos de ligao com marcadores em ambos os genitores, possibilitando explorar as relaes de genes colineares (sintenia) por mapeamento comparativo. d) Os marcadores apresentando 31% de taxa de desvio de segregao podem ser considerados para a construo dos mapas de ligao para Citrus, em virtude de rearranjos cromossmicos, seleo gamtica, zigtica e/ou pszigtica, assim como, presena de fatores letais recessivos que ocorrem, geralmente, neste gnero e naqueles correlatos, como Poncirus. e) A alta herdabilidade para a caracterstica morfologia foliar confirmada com as anlises dos QTL em citrumelo Swingle e um gene de grande efeito est envolvido na determinao dessa caracterstica. f) Em funo da baixa densidade do mapa de limo Cravo no foi possvel detectar QTLs para nenhuma caracterstica. g) Embora existam na literatura diferentes classes fenotpicas ocorrendo na resistncia ou mesmo tolerncia a CTV, abrindo possibilidades de uma possvel dominncia incompleta ou mesmo hipteses de epistasia dominante-recessiva, tais observaes no influenciam sobremaneira nas concluses concernentes ao controle gentico monognico encontrado no presente trabalho, com proporo 1:1.

67

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7 ANEXOS Anexo I. Distribuio de mdias para as variveis: nmero de estacas enraizadas (mensuradas em 94 hbridos e seus genitores), absorbncia em ELISA (CTV) (mensurada em 85 hbridos e seus genitores) e ndice de morfologia foliar (mensurado em 90 hbridos e seus genitores)......................................................... 88 Anexo II. Anlise de varincia para CTV, enraizamento e morfologia foliar, referentes avaliao de uma populao de hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle em experimento completamente casualizado em casa de vegetao (Aplicativo: SASM-Agri, CANTERI et al., 2001)................................................. 89 Anexo III. Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana.............................................................................................................. 90 Anexo IV. Marcadores Microssatlites obtidos a partir de bibliotecas genmicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetio, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana.............................................................................................................. 91 Anexo V. Marcadores TRAPs, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana................................................... 93

87

35

30

Nmero de observaes

25

20

15

10

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

Nmero de estacas enraizadas

24 22 20

Nmero de observaes

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Absorbncia em ELISA (CTV)

35 30

Nmero de observaes

25 20 15 10 5 0

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2

2.6

3.0 3.2

3.6 3.8

4.2

ndice de morfologia foliar

Anexo I. Distribuio de mdias para as variveis: nmero de estacas enraizadas (mensuradas em 94 hbridos e seus genitores), absorbncia em ELISA (CTV) (mensurada em 85 hbridos e seus genitores) e ndice de morfologia foliar (mensurado em 90 hbridos e seus genitores).
*As variveis associadas ao nmero de estacas enraizadas e leitura da absorbncia em ELISA (CTV) mostram distribuio em classes distintas, enquanto que o ndice de morfologia foliar mostra uma distribuio contnua, aproximadamente normal.

88

Anexo II. Anlise de varincia para CTV, enraizamento e morfologia foliar, referentes avaliao de uma populao de hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle em experimento inteiramente casualizado em casa de vegetao (Aplicativo: SASM-Agri, CANTERI et al., 2001). CTV Fonte de variao Gentipo Resduo CV(%) N de repeties
Pr* > 5%

Enraizamento Pr*>F GL 95 384 29,9 5 Q.M 0.21 0.072 F Pr*>F GL 91 84

Morfologia foliar Q.M F Pr*>F 0,015

GL 86 174 72,81 3

Q.M

0.407 3,35 0,01348 0,121

2,99 0,014

0,433 6,205 0,069 10 3

89

Anexo III. Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana.

Marcador C9-400 C9-700 C9-4000 C9-5500 C19-950 I7-600 I10-450 I10-580 I10-1650 I10-1800 R1-350 R1-870 R1-1750 R2-2150 R5-350 R5-800 R5-925 R5-1325 R6-1100 R7-450 R7-570 R7-630 R7-1100 R9-3000 R10-1200 R12-600 R13-550 R13-575 R14-750 R14-900 R14-1300 R14-1500 R14-2500 R15-750 R15-950 Y14-500 Y14-1400 Y14-1650 Y14-3000 Y14-4000 Tipo de segregao* nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp lmxll nnxnp lmxll nnxnp nnxnp nnxnp lmxll nnxnp nnxnp nnxnp lmxll lmxll nnxnp nnxnp nnxnp lmxll lmxll nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp lmxll nnxnp nnxnp lmxll nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp lmxll nnxnp lmxll nnxnp nnxnp lmxll

8.34042553191** 0.680851064 3.446808511 5.14893617021** 1.063829787 0 0.042553191 2.085106383 0.042553191 4.25531914893** 1.531914894 0 7.19148936170** 22.510638297*** 0.680851064 0.170212766 0.170212766 2.085106383 0.382978723 7.191489362 0.042553191 10.8936170212*** 3.446808511 1.063829787 3.446808511 4.255319149 10.8936170212*** 33.361702127*** 1.531914894 1.063829787 12.2978723404*** 7.19148936170** 2.085106383 5.14893617021** 0.170212766 0.382978723 9.57446808510*** 0.170212766 0.382978723 10.8936170212***

Nveis de significncia: *cdigos do programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001), referentes aos tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators) (Tabela 1), ** =0,05, *** =0,01 a 1 grau de liberdade (GL).

90

Anexo IV. Marcadores Microssatlites obtidos a partir de bibliotecas genmicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetio, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana. (Continua...)
Primer CCSM 01 CCSM 09 CCSM 12 CCSM 17 CCSM 19 CCSM 29 CCSM 40 CCSM 46 CCSM 51 CCSM53 CCSM55 CCSM 091 CCSM 146 CCSM 118 CCSM 128 CCSM 129 CCSM 147 CCSM 151 CCSM 154 CCSM 156 CCSM 161 CCSM 162 CCSM 163 CCSM 168 CCSM 170 CCSME 020 CCSME 022 CCSME 024 CCSME 026 CCSME 027 CCSME 049 Repetio (AG)n (AG)n (AG)n (AG)n (AG)n (TGA)15(TTA)9 (GCAACA)10 (GCA)6(CAA)8 (CA)21 (GTT)7 (CAA)7 (AG)14 (AG)25 (GT)12 (GT)6 TTC (T)12 (CA)7 (TA)4 (AG)18 (TC)12 (AG)19 (TC)20 (GA)14 (TC)13 (TC)14 (AG)16 (GA)21 (CTGCTC)5 (ATC) 8 (AT) 11 (GT) 10 (ATAG) 5 (GTTGA)6 Forward (53) cagctccaagaaacccta gactggattagagttctctg gattgaatcttctgtagctc acatggacaggacaactaag ggacactgtgactaa cgtgattgtgtccga acaagagtcgcaacaatc ataccttatcaagtaacacg ccaagcttcccgggtaccgc atgacgacatcgacaacg agcatgaagagcagcaag gagattaaagatgaagac tggttagaaggtgaacag tcaatagaggatacactacc atctgatagatgagccac gtatgtggagagatgttc agactcacgtaacctacttc acgtagagcttgttatagag gactccgcttctgttctatg gtctctgttgtgtgtcggtt tacacatacatgcacgtaca cagctgcagtatccatctaa actcagtacgctcctcaata acttacatgcaaggagagtg agttgagtactgtgtgcgaa catctcagactcctgcacca ctatcggcaaaggagcagtc gcttcttggaatggagcaag gaagaagaagcacgaggacg gttttgcttgctttgtgtcg aataagcgtatcagcagcagg Reverse (53) gccaatatatcatgcaggta atggatgtgttatctcactc atcatcatctagtgtcactg gttatgatacgtctgtgtcc agctaccaagacaccacc cacacttcacaatgttgcac gacaacagtggcaatacc tcagaatgagtactagctcc agtgtgctggaattcggc cgttaccacttcaccaatac gcttggcctctcactcta ttcttgtgactgtactcg acatagaggtttgcttatc tgtcaacaaggctatacac taacagttgtagttgtcc atctgctcttatgaccac gctatgttatgatacgtctg ctaggattgttagagatagc acaatagaccagcacttcaa acgaagtgaagtgtgtaatg actcagtacgctcctcaata ggtgaagtcaagtgcgag tacacatacatgcacgtaca gagacactggaaggtatcaa ctaatggctgagagagttgc ccctccacccatatcaagaa tctctgcaggtaaggttggg cgtttttctgaggtcacggt ccccaaaaataaagcagcaa caaacccatctaaagcccaa aatcatgaacgggctgaaac Tipo de segregao efxeg abxcd hkxhk nnxnp hkxhk hkxhk abxcd lmxll lmxll hkxhk hkxhk lmxll lmxll hkxhk hkxhk hkxhk nnxnp nnxnp efxeg nnxnp efxeg efxeg efxeg efxeg hkxhk nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp hkxhk nnxnp

0.680851064 12.29787234** 6.127659574** 2.085106383 20.59574468** 6.127659574** 1.531914894 5.14893617* 0 0.680851064 1.531914894 0.170212766 0 5.14893617* 0.680851064 1.531914894 0.170212766 0.382978723 0.042553191 8.340425532** 0.042553191 0 0 4.255319149* 0.382978723 0.680851064 1.531914894 1.531914894 1.531914894 0.042553191 0.170212766

91

Anexo IV. Marcadores Microssatlites obtidos a partir de bibliotecas genmicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetio, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana. (Continuao)
Primer CCSME 050 CCSME 052 CCSME 053 CCSME 089 CCSME 091 CCSME 092 CCSME 097 CCSME 099 CCSME 100 CCSME 102 CCSME 107 CCSME 109 CCSME 113 Nveis de significncia: * Repetio (GAA) 7 (TC)14 (TAA) 11 (ATA)7 (GAT)8 (GCC)6 (TCA)6 (TCA)6 (ATT)7 (TCT)6 (TGG)6 (AAT)8 (CAA)8 Forward (53) gagttgggattctgctgttga ctggctcagctctgctcatt gatctccctatcatcggcaa gaggtctcgaagtcacggag cggtaataacgccgtcaagt aagcatcgtcaaagtttggg ccattaacgagaaaaccaaaca cacccacctcgaaaacactt gaaggtgagccaggaccata gccccatccaaaaccttatt ggactccaagcaagcaaaag tcaaagtcgatttctgcacg gtgccaacaatagcagcaga Reverse (53) gactgttgttctgatgccga tgctgctgcttctgcttcta ttttgagggctggatggata acttatcttgcacccgacga tacttttaacggcgtcaccc ttgatgcatgttctcaaggc caaaaaggggttgcaaagaa gcccaactgtcgacaaaaat cctgatacccggaactgaag gaaggttgctgctcttcacc ggttgcgtaagtgtggaggt catatggtttggccgttctt tgtaattgctggcataagcg Tipo de segregao abxcd lmxll nnxnp efxeg lmxll efxeg efxeg hkxhk hkxhk abxcd hkxhk hkxhk hkxhk

0.170212766 1.531914894 2.085106383 0.680851064 0.680851064 9.574468085** 0.170212766 5.14893617* 0.184568387 1.531914894 2.723404255 9.5744680851* 1.063829787

=0,05, ** =0,01 a 1 grau de liberdade (GL)

92

Anexo V. Marcadores TRAPs, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana.
Marcadores P1R1-1 (745)*** P1R1-2 (735) P1R1-3 (685) P1R1-4 (660) P1R1-5 (510) P1R1-6 (360) P1R1-7 (338) P1R1-8 (315) P1R1-9 (245) P1R1-10 (215) P1R2-1 (850) P1R2-2 (680) P1R2-3 (625) P1R2-4 (525) P1R2-5 (318) P1R2-6 (100) P1R2-7 (54) P1R3-1(730) P1R3-2 (690) P1R3-3 (570) P1R3-4 (430) P2R2-1 (830) P2R2-2 (752) P2R2-3 (640) P2R2-4 (630) P2R2-5 (610) P2R2-6 (560) P2R2-7 (430) P2R2-8 (215) P2R2-9 (110) P2R2-10 (98) Nveis de significncia: * Forward (53) Reverse (53) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc =0,05, ** =0,01 a 1 grau de liberdade (GL), *** nmero de pares de bases Tipo de segregao nnxnp lmxll nnxnp lmxll lmxll nnxnp nnxnp lmxll nnxnp lmxll nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp lmxll nnxnp hkxhk nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp lmxll lmxll lmxll nnxnp hkxhk nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp nnxnp

0.680851064 35.7872340425** 0.042553191 10.8936170212** 28.765957446** 0.170212766 12.2978723404** 10.8936170212** 22.5106383 0.170212766 5.1489361702* 1.531914894 1.063829787 3.446808511 2.723404255 0.382978723 0.170212766 0.042553191 4.255319149 4.255319149 1.063829787 0.680851064 1.531914894 1.531914894 7.191489362 0.680851064 35.7872340425** 0.042553191 10.8936170212** 28.765957446** 0.170212766

93