UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA
ESTUDO DE NOVOS SISTEMAS
QUIMILUMINESCENTES APLICADOS NA DETERMINAO
DE ATIVIDADE ENZIMTICA
VALDECIR FARIAS XIMENES
TESE DE DOUTORADO
ORIENTADOR: Prof. Dr. LUIZ HENRIQUE CATALANI
SO PAULO


2
2
2 0 0 0
Para a alma nunca h nascimento nem morte.
Nem, uma vez que exista, ela vai deixar de existir.
Ela no nascida, eterna, sempre existente,
imortal e primordial.


3
3
Bhagavad Gita
minha esposa Aparecida, pelo amor,
compreenso e ajuda durante todos estes anos.
Aos meus filhos amados Thomaz e Pedro, o que
de mais importante aconteceu na minha vida.
minha me Francisca, simplesmente por
ser uma verdadeira ME


4
4
Agradecimentos
Ao Lique, pela orientao, confiana e por nunca estar
plenamente satisfeito com os nossos resultados.
Ao Willi e Ana Campa, os quais eu considero como meus
co-orientadores.
Paulete, por ter me apresentado ao Willi e ao Lique.
Ao pessoal do nosso laboratrio: Lilian, Patrcia, Chien, rick, Carlo,
Sandra, Silvia, Bete, Magali, Ana Luiza, Carminha, Cassius, Sascha, Paulo
Cezar, Luzia, Maurcio, Xud`s, Daisy e Ivan.
Ao pessoal do Laboratrio da Prof. Ana Campa: Elaine, Suely, Rita e
Boni.
Ao Prof. Jair Chagas da Escola Paulista de Medicina, pelas sugestes nos
estudos com o substrato de proteases.
Ao CNPq e Fapesp, pelo apoio financeiro.


5
5
ndice
Resumo
Abstract
1 - Introduo
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3
1. 1- Interao entre luz e matria
1. 1. 1 - Absoro de energia na regio do ultravioleta e visvel
1. 1. 2 - Estados excitados singletes e tripletes
1. 1. 3 - A eficincia das transies eletrnicas
1. 1. 4 - Processos de desativao de um estado eletronicamente excitado
1 . 2- O fenmeno da quimiluminescncia .............................................................................................................
19
1. 2 . 1- Quais so as caractersticas que uma reao quimiluminescente possui?
1. 2 . 2- Caracterizando algumas reaes bio e quimiluminescentes
1. 2. 3- Anis 1,2-dioxetnicos: gerao de estados eletronicamente excitados e quimiluminescncia
1 . 3- Quimiluminescncia direta e indireta: transferncia de energia .....................................................................
27
1. 3 . 1- Reaes promovidas por transferncia de energia
1 . 4- Gerao enzimtica de compostos carbonlicos excitados tripletes via
ao cataltica da peroxidase de raiz forte (HRP) ..........................................................................................
30
1 . 4. 1- Enis so os verdadeiros substratos da HRP
1 . 4. 2- Mecanismo de ao da HRP
1. 5- Quimiluminescncia de derivados indlicos ...................................................................................................
. 3 9
1. 6- Quimiluminescncia de compostos o - hidroperoxi-carbonlicos ......................................................................
43
1. 7- Aplicaes de reaes bio e quimiluminescentes .........................................................................................
49
1. 7 . 1- Luminescncia celular: burst oxidativo
1. 7 . 2- Luciferases e luciferinas: aplicaes de bioluminescncia
1. 7 . 3- Imunoensaios e quimiluminescncia
1. 7 . 3. 1- Enzimaimunoensaios e dioxetanos sintticos
1. 7 . 4- Deteco de fosfatase alcalina livre e em conjugados por quimiluminescncia
1. 7 . 5- Deteco de HRP por quimiluminescncia
2 - Objetivos ...............................................................................................................................54
3 - Desenvolvimento de uma Metodologia Quimiluminescente para
Anlise da Atividade das Enzimas Fosfatases
Alcalina (ALP) e cida (ACP)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9


6
6
3 . 1 - Resultados
3 . 1 . 1 - Sntese do 2-cloro-2-metilpropanal
3 . 1 . 2 - Sntese do dimetil-(2-metil-1-propenil)fosfato
3 . 1 . 3 - Sntese do bis(trimetilsilil)-(2-metil-1-propenil)fosfato
3 . 1 . 4 - Sntese (2-metil-1-propenil)fosfato de anilnio
3 . 1 . 5 - Sntese do (2-metil-1-propenil)fosfato de sdio
3 . 2 - Desenvolvimento do protocolo analtico
3 . 2 . 1 - Sal anilnico versus sal sdico
3 . 2 . 2 - Efeito da concentrao de DBAS e DMSO na atividade da fosfatase alcalina e
quimiluminescncia
3 . 2 . 3 - Correlao [ALP] versus intensidade mxima de luz
3 . 2 . 4 - Correlao [ALP] versus consumo de oxignio
3 . 2 . 5 - Aplicao em anlise d atividade de ALP em soro sangineo
3 . 2 . 6 - Aplicao em tcnica de imunoensaio (conjugado ALP-IgG
3 . 2 . 7 - Aplicao como revelador em um ensaio completo para determinao do vrus Epstein-
Barr.em soro sangineo
3 .2 .8 - Determinao da atividade da enzima fosfatase cida prosttica
3 . 3 - Discusso e Concluses
4 - Tentativa de desenvolvimento de uma metodologia quimiluminescente para anlise da
atividade de
proteases...........................................................................................................................85
4 . 1 - Resultados
4 . 1 . 1 - Sntese da N-isobutilidenoetilamina
4 . 1 . 2 - Sntese da N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida
4 . 1 . 3 - Medidas de consumo de oxignio e quimiluminescncia na oxidao da N-
isobutilidenoetilamina
4 . 1 . 4 - Medidas de consumo de oxignio e quimiluminescncia na oxidao da N-etil-N-(2-
metil-1-propenil)benzenamida
4 . 2 - Discusso e Concluses
5 - Estudo do potencial quimiluminescente da oxidao de derivados indlicos catalisada por
HRP: Desenvolvimento de uma metodologia analtica para determinao de
HRP........................................................................................................................................................
. . 9 4
5 . 1 - Resultados
5 . 1 . 1 - Efeito da concentrao do tampo, tipo de tampo e pH na eficincia de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 2 - Efeito da concentrao do substrato na eficincia de quimiluminescncia da oxidao
do 2-metilindol via HRP/H O /O
2 2 2


7
7
5 . 1 . 3 - Efeito da concentrao da HRP na eficincia de quimiluminescncia da oxidao do
2 -m etilindol via HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 4 -C onsumo ou produo de oxignio na reao
2 -m etilindol/HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 5 - Efeito da concentrao de perxido de hidrognio na eficincia de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 6 - Envolvimento de nions superxido na reao
2 -m etilindol/HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 7 - Comparao da eficincia de quimiluminescncia na oxidao de vrios derivados
indlicos via HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 8 - Espectros de quimiluminescncia, fluorescncia e caracterizao de produtos
5 . 1 . 9 - Diindoxil atuando como um sensibilizador da reao
2 -m etilindol/HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 1 0 -. Relao entre produtos de oxidao e eficincia de quimiluminescncia da reao
2 -m etilindol/HRP/H O /O
2 2 2
5 . 1 . 1 1 - Potenciais aplicaes do sistema 2-Metilindol/HRP/H O /O
2 2 2
5 . 2 - Discusso e Concluses
6 - Sntese e estudo de oo o o -h idroperoxi-aldedos protegidos como substratos quimiluminescentes
de enzimas.........................................................................................................151
6 . 1 - Resultados
6 . 1 . 1 - Tentativa de sntese do 2-peracetxi-2-metilpropanaldedo
6 . 1 . 2 - Sntese do 2-peracetxi-2-adamantanocarboxialdedo
6 . 1 . 2 . 1 - Sntese do iodeto de trimetilsulfoxnio
. . . . 6 . 1 . 2 . 2 - Sntese do 2-epoximetiladamantano
. . . . 6 . 1 . 2 . 3 - Sintese do 2-adamantanocarboxialdedo
. . . . 6 . 1 . 2 . 4 - Sntese do acetato de 2-metiladamantilideno
. . . . 6 . 1 . 2 . 5 - Sintese do 2-peracetxi-2-adamantanocarboxialdedo
6 . 1 . 3 - Estudo do potencial quimiluminescente do 2-peracetxi-2-adamantanocarboxialdedo
6 . 2 - Discusso e concluses
7 - Parte Experimental..............................................................................................................164
7 . 1 - Reagentes
7 . 2 - Equipamentos e mtodos
7 . 3 - Metodologias analticas
7 . 4 - Preparao de solues estoques
7 . 5 - Snteses
7 . 5 . 1 - Sntese de 2-cloro-2-metilpropanal
7 . 5 . 2 - Sntese de dimetil-(2-metil-1-propenil)fosfato
7 . 5 . 3 - Sntese de bis(trimetilsilil)-(2-metil-1-propenil)fosfato
7 . 5 . 4 - Sntese de (2-metil-1-propenil)fosfato de anilnio


8
8
7 . 5 . 5 - Sntese de (2-metil-1-propenil)fosfato de sdio
7 . 5 . 6 - Sntese de N-(2-metilpropilideno)etilamina
7 . 5 . 7 - Sntese de N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida
7 . 5 . 8 - Sntese de 5-metil-3-hexen-2-ona
7 . 5 . 9 - Sntese de 5-hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
7 . 5 . 1 0 - Sntese de 5-peracetxi-5-metil-3-hexen-2-ona
7 . 5 . 1 1 - Ozonlise de 5-peracetxi-5-metil-3-hexen-2-ona
7 . 5 . 1 2 - Sntese do iodeto de trimetilsulfoxnio
7 . 5 . 1 3 - Sntese do 2-epoximetiladamantano
7 . 5 . 1 4 - Sntese do 2-adamantanocarboxialdedo
7 . 5 . 1 5 - Sntese do acetato de 2-metiladamantilideno
7 . 5 . 1 6 - Sntese do 2-peracetxi-2-adamantanocarboxialdedo
8 - Referncias Bibliogrficas.................................................................................................183


9
9
Resumo
O fenmeno da bio- e quimiluminescncia tem atrado o interesse da
comunidade cientfica nas ltimas dcadas no s pelo seu inerente interesse
acadmico, mas tambm devido as incontveis aplicaes analticas que dele tm
surgido. A maior parte do trabalho acadmico que tem sido desenvolvido est
relacionado ao estudo do mecanismo de gerao de estados excitados e a eficincia
de desativao radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicaes
tecnolgicas, as metodologias para anlise de enzimas, drogas e metablitos,
aplicadas imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em
quimiluminescncia, esto entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em
laboratrios. O desenvolvimento de substratos e, conseqentemente, novas tcnicas
quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta
sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que
utilizam rtulos radioativos.
Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias
quimiluminescentes para a determinao de atividade enzimtica. O princpio
qumico a gerao de perxidos cclicos instveis, conhecidos como 1,2-
dioxetanos, aps a hidrlise de substratos especficos, catalisada pela enzima objeto
de estudo. Anis dioxetnicos so conhecidos pela sua propriedade de gerar
produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emisso de
luz pode ser relacionada atividade enzimtica.


1 0
1 0
Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissdico de 2-metil-1-propenila, NA-
MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via
a ao cataltica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase cida (ACP). Este
enol oxidado, sob ao cataltica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP),
gerando acetona em estado excitado triplete. A emisso de luz direta ou
sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da
ALP ou ACP. A determinao da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em
anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicao em tecnologias de
diagnstico, seja como um marcador de diversas doenas, seja como uma sonda em
ensaios imuno-enzimticos (EIA). A sensibilidade alcanada com este substrato foi
de 10
- 1 5
mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluies de at 300.000 de um
conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Tambm foi possvel correlacionar a atividade de
ALP velocidade de consumo do oxignio dissolvido no meio de reao, que uma
caracterstica dessa oxidao.
Partindo do mesmo princpio delineado no pargrafo anterior, desenvolveu-se
um composto para determinao de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-
metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligao
amdica geraria uma enamina, que tambm pode ser oxidada pela ao cataltica da
HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto no reconhecido
como substrato das proteases.
Tomando como base a bem conhecida caracterstica de gerar uma fraca
emisso de luz quando derivados indlicos so oxidados por agentes oxidantes
clssicos, como KMnO , K S O , etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de
4 2 2 4
alguns derivados indlicos quando submetidos ao sistema HRP/H O /O . Como era
2 2 2
esperado, detectou-se quimiluminescncia de baixa intensidade para a maioria dos
derivados indlicos. Tambm neste caso a clivagem do anel indlico, via um
intermedirio dioxetnico, parece ser a responsvel pela emisso observada na
maioria dos compostos testados. Alm disso, a oxidao do composto 2-metilindol
(III) mostrou uma eficincia de quimiluminescncia com cerca de 3 ordens de
grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento
diferenciado desse composto estava relacionado exclusiva formao de um
composto secundrio. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuda ao 2,2-
dimetil-2,2-diindoxil. Ento, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se


1 1
1 1
uma metodologia analtica para determinao de HRP livre ou ligada em anticorpos
(conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo
HRP-IgG so largamente utilizados em EIA.
Tambm com base nas caractersticas quimiluminescentes de o - hidroperxi-
cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial
substrato para anlise de esterases. A hidrlise catalisada por esterase de 2-
peracetoxiadamantano-2-carboxialdedo (IV) geraria um o - hidroperxi-aldedo, que
por um ataque nucleoflico intramolecular, levaria a um intermedirio dioxetnico.
Este composto mostrou-se instvel, gerando quimiluminescncia mesmo na ausncia
da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado.
O
P
O
ONa
ONa
N
O
N
H
O H
OO
O
(I) (II) (III)
(IV)
Abstract
The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists
attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but
also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the
academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the
generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the
other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme,
drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic
science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most
applied techniques in routine laboratory procedures. The development of
chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high
sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels.
This thesis reports the development of new chemiluminescent
methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the
generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of


1 2
1 2
specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by
their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The
light emission can be related to enzymatic activity.
It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-
MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by
alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon
horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The
direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to
enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to
antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a
direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays
(EIA). The sensibility reached with this substrate was 10
- 1 5
mols to ALP, 0,0027 u/mL
to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system
consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may
be performed by following the oxygen uptake rate.
By applying the same principle above delineated, it was synthesized a
compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-
methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to
an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However,
our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases.
Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are
oxidized by classical oxidants like KMnO ,
4
K S O , etc., it was studied
2 2 4
the
chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H O /O oxidant
2 2 2
system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives.
Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate
leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore,
the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3
orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was
related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially
attributed to 2,2-dimethyl-2,2-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was
possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to
antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most
important labels.


1 3
1 3
From the also known chemiluminescent characteristics of o - hidroperoxy-
ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential
substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2 -
acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an o - hidroperoxy-
aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane
intermediate. This compound showed to be unstable and it generated
chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as
planned.
1 - Introduo
1 .1 - Interao entre luz e matria
Em ltima anlise, a energia solar o combustvel que torna possvel todas as
formas de vida em nosso planeta. realmente interessante imaginar que a energia
que gastamos nos movimentando, ou at mesmo pensando, provm dessa radiao
eletromagntica extraterrestre, captada pelos vegetais e transformada em
carboidratos dos quais nos alimentamos. A mquina existente nos seres
autotrficos, capaz de absorver e transformar esta energia em energia potencial
qumica, conhecida como processo fotossinttico
(1)
.
No fenmeno de bioluminescncia, emisso de luz por organismos vivos,
observa-se o processo inverso, ou seja, a transformao de energia qumica em
energia eletromagntica. Certamente, do ponto de vista humano, este processo
bem menos importante do que a fotossntese, mas ser que o mesmo poderia ser
dito a respeito de uma extensa variedade de organismos como peixes, crustceos,
insetos e microorganismos, que dele dependem para processos vitais como
alimentao, defesa, reproduo, etc.
(2)
?
O estudo da interao entre as radiaes eletromagnticas e a matria, alm
de ser um assunto de imenso interesse cientfico, possibilitou o desenvolvimento de
uma srie de aplicaes acadmicas e tecnolgicas. S para citar alguns exemplos
poderamos questionar o que seria, atualmente, da qumica ou da bioqumica se no


1 4
1 4
existissem tcnicas como ressonncia magntica nuclear, infravermelho ou
espectrofotometria? E quantos processos teis existem nos dias de hoje, que
envolvem emisso de luz visvel pela matria, seja atravs de reaes
quimiluminescentes, seja atravs de fluorescncia ou fosforescncia? Alguns
exemplos so: tintas fluorescentes ou fosforescentes, luzes de sinalizao como as
usadas nos lightsticks, centenas de aplicaes de reaes bio e quimiluminescentes
em metodologias biomdicas, etc.
1 .1 .1 - Absoro de energia na regio do ultravioleta e visvel
Descoberto por Planck, em 1900 quando estudava as radiaes de um corpo
negro, e refinado por Einstein em 1905, ao explicar o fenmeno fotoeltrico, a
Quantizao da energia estabelece que as radiaes eletromagnticas podem ser
encaradas como um fluxo de partculas-ondas, chamados ftons, que viajam no
espao com a velocidade da luz. A energia do fton est relacionada ao
comprimento de onda da radiao dada por E = h v . Assim, o que difere a radiao
gama, obtida nas desintegraes nucleares e que possui um efeito destrutivo sobre a
matria orgnica, das radiaes visveis aos olhos humanos, da qual inclusive faz
parte a radiao absorvida na fotossntese, simplesmente o comprimento de onda
desses ftons e, conseqentemente, a energia que eles transportam
(3)
.
A matria, ou seja, os tomos e as molculas, absorvem as diferentes
radiaes eletromagnticas fazendo transies entre seus nveis energticos, os
quais, assim como as radiaes, so Quantizados. O resultado da absoro um
aumento do nvel energtico da substncia, que depender do tipo de radiao
absorvida (por exemplo, aumento do nvel de vibrao das ligaes qumicas,
inverses de spin dos ncleos ou eltrons, transies entre orbitais eletrnicos, etc.).
As absores de radiao eletromagntica correspondente ao ultravioleta e
visvel so responsveis pelas transies eletrnicas e clivagem de ligaes
qumicas nas molculas. Estas transies consistem na excitao dos eltrons
presentes em orbitais moleculares ocupados de mais alta energia (HOMO, highest
occupied molecular orbitals) para os prximos orbitais moleculares desocupados de
mais baixa energia (LUMO, lowest unoccupied molecular orbital) (figura 1.1). So


1 5
1 5
usualmente transies entre orbitais no-ligantes (n) ou orbitais ligantes ( t ) para
orbitais antiligantes t * ou o *
(4)
.
1 .1 .2 - Estados excitados singletes e tripletes
Quando ocorre uma transio eletrnica, o eltron pode conservar ou inverter
seu spin, que o campo magntico gerado pelo movimento do eltron em torno de si
mesmo. Isto dar origem aos chamados estados excitados singletes, se houver
conservao do spin, e tripletes, se houver inverso. H dois aspectos
importantes neste ponto:
i) estados excitados tripletes possuem menor energia que singletes. A
explicao desse fato baseia-se na regra de Hund, que estabelece que quando os
eltrons tm o mesmo spin, eles devem evitar-se, portanto, haver menor repulso
eletrosttica entre os mesmos;
ii) as transies onde ocorre mudana de spin so proibidas, ou seja, so pouco
provveis. Isto ocorre porque em uma transio deve haver conservao do
momento magntico produzido pelo eltron (spin). Experimentalmente, esta uma
propriedade muito interessante, pois reflete diretamente no tempo de vida das
espcies em estado excitado. Para tripletes, o tempo de vida da ordem de 10
- 3
a
1 0
0
s, portanto, muito superior ao tempo de vida de uma espcie singlete 10
- 9
a 10
- 6
s
(5)
.


1 6
1 6
HOMO
LUMO
h v
estado excitado
singlete
estado excitado
triplete
estado fundamental
E
Figura 1.1- Absoro de luz (ultravioleta ou visvel) e a gerao de estados
excitados singlete ou triplete
1 .1 .3 - A eficincia das transies eletrnicas
Embora a condio primria para que haja absoro seja a igualdade entre a
energia do fton e a diferena de energia entre os orbitais, outro fator de extrema
importncia a eficincia do processo. Esta eficincia ou probabilidade de absoro
medida experimentalmente pelo coeficiente de absortividade molar ( c ) . So trs os
fatores que influenciam a probabilidade de uma transio
(5)
:
i) princpio de Franck-Condon: transies que levam a grandes mudanas na
geometria dos ncleos so pouco provveis. Se a posio de equilbrio dos
ncleos bastante diferente entre os estados fundamental e excitado, parte da
energia de excitao eletrnica deve ser transformada em energia vibracional dos
ncleos, o que no um processo favorvel;
ii) sobreposio espacial dos orbitais: transies entre orbitais de diferentes
simetrias ou bastante separados no espao so pouco provveis. Por exemplo,
transies do tipo n- t * em compostos carbonlicos (em cetonas c
max
< 200),
comparado a transies t - t * (em cetonas c
max
>1000). Orbitais no ligantes (n)
possuem simetria diferente em relao aos orbitais t * , assim, a probabilidade de


1 7
1 7
transio de um eltron em um orbital n para um orbital t * baixa, o que est
refletido no baixo coeficiente de absortividade molar;
iii) sobreposio de spin: como dito anteriormente, transies que levam a inverso
de spin so de baixa probabilidade
(5)
.
1 .1 .4 - Processos de desativao de um estado eletronicamente
excitado
Obviamente, uma molcula em estado excitado termodinamicamente
instvel e deve desativar-se voltando ao estado fundamental. Abaixo so descritos
os vrios processos que podem acontecer aps a excitao eletrnica:
i) fluorescncia: uma molcula em estado excitado singlete pode reemitir a energia
absorvida na forma de um fton, usualmente de menor energia (maior
comprimento de onda), pois ocorre relaxao vibracional do estado excitado;
ii) cruzamento inter-sistema: uma molcula em estado excitado singlete pode ser
convertida em triplete. Embora este processo seja termodinamicamente favorvel,
pois a energia singlete sempre maior que a energia triplete, ele proibido pela
regra de conservao de spin. Por outro lado, esta regra pode ser parcialmente
quebrada quando ocorrer o chamado acoplamento spin-orbital. Neste caso, uma
interao entre os campos magnticos gerados pelos movimentos do eltron em
torno de si mesmo (spin) e pelo movimento no prprio orbital criam um fora capaz
de inverter o spin do eltron. Este efeito pronunciado nas transies n- t * e,
principalmente, quando houver a presena de tomos pesados na molcula;
iii) fosforescncia: a desativao radiativa de um estado triplete para o estado
fundamental singlete. Uma comparao entre a fosforescncia e fluorescncia
revela duas caractersticas principais que distinguem entre estados excitados
tripletes e singletes. Uma delas o tempo de vida do estado excitado, sendo para
o singlete da ordem de nanosegundos e, para o triplete, de milissegundos a
segundos. A outra obviamente a mais baixa energia dos estados tripletes e,
portanto, emisso de luz em comprimento de onda maior;
iv) desativao trmica: uma molcula em estado excitado pode perder energia por
relaxao vibracional, ou seja, convertendo a energia de excitao eletrnica em
calor (relaxao vibracional ou converso interna);


1 8
1 8
v) transferncia de energia: uma molcula pode desativar-se transferindo a sua
energia de excitao para outra molcula e consequentemente promovendo a sua
excitao;
vi) foto-reao: uma vez em estado excitado, uma molcula pode sofrer uma
profunda mudana em suas propriedades qumicas, assim, reaes que no
seriam possveis com os reagentes no estado fundamental tornam-se factveis. Um
bom exemplo so as reaes com oxignio excitado singlete, que perde a sua
caracterstica de um birradical e comporta-se como uma olefina (dupla ligao).
Outro exemplo importantssimo e estmulo inicial para a apresentao desse
assunto a fotossntese. Neste caso, a excitao da molcula de clorofila
promove um decrscimo no seu potencial de reduo, aumentando a sua
tendncia em doar eltrons, tornando-a, dessa forma, capaz de reduzir o NADP
+
NADPH, que aps um seqncia de reaes e juntamente com ATP ir converter
o CO em glicose.
2
O diagrama da figura 1.2 esquematiza os processos citados acima (diagrama de
Jablonski)
(6)
.


1 9
1 9
a
b
c
d
e
d
f
E
S
0
S
1
S
2
T
1
T
2
S
3
T
3
S : estado fundamental
0
S , S , S : estados excitados singletes
1 2 3
T , T , T : estados excitados tripletes
1 2 3
(a) : absoro
(b) : fluorescncia
(c) : converso interna
(d) : relaxao vibracional
(e) : cruzamento inter-sistema
(f) : fosforescncia
transies radiativas
transies no radiativas
Figura 1.2- Diagrama de Jablonski


2 0
2 0
1 .2 - O fenmeno da quimiluminescncia
Nos itens anteriores foi mostrado que as molculas podem absorver radiaes
eletromagnticas. A absoro na regio do visvel ou ultravioleta gera estados
eletronicamente excitados, que se desativam e provocam uma srie de fenmenos.
Agora inicia-se o estudo da quimiluminescncia, em que a gerao de estados
eletronicamente excitados ocorre atravs de uma reao qumica.
Se a energia no pode ser criada nem destruda, ento, certamente, a luz
produzida pelos vagalumes deve ser proveniente de uma transformao de energia.
Como mostrado, a emisso de luz, a partir de um composto qumico, possvel
atravs da desativao radiativa de um estado eletronicamente excitado. Se este
composto no foi inicialmente excitado por absoro de radiao, ento, deve existir
um processo escuro de excitar molculas eletronicamente. Este mtodo
chamado de quimi-excitao e est por trs de todos os fenmenos de bio e
quimiluminescncia. A seguir, a descrio das caractersticas comumente
encontradas em reaes capazes de emitir luz sero apresentadas. Mas antes e
importante frisar a diferena entre um processo de quimiluminescncia (gerao
de luz a partir de reaes qumicas) e processos luminescentes como
fluorescncia ou fosforescncia onde a emisso de luz provm de uma
excitao prvia tambm por radiao, embora nem sempre visvel.
1 .2 .1 - Quais so as caractersticas que uma reao
quimiluminescente possui
(7)
?
A primeira caracterstica observada nas reaes quimiluminescentes seu
carter exotrmico, devido a liberao de energia sob a forma de radiao. A figura
1 .3 abaixo mostra a exigncia energtica para que uma reao possa levar a
gerao de estados eletronicamente excitados. Como apresentado, a soma da
variao de entalpia da reao com a entalpia de ativao deve ser pelo menos igual
a energia de excitao do produto.


2 1
2 1
R
P
Energia
de
excitao
P
P
A
H
R
A
H
Coordenada de reao
E
Figura 1.3- Exigncias energticas para que uma reao seja quimiluminescente
A segunda caracterstica e talvez a mais importante a existncia de um
mecanismo pelo qual esta energia liberada possa ser canalizada para gerar produtos
em estados eletronicamente excitados (mecanismo de quimi-excitao). Este
realmente um ponto fundamental pois, para a maioria das reaes exotrmicas, esta
energia liberada na forma de calor e assim so classificadas como reaes
trmicas.
A terceira caracterstica, certamente menos bvia do que a primeira, que o
produto excitado eletronicamente deve possuir um bom rendimento de desativao
radiativa. Como ser exposto mais adiante, uma reao pode gerar produtos em
estados eletronicamente excitados, sem entretanto produzir quimiluminescncia.
1 .2 .2 - Caracterizando as reaes bio e quimiluminescentes
Em primeiro lugar, reaes bioluminescentes nada mais so do que reaes
quimiluminescentes que ocorrem em organismos vivos ou nas secrees destes. So
reaes enzimticas que foram denominadas por Du BOIS em 1887 como sistemas
luciferina/luciferase
(8)
. Luciferinas so os substratos que sero oxidados e luciferases
so as enzimas que catalisam as reaes.


2 2
2 2
Todas as reaes bioluminescentes conhecidas e a maioria das reaes
quimiluminescentes orgnicas so, direta ou indiretamente, oxidaes envolvendo
oxignio ou alguns dos seus derivados, como perxido de hidrognio (H O ), nion
2 2
superxido ( - O
2
- .
) , radical hidroxila ( OH) entre outros e, portanto, a primeira
_
condio parece estar satisfeita, visto que oxidaes so, por natureza, reaes
que liberam calor.
Em todas estas reaes foi proposto o envolvimento de intermedirios
peroxdicos lineares ou, principalmente, cclicos (anis 1,2-dioxetnicos), que so
conhecidos pela sua capacidade de gerar estados excitados aps clivagem trmica.
Estes fornecem o mecanismo de quimi-excitao citado anteriormente
(9)
.
A alta eficincia de desativao radiativa das reaes bioluminescentes
poder ser entendida com a apresentao das propriedades dos compostos
dioxetnicos. Os esquemas 1.1, 1.2 e 1.3 mostram os mecanismos propostos para
alguns sistemas bio e quimiluminescentes j esclarecidos, em que se pode constatar
as caractersticas citadas.
-
O
N
S
N
S
O
OH
Luciferase
ATP/Mg
+ 2
/O
2
-
O
N
S
N
S
O O
O
-
O
N
S
N
O
+ CO
2
+ Luz
Lucifer ina do vagalume I nter medir io dioxetnico
Esquema 1.1- Mecanismo proposto para a reao bioluminescente do vagalume
(10)


2 3
2 3
Lucifer ase
O
2
Lucifer ina da Cypridina
I nter medir io dioxetnico
+ CO
2
+
Luz
N
H
N
N
H
N
O
N
H
NH
NH
2
N
N
H
NH
NH
2
H
N
N
H
N
O O
O
N
H
O
NH
2
NH
H
N
H
N
N
H
N
Esquema 1.2- Mecanismo proposto para a reao bioluminescente da cipridina
(crustceo)
(11)
N
O
ArO
H
CH
3
O
2
base
N
O
ArO
O
-
O
CH
3
+
CO
2
N
O
CH
3
+ Luz
N
H
O
O
O
ArO
-
Intermedirio dioxetnico
+
Esquema 1.3- Oxidao quimiluminescente da acridina
(12)


2 4
2 4
Como mostra os esquemas anteriores, os anis peroxdicos cclicos (1,2-
dioxetanos) tm papel relevante nessas reaes e, de fato sua clivagem o passo
fundamental no processo de quimi-excitao. Estes perxidos que se acreditava
serem apenas intermedirios instveis foram sintetizados e isolados pela primeira
vez em 1969 por Kopeck e Munford
(13)
(esquema 1.4) e, desde ento, centenas de
novos derivados tm sido sintetizados e estudados, com o objetivo de entender o
mecanismo de gerao de estado excitado quando os mesmos so decompostos.
Atualmente, alm do grande progresso alcanado do ponto de vista acadmico,
dioxetanos artificiais so comercializados como sondas quimiluminescentes
extremamente teis em biotecnologia. A seguir so descritos algumas caractersticas
destes importantes compostos.
C CH
3
H
Br
C
CH
3
O
OH
H C
3
HO
-
CH OH/OC
3
C CH
3
O
H
C
CH
3
O
H C
3
Esquema 1.4- Sntese do primeiro dioxetano (trimetil-1,2-dioxetano)
1 .2 .3 - Anis 1,2-dioxetnicos: gerao de estados eletronicamente
excitados e quimiluminescncia.
Como foi dito anteriormente, o primeiro critrio que uma reao deve
satisfazer para gerar quimiluminescncia ser exotrmica. De fato, esta a
evidncia experimental mais direta que a clivagem trmica de um anel 1,2-
dioxetnico fornece. A alta exotermicidade (62
_
7 Kcal/mol), dependendo dos
substituintes, somada a tpica energia de ativao para decomposio dos
dioxetanos de 25
_
3 Kcal/mol mais do que suficiente para excitar carbonilas aos
primeiros estados singletes e tripletes ( A H
ex
s 8 5 Kcal/mol)
(14,15)
.
A segunda caracterstica dos dioxetanos, e a mais importante, a capacidade
que eles tm de canalizar a energia liberada, aps a clivagem, para popular uma das
molculas produto em estado eletronicamente excitado. Outra caracterstica
importantssima dos dioxetanos simples, ou seja, aqueles que possuem como


2 5
2 5
substituintes os grupos alquila, acila, alcoxila e homoarilas, deve ser mencionada.
Trata-se da formao principal de carbonilas tripletes (6 a 40%) em relao a
singletes, geralmente menor do que 0 ,1%, quando estes compostos so
decompostos
(14)
. Entre os mecanismos propostos para explicar o processo de quimi-
excitao, responsvel pela gerao de carbonilas predominantemente tripletes,
destaca-se o mecanismo intermediado por um birradical
(16)
. As evidncias para esta
proposta baseiam-se em experimentos de captura do birradical intermedirio
(17)
, na
explicao dos efeitos dos substituntes no anel dioxetnicos e nos clculos tericos
que mostram a proximidade entre as superfcies de energia potencial do dioxetano,
no estado fundamental, com a superfcie de energia potencial do dioxetano no
estado excitado triplete, medida que a ligao O-O alonga-se.
(18)
Esta propriedade de gerar especialmente estados eletronicamente
excitados tripletes, quando dioxetanos so clivados, afastou, de certa forma,
os mesmos como intermedirios das eficientes reaes bioluminescentes j
mencionadas. O fato que estados excitados tripletes so por natureza pouco
emissivos, haja visto que, devido ao seu longo tempo de vida, como foi mencionado
anteriormente, estes so preferencialmente desativados por processos no
radiativos. Assim, principalmente em solues aeradas, quase impossvel detectar
quimiluminescncia direta a partir da termlise de dioxetanos simples. No estudo da
decomposio do tetrametil-1,2-dioxetano por exemplo, observou-se que em
solues aeradas a quimiluminescncia caiu para cerca de 1% do valor obtido em
solues desaeradas
(19)
, j que o oxignio um timo supressor de tripletes.
Esta controvrsia, embora ainda hoje em estudo, comeou a ser esclarecida
com os trabalhos de Schuster sobre a decomposio trmica do perxido de
dibenzola. Verificou-se, neste caso, que embora a reao fosse suficientemente
exotrmica para gerar o produto (benzocoumarina) em estado excitado, isto no era
observado. Por outro lado, quando 9,10-difenilantraceno foi adicionado reao,
alm de ocorrer um acrscimo na velocidade da reao, observava-se uma eficiente
fluorescncia do difenilantraceno, o que indicava a formao de estado excitado
singlete. Schuster props um mecanismo com os seguintes passos
(20)
:
i) formao de um complexo;
ii) transferncia de eltrons do difenilantraceno para o perxido de dibenzola
formando um par de ons radicais;


2 6
2 6
iii) perda de CO ;
2
iv) aniquilamento do par radical com formao do difenilantraceno em estado
excitado singlete (esquema1.5).
Observou-se, tambm, que outros hidrocarbonetos poliaromticos, agora
classificados como ativadores, podiam ser usados e a eficincia cataltica de
decomposio era inversamente dependente do potencial de oxidao destes, ou
seja, estaria relacionado capacidade de doao de eltrons dos mesmos.
C
O
C
O
O
O
+
Ph
Ph
C
O
C
O
O
O
Ph
Ph
complexo de encontro
Ph
Ph
+
C
O
O
C
O
O
CO
2
+
Ph
Ph
C
O
O
C
O
O
Ph
Ph
+
aniquilao
Ph
Ph
+ Luz
Esquema1.5- Proposta de mecanismo para decomposio quimiluminescente do
perxido de dibenzola (mecanismo CIEEL)
Resultado semelhante foi obtido no estudo da decomposio de uma
dioxetanona (3,3-dimetil-1,2-dioxetanona). Neste caso, a decomposio simples
levava formao de estados excitados predominantemente tripletes, como seria
esperado. Por outro lado, quando na presena de ativadores, verificou-se a formao
dos mesmos em estado excitado singlete e, conseqentemente, um grande aumento
no rendimento quntico de quimiluminescncia
(21)
. Este mecanismo foi chamado


2 7
2 7
de CIEEL (Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence) e,
atualmente, aceito como envolvido em grande parte das reaes
bioluminescentes conhecidas, em que alm dos intermedirios dioxetnicos,
grupos heteroaromticos capazes de doar eltrons esto normalmente
presentes.
Estas propostas foram apoiadas ainda pelos trabalhos de Schaap e
Gagnon
(22)
, ao estudarem a decomposio dos derivados do 1,6-diaril-2,5,7,8-
tetraoxabiciclo-[2,4,0]-octanos em funo do pH. Observou-se que a forma
desprotonada, alm de decompor cerca de 10 vezes mais rapidamente, possua um
6
rendimento de fluorescncia de aproximadamente 200 vezes maior do que a forma
protonada. Aqui foi proposto que um mecanismo CIEEL intramolecular estivesse
operando, em que a forma desprotonada fosse mais efetiva na doao de eltrons ao
anel dioxetnico (esquema 1.6).
O O
O O
Ph
HO
O O
O O
Ph
HO
O O
Ph
-
O
O O
Ph
-
O
|~0,01
|~5.10
5
Esquema 1.6- Mecanismo CIEEL intramolecular. O dioxetano desprotonado
transfere eltrons para o anel peroxdico aumentando a eficincia de
quimiluminescncia.
Com essa nova proposta, Schuster sugeriu que no sistema bioluminescente
do vagalume um mecanismo do tipo CIEEL intramolecular fosse o responsvel pela
alta eficincia de quimiluminescncia
(23)
. De fato, na estrutura da luciferina h uma
dioxetanona ligada a um grupo fenlico capaz de doar eltrons. Em 1966, White


2 8
2 8
tambm observou que luciferinas de vagalume, em que o grupo fenlico estava
metilado, apesar de ser oxidada in vitro na presena de luciferase, no se observava
quimiluminescncia
(24)
.
Concluindo, alm do envolvimento de intermedirios dioxetnicos, a presena
de grupos facilmente oxidveis pode ser a resposta para a alta eficincia de
quimiluminescncia dos processos bioluminescentes. importante ressaltar que em
alguns organismos bioluminescentes, como o caso das bactrias luminescentes,
um hidroperxido linear est envolvido no processo de quimi-excitao e, portanto,
tudo o que foi colocado at agora no uma regra geral e absoluta.
1 .3 - Quimiluminescncia direta e indireta: transferncia de energia
Uma reao quimiluminescente classificada como direta quando um dos
produtos da mesma o responsvel pela emisso de luz. Por outro lado, ela ser
indireta se apenas gerar produtos excitados que transferem energia para uma outra
molcula, que uma vez excitada desativa-se radiativamente (esquema 1 .8 ) .
Exemplos desses casos podem ser encontrados at mesmos em organismos
bioluminescentes. Por exemplo, enquanto na maioria dos sistemas bioluminescentes
conhecidos as chamadas oxiluciferinas (luciferina oxidada) so as espcies
emissoras (quimiluminescncia direta), em outros casos, como na bioluminescncia
do camaro meganyctiphanes, uma substncia fluorescente F, que no sofre
alterao no decorrer da reao, a espcie emissiva, revelando-se assim como um
caso de quimiluminescncia indireta
(25)
.
A) R
P P + Luz
B) R P P + F
F + Luz
F
Esquema 1.7- Representao genrica de uma reao quimiluminescente direta (A)
e indireta (B)


2 9
2 9
Os compostos que desempenham esta funo so chamados aceptores
fluorescentes de energia e tm como principal caracterstica aumentar o rendimento
total de quimiluminescncia. Como foi exposto anteriormente, dioxetanos simples em
que o mecanismo CIEEL no opera so pouco emissivos, pois geram principalmente
tripletes. Assim, a utilizao desses aceptores extremamente comum no estudo de
reaes quimiluminescentes artificiais.
Basicamente, as caractersticas buscadas em um aceptor de energia, para
que ele seja til como intensificador de quimiluminescncia (enhancer), so um alto
rendimento de fluorescncia e, principalmente, que a energia do estado excitado do
mesmo seja inferior do doador, isto , o processo deve ser termodinamicamente
favorvel. Normalmente, os aceptores clssicos so compostos aromticos
policondensados e alguns corantes, os quais, devido a sua extensa rede de
conjugao, possuem estados excitados de baixa energia e, em muitos casos, bons
rendimentos de fluorescncia.
Outro ponto de grande importncia, no que diz respeito aos aceptores de
energia, que por meio de uma escolha adequada dos mesmos possvel distinguir
a multiplicidade das molculas em estado excitado, se singlete ou triplete. Por
exemplo, no estudo de rendimento de quimi-excitao de dioxetanos extensamente
utilizado o 9,10-difenilantraceno (DPA) para singletes, e 9,10-dibromoantraceno
(DBA) para tripletes. DPA apresenta um rendimento de fluorescncia de quase 100%
e a energia de seu estado singlete (70,1 Kcal/mol) est abaixo da energia singlete de
cetonas e aldedos formados na decomposio de dioxetanos. A sua seletividade
para estados singletes baseia-se no fato de que a transferncia de energia de
carbonilas triplete para gerar DPA singlete desprezvel. No caso do DBA, o efeito
de tomo pesado (bromo) possibilita que aps ocorrer uma transferncia de energia,
permitida por spin, do triplete da carbonila excitada para o 2 triplete do DBA,
acontea uma inter-converso triplete-singlete deste ltimo e, finalmente, sua
fluorescncia
(26)
. Estas sondas, extremamente teis na deteco e quantificao de
estados excitados, puderam ser aplicadas em sistemas aquosos com a sntese de
seus equivalentes sulfonados: DPAS (9,10-difenilantraceno-2-sulfonato de sdio) e
DBAS (9,10-dibromoantraceno-2-sulfonato de sdio) (esquema 1.9)
(27)
.


3 0
3 0
SO Na
3
- +
Br
Br
SO Na
3
- +
DPAS
DBAS
Esquema 1.9- Aceptores fluorescentes para deteco especfica de carbonilas
excitadas singlete (DPAS) e tripletes (DBAS) em meio aquoso
1 .3 .1 - Reaes promovidas por transferncia de energia
Outra importante aplicao das transferncias de energia de um composto em
estado excitado (doador) para outro no estado fundamental (aceptor), encontra-se
nas reaes fotoqumicas. Trata-se dos casos em que o reagente, que deveria estar
em estado excitado, no possui um bom rendimento de excitao a partir de
absoro direta de luz. Nestes casos, com o uso de um sensibilizador a radiao
ser captada e ento transferida para o reagente. Um timo exemplo disso so as
reaes com oxignio excitado singlete. Por exemplo, um importante mtodo de
sntese de alguns 1,2-dioxetanos por meio da reao de olefinas com oxignio
singlete Trata-se de uma ciclo-adio [2+2] permitida fotoquimicamente por simetria
de orbitais (esquema 1.10)
(28)
. Neste tipo de reao, um corante (sensibilizador)
absorve energia de uma fonte de luz visvel, populando seu estado excitado singlete
e ento, por cruzamento inter-sistema, popula seu triplete. Depois disso poder
ocorrer transferncia de energia do corante excitado triplete para o oxignio no seu
estado fundamental triplete, de modo a gerar oxignio excitado singlete. Os
sensibilizadores normalmente utilizados so: azul de metileno, rosa bengala
polimrica e algumas porfirinas. importante lembrar que a molcula de oxignio no
seu estado fundamental tem seus dois ltimos eltrons em orbitais degenerados e,
obedecendo a regra de Hund, so desemparelhados (mesmo spin). Assim, oxignio


3 1
3 1
no estado fundamental possui multiplicidade triplete, explicando o seu carter
paramagntico.
r osa bengala
+ h
v
r osa bengala
r osa bengala + O
2
3
r osa bengala
+ O
2
1
+
1
O
2
C H OCH
2 5
CHOC H
2 5 C H O
2 5
C
H
C
OC H
2 5
O O
H
Esquema 1.10- Exemplo de uma reao promovida por sensibilizao. Sntese de
um dioxetano por meio da reao com oxignio singlete
1 .4 - Gerao enzimtica de compostos carbonlicos excitados
tripletes via ao cataltica da peroxidase de raiz forte (HRP)
O grupo de pesquisa do prof. Cilento, durante as dcadas de 70 e 80, na
busca por processos bioqumicos capazes de gerar compostos em estado
eletronicamente excitado e identificar os possveis efeitos que estes causariam,
fisiolgicos ou deletrios, estudou reaes que, potencialmente, poderiam levar
gerao de espcies excitadas tripletes. O critrio escolhido foi identificar reaes
enzimticas em que, presumivelmente, intermedirios dioxetnicos pudessem estar
envolvidos. Utilizou a oxidao do isobutanal
(29)
como modelo inicial, que
conhecida por gerar acetona e cido frmico quando na presena de peroxidase de
raiz forte (HRP), atuando como catalisador
(30)
. Como mostrado no esquema 1.11
abaixo, um intermedirio dioxetnico pode facilmente ser formulado com base nos
produtos formados.


3 2
3 2
CH C
O
H
H C
3
H C
3
+
HRP
O
2 C CH H C
3
CH
3
OH
O O
+
H C
3
CH
3
C
O
H C
3
CH
3
C
O
+ Luz
HCOOH
Esquema 1.11- Oxidao quimiluminescente do isobutanal catalisada por HRP
Sua proposta estava correta, pois pode-se detectar at mesmo
quimiluminescncia direta, embora fraca, em condies otimizadas nesta reao.
Mais do que isso, fortes evidncias apontavam para a gerao de acetona em estado
excitado triplete, como seria esperado pela clivagem de um dioxetano simples, como
foi visto anteriormente. Dentre estas evidncias, destacaram-se:
i) espectro de quimiluminescncia idntico ao espectro de fosforescncia da
acetona;
ii) intensificao de emisso na presena de sensibilizadores especficos para
tripletes (9,10-dibromoantraceno-2-sulfonato de sdio, DBAS);
iii) intensificao da emisso medida que o oxignio era consumido. Lembrando
que oxignio suprime estados excitados tripletes, ento a diminuio da
concentrao do mesmo deve favorecer a emisso.
A partir deste modelo, rotas bioqumicas em que peroxidases ou oxidases
estavam presentes, ou substratos que potencialmente pudessem ser oxidados via
ao cataltica dessa enzimas, foram investigados e, como era esperado, observou-
se a gerao de estados excitados tripletes em vrios casos
(31)
. Dentre estes, pode-
se destacar:
i) Oxidao do hormnio vegetal cido 2 - (indol-3-il)actico (IAA) via
HRP/O /H O : Peroxidase considerada a principal enzima responsvel pelo
2 2 2
catabolismo do hormnio vegetal cido 2-(indol-3-il)actico (IAA), envolvido no
crescimento de plantas
(32)
. Diversos pesquisadores tm realizado estudos sobre o
mecanismo dessa reao e muitos produtos foram identificados
(33)
. A estrutura de
alguns desses produtos sugere a formao de espcies excitadas, o que de fato


3 3
3 3
foi confirmado pelo carter emissivo dessa reao. Dentre os produtos dessa
reao, destaca-se o indol-3-carboxialdedo (IAL), cuja formao pode ser
formulada via um intermedirio dioxetnico
(34)
(esquema 1 .1 2 ) . Estudos
posteriores, utilizando tcnicas de ressonncia paramagntica de eltrons (EPR),
mostraram a formao de radicais tercirios na oxidao do ster metlico do IAA.
Este fato, associado semelhana do espectro de emisso deste com o do
prprio IAA, levantou a suspeita de que compostos do tipo N-formil-kinurennicos
(abertura do ncleo indlico) pudessem tambm ser formados em estado
excitado
(35)
.
N
H
CH COOH
2
+ O
2
HRP/H O
2 2
N
H
C
O O
C
O
H
N
H
O
H
IAA
+ CO
2
N
H
O
H
+ Luz
IAL
Esquema 1.12- Oxidao do cido 2-(indol-3-il)actico catalisada por HRP
ii) Oxidao de cidos graxos por oo o o - oxidase extrada de plantas : a oxidao de
cidos graxos por uma preparao enzimtica extrada de plantas produz o
aldedo homlogo com um -CH - a menos e perda de CO . Uma emisso de luz
2 2
pode ser observada quando esta reao conduzida na presena de clorofila
solubilizada em micelas
(36)
. Neste caso, a no observncia de quimiluminescncia
direta ou intensificao da mesma, quando aceptores de tripletes foram utilizados,
e o fato de que, ao contrrio de um dioxetano, uma dioxetanona seria o
intermedirio formado, levou a proposio que um mecanismo tipo CIEEL
estivesse operando neste caso.


3 4
3 4
+
O
2
o
- oxidase
R C C
O O
O
H
Chl
R C
O
H
+
Chl
Chl
+
Luz
CH
2
C
O
OH
R
R C C
O O
O
H
Chl
Chl = clorofila
Esquema 1.13- Oxidao de cidos graxos por o -ox idases
iii) Oxidao de bases de Schiff : iminas so os anlogos nitrogenados dos aldedos
e, de fato, observou-se que estes compostos tambm poderiam ser oxidados via
ao cataltica de HRP, gerando quimiluminescncia. Tanto iminas alifticas
quanto iminas geradas por aminocidos (histidina, arginina, lisina e fenilalanina)
incubados com glicoaldedo foram submetidos a oxidao catalisada por HRP.
Como esperado, observou-se, alm do consumo de oxignio, quimiluminescncia
direta e indireta intensificada por DBAS
(37)
(esquema 1.14).


3 5
3 5
HRP/O
2
C C
NR
3
H
H
R
1
R
2
C C
H
O
R
1
R
2 O
NHR
3
R
1
R
2
O
+ C
H
NHR
3
O
R
1
R
2
O
+
Luz
Esquema 1.14- Oxidao quimiluminescente de bases de Schiff
1 .4 .1 - Enis so os verdadeiros substratos da HRP
A necessidade do tampo fosfato ou arseniato, e a dependncia de suas
concentraes para que a oxidao, seja do isobutanal, seja das iminas, fosse
observada, levou suspeita de que a forma enlica ou enamnica dos mesmos
pudessem ser o reais substratos da HRP. Neste caso, o fosfato poderia estar
atuando como um catalisador do equilbrio ceto-enlico
(38)
. Esta proposta foi
posteriormente apoiada a partir da observao de que o enol-fosfato atuava como
catalisador da reao
(39)
. Ainda dentro dessa proposta, foram realizados estudos
comparativos entre o isobutanal e o seu correspondente enol protegido por
trimetilsilano (trimetilsilil-enol-ter), quando oxidados em diferentes tampes e de
diferentes concentraes. A tabela 1.1 abaixo reproduz os resultados obtidos e deixa
claro, tanto o papel cataltico desempenhado pelo tampo fosfato, como a
participao efetiva da forma enlica dos substratos no mecanismo de oxidao
(40)
.
Tabela 1.1- Influncia da natureza e concentrao do tampo sobre a oxidao de
isobutanal e sua forma enlica catalisada por HRP
Tampo Concentrao Substrato Intensidade mxima (10 cps)
5
Fosfato 0,1 Isobutanal 0,83
0,1 Enol 19 ,5
0,01 Isobutanal 0 ,025
0,01 Enol 5,35


3 6
3 6
Borato 0 ,067 Isobutanal Sem emisso
0 ,067 Enol 3,70
Tris 0 ,033 Isobutanal Sem emisso
0 ,033 Enol 0,82
T = 27,5C ; [enol] = 16 mM; [isobutanal] = 55 mM; [H O ] = 0,1 mM, [HRP] = 2
2 2
M
Neste trabalho tambm foi possvel correlacionar a intensidade de emisso
concentrao de fluoreto, que desempenhava um papel de catalisador da reao, por
meio da desproteo do enol-ter. No esquema 1.15 mostrado o mecanismo
proposto para a oxidao quimiluminescente do enol derivado do isobutanal
protegido pelo grupo trimetilsilano
(41)
. A descoberta de que as formas enlicas
desses substratos eram as reais espcies oxidadas pela peroxidase constitui,
como veremos, o princpio bsico dessa tese.


3 7
3 7
H O/F
2
-
+
HRP-I
+ HRP-II
HRP-II +
+
HRP
+ O
2 +
Luz
OSi(CH )
3 3
O
OH
OH
O
OH
O O
O
OH
O
O
O
HCOOH
O
+
Esquema 1.15 - Mecanismo proposto para a oxidao quimiluminescente do enol
derivado do isobutanal protegido por trimetilsilano. O passo limitante da velocidade
da reao a desproteo do silil-enol-ter
A gerao de quimiluminescncia de baixa intensidade, via ao cataltica de
HRP, no exclusiva para compostos enolizveis. Substratos fenlicos como L -
tirosina e cido p -hidroxibenzico, quando submetidos ao sistema oxidante
HRP/H O ,
2 2
geram quimiluminescncia
(42)
. tambm conhecida a gerao de
quimiluminescncia devido a produo de oxignio singlete, quando o perxido de
hidrognio adicionado a outros tipos de peroxidases, como mieloperoxidase,
lactoperoxidase e cloroperoxidase
(43,44)
.


3 8
3 8
1 .4 .2 - Mecanismo de ao da HRP
Peroxidases so enzimas que catalisam a oxidao de diversos substratos s
custas de perxido de hidrognio. Estas enzimas esto largamente distribudas tanto
no reino animal quanto no vegetal; existem cerca de 40 formas isoenzimticas s
para a peroxidase de raiz forte (HRP). Esta peroxidase pode ser facilmente extrada
da planta raiz forte, que lhe d o nome. a peroxidase mais extensamente estudada
e utilizada em metodologias analticas devido a sua alta estabilidade, o que a faz ser
encarada quase como um reagente qumico. Possui um peso molecular de 42100 e,
como grupo prosttico, a protoporfirina IX frrica ligada no covalentemente a
protena
(45)
.
A HRP atua sobre os seus substratos atravs de um ciclo que consta das
seguintes etapas (esquema 1.16)
(46)
:
HRP + H O
2 2
k
1
HRP-I + H O
2
HRP-I
+ AH
2 HRP-II
+
AH
HRP-II + AH
2
HRP
+
AH + H O
2
k
2
k
3
i)
ii)
iii)
HRP
HRP-I
HRP-II
Fe
III
Fe
IV
Fe
IV
Esquema 1.16- Mecanismo de ao cataltica da peroxidase de raiz forte
i) Oxidao da HRP nativa pelo perxido de hidrognio levando formao do
composto I (HRP-I), que est formalmente dois nveis de oxidao acima da forma
nativa. Ele aceito como possuindo o tomo de ferro em estado de oxidao IV e
o ncleo porfirnico deficiente em um eltron ( t ction radical);


3 9
3 9
ii) Abstrao de hidrognio de um substrato do tipo AH com conseqente reduo da
HRP-I para HRP-II, formalmente em estado de oxidao IV. Neste passo, o eltron
transferido para o anel porfirnico e o prton retido pelo cadeia polipeptdica,
provavelmente por meio de um resduo de histidina (base);
iii) Abstrao do hidrognio de um segunda molcula de substrato com a reduo da
HRP-II forma nativa. Neste passo, o oxignio deslocado na forma de gua pela
reteno de um prton do substrato e o outro j previamente retido pela enzima. A
formao de gua como grupo de partida est condicionado ao pKa do resduo de
histidina e, como conseqncia disso, este passo dependente do pH do meio.
Medidas do potencial de reduo mostram que o par HRP-II/HRP tem o seu
potencial reduzido de 1,0 V em pH 6,5 para aproximadamente 0,5 V em pH
alcalino
(47)
.
Outra importante forma ativa das peroxidases o chamado HRP-III, composto
trs. Ele pode ser formado das seguintes maneiras: reao entre HRP nativa e
excesso de perxido de hidrognio ou superxido; reao entre HRP-II e perxido de
hidrognio; reao entre HRP ferrosa (forma reduzida de peroxidase, Fe ) e
I I
oxignio. A HRP-III que formalmente est em um estado de oxidao seis
representada como um hbrido de ressonncia entre um complexo da forma ferrosa
com oxignio e da forma frrica com nions superxido (Fe -O
I I
2
Fe
III
- O
2
- -
)
(46)
. Um
ciclo envolvendo a forma ferrosa e HRP-III foi proposto como responsvel pela
oxidao do cido 2-(3-indolil)actico na ausncia de perxido
(48)
.


4 0
4 0
1 .5 - Quimiluminescncia de derivados indlicos
Os primeiros trabalhos que procuravam identificar em derivados indlicos as
propriedades de potenciais luciferinas apareceram na dcada de 60. Em 1965,
motivados pelo presena do ncleo indlico em sistemas bioluminescentes como a
luciferina da cipridina (esquema 1.2), ou a luciferina de um verme marinho,
balonoglassus, que apresenta um forte odor, caracterstico de compostos indlicos;
Philbrook e colaboradores
(49)
realizaram um estudo sobre o potencial
quimiluminescente de 24 derivados indlicos, quando submetidos ao sistema
oxidante K S O /HO
2 2 4
-
em meio aquoso ou em DMSO. Uma comparao de
intensidade de quimiluminescncia foi realizada entre os vrios derivados testados,
tomando como referncia a emisso originada pela oxidao do luminol quando
submetido as mesmas condies. De modo geral, obteve-se pouco ou nenhum
indcio de quimiluminescncia para a maioria dos derivados testados, exceto para
alguns derivados alquilados como o 3 - metilindol, cuja quimiluminescncia foi
comparvel a emisso do luminol. A tabela 1.2 reproduz os resultados obtidos por
estes autores.


4 1
4 1
Tabela1.2- Quimiluminescncia de Derivados Indlicos
Substrato Intensidade de
Quimiluminescncia em
H O
2
Intensidade de
Quimiluminescncia em
DMSO
Luminol 6 0 0 0 -
2 - metilindol 4 0 2 1 0 0
3 - metilindol 8 0 1 0 0 0 0
1 ,2-dimetilindol 5 5 3 0 0
2 ,3-dimetilindol 0 3 0 0 0
2 ,5-dimetilindol 0 6 0 0
3 - fenilindol 0 3 0
Indol-3-carboxialdedo 0 3 0
cido indol-3-carboxlico 0 0
cido 2-(indol-3-il)actico 0 - 1 0 9 5
cido 3-(indol-3-
il)propanico
0 1 2 0
Triptofano 2 5 0
3 - acetilindol 0 6 0
3 - cloroindol 0 0
5 - nitroindol 0 0
2 ,3-dicloroindol 0 0
3 - acetil-2-metilindol 0 0
2 ,3-difenil-1-metilindol 0 0
1 - etil-2,3-difenilindol 0 0
Indol 1 3 5 1 0 5
2 - fenilindol 0 0


4 2
4 2
Em DMSO: [Indol] = 0,05 mol/L, KOH = 0,5 g. Em gua: [indol] = 0,025 mol/L, [NaOH]
= 0,5 mol/L, [K S O ] = 0,08 mol/L
2 2 4
Em 1967, Sugiyama e colaboradores mostraram que durante a oxidao do
2 ,3-dimetilindol por O
2
em meio alcalino (DMSO/KOH) ocorria quimiluminescncia
que era dependente da formao de um hidroperxido intermedirio. Este
hidroperxido foi inclusive sintetizado e submetido s mesmas condies
(DMSO/KOH), mas em meio desaerado, gerando quimiluminescncia. Aliado a esta
evidncia experimental, e a posterior identificao de N-(2-acetilfenil)acetamida
como produto da oxidao do 2,3-dimetilindol, estes autores propuseram um
mecanismo intermediado por um derivado dioxetnico como responsvel pelo passo
de quimi-excitao da reao (esquema-1.17)
(50,51)
.
N
H
CH
3
CH
3
KOH/O /DMSO
2
N
CH
3
CH
3
OOH
N
CH
3
CH
3
O
H
O
CH
3
O
NH
O
CH
3
CH
3
O
NH
O
CH
3
+ Luz
2 ,3-dimetilindol
N - (2-acetilfenil)acetamida
Esquema1.17- Proposta de mecanismo para oxidao quimiluminescente do 2,3-
dimetilindol


4 3
4 3
Estruturas indlicas esto presentes em um grande nmero de compostos de
importncia biolgica, como o hormnio envolvido no crescimento de plantas cido 2-
(indol-3-il)actico, o neuro-hormnio melatonina, serotonina e o aminocido
triptofano. Apoiando-se nas potenciais propriedades quimiluminescentes dos
mesmos quando oxidados, metodologias analticas tm sido desenvolvidas para
determinao desses compostos. Neste contexto, vrios sistemas oxidantes, como
Fe /H O /HO , MnO /HO /Cu , MnO /H /Ce , etc. foram
+ 3
2 2
-
4
- - + 2
4
- + + 4
testados, visando
encontrar a maior eficincia de quimiluminescncia
(52,53)
. Dos resultados
apresentados, embora fracas emisses estejam presentes em muitos casos, no
possvel indicar uma estrutura indlica ou um sistema oxidante que se mostrem mais
eficientes em gerar quimiluminescncia.
Observou-se quimiluminescncia tambm quando indol e triptofano foram
submetidos a eletrlise (quimiluminescncia eletrogerada). Novamente um
mecanismo intermediado por dioxetano levando clivagem do anel pirrlico foi
proposto como responsvel pela quimiluminescncia
(54)
.
Sistemas oxidantes geradores de nion superxido, como o sistema
enzimtico xantina/xantina-oxidase ou perxido de hidrognio em meio alcalino,
especialmente quando catalisados por hemina, promovem a clivagem oxidativa do
anel pirrlico de diversos derivados indlicos de relevncia biolgica. Para a
melatonina em particular observou-se quimiluminescncia associada a estas
clivagens
(55,56,57)
.
A HRP, como foi descrito anteriormente, tambm catalisa a clivagem oxidativa
do anel pirrlico do ster etlico do cido 2-(indol-3-il)actico. A formao deste
produto em estado excitado pode ser um dos responsveis pela quimiluminescncia
observada
(35)
.


4 4
4 4
1 .6 - Quimiluminescncia de compostos oo o o - hidroperxi-carbonlicos
Compostos o - hidroperxi-carbonlicos como o - hidroperxi-cetonas,
o - hidroperxi-steres ou congneres como o - hidroperxi-nitrilas, que podem ser
preparados por auto-oxidao em meio aprtico alcalino e baixa temperatura, tm
sido isolados e so estveis em meio neutro
(58,59)
. Suas decomposies em meio
alcalino geram quimiluminescncia de baixa intensidade e que pode ser intensificada
na presena de 9,10-dibromoantraceno (DBA), o que evidencia a formao de
compostos carbonlicos em estado excitado triplete, via anis.1,2-dioxetnicos. No
entanto, deve-se mencionar que este mecanismo no exclusivo, pois na verdade
estudos cinticos e de formao de produtos mostraram que a decomposio das
o - hidroperxi-cetonas ocorre preferencialmente via um mecanismo acclico no
quimiluminescente
(59)
(esquema 1.18).
R C
1
CR R
2 3
O OOH
+
RO
-
R CO R
1 2
+ R R C
2 3
O + HO
-
+ R CO
1 2
-
R C
1
CR R
2 3
O OO
-
O O
CR R
2 3
R C
1
O
-
O
O
Luz +
R C
1
CR R
2 3
OOH
OR
O
-
Esquema 1.18- Mecanismos cclico e acclico de decomposio de o - hidroperxi-
cetonas


4 5
4 5
Ao contrrio das o - hidroperxi-cetonas, o - hidroperxi-aldedos nunca foram
isolados, o que poderia ser esperado, devido a sua maior susceptibilidade a ataques
nucleoflicos. No entanto, estes derivados, protegidos na funo peroxdica, tiveram
a sua primeira sntese em 1989 por Catalani e colaboradores. A desproteo dos
mesmos em meio neutro, catalisada por ons fluoreto, novamente resultou em
quimiluminescncia
(60)
.
1 .7 - Aplicaes de reaes bio e quimiluminescentes
Muito mais do que um assunto meramente acadmico, o fenmeno da
bioluminescncia e quimiluminescncia vem despertando o interesse dos cientistas
ao longo das ltimas dcadas, tambm pelas inmeras possibilidades de aplicao
analticas que estes propiciaram, principalmente em reas biomdicas. Para se ter
uma idia da amplitude desse campo, bastaria dizer que a cada dois anos realiza-se
um congresso, sobre bio e quimiluminescncia
(61)
(atualmente na 10 edio), onde
so apresentados centenas de novas aplicaes ou avanos em tcnicas j
conhecidas. So trs as caractersticas principais que tornam as reaes
quimiluminescentes to teis em metodologias analticas:
i) Alta sensibilidade. Uma comparao entre as sensibilidades alcanadas pelas
tcnicas espectrofotomtricas da ordem de 1 M, fluorimtricas de 1-10 nM e
quimiluminescentes que podem alcanar limites abaixo de 1 fM, ou seja 1 amol
(10
- 1 8
mol) em 0,1 mL, mostra a superioridade dessa ltima. O principal fator que
limita a sensibilidade de uma tcnica o sinal inerente ao branco, (mistura de
reao completa sem o analito), que estar sempre presente em metodologias
analticas. No caso de tcnicas espectrofotomtricas ou fluorimtricas, este sinal
seria causado pela absoro ou fluorescncia dos reagentes. Em tcnicas bio e
quimiluminescentes, a menos que exista uma reao lateral que produza luz, a
limitao causada pelo sinal do branco estar bastante diminuda
(7)
;
ii) Reaes bio e quimiluminescentes podem facilmente ser associadas a re
aes de interesse biolgico. Sendo os sistemas bioluminescentes obviamente
reaes bioqumicas, tornou-se muito fcil associar o sinal de luz concentrao


4 6
4 6
de metablitos e enzimas envolvidas em alguma etapa das mesmas. Alm disso,
estas aplicaes iniciaram-se muito antes do conhecimento dos mecanismos
dessas reaes. Beijerinck, por exemplo, em 1902 associou a bioluminescncia
produzida por bactrias produo de oxignio por fotossntese
(62)
. Outro exemplo
importante pode ser dado pelo trabalho de McElroy em 1947, que ao descobrir a
necessidade de ATP na reao bioluminescente do vagalume
(63)
deu incio
aplicao desse sistema na determinao de ATP e, conseqentemente, a uma
vasta gama de aplicaes analticas envolvendo o mesmo;
iii) Bio e quimiluminescncia possibilita a deteco, quantificao e
visualizao de eventos qumicos em clulas vivas.
A seguir so explorados, com mais detalhes, algumas reas que tm se
beneficiado das metodologias analticas bio e quimiluminescentes.
1 .7 .1 - Luminescncia celular: burst oxidativo
Em 1961 Tarusov detectou uma quimiluminescncia de ultra-baixa-intensidade
in situ proveniente de fgado de rato e, desde ento, uma grande variedade de
rgos intactos, tecidos, clulas isoladas de vertebrados, de invertebrados ou
plantas tm mostrado esta propriedade
(7)
. Dentro deste campo, destaca-se a
quimiluminescncia nativa que acompanha o mecanismo de defesa por fagcitos
estimulados. Em essncia, a estimulao, ou seja, a presena de organismos
estranhos, resulta na ativao de oxidases que catalisam a reduo de oxignio, via
NADPH
_
NAD
+
nion superxido ( - O ). Outras espcies reativas de oxignio
2
-
(ROS) podero ento ser formadas a partir deste por diferentes meios, como
formao de peroxinitrito (ONOO ) por reao com xido ntrico (NO); reduo do
-
- O
2
-
a perxido de hidrognio (H O ) via ao enzimtica da superxido dismutase
2 2
(SOD); formao do cido hipocloroso (HOCl) pela oxidao de cloreto (Cl ) por meio
-
da ao cataltica da enzima mieloperoxidase (MPO). Estas ROS alm de destruir
microorganismos invasores, podem tambm causar danos as clulas, sendo
responsveis por exemplo pela destruio de tecidos associado a reaes
inflamatrias
(64)
. Estes produtos da reduo do oxignio podem levar oxigenao
de substratos biolgicos que, por sua vez, podem levar a gerao de estados
eletronicamente excitados e, conseqentemente, fraca emisso observada nestes


4 7
4 7
processos
(65)
. Esta quimiluminescncia tem sido aplicada como uma tcnica para
estudar o processo de fagocitose e para auxiliar no diagnstico de algumas doenas.
Um exemplo clssico o caso dos pacientes com doena granuloctica crnica,
caracterizado pela pr-disposio a infeces por bactrias e fungos. Os neutrfilos
destes pacientes no produzem, ou produzem pouco, nion superxido e,
conseqentemente, no se observa a quimiluminescncia
(66,67)
.
Ainda mais interessante a possibilidade de intensificao dessa emisso
nativa atravs de substratos orgnicos, cuja oxidao leva gerao de
quimiluminescncia com alto rendimento quntico. Para este propsito so utilizados
principalmente luminol, isoluminol e lucigenina. Alm de intensificar, estes substratos
atuam de forma mais ou menos seletiva e assim, podem medir diferentes espcies
reativas de oxignio em diferentes locais da clula. A seletividade que estes
substratos possuem sobre as espcies reativas de oxignio so de grande valor na
elucidao e diagnstico de males associados s clulas fagocticas. Um bom
exemplo o caso de pacientes que apresentam neutrfilos deficientes em
mieloperoxidase. Nestes casos, apesar de haver formao de - O
2
-
e H O , o que
2 2
pode ser medido por outras tcnicas, no se verifica a quimiluminescncia quando
adicionado luminol, sendo que, aps a adio de mieloperoxidase externa, ocorre o
restabelecimento da quimiluminescncia
(68)
.
1 .7 .2 - Luciferases e luciferinas: aplicaes de bioluminescncia
Luciferinas e luciferases so, como foi dito anteriormente, nomes genricos
para os substratos e as enzimas envolvidas em bioluminescncia. Estes sistemas
propiciam tcnicas simples, rpidas e altamente sensveis para determinar uma
extensa classe de substncias. Os dois sistemas luciferina/luciferase mais utilizados
so os do vagalume e de bactrias marinhas. No caso da reao bioluminescente do
vagalume h o consumo de ATP, assim, qualquer reao ou sistema de reaes
acopladas, que envolvam em alguma etapa a produo ou o consumo do mesmo
pode ser, em princpio, monitorada pela luminescncia caracterstica desse sistema.
No caso da reao bioluminescente das bactrias marinhas h o consumo de
NADPH e o exposto acima tambm vlido neste caso (esquema 1.19). Atualmente
so comercializados kits contendo luciferina e luciferase de vagalumes e bactrias


4 8
4 8
prontos para uso, sendo que a sensibilidade dos ensaios pode alcanar 0,1-100 pmol
em 10-100 L de amostra.
Metablito + ATP
Enzima
Metablito + ADP
Enzima
Decrscimo de ATP
Acrscimo de ATP
ATP + Luciferina
Mg
+ 2
+
AMP-Luciferina
PPi
Luciferase
O
2
Oxiluciferina + AMP +
Luz
Metablito + NADP
+
NADPH
Metablito + NADPH
Enzima
Enzima
NADP
+
FMN
NADPH
FMN-oxiredutase
FMNNH
2 +
NADP
+
FMNNH
2
+ RCHO
+
+
O
2
Luciferina
FMN RCHO + +
H2O
+
Luz
a)
b)
Esquema 1.19- Esquema geral para a utilizao dos sistemas luciferina/luciferase
para determinar enzimas e metablitos. a) vagalumes; b) bactrias bioluminescentes
So inmeras as aplicaes destes sistemas bioluminescentes, principalmente
nas reas de: microbiologia (anlises de alimentos, bebidas, etc.); ensaios de
enzimas, substratos e cofatores (desidrogenases, | - D- galactosidase, creatina
Kinase, enolase, L-alanina, ATP, FAD, NAD, NADH, glicose, lactato, cidos biliares,
creatinina, lactado, etanol, etc.); imunoensaios; Blot de protenas e ensaios de
DNA
(69)
.


4 9
4 9
1 .7 .3 - Imunoensaios e quimiluminescncia
A combinao da sensibilidade de deteco dos ensaios que utilizam como
princpio a radiao emitida por istopos radioativos com a especificidade
caracterstica de uma reao antgeno-anticorpo, resultou em um dos principais
mtodos de diagnsticos in vitro utilizados em medicina. Esta tcnica, conhecida
como radioimunoensaio, foi introduzida no final da dcada de 50 por Yalow e
Berson
(70)
e hoje rotineiramente utilizada nos laboratrios clnicos para detectar
substncias endgenas e exgenas (por exemplo, hormnios, bactrias, vrus,
toxinas, drogas, etc.). Um ensaio imunolgico consiste, basicamente, na utilizao de
um anticorpo especfico para a substncia que se deseja detectar, ligado em um
rtulo (molcula fluorescente, quimiluminescente, enzima, etc.) que ser
responsvel pela revelao do complexo antgeno-anticorpo, se este for formado. No
caso dos radioimunoensaios, este rtulo um istopo radioativo como, por exemplo,
1 2 5
I (iodo istopo 125).
Apesar do enorme sucesso alcanado pelos radioimunoensaios, estes
tambm apresentam desvantagens importantes, como o tempo de vida til dos
conjugados anticorpo-istopo, a necessidade de licena oficial para a utilizao de
compostos radioativos, o alto custo e os cuidados com o manuseio e descarte. Estas
desvantagens levaram busca de novos mtodos de marcao dos anticorpos e
dentre estes a utilizao de enzimas como rtulo foi considerada como primeira
alternativa ao uso de substncias radioativas. A utilizao desse tipo de rtulo
originou os chamados enzimaimunoensaios (EIA). A idia bsica era realmente
promissora, pois no se tratava de usar um composto gerador de sinal, mas sim uma
enzima cuja deteco poderia ser alcanada utilizando-se diferentes tcnicas e,
conseqentemente, uma porta abriu-se para o desenvolvimento de diferentes
procedimentos, visando maior eficincia (limite de deteco), menor custo e
facilidade de manuseio
(71)
.
As trs mais importantes enzimas utilizadas como rtulos em EIA so a
peroxidase de raiz forte (HRP), fosfatase alcalina (ALP) e a | - D-galactosidase (GAL).
A peroxidase uma enzima altamente estvel e a menor entre as trs (PM aprox.


5 0
5 0
4 0 0 0 0 ) , como resultado, apresenta menores problemas estricos. Por outro lado,
sensvel a agentes antimicrobicidas como azida, que so freqentemente utilizados.
A fosfatase alcalina possui peso molecular de aproximadamente 100.000 e maior
atividade cataltica, mas inibida por fosfato e EDTA. A galactosidase apresenta
peso molecular de 500.000 e, conseqentemente, maiores problemas estricos.
A utilizao de enzimas como rtulos nos chamados enzimaimunoensaios,
como j foi exposto, levou ao surgimento de uma enorme classe de substratos para
deteco dessas enzimas. Dentre estes, que podem ser cromognicos, fluorognicos
ou quimiluminescentes, destacam-se estes ltimos, com os quais foi alcanado, e em
alguns casos superado, a sensibilidade antes s atribuda aos radioimunoensaios
(72)
.
A figura 1.7 esquematiza o princpio de um enzimaimunoensaio do tipo sanduche A
seguir ser apresentado alguns desses importantssimos substratos, dando especial
ateno aos substratos das enzimas HRP e ALP, visto que so estas as enzimas
cuja deteco esto dentro dos objetivos primrios dessa tese.
E
revelao
substratos da
enzima (E)
substrato
cromognico
substrato
fluorescente
substrato
quimiluminescente
sinal por absoro de luz
sinal fluorescente
sinal quimiluminescente
A
B C
(A) = antgeno
(B) = anticorpo (analito)
(C) = anticorpo de deteco
Figura 1.7- princpio de um enzimaimunoensaio do tipo sanduche
1 .7 .3 .1 - Enzimaimunoensaios e dioxetanos sintticos
A primeira utilizao de um derivado dioxetnico sinttico para quantificar a
atividade de uma enzima foi descrita em 1987 por Schaap e col.
(73)
. Tomando como


5 1
5 1
base seu prprio trabalho de 1982, em que um dioxetano contendo um grupo fenlico
podia ter a sua quimiluminescncia disparada pela desprotonao do mesmo (vide
item 1.2.3), foi sintetizado um dioxetano em que um grupo acetila poderia ser
removido via hidrlise catalisada pela enzima aril-esterase (esquema 1.21). A adio
dessa enzima de fato produziu quimiluminescncia e foi possvel correlacionar a
concentrao da mesma ao sinal obtido. importante salientar que se obteve uma
perfeita correlao entre os espectros de quimiluminescncia da reao e
fluorescncia do produto 6-hidroxinaftoato de metila, o que significa que este ltimo
foi gerado em estado eletronicamente excitado singlete, como seria esperado,
supondo que o mecanismo CIEEL estivesse operando.
dioxetano instvel
aril-esterase
dioxetano estvel
O
-
O
CH O
3
O
-
O
CH O
3 + Luz
O O
OCH
3
O
-
O O
OCH
3
O
O
CH
3
O
+
Esquema 1.21- Substrato desenvolvido por Schaap e col. para determinao da
atividade enzimtica da aril-esterase
A partir deste primeiro exemplo, diversos novos substratos dioxetnicos foram
desenvolvidos visando aumentar o limite de deteco e ampliar os tipos de enzimas
a serem detectadas. Dentre estes, os substratos 3-(2-spiroadamantil)-4-metxi-4-(3-
fosforilxi)fenil-1,2-dioxetano (AMPPD) e o 3 - (2-spiroadamantil)-4-metxi-4-(3-
galactosil)fenil-1,2-dioxetano (AMPGD) so atualmente considerados os mais
importantes substratos para deteco quimiluminescente de fosfatase alcalina e
| - D-galactosidase, alcanando limite de deteco da ordem de zeptomol (10
- 2 1
mol)
(esquema 1.22)
(74,75,76)
. Estes compostos j so comercializados na forma de kits
Tropix (Bedford, MA, USA) e largamente aplicados em diversas reas como
imunologia, medicina forense, anlise ambiental, seqenciamento de DNA, etc.


5 2
5 2
AMPPD: R = PO
3
-
AMPGD: R = Galactosil
ALP ou GAL
+
O
O
-
OCH
3
+
Luz
O O
OCH
3
OR
O O
OCH
3
O
-
O
O
O
-
OCH
3
Esquema 1.22- Substratos AMPPD e AMPGD para determinao quimiluminescente
de fosfatase alcalina (ALP) e | - D- galactosidase (Gal)
1 .7 .4 - Deteco de fosfatase alcalina livre e em conjugados por
quimiluminescncia
Alm das aplicaes como rtulo em enzimaimunoensaios (conjugados de
imunoglobulina com ALP, (ALP-IgG)), quando determinada livre no soro sangneo A
enzima fosfatase alcalina um importante sinalizador de diversas doenas. Altos
nveis de ALP no soro sangneo so normalmente encontrados em pessoas que tm
doenas sseas ou hepticas
(77,78,79)
. Tambm tem sido proposta a determinao de
sua atividade como marcadores secundrio de doenas como: tumor de ovrio
(80)
,
infeces bacterianas em pacientes aidticos
(81)
e leucemia
(82)
.
Alm dos substratos dioxetnicos, vrios compostos tm sido utilizados para
determinao quimiluminescente da ALP. A seguir sero mostrados alguns desses
substratos desenvolvidos nos ltimos anos para determinar essa importante enzima.
Embora no sejam dioxetanos, a presena destes como intermedirios foi proposta
para a maioria dos casos. Em alguns casos, o mesmo tipo de composto pode ser
utilizado tanto para fosfatase alcalina quanto para a | - D- galactosidase, bastando
apenas trocar o grupo a ser reconhecido pelas enzimas (esquema 1.23).


5 3
5 3
CH
3
OPh Na O PO
2 3
O O
CH
3
O
CH
3
O
+ CO
2
+
Luz
ALP /O
2
S
N
S
N
C
O
OH
RO
R = Galactosil ou PO Na
3 2
| - Gal ou
ALP
luciferase
O /Mg
2
+2
/ATP
S
N
S
N
-
O
O
O
O
S
N
S
N
-
O
O
+
CO
2
+ Luz
N
H
OR
Br
Cl
| - Gal ou
ALP HRP
N
H
O
-
Br
Cl
O
O
O
O
-
NH
O
+ Luz
R = Galactosil ou PO Na
3 2
(A)
(B)
(C)
Esquema 1.22- Alguns substratos quimiluminescentes no dioxetnicos para
determinao de ALP e | - Gal. a) Lumigen
TM
APS , substrato baseado na formao
de N-metilacridona em estado excitado (substrato comercialmente disponvel)
(83)
b) o
sistema quimiluminescente de vagalume pode ser disparado via hidrlise catalisada
por vrias enzimas. Alm do grupo fosfato e galactose, luciferinas protegidas por
sulfato, arginina e grupos steres foram sintetizados visando outras enzimas
(84)
. c)
substrato baseado na hidrlise de um derivado de indoxil. Neste caso foi proposto
um passo inicial onde h a formao de perxido de hidrognio via formao de
indigo
(85,86)


5 4
5 4
1 .7 .5 - Deteco de HRP por quimiluminescncia
O principal mtodo para determinao quimiluminescente de peroxidase de
raiz forte, seja livre, seja na forma de conjugados (HRP-IgG), por meio do sistema
Luminol/H O / OH. Esta tcnica foi ainda melhorada pelo uso de intensificadores de
2 2
-
emisso, como p-iodofenol, p-fenilfenol
(87)
, derivados de cido bornico
(88)
, etc.
Outros mtodos tm sido propostos com este fim, como, por exemplo, utilizando
pirogalou
(89)
ou um composto anlogo luciferina da cipridina
(90)
(esquema 1.23).
NH
NH
O
O NH
2
HRP/H O /HO
2 2
-
O
O NH
2
O
-
O
-
+
N
2
+
Luz
CH O
3
N
N N
O
H
CH
3
HRP /H O
2 2
+ CO
2
+ Luz
(A)
(B)
NH N
N
CH O
3
O CH
3
Esquema 1.23- Alguns substratos quimiluminescentes para determinao de HRP.
A) sistema luminol; b) derivado da luciferina da cipridina


5 5
5 5
2 - Objetivos
Considerando que sistemas bio e quimiluminescentes possuem larga
aplicao como ferramentas analticas em diversas reas bioqumicas e biomdicas,
tanto em nvel acadmico quanto tecnolgico, como:
i) quantificao de atividade de uma grande variedade de enzimas e metablitos;
ii) monitorao de processos bioqumicos;
iii) sistemas reveladores em enzimaimunoensaios, etc.,
explorou-se este campo, sintetizando e estudando novos substratos
enzimticos potencialmente quimiluminescentes. Estvamos interessados em
substratos que pudessem produzir, aps ao enzimtica, intermedirios instveis
do tipo hidrxi-dioxetano ou amino-dioxetano (esquema 2.1), que, como foi mostrado
na introduo, so reconhecidamente geradores de estados excitados aps clivagem
do anel peroxdico.
R
1
R
2
O O
H
OH
R
1
R
2
O O
H
NHR
Esquema 2.1- Intermedirios geradores de estados excitados
Utilizou-se quatro abordagens para produzir indiretamente os
intermedirios acima e correlacion-los atividade de enzimas:
i) Hidrlise de enis protegidos e posterior oxidao catalisada por HRP:
desenvolvimento de metodologia quimiluminescente para determinao
quantitativa da atividade das enzimas fosfatase alcalina e fosfatase cida.
sabido que alguns compostos carbonlicos podem ser oxidados, gerando
estados excitados por meio da ao cataltica da peroxidase de raiz forte (HRP). O
mecanismo proposto para estas reaes indica que a forma enlica, gerada a partir
do equilbrio ceto-enlico, o verdadeiro substrato da peroxidase
(40)
. Seguindo esta


5 6
5 6
propriedade foi sintetizado um enol protegido por um grupo fosfato, a fim de que o
mesmo pudesse ser hidrolisado via ao cataltica das enzimas fosfatase alcalina e
cida e, como resultado, gerar quimiluminescncia aps oxidao (esquema 2.2).
Fosfatases
Alcalina ou cida
HRP/H O /O
2 2 2
HCOOH
O
P
O
O
-
-
O
OH
O
O
+
HPO
4
2 -
+
H O
2
OH
O
+
O
+ Luz
Esquema 2.2- Proposta de desenvolvimento de uma metodologia
quimiluminescente para anlise de fosfatases alcalina e cida


5 7
5 7
ii) Hidrlise de enaminas protegidas e posterior oxidao catalisada por HRP:
desenvolvimento de uma metodologia quimiluminescente para determinao
quantitativa de proteases.
Assim como no caso dos aldedos, enaminas, que seriam geradas
atravs do equilbrio imina-enamina, foram propostos como substratos da HRP
(37)
.
Partindo do mesmo princpio do primeiro item, realizou-se a sntese de uma enamina
protegida. A hidrlise desse composto, catalisada por proteases, visto tratar-se de
uma ligao amdica, produziria uma enamina que ento seria oxidada via HRP.
O substrato N-etil-N-(2-metilpropen-1-il)benzenamida foi escolhido para testar a
viabilidade da metodologia e, caso o resultado fosse positivo, novos substratos com
cadeias polipeptdicas especficas poderiam ser sintetizados, visando proteases
especficas. O esquema 2.3 a seguir mostra o princpio da tcnica.
H O
2
Protease
HRP/H O /O
2 2 2
N
O
O H
+
N H
O
H
+
Luz
O
N
N
H
+
O
OH
O
O
+
Esquema 2.3- Proposta de desenvolvimento de uma metodologia quimiluminescente
para anlise de proteases


5 8
5 8
iii) Oxidao de derivados indlicos: desenvolvimento de uma metodologia
quimiluminescente para determinao quantitativa da peroxidase de raiz
forte (HRP).
A similaridade estrutural entre o ncleo pirrlico dos derivados indlicos e as
enaminas alifticas, o conhecimento das caractersticas quimiluminescentes da
oxidao dessas ltimas via HRP/H O , o
2 2
conhecimento das propriedades
quimiluminescentes dos derivados indlicos quando submetidos a oxidao
qumica
(49,50,51)
e, finalmente, a proposta de que um produto do tipo quinurennico
(abertura do anel pirrlico) poderia estar entre os produtos de oxidao do ster
etlico do cido 2 - (3-indolil)actico
(35)
, levou-nos a um estudo do potencial
quimiluminescente da oxidao de uma srie de derivados indlicos catalisada por
peroxidase de raiz forte (esquema 2 .4 ) . Aqui buscvamos metodologias
quimiluminescentes para determinao de atividade de peroxidases, como a prpria
HRP ou outras peroxidases como a mieloperoxidase presentes em neutrfilos.
N
R
2
R
1
H
N
R
1
R
2
O
O
H
N
H
O
R
2
O
R
1
HRP/H O /O
2 2 2
N
H
O
R
2
O
R
1
+
Luz
Esquema 2.4- Proposta de desenvolvimento de uma metodologia quimiluminescente
para anlise de peroxidases


5 9
5 9
iv) Hidrlise de oo o o - hidroperxi-aldedos protegidos: desenvolvimento de uma
metodologia quimiluminescente para determinao quantitativa de
esterases.
Como foi exposto na introduo, o - hidroperxi-aldedos protegidos por um
grupo silila foram sintetizados e as suas desprotees geraram quimiluminescncia.
Partindo deste princpio, um composto desse tipo, protegido por um grupo acila, foi
sintetizado. O objetivo, neste caso era que o mesmo pudesse ser hidrolisado via
ao cataltica de esterases e, conseqentemente, atuar como uma sonda
quantitativa de sua atividade (esquema 2.5).
O H
R
1
R
2
O
O
R
3
Esterase
O H
R
1
R
2
OOH
R
1
R
2
O
O
HO
+
HCOOH
+
Luz
+ H O
2
R
3
O
OH
+
R
2
R
1
O
+ HCOOH
R
2
R
1
O
Esquema 2.5- Proposta de desenvolvimento de uma metodologia
quimiluminescente para anlise de esterases


6 0
6 0
3 - Desenvolvimento de uma Metodologia
Quimiluminescente para Anlise de Atividade de Fosfatase
Alcalina e Fosfatase cida
3 .1 - Resultados
Tendo como objetivo ltimo desenvolver uma metodologia quimiluminescente
para quantificao de atividade das enzimas fosfatase alcalina e fosfatase cida, os
trabalhos foram iniciados com a sntese dos sais de anilnio e de sdio do fosfato de
2 - metilpropen-1-ila, que sero designados como anilina-MPP e sdio-MPP
respectivamente, e que seriam possveis substratos das fosfatases. Abaixo descreve-
se, passo a passo, como estes compostos foram obtidos.
3 .1 .1 - Preparao do 2-cloro-2-metilpropanal
(91)
Preparou-se este composto por meio da o - halogenao do 2-metilpropanal.
Trata-se de uma reao de halogenao de compostos carbonlicos cujo princpio
o ataque nucleoflico do enol sobre o tomo de cloro do cloreto de sulfurila.
(esquema 3.1). O rendimento foi de 49%.
O
H H
HO
S
O
O
Cl Cl
+
H
O
Cl
+
HCl SO
2
+
2 - cloro-2-metilpropanal
Esquema 3.1- Preparao do 2-cloro-2-metilpropanal


6 1
6 1
3 .1 .2 - Preparao do fosfato de dimetila e 2-metilpropen-1-ila
(92)
Preparou-se este enol-fosfato por meio da reao de Perkov
(93)
, que
consiste na reao entre um composto carbonlico o - halogenado (aldedos, cetonas
e alguns steres e amidas) e steres de fsforo trivalente (neste trabalho, utilizou-se
fosfito de metila). Trata-se de uma reao de timo rendimento e que tem como
possvel mecanismo a formao de um intermedirio cclico. O rendimento obtido foi
de 82% (esquema 3.2).
(CH O) P
3 2
OCH
3
C
O
H
C(CH )
3 2
Cl
(CH O) P
3 2
O
C
H
O
-
CH
3
C(CH )
3 2
Cl
(CH O) P
3 2
C
C
Cl
O
O
CH
3
H
(CH )
3 2
(CH O) P
3 2
O CH
O
C
CH
3
CH
3
+ CH Cl
3
enol-fosfato
Esquema 3.2- Preparao do fosfato de dimetila e 2-metilpropen-1-ila
3 .1 .3 - Preparao do fosfato de bis(trimetilsilila) e 2 -
metilpropen-1-ila
(94)
Para tornar o enol-fosfato solvel em meio aquoso, este deveria ser
transformado no seu sal correspondente. Para isso, o primeiro passo foi realizar a
sua de-metilao atravs da reao com cloreto de trimetilsilano. O rendimento foi de
5 6 % (esquema 3.3).
+
2 (CH ) Si
3 3
Cl + 2 CH Cl
3
enol-fosfato sililado
P
O
OCH
3
OCH
3
O
P
O
OSi(CH )
3 3
OSi(CH )
3 3
O
Esquema 3.3- Preparao do fosfato de bis(trimetilsilila) e 2-metilpropen-1-ila


6 2
6 2
3 .1 .4 - Preparao do hidrogenofosfato de anilnio e 2 -
metilpropen-1-ila
(94)
Este passo final, para sntese do substrato anilina-MPP, foi realizado
utilizando-se etanol em excesso para desproteo do grupo fosfato, e anilina como
base necessria formao do sal. O rendimento foi de 70% (esquema 3.4).
OSi(CH )
3 3
+
NH
2
P
O
O
-
O
OH
NH
3
+
anilina-MPP
etanol
P
O
OSi(CH )
3 3
O
+ OH
OSi(CH )
3 3
2
+ 2
Esquema 3.4- Preparao do hidrogenofosfato de anilnio e 2-metilpropen-1-
ila
3 .1 .5 - Sntese do fosfato dissdico de 2-metilpropen-1-ila
(95)
Para preparao do substrato sdio-MPP utilizou-se um tcnica adaptada de
um procedimento para sntese de fosfoenolpiruvato, que consiste em desproteger o
enol-fosfato sililado com etxido de sdio (esquema 3.5). O rendimento foi de 77%.
OSi(CH )
3 3
+ 2
sdio-MPP
P
O
OSi(CH )
3 3
O
P
O
O Na
- +
O Na
- +
O ter
OSi(CH )
3 3
+ 2
O Na
- +
Esquema 3.5- Sntese do fosfato dissdico de 2-metilpropen-1-ila


6 3
6 3
3 .2 - Desenvolvimento do protocolo analtico
Uma vez preparados os substratos, iniciaram-se os testes para verificar
a viabilidade do sistema e, se o resultado fosse positivo, buscar as condies de
maior eficincia. A reao em estudo (esquema 3.6) e o perfil de emisso (figura
3 .1 ) , obtido aps otimizao do sistema esto apresentados abaixo.
O
P
O
O
-
O
-
HRP/H O /O
2 2 2 H O/ALP
2
O
HCOOH HPO
4
- 2
+ + + Luz
pH 9,3
Esquema 3.6- Reao quimiluminescente para determinao de fosfatase
alcalina (ALP)
0 1 2 3 4 5 6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
12 0
14 0
D
C
B
A
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e
l

u
z

(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 3.1- Perfil do sinal quimiluminescente em funo da atividade da
enzima fosfatase alcalina. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ] = 1 mol/L, [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3,
2
37 C. [DBAS] = 40 mol/L. [ALP] = A 0,09 u/mL, B 0,18 u/mL, C 0,27 u/mL, D 0,
0 ,36 u/mL



6 4
6 4
Embora tenha sido indicado a preparao simultnea dos dois substratos, na
verdade o substrato anilina-MPP foi o primeiro a ser sintetizado e estudado. A seguir
sero mostrados os ensaios realizados com este substrato para encontrar as
melhores condies de anlise e eficincia quntica de quimiluminescncia. Estes
ensaios foram realizados em triplicatas ou duplicatas e para alguns parmetros,
como concentrao de perxido de hidrognio, concentrao de HRP e a
concentrao de substrato, foram tomados como ponto de partida as condies
timas obtidas no estudo cintico da quimiluminescncia do enol-sililado, realizado
por Baader e colaboradores (vide introduo item 1.4.1)
(41)
. Para os parmetros como
concentrao de tampo e pH foram tomados como base os valores utilizados em
metodologias comuns de determinao de ALP ou ACP
(96)
. Os testes abaixo foram
realizados em um contador de ftons em um volume total de 3 mL e a reao
disparada pelo substrato.
Tabela 3.1- Efeito do tipo de tampo sobre a intensidade
mxima de luz
Tampo Intensidade de luz (V)
2 - amino-2-metil-propanol 0,19
_
0,03
Carbonato 0,08
_
0,02
Glicina 0,15
_
0,02
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 18
u/mL, [MgCl ] = 1 mmol/L, [DBAS] = 30
2
mol/L, [anilina-MPP] = 30 mol/L, [tampes] =
0,90 mol/L, pH 10,4, 37C
Tabela 3.2- Efeito da concentrao do tampo 2-amino-2-metil-propanol
(AMP) sobre a intensidade mxima de luz
[AMP] (mol/L) Imtensidade (V)
0 ,90 0,17
_
0,02
0 ,45 0,20
_
0,02
0 ,15 1,25
_
0,16
0 ,10 1,01
_
0,14


6 5
6 5
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 18 u/mL,
[MgCl ] = 1 mmol/L, [DBAS] = 30
2
mol/L; [anilina-MPP] = 30 mmol/L, pH 10,4, 37C
Tabela 3.3- Efeito da concentrao do substrato [anilina-MPP] sobre a
intensidade mxima de luz
Anilina-MPP (mM) Intensidade (V)
3 0 1 ,27
_
0,25
1 0 3 ,20
_
0,17
5 3 ,90
_
0,27
2 .5 2 ,80
_
0,10
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 18
u/mL, [MgCl ] = 1 mmol/L, [DBAS] = 30
2
mol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 10,4; 37C
Tabela 3.4- Efeito do pH do tampo sobre a intensidade mxima
de luz
pH do tampo [AMP] 0,15 M Intensidade (V)
8 ,5 1 ,15
_
0,21
9 ,3 4 ,05
_
0,22
9 ,8 3 ,70
_
0,20
1 0 ,4 2 ,75
_
0,06
1 1 ,0 1 ,40
_
0,14
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L; [HRP] = 2
2 2
mol/L; [ALP] = 10
u/mL; [MgCl ] = 1 mol/L; [DBAS] = 30
2
mol/L; [anilina-MPP] = 5,0 mmol/L; [AMP] =
0 ,15 mol/L; 37C
Tabela 3.5- Efeito da concentrao de perxido de hidrognio sobre a
intensidade mxima de luz
[H O ] mM
2 2
Intensidade (V)
0 .0 5 3 ,30
_
0,20
0 .1 0 3 ,87
_
0,08
0 .2 0 4 ,00
_
0,10


6 6
6 6
0 .3 0 3 ,45
_
0,05
Concentraes finais: [HRP] = 2 mol/L; [ALP] = 10 u/mL, [MgCl ] = 1 mmol,
2
[DBAS] = 30 mol/L, [anilina-MPP] = 5,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C
Tabela 3.6- Efeito da concentrao de peroxidase de raiz forte (HRP)
sobre a intensidade mxima de luz
[HRP] M Intensidade (V)
0 ,5 1 ,98
_
0 ,17
1 ,0 2 ,42
_
0 ,32
2 ,0 3 ,27
_
0 ,24
4 ,0 3 ,50
_
0 ,30
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [ALP] = 10 u/mL, [MgCl ] = 1
2 2 2
mmol/L, [DBAS] = 30 mol/L, [anilina-MPP] = 5,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3,
3 7 C
3 .2 .1 - Sal de anilnio versus sal de sdio
Objetivando aumentar a sensibilidade da metodologia, resolveu-se trocar o
contra-on do sal de enol-fosfato. A idia era avaliar a interferncia do on anilnio no
meio de reao, pois conhecido o efeito supressor que as aminas exercem sobre
estados excitados. Alm disso, sendo os sais sdicos, em geral, bastante solveis
em meio aquoso, haveria a possibilidade de um aumento da solubilidade do
substrato, tornando-o mais adequado a uma reao enzimtica. O resultado foi
excelente, pois ao contrrio do substrato anilina-MPP, a soluo estoque de sdio-
MPP pode ser preparada em meio aquoso e foi obtido um aumento significativo no
rendimento quntico de quimiluminescncia.
Foram realizados alguns ensaios semelhantes aos anteriores (no
mostrados) e concluiu-se que, de modo geral, as condies timas obtidas para o
substrato anilina-MPP eram tambm verificadas para o substrato sdio-MPP. Uma
exceo foi a concentrao tima do substrato. Neste caso, obteve-se os melhores
resultados utilizando-se 1 mmol/L como concentrao final para o mesmo. Abaixo
apresentado uma comparao entre os sinais quimiluminescentes obtidos com


6 7
6 7
ambos os substratos. Observe que agora foram utilizados apenas 0,5 u/mL de ALP e
5 mol/L de DBAS (figura 3.2).
0 3 6 9 1 2
0 ,0
0 ,5
1 ,0
1 ,5
2 ,0
B
A
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

V

)

tempo (min)
Figura 3.2- Comparao entre os sinais quimiluminescentes dos substratos
anilina-MPP e sdio-MPP. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 0,5 u/mL, [MgCl ] = 1 mmol/L, [DBAS] = 5
2
mol/L, [anilina-MPP] = 1,0
mmol/L, [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C. (A) substrato
sdio-MPP; (B) substrato anilina-MPP
3 .2 .2 - Efeito da concentrao de DBAS e DMSO na atividade da
fosfatase alcalina e quimiluminescncia
Se por um lado o uso de DBAS intensifica o sinal de luz por sensibilizao das
carbonilas tripletes formadas, por outro lado nada se conhecia sobre a ao que o
mesmo poderia exercer sobre a atividade cataltica da fosfatase alcalina. Resolveu-
se, ento, estudar o efeito do mesmo e tambm o efeito do solvente utilizado para
preparar as solues estoques sobre a atividade da enzima. Para investigar estas
possibilidades foi estudado como o consumo de oxignio dissolvido, caracterstica
bsica dessa reao, estava sendo afetado por estes reagentes. A vantagem em se



6 8
6 8
utilizar como parmetro de medida a velocidade do consumo de oxignio est no fato
de que se monitora o papel desses reagentes diretamente sobre a atividade da
fosfatase e no a possvel supresso ou sensibilizao do produto em estado
excitado, o que poderia gerar resultados falsos. Em outras palavras, a reao
monitorada passos antes da gerao de estados excitados. Como mostra a tabela
3 . 7, estes reagentes realmente provocam um decrscimo de at 50% na velocidade
de consumo de oxignio e, assumindo que a etapa lenta da reao a hidrlise do
substrato catalisada pela ALP, estes resultados indicam uma inibio dessa enzima.
Tabela 3.7 Efeito da concentrao de DMSO e DBAS na velocidade
relativa de consumo de oxignio
[DMSO]
(mmol/L)
[DBAS] ( mol/L) Vel. Rel. Cons .O
2
0 0 1
0 ,35 1 0 0 ,41
0 ,35 0 0 ,55
0 ,18 1 0 0 ,56
0 ,18 0 0 ,59
0 ,035 1 0 0 ,84
0 ,035 0 0 ,88
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, HRP = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 0,11
u/mL, [MgCl ] = 1 mmol/L, [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3,
2
37 C. Os valores de concentrao indicados na tabela representam as
concentraes finais. As velocidades de consumo de oxignio foram medidas
dividindo o decrscimo na concentrao do mesmo em funo de um intervalo de
tempo fixado. O teste controle sem DMSO ou DBAS foi tomado como referencial


6 9
6 9
Uma vez verificado o significativo efeito inibidor que o DMSO exercia sobre a
atividade ALP, passou-se a utilizar uma soluo estoque o mais concentrada
possvel de DBAS em DMSO, a fim de diminuir o efeito do solvente. A seguir ser
mostrada a correlao entre a intensidade de luz e a concentrao do sensitizador
(figura 3.3). A saturao foi alcanada para concentraes de DBAS em torno de 50
mol/L. Acima desta concentrao observou-se um decrscimo na intensidade de
luz, o que pode ser fruto do efeito inibidor mencionado acima sobre a ALP.
0 5 0 1 0 0 1 5 0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0 . 8
1 . 0
1 . 2
1 . 4
1 . 6
1 . 8
i

n

t

e
n

s

.

m

x

.

d

e
l

u
z

(

v

)

DBAS ( M)
Figura 3.3- Efeito da concentrao de DBAS sobre a intensidade mxima de
luz. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [ALP] = 0,011
u/mL, [MgCl ] = 1 mmol/L; [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3,
2
3 7 C



7 0
7 0
3 .2 .3 - Correlao [ALP] versus intensidade mxima de luz
Aps alcanar as condies timas para o ensaio quimiluminescente de
deteco de fosfatase alcalina, determinou-se as curvas de calibrao [ALP] x
intensidade de luz a fim de avaliar a correlao existente e tambm o limite de
deteco alcanado pela tcnica. Como est mostrado abaixo (figura 3.4), o eixo das
abscissas est projetado em log de mols de ALP, que embora no seja comum para
expressar atividade enzimtica, usual quando se deseja expressar o limite de
deteco alcanado por alguma tcnica ou substrato. Para obter estes valores a
massa de protena (enzima) foi dividida pelo seu peso molecular. Supondo que a
enzima tenha perdido parcialmente a sua atividade, o limite de deteco real pode
ser menor do que o aqui apresentado. Na figura abaixo so apresentados quatro
curvas de calibrao em funo da quantidade de DBAS utilizada. Embora isto tenha
sido feito devido a estreita faixa de deteco do contador de ftons utilizado, este
resultado mostra que a concentrao de DBAS poder, em princpio, ser ajustada
para cobrir uma determinada faixa de concentrao de enzima, conforme a
necessidade.
- 1 3 ,5 - 1 3 ,0 - 1 2 ,5 - 1 2 ,0 - 1 1 ,5 - 1 1 ,0 - 1 0 ,5
1 ,0
1 ,5
2 ,0
2 ,5
3 ,0
3 ,5
D C B A
l

o
g
[
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

m

x

i

m

a

d
e

l

u

z

]

(

V

)

log [mol de ALP]
Figura 3.4- Curvas de calibrao, [ALP] versus Intensidade mxima de luz em
vrias concentraes de DBAS, obtido em um contador de ftons. Concentraes



7 1
7 1
finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ] = 1 mmol/L, [sdio-MPP] = 1,0
2
mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C. [DBAS] ( mol/L): A = 0, B= 1, C= 10, D =
4 0
Aps a aquisio de um luminmetro comercial, capacitado para leituras em
microplacas utilizadas em testes imunolgicos, repetiu-se os ensaios de
determinao da curva [ALP] x Luz. Este novo aparelho, alm de mais sensvel
(cerca de uma ordem de grandeza quando comparado ao contador de ftons
utilizado), possui uma faixa de operao bastante superior, no sendo necessrio
utilizar vrias concentraes de DBAS. O limite de deteco alcanado foi da ordem
de 10
- 1 5
mol de ALP em 0,3 mL (figura 3.5).
- 1 5 - 1 4 - 1 3 - 1 2 - 1 1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
l

o
g
[

i

n

t

e
n

s

.

m

x

i

m

a

d

e
l

u

z

]

(

c
p

s

)

log [mol de ALP]
Figura 3.5- Curva de calibrao [ALP] x intensidade mxima de luz obtido em
um luminmetro de placas (r = 0,994, desvio padro = 0,21, N = 18).
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L; [MgCl ] = 1 mmol/L;
2
[sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C. [DBAS] 40 mol/L.



7 2
7 2
3 .2 .4 - Correlaco [ALP] versus consumo de oxignio
Tambm foi possvel fazer uma correlao entre a concentrao de
enzima e a velocidade de consumo do oxignio dissolvido no meio de reao. A
seguir ser mostrado o perfil de consumo e a curva de calibrao obtida (figura 3.6
(A) e (B)). Como pode ser observado, o limite de deteco alcanado foi
praticamente o mesmo que se observou quando se utiliza a quimiluminescncia
como sinal analtico.
(A)
0 5 1 0 1 5 2 0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
branco
E
D
C
B
A
%
O

x

i

g

n

i

o

d

i

s
s
o

l

v

i

d
o

Tempo (min)
(B)



7 3
7 3
- 1 5 - 1 4 - 1 3 - 1 2 - 1 1
- 1
0
1
2
E A
l

o
g
(

v
e

l
.

c
o
n

s

.

o

x

i

g

n

i

o

)

log [mol de ALP]
Figura 3.6- (a) Perfil de consumo de oxignio em funo da concentrao de
ALP. (b) Curva de calibrao velocidade de consumo de oxignio versus [ALP] (r =
0 ,991, desvio padro = 0 ,16, N = 5). Concentraes finais: H O ] = 0,10 mmol/L;
2 2
[HRP] = 2 mol/L; [MgCl ] = 1 mmol/L; [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L,
2
pH 9,3, 37C.
3 .2 .5 - Aplicao em anlise de atividade de ALP em soro
sangneo humano
Uma das possveis aplicaes da metodologia quimiluminescente em
desenvolvimento a determinao da atividade da ALP em soro sangneo humano,
que, como foi apresentado na introduo, utilizada no diagnstico de doenas
sseas e hepticas. Para testar esta possibilidade, foram colhidos soros sangneos
de pacientes que apresentavam esta enzima alterada ou normal (material cedido
pelo Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Universitrio). Fez-se ento uma
comparao entre os resultados obtidos com a metodologia quimiluminescente em
desenvolvimento, e os valores encontrados por meio de uma metodologia comercial.
Para isso, os soros sangneos foram submetidos ao ensaio convencional (mtodo
espectrofotomtrico, vide parte experimental); obteve-se assim os valores de ALP
segundo esta tcnica, os quais foram projetados na abscissa. A seguir, as mesmas
amostras foram submetidas a metodologia quimiluminescente e os valores,
projetados na ordenada. A figura 3.7 mostra que uma boa correlao foi observada.



7 4
7 4
1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
I

n

t

e
n

s

i

d

a
d

e

m

x

.

d

e
l

u

z
(

c
p

s
)

[ALP] (unid/L)
Figura 3.7- Comparao entre os mtodos quimiluminescente e
espectrofotomtrico de anlise de atividade de ALP. Abscissa = mtodo
espectrofotomtrico, ordenada = mtodo quimiluminescente. (r = 0,991, desvio
padro = 4,85, N = 12). Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ] = 1 mmol/L; [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3,
2
3 7 C, [DBAS] = 40 mol/L



7 5
7 5
3 .2 .6 - Aplicao em tcnicas de imunoensaios (conjugados de
ALP)
A segunda possvel aplicao desta metodologia quimiluminescente est na
determinao quantitativa de conjugados de fosfatase alcalina, que como foi exposto
anteriormente, so largamente utilizados em enzimaimunoensaios (EIA). Para isso,
adquiriu-se um conjugado do tipo ALP-IgG anti-humano (Sigma n9919). comum,
quando se trata de ensaios imunolgicos, expressar o limite de deteco por meio do
mximo de diluio do conjugado onde ainda se obtm sinal analtico. Abaixo est
apresentado a correlao entre a diluio do conjugado e a intensidade mxima de
luz (Figura 3.8).
3 ,0 3 ,5 4 ,0 4 ,5 5 ,0 5 ,5
2
3
4
5
6
l

o
g

[
i

n

t

e
n

s

.

m

x

.

d

e
l

u
z

]

(

c

p

s
)

log [diluio]


7 6
7 6
Figura 3.8- Aplicao da metodologia quimiluminescente para quantificao
da concentrao de um conjugado de ALP (ALP-IgG) r = 0,997, desvio padro =
0,10, N = 18). Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ]
2
= 1 mmol/L, [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C, [DBAS] =
4 0 mol/L
3 . 2. 7 - Aplicao do ensaio quimiluminescente como revelador em um ensaio
completo para determinar a infeco pelo vrus Epstein-Barr em soro sangneo
O ensaio quimiluminescente como sistema revelador em aplicaes de EIA foi
tambm testado em um kit comercial para determinao semi-quantitativa de
anticorpos anti-Epstein-Barr em soro sangneo. Trata-se de um ensaio do tipo
sanduche, capaz de detectar espectrofotometricamente a presena e o nvel de
infeco por este vrus. Basicamente, o kit consta de uma placa com 96 poos nos
quais os antgenos esto aderidos. A incubao com o soro sangneo positivo
permite a formao do complexo antgeno-anticorpo que fica aderido placa. Depois
de uma srie de lavagens (vide parte experimental) adicionado o conjugado anti-
humano ALP-IgG, que-se complexa aos anticorpos humanos presentes. O ltimo
passo a adio do revelador, que neste kit p -nitrofenolfosfato. Este reagente
sofre hidrlise catalisada por ALP, gerando p -nitrofenol que apresenta uma
absorbncia a 405 nm maior do que o fosfato original.
Para testar a metodologia quimiluminescente, realizou-se todos os
passos at a adio do revelador, quando, ento, este foi substitudo pelo sdio-MPP
e por todas as demais condies do ensaio. A seguir, a figura 3.9 apresentar os
resultados obtidos utilizando-se os calibradores e um soro controle fornecidos pelo
fabricante.



7 7
7 7
2 4 6 8
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0 E
D
C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

c
p
s

)

Tempo (min)
Figura3.9- Enzimaimunoensaio para determinar a infeco pelo vrus Epstein-
Barr e revelado pela metodologia quimiluminescncia em desenvolvimento.
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ] = 1 mmol/L,
2
[sdio-MPP] = 1,0 mmol/L, [AMP] = 0,15 mol/L, pH 9,3, 37C, [DBAS] = 40 mol/L. (A)
= branco; (B) = calibrador com 15 unidades arbitrrias (Au)/ mL; (C ) idem com
2 1 0 Au/mL; (D) = idem com 485 Au/mL; (E) = soro controle com 350-600 Au/mL.



7 8
7 8
3 .2 .8 - Determinao da atividade da enzima fosfatase cida
prosttica
Alm da fosfatase alcalina, uma outra forma isoenzimtica das
monofosfatases, cuja determinao bastante til em diagnsticos de doenas, a
fosfatase cida (ACP). Esta enzima, que apresenta atividade tima em pH levemente
cido (em torno de 5,0), existe sob duas formas: ACP total no soro e ACP-prosttica.
A determinao dessa ltima, como foi descrito na introduo, de extrema
importncia no diagnstico de enfermidades da prstata. Para testar a potencialidade
da metodologia em desenvolvimento na determinao de fosfatase cida adquiriu-se
ACP-Prosttica comercial, que pode ser submetida ao ensaio sendo apenas
necessrio alterar o pH para 4,8 (figuras 3.10 e 3.11).
0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
F
E
D
C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

Tempo (s)
Figura 3.10- Perfil do sinal quimiluminescente em funo da atividade da
enzima fosfatase cida prosttica. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP]
2 2
= 2 mol/L, [MgCl ] = 1 mmol/L; [sdio-MPP] = 1,0 mmol/L [Tampo citrato] = 0,05
2
mol/L, pH 4,8, 37C. [DBAS] = 40 mol/L. (A) 0,09, (B) 0,023, (C) 0,045, (D) 0,067,
(E) 0,090, (F) 0,135 unid/mL



7 9
7 9
0 ,0 0 ,5 1 ,0 1 ,5
- 2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

m

x

.

d
e

l

u

z

(

1
0

3
c
p
s

)

ACP (unid/mL)
Figura 3.11- Curva de calibrao [ACP] versus intensidade mxima de luz.
Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [MgCl ] = 1 mmol/L;
2
[sdio-MPP] = 1,0 mmol/L [Tampo citrato] = 0,05 mol/L, pH 4,8, 37C. [DBAS] = 40
mol/L (r = 0,9973, desvio padro = 2 70 0, N = 18)



8 0
8 0
3 .3 - Discusso e concluses
O substrato quimiluminescente (sdio-MPP) aqui desenvolvido, pode ser
encarado como simples e de baixo custo (do ponto de vista de sua preparao),
quando comparado a substratos como o AMPPD ou a luciferina de vagalume
protegida por fosfato (esquema 3 . 6), utilizados em metodologias
semelhantes
(74,75,76,84)
. Sua preparao envolve quatro passos relativamente simples
e a nica etapa que mostrou uma maior dificuldade foi a sililao do enol-fosfato, que
exigiu trs tentativas para alcanar o produto desejado. Nas primeiras tentativas
obteve-se apenas a sililao de um dos grupos metxi. Para obter a sililao
completa foi necessrio fazer um acompanhamento (cromatografia gasosa) por seis
dias, sob refluxo, at que todo composto mono-sililado desaparecesse.
S
N
S
N
O
OH
Na O PO
2 3
O O
OPO Na
3 2
OPO Na
3 2
Luciferina de vagalume protegida
AMPPD Sdio-MPP
Esquema 3.6- Comparao entre as estruturas moleculares de alguns
substratos quimiluminescentes para determinao de ALP e o substrato sdio-MPP
A condio primria para que esta metodologia analtica obtivesse
sucesso, era, obviamente, a possibilidade de correlao entre a concentrao ou a
atividade da ALP com o sinal quimiluminescente. Isto seria possvel se a hidrlise do
substrato fosse a etapa lenta da reao, pois assim a correlao poderia ser feita
com a concentrao do catalisador (enzima). Nos trabalhos desenvolvidos por
Baader
(41)
estudou-se a cintica da decomposio quimiluminescente de um enol
protegido pelo grupo trimetilsilano e constatou-se que a etapa lenta da reao era,
de fato, a desproteo do enol catalisada por fluoreto. Assim, como era esperado,
para o enol protegido pelo grupo fosfato tambm foi obtida uma tima correlao
entre a atividade enzimtica e a intensidade mxima de luz. Por outro lado, no se
verificou uma correlao entre a atividade enzimtica e a rea integrada total de luz.


8 1
8 1
De fato, deveria-se esperar que a intensidade integrada total de luz se mantivesse
constante e independente da concentrao da enzima, visto que foi alterado apenas
a concentrao do catalisador da reao. No entanto, observou-se que a intensidade
integrada de luz no se manteve nem mesmo constante, seja quando utilizada a
fosfatase alcalina (figura 3.1), seja quando utilizada a fosfatase cida (figura 3.10).
Isto pode ser fruto de reaes laterais como, por exemplo, a decomposio do
perxido de hidrognio. Realmente, observou-se que as re-adies de perxido
podiam restabelecer parcialmente a quimiluminescncia e o consumo de oxignio.
Para o desenvolvimento do protocolo analtico partiu-se de condies usuais,
tanto para oxidaes quimiluminescentes catalisadas por HRP de isobutanal ou seu
enol sililado, quanto para ensaios comerciais de ALP. Obviamente, o desafio era
encontrar uma condio tima de reao para duas enzimas que possuem
comportamentos bastante diferentes. No caso da fosfatase alcalina, cujo pH de
mxima atividade est na faixa de 9,0 a 10,5, os mtodos analticos descritos
mostram uma larga variedade de condies, seja do tipo e concentrao do tampo,
seja da temperatura do ensaio, seja da concentrao dos reagentes
(96)
. Assim, a
condio inicial utilizada (tampes 0 ,90 mol/L, pH 10 ,4, etc) foi um valor
arbitrariamente escolhido entre os vrios encontrados. Outro ponto importante com
relao aos ensaios de fosfatase alcalina a utilizao, em todos os casos, de Mg
+ 2
como um cofator da mesma. Embora no tenha sido observado um aumento
significativo de quimiluminescncia com a utilizao de magnsio, resolveu-se
manter a adio do mesmo. A enzima HRP, por sua vez, apresenta atividade
cataltica em uma larga faixa de pH, sendo que em cerca de pH 11,0 a enzima perde
em torno de 50% de sua capacidade cataltica
(7)
. Nos estudos aqui desenvolvidos
encontrou-se o ponto timo de pH em 9,3. Para as concentraes de HRP e H O
2 2
partiu-se tambm dos valores timos encontrados por Baader no estudo cintico da
oxidao do enol sililado, que so respectivamente 2 mol/L e 0,1 mmol/L. A
propsito, este valor de concentrao de H O
2 2
metade da concentrao de
oxignio dissolvido (0,2 mmol/L) no meio tamponado, sendo que na estequiometria
da reao h o consumo de 0,5 mols de H O para cada mol de O . Tambm neste
2 2 2
estudo verificou-se que estes valores estavam muito prximos do ideal. Assim
decidiu-se manter os valores de concentrao em 2 mol/L e 0,1 mmol/L
respectivamente para HRP e H O .
2 2


8 2
8 2
Os primeiros ensaios realizados (tabela 3 . 1) mostraram sinais
extremamente baixos, tendo em vista a alta concentrao de ALP utilizada (18 u/mL).
Ao diminuir a concentrao daquele que se mostrava como o melhor tampo (AMP,
2 - amino-2-metilpropanol) de 0,90 mol/L para 0,15 mol/L, obteve-se um aumento de
cerca de 10 vezes no sinal analtico. O efeito supressor que aminas possuem sobre
estados excitados tripletes pode estar por trs dessa constatao experimental.
Entretanto, o tampo carbonato, apesar de no apresentar o problema citado acima,
mostrou-se menos eficiente do que o tampo AMP. No entanto, preciso lembrar
que a condio tima do ensaio no depende apenas da eficincia de desativao
radiativa do produto em estado excitado, mas tambm do efeito dos vrios reagentes,
inclusive os tampes, sobre a atividade cataltica das enzimas.
O substrato anilina-MPP foi inicialmente utilizado devido a facilidade com que
poderia ser preparado pela precipitao aps a adio da anilina em meio de etanol.
No entanto, a baixa sensibilidade do ensaio alcanada com a utilizao do mesmo,
que tambm pode ser fruto do efeito supressor das aminas, levou-nos a troca do
contra on. Para isto, tomou-se como base a sntese de um enol-fosfato derivado do
cido pirvico, onde a retirada do grupo trimetilsilila foi conseguida atravs de
metxido de sdio em meio etrico. O primeiro resultado positivo encontrado com
este novo composto foi a sua total solubilidade em meio aquoso. O substrato anilina-
MPP era pouco solvel em meio aquoso, sendo necessrio dissolv-lo em DMSO
antes do uso.
A eficincia de quimiluminescncia alcanada com este novo substrato
superou as nossas expectativas. A figura 3.2 ilustra uma comparao entre os dois
substratos. A maior solubilidade desse substrato favoreceu tambm o manuseio do
mesmo. Para entender esta afirmativa deve-se esclarecer que o disparo da reao,
quando utilizado o contador de ftons, era realizado atravs de uma cnula (1 m de
comprimento) de modo a evitar a exposio da fotomultiplicadora luz externa.
Assim, solues viscosas, como a soluo de anilina-MPP em DMSO, apresentavam
uma grande dificuldade para ser introduzida no meio de reao.
Para este novo substrato tambm realizou-se alguns testes para a otimizao
do ensaio, obtendo-se resultados semelhantes aos obtidos com o substrato anilina-
MPP. Uma exceo foi a concentrao do substrato que, neste caso, mostrou


8 3
8 3
melhores resultados quando utilizado 1mmol/L do mesmo contra 5 mmol/L do
substrato anilina-MPP.
Uma vez alcanadas as condies timas de pH, tipo e concentrao de
tampo, melhor substrato, etc., realizou-se ensaios para verificar a correlao [ALP]
versus sinal quimiluminescente e avaliar o limite de deteco da metodologia. Uma
inspeo da figura 3.1 mostra qualitativamente e foi comprovado quantitativamente
por integrao que no era possvel estabelecer uma correlao entre [ALP] e a rea
integrada de luz. De fato, como foi exposto anteriormente, a rea integrada de luz
deveria ser constante e independente da quantidade de enzima. Por outro lado, uma
tima correlao foi encontrada com a intensidade mxima da luz, o que tornou a
metodologia potencialmente til. Outro ponto importante que este pico mximo
alcanado dentro de poucos segundos, o que torna a metodologia interessante do
ponto de vista de ensaios automatizados, em que o tempo de anlise de grande
importncia.
Como era esperado supondo a gerao de acetona em estado excitado
triplete, o sensibilizador (DBAS)
(27)
utilizado na reao intensificou a emisso de luz.
Por outro lado, a diminuio da velocidade de consumo de oxignio causada por ele
e principalmente pelo seu solvente mostrou o efeito inibidor que eles exercem sobre
a fosfatase alcalina.
Um ponto interessante sobre as curvas obtidas alterando a concentrao de
DBAS (figura 3.4) que, a princpio, um protocolo analtico em desenvolvimento
poderia ser modulado, de acordo com a sensibilidade desejada. Na figura 3.5,
agora utilizando um luminmetro adaptado para leituras em microplacas, foi
detectado em torno de 10
- 1 5
mol de ALP dissolvidos em 0,3 mL de soluo.
Outra caracterstica interessante dessa metodologia a possibilidade
de correlao entre a atividade de ALP e a velocidade de consumo de oxignio
dissolvido. Embora no seja um ensaio quimiluminescente, esta possibilidade pode
abrir um novo campo de aplicao desse tipo de substrato em sistemas opacos, em
que medidas de emisso de luz no seriam viveis (figura 3.6).
A primeira aplicao da metodologia foi a anlise de ALP presente em
soro sangneo humano. Embora tenham sido submetidos comparao apenas 5
amostras, sendo que para o estabelecimento de uma nova tcnica seriam necessrio
pelo menos 200 amostras, os resultados obtidos indicam a potencialidade da tcnica


8 4
8 4
neste campo de aplicao (figura 3.7). Seguindo a proposta de usar a velocidade de
consumo de oxignio como sinal analtico, foram submetidas amostras de soro
sangneo a este mtodo de anlise. Embora tenha sido observado consumo de
oxignio, no se obteve uma correlao entre [ALP] e a velocidade de consumo do
oxignio. Testes controles mostraram consumo de O
2
mesmo na ausncia do
substrato sdio-MPP, quando apenas HRP e H O
2 2
estavam presentes. Este fato
evidencia a existncia de substratos presentes comumente em soros sangneos,
capazes de serem oxidados via HRP/H O
2 2
sem, entretanto, ter sido detectado
quimiluminescncia nestes controles. Alm do mais, este consumo no era
constante, dependendo da amostra utilizada. Portanto, no foi possvel padroniz-lo
como branco.
A segunda, e at mais importante, potencial aplicao dessa
metodologia quimiluminescente de deteco de concentrao de ALP o seu uso
como revelador em enzimaimunoensaio (EIA). Para testar esta possibilidade
adquiriu-se um conjugado do tipo ALP-IgG que foi submetido anlise. Com este
conjugado, diluies finais de at 300.000 do mesmo puderam ser detectadas (figura
3 . 8).
Dando um passo adiante, adaptou-se uma metodologia de
enzimaimunoensaio colorimtrica para a metodologia em desenvolvimento. Foi
possvel distinguir o controle negativo (at 15 u/mL) dos positivos baixo e alto e do
soro controle infectado. Pode-se observar na figura 3.9 que, embora satisfatrio a
quimiluminescncia obtida nestes testes foi bastante baixa. No entanto, trata-se de
uma adaptao de uma metodologia colorimtrica comercial, onde reagentes
desconhecidos (tampo, reagente de lavagem, entre outros e que so adaptados
tcnica) foram adicionados antes da troca do substrato colorimtrico pelo substrato.
sdio-MPP. Alm disso, a microplaca utilizada era transparente, o que prprio de
um ensaio colorimtrico, e totalmente inadequado a um ensaio quimiluminescente.
De fato, testes posteriores com a enzima purificada, utilizando estas microplacas
transparentes, revelaram um perda de sensibilidade de uma ordem de grandeza
quando comparado s placas brancas e opacas. Assim, acreditamos que uma
melhora significativa poder ser alcanada com o desenvolvimento de uma tcnica
do tipo EIA prpria para este substrato. Isto passa, obviamente, pelo processo de


8 5
8 5
aderir os antgenos ou anticorpos nas microplacas e, portanto, fora do nosso campo
de atuao.
A terceira potencial aplicao dessa metodologia na determinao da
atividade de fosfatase cida em soro sangneo, tambm de grande utilidade no
auxlio de diagnstico de enfermidades como cncer de prstata. As condies do
ensaio foram as mesmas utilizadas no caso da ALP, exceto o tampo e pH do
mesmo (citrato 0,1mol/L, pH 4,8). A figura 3.10 mostra a boa correlao obtida entre
a atividade de ACP-prosttica e intensidade mxima de quimiluminescncia. Verifica-
se tambm uma mudana no perfil cintico do sinal quimiluminescente em relao
aos ensaios com fosfatase alcalina. O perfil do decaimento de quimiluminescncia
obtido na hidrlise do substrato sdio-MPP, catalisada pela fosfatase cida, mostrou
uma maior semelhana com os perfis obtidos no estudo do enol-sililado ou mesmo da
oxidao do isobutiraldedo. Nestes casos observa-se uma subida rpida seguida de
um plat ascendente devido ao consumo do oxignio do meio, que atua como
supressor de estados excitados tripletes, e posterior queda rpida, devido ao trmino
do oxignio (reagente limitante).


8 6
8 6
4 - Tentativa de Desenvolvimento de uma Metodologia
Quimiluminescente para Anlise da Atividade de Proteases
4 .1 - Resultados
Tendo como objetivo ltimo desenvolver uma metodologia quimiluminescente
para quantificao de atividade de proteases, os trabalhos foram iniciados
preparando uma enamina protegida. Escolheu-se como modelo o composto N -etil- N -
(2-metilpropen-1-il)benzenamida, cuja sntese ser descrita a seguir.
4 .1 .1 - Preparap da N-(2-metilpropilideno)etilamina
(97)
Preparou-se esta imina por meio da reao entre isobutanal e etilamina em
meio alcalino (esquema 4.1). O rendimento obtido foi de 48%.
H O
N
NH
2
H O
2
+
+
KOH
N - (2-metilpropilideno)etilamina
Esquema 4.1- Preparao da N -(2-metilpropilideno)etilamina
4 .1 .2 - Preparao da N-etil-N-(2-metilpropen-1-il)benzenamida
(98)


8 7
8 7
Preparou-se este composto por meio da reao entre a N -(2-
metilpropilideno)etilamina e cloreto de benzola (esquema 4.2). O rendimento foi de
5 1%.
O
Cl
+
trietilamina/
benzeno
O
N
+
HCl
N
enamina-protegida
Esquema-4.2- Preparao da N -etil- N -(2-metilpropen-1-il)benzenamida
4 .1 .3 - Medidas de consumo de oxignio e quimiluminescncia
na oxidao da N-(2-metilpropilideno)etilamina
Embora seja conhecida a propriedade quimiluminescente das iminas
quando submetidas oxidao pela ao cataltica da HRP (vide introduo)
(37)
,
alguns testes foram realizados com a N -(2-metilpropilideno)etilamina. As figuras 4.1
e 4 . 2 mostram os perfis de consumo de oxignio e quimiluminescncia
respectivamente em tampo fosfato e tris. Escolheu-se o tampo tris pH 8,0 para os
testes com a imina e a enamina protegida, pois so estas as condies utilizadas
para detectar a atividade da quimiotripsina por meio de uma tcnica comercial
fluorimtrica que estava disponvel neste laboratrio.



8 8
8 8
0 1 2 3 4 5 6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
B
A
%

O

x

i

g

n

i

o

d

i

s
s
o

l

v

i

d
o

Tempo (min)
Figura 4.1- Consumo de oxignio na oxidao da N -(2-
metilpropilideno)etilamina. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [imina] = 30 mmol/L, [tampo fosfato] = 0,05 mol/L, pH 7,4, [tampo Tris] =
0,05 mol/L, pH 8,0, 37C. (A) tampo tris; (B) tampo fosfato
0 1 2 3
0
1
2
3
4
5
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
(

V

)

Tempo (min)


8 9
8 9
Figura 4.2- Quimiluminescncia na oxidao da N -(2-
metilpropilideno)etilamina. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [imina] = 30 mmol/L, [tampo fosfato] = 0,05 mol/L, pH 7,4, [tampo Tris] =
0,05 mol/L, pH 8,0, 37C. (A) tampo tris; (B) tampo fosfato
4. 1. 4- Medidas de consumo de oxignio e quimiluminescncia na
oxidao da N-etil-N-(2-metilpropen-1-il)benzenamida
Para testar a potencialidade da tcnica utilizou-se a enzima
quimiotripsina para hidrolisar o substrato N -etil- N -(2-metilpropen-1-il)benzenamida.
Aps diversas tentativas para se obter indcios de quimiluminescncia, medidas de
consumo de oxignio e controles de consumo ou formao de produtos por
cromatografia gasosa, constatou-se que este composto no era reconhecido como
substrato da quimiotripsina. Uma mistura usada para digesto de protenas
(proteinase-k) tambm foi testada e novamente no foi constatado hidrlise da
enamina protegida (esquema 4.3).



9 0
9 0
N
O
quimiotripsina ou
proteinase-K
Tris / pH 8,0
OH
O
+
NH
HRP/H O /O
2 2 2
+ H O
2
O
+ H NH
O
+
Luz
Esquema 4.3- Proposta de uma metodologia quimiluminescente para anlise
de proteases. Concentraes finais: [enamina protegida] = 30 mmol/L, [tampo Tris]
= 0,05 mol/L, pH 8,0, 37C, [quimiotripsina] = 2,5 . 10
- 5
mg/mL
Na tentativa de explicar a ausncia de quimiluminescncia quando a
enamina protegida foi submetida hidrlise enzimtica, foram realizados ensaios
para avaliar o efeito que a quimiotripsina teria sobre a peroxidase e vice-versa. Para
isso, esta enzima foi adicionada a um ensaio quimiluminescente j estudado e que
utiliza HRP como catalisador. Trata-se do uso do sistema HRP/H O /O /acetato de 2-
2 2 2
metipropen-1-ila, que gera quimiluminescncia quando na presena de esterases
(99)
(figura 4.3). O oposto tambm foi verificado, ou seja, o efeito da peroxidase sobre a
atividade cataltica da quimiotripsina. Neste caso foi utilizado uma metodologia
fluorimtrica para medida de atividade da quimiotripsina e ento foi adicionado


9 1
9 1
HRP/H O ao meio de reao (figura 4.4). Em ambos os casos no foi detectada a
2 2
inativao de uma enzima sobre a outra.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d

a
d

e

d

e

L

u
z

(

1
0

4

c

p

s
)

Tempo (s)
Figura 4.3- Influncia da quimiotripsina nos ensaios quimiluminescentes
catalisados por HRP. Concentraes finais: [H O ] = 0,10 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L,
[acetato de 2-metilpropen-1-ila] = 30 mmol/L, [esterase] = 5 u/L, Tris 0,05 mol/L, pH
8,0, 37C. (A) controle; (B) adicionando 25 mg/mL de quimiotripsina;
adicionando 50 mg/mL de quimiotripsina



9 2
9 2
0 8 1 6 2 4 3 2 4 0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
(

1
0

3
c
p
s

)

Tempo (min)
Figura 4.4- Influncia da peroxidase na atividade cataltica da quimiotripsina.
Concentraes finais: substrato [Pro-Phe-Phe-MCA] = 0,01 mg/mL, [quimiotripsina] =
0 ,25 M, tris 0,05 mol/L, pH 8,0, 37C,
ex
= 360 nm,
em
= 480. (A) branco sem
quimiotripsina, (B) controle, (C ) em presena de [HRP] = 2 mol/L e [H O ] = 0,1
2 2
mmol/L



9 3
9 3
4 .2 - Discusso e concluses
Os resultados de consumo de oxignio e quimiluminescncia
comprovam a potencialidade das iminas como substratos do sistema oxidante
HRP/H O /O
2 2 2
(figuras 4.1 e 4.2). A maior velocidade de consumo de oxignio e o
decaimento da emisso de luz, quando o tampo fosfato foi utilizado versus o
tampo tris compatvel com o efeito cataltico sobre o equilbrio imina-enamina,
desempenhado por este tampo
(129)
. Similarmente, a reao de oxidao do
isobutanal por meio de HRP/H O /O requer tampo fosfato (vide introduo)
2 2 2
(38)
.
A escolha do substrato N -etil- N -(2-metilpropen-1-il)benzenamida para estudo
das potencialidades da tcnica baseou-se na maior facilidade de sntese do mesmo
e, principalmente, pela sua semelhana com o benzoato de 2-metilpropen-1-ila, cuja
hidrlise, pela ao cataltica de esterases, j foi extensamente estudado
(100)
(esquema 4.3).
A quimiotripsina catalisa a hidrlise de ligaes peptdicas prximas de
aminocidos aromticos
(101)
. Assim, a presena do anel aromtico no substrato
desenvolvido poderia ajudar no reconhecimento do mesmo.
O
N
N-
etil- -(2-metilpropen-1-il)benzenamida
N benzoato de 2-metilpropen-1-ila
O
O
Esquema 4.3- Semelhana estrutural entre o benzoato de 2-metilpropen-1-ila
e N -etil- N -(2-metilpropen-1-il)benzenamida
Como foi dito anteriormente, no se detectou quimiluminescncia ou consumo
de oxignio quando a enamida protegida ( N -(2-metilpropen-1-il)- N -etilbenzenamida)
foi submetida ao sistema quimiotripsina/HRP/H O /O . Uma primeira explicao para
2 2 2
as evidncias experimentais seria a perda de atividade da HRP que, sendo uma
protena, poderia ser inativada na presena da enzima proteoltica. Os resultados
no confirmaram esta proposta (figura 4.3). Poderia tambm estar ocorrendo a
inibio da quimiotripsina pelo sistema HRP/H O . Para avaliar esta possibilidade
2 2


9 4
9 4
foram realizados ensaios fluorimtricos comerciais de determinao da atividade da
quimiotripsina, e ento adicionado HRP e perxido de hidrognio ao meio de reao.
Novamente no foi observado uma alterao significativa na atividade cataltica da
enzima (figura 4.4).
Sabendo-se que no h inibio de uma enzima sobre a outra e que a
enamina, que seria gerada por hidrlise do substrato, poderia certamente ser
oxidada pelo sistema HRP/H O /O , gerando quimiluminescncia, ento a nica
2 2 2
possibilidade que restava era o no reconhecimento do substrato N -etil- N -(2-
metilpropenil)benzenamida pela quimiotripsina. Para avaliar esta possibilidade foram
realizados controles de consumo de substrato por cromatografia gasosa, e de fato,
no se verificou consumo do mesmo. O mesmo teste foi realizado utilizando-se uma
mistura proteoltica (proteinase-k), usada para digesto de protenas e portanto de
baixa especificidade pelo substrato. Aps vrias horas de reao no foi detectado
qualquer consumo do substrato tambm neste caso.
Acreditamos que o no reconhecimento do substrato N -etil- N -(2-
metilpropen-1-il)benzenamida pelas proteases testadas seja devido ao nitrognio
tercirio presente no mesmo. De fato, um levantamento posterior sobre substratos
artificiais de proteases
(101)
mostrou em todos os casos a presena grupos steres ou
amidas secundrias e nunca terciria, como o caso do substrato aqui desenvolvido.
Obviamente no seria possvel, na metodologia aqui empregada, desenvolver um
substrato que tivesse as propriedades desejadas e ainda ser uma amida secundria.
Certamente, a formao de -NH vinlico na etapa de desproteo o passo
fundamental para a oxidao quimiluminescente. Sem esta etapa a
quimiluminescncia no seria disparada pela hidrlise, inabilitando o mtodo. Em
outras palavras, tendo o substrato o grupo -NH livre, que o ponto de ataque das
formas ativas de peroxidase, no haveria necessidade de desproteo do mesmo e,
como resultado, a enzima hidroltica no seria o disparador da reao (esquema 4.5).


9 5
9 5
N
H
N
HRP/H O /O
2 2 2
N
O
O H
O
N
O
H
+ + Luz
N
O
H
HRP/H O /O
2 2 2
H
O
N
O
O
H
O
N
O
H
O
+
+
Luz
(A)
(B)
Esquema 4.5- Assim como iminas (A) so oxidadas via HRP/H O /O , uma
2 2 2
amida secundria (B), como por exemplo a acima descrita, tambm poderia ser
oxidada independente de sua hidrlise.
Certamente o problema tambm poderia estar na estrutura bastante simples
do substrato e talvez fosse necessrio, alm do grupo amdico, uma cadeia peptdica
ou pelo menos a presena de alguns aminocidos, como no substrato comercial que
utilizamos (Pro-Phe-Phe-MCA), para que o mesmo fosse reconhecido pela
quimiotripsina. No entanto, desenvolver substratos com as caractersticas citadas
seria um trabalho extremamente laborioso e acreditando que o problema principal
esteja na estrutura amdica, que no poderia ser resolvido, resolvemos no investir
mais nesta linha de trabalho.


9 6
9 6
5 - Estudo do Potencial Quimiluminescente da
Oxidao de Derivados Indlicos Catalisada por HRP:
Desenvolvimento de Metodologia para Determinao
Quantitativa de HRP
5. 1- Resultados
Tendo como objetivo estudar o potencial quimiluminescente da oxidao de
derivados indlicos e a aplicao desses compostos no desenvolvimento de
metodologias para anlise de enzimas, os trabalhos tiveram incio testando a
oxidao do indol frente ao sistema HRP/H O /O e, como era esperado, verificou-se
2 2 2
quimiluminescncia. As reaes foram realizadas em tampo alcalino e as
concentraes de HRP e H O inicialmente testadas foram as mesmas utilizadas na
2 2
oxidao dos enis. As reaes foram disparadas pela adio de HRP aps 2
minutos de incubao, tempo necessrio para termostatizao a 37C. O 2-metilindol
destacou-se pela sua intensidade de quimiluminescncia, obtida j nos primeiros
testes, cerca de 50 vezes maior do que os demais derivados testados. A seguir sero
mostrados os perfis cinticos de emisso de luz para alguns derivados indlicos
(figura 5.1).
Aps a otimizao das condies de reao, mediu-se o rendimento total de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol, utilizando o padro de luminol para
calibrao do espectrofluormetro e anlise por cromatografia lquida de alta
eficincia (HPLC) da quantidade de substrato consumido. O rendimento encontrado
foi de (9,1 0 ,8) x 10
- 5
E/mol.



9 7
9 7
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
2 - metilindol
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e

l

u
z

(

1
0

3

c
p

s

)

tempo (min)
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
0
2
4
6
8
5 - metoxindol
indol
3 - metilindol
N
H
N
H
CH
3
N
H
CH
3
N
H
CH O
3
5 - metoxindol indol
2 - metilindol 3 - metilindol
Figura 5.1- Oxidao de derivados indlicos catalisada por HRP:
Concentraes finais: [H O ] = 0,1 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L, [derivados indlicos] =
0 ,5 mmol/L, [tampo AMP] = 0,15 mmol/L, pH 9,3, 37C


9 8
9 8
O resultado positivo obtido com o indol e seus derivados levou-nos a testar a
oxidao de alguns indis biologicamente ativos como triptofano, serotonina, cido 2-
(indol-3-il)actico, melatonina, entre outros. Dos compostos testados apenas a
melatonina mostrou significativa quimiluminescncia quando submetida a oxidao
via HRP/H O /O . Este resultado confirma o importante papel dos substituntes no
2 2 2
ncleo indlico no que diz respeito a eficincia de quimiluminescncia, o que j havia
sido observado com os indis no biolgicos. A seguir sero mostrados os perfis
cinticos de emisso de luz para os compostos serotonina, melatonina, 6-
hidroximelatonina, 5-metoxitriptamina e cido 2-(indol-3-il)actico, quando oxidados
(figura 5.2).



9 9
9 9
0 1 2 3 4 5
0 ,0
0 ,1
0 ,2
0 ,3
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z

(

1
0

3

c
p

s

)

tempo (min)
6 - hidroximelatonina
serotonina
5 - metoxitriptamina
cido2-(indol-3-il)actico
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 ,0
0 ,5
1 ,0
1 ,5
2 ,0
2 ,5
3 ,0
melatonina
N
CH O
3
N
H
H
O
N
HO NH
2
H
melatonina serotonina
5 - metoxitriptamina
N
CH O
3
NH
2
H
6 - hidroximelatonina
N
CH O
3
N
O
HO
H
H
N
H
O
OH
cido 2-(indol-3-il)actico
Figura 5.2- Oxidao de alguns derivados indlicos biologicamente ativos
catalisada por HRP. Concentraes finais: [H O ] = 0,1 mmol/L, [HRP] = 2
2 2
mol/L;
[derivados indlicos] = 0,5 mmol/L, [tampo AMP] = 0,15 mmol/L, pH 9,3, 37C.



10 0
10 0
O maior rendimento quntico de quimiluminescncia obtido na oxidao do 2-
metilindol, quando comparado aos demais derivados, levou-nos a investigar mais
profundamente as caractersticas da oxidao deste composto. Trata-se de um
comportamento inesperado em que, pelo contrrio, tanto o 3-metilindol quanto o 2,3-
dimetilindol quando submetidos oxidao no enzimtica
(49)
(DMSO/KOH/O ),
2
produzem maior quimiluminescncia do que o 2-metilindol. Realizou-se uma
comparao entre o 2-metilindol e o 2,3-dimetilindol, utilizando-se este meio oxidante
e o resultado foi confirmado (figura 5.3). Deve-se ressaltar, tambm, que a
intensidade relativa de quimiluminescncia obtida na oxidao qumica do 2-
metilindol foi cerca de 4 ordens de grandeza menor do que aquela obtida na
oxidao catalisada por HRP.
0 3 6 9 1 2
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
2 ,3-dimetilindol
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z

(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
0 3 6 9 1 2
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1 ,0
1 ,2
2 - metilindol
Figura 5.3- Comparao entre os sinais quimiluminescentes obtidos na
oxidao do 2-metilindol e 2,3-dimetilindol quando oxidados via DMSO/KOH/O .
2
Concentraes finais: [substratos] = 1 mmol/L em DMSO, [KOH] = 5 mol/L
A seguir sero mostrados estudos em que se buscou um melhor conhecimento
do sistema quimiluminescente 2-metilindol/HRP/H O /O .
2 2 2


10 1
10 1
5 .1 .1 - Efeito da concentrao do tampo, tipo de tampo e pH
na eficincia de quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via
HRP/H O /O
2 2 2
Os primeiros ensaios j mostraram a importncia do uso de tampes alcalinos
na oxidao dos derivados indlicos, principalmente para o 2-metilindol e 2,5-
dimetilindol. A figura 5.4 mostra o efeito da concentrao do tampo 2-amino-2-
metilpropanol (AMP) na eficincia de quimiluminescncia da oxidao do 2-
metilindol. Utilizou-se este tampo por convenincia, sendo que outros tampes
alcalinos testados, como carbonato ou dietanolamina, produziram resultados
semelhantes. Ao contrrio do verificado na oxidao de iminas, no se observou o
efeito cataltico do tampo fosfato. Isto seria esperado j que no h o equilbrio
imina-enamina envolvido.
0 2 4 6 8 1 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
E
D
C
B
A
A = 0,05 mol/
B = 0,03
C = 0,10
D = 0,35
E = 0,50
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

1
0

3

c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.4- Efeito da concentrao do tampo (2-amino-2-metilpropanol) na
oxidao quimiluminescente do 2-metilindol via HRP/H O /O . Concentraes finais:
2 2 2
[HRP] = 2 mol/L, [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 1,5 mmol/L, pH 9,3, temp. 37C
2 2




10 2
10 2
O pH exerceu profunda influncia sobre a intensidade de quimiluminescncia
e sobre a cintica da reao de oxidao do 2-metilindol (figura 5.5), sendo que a
intensidade integrada de quimiluminescncia aumenta de 2 a 3 ordens de grandeza
quando em pH alcalino comparado ao pH prximo do neutro. Por exemplo, a
intensidade de quimiluminescncia da reao realizada em pH 11,6 (tampo fosfato)
foi cerca de 500 vezes maior do aquela observada em pH 7,4 (tampo fosfato). A
maior eficincia de quimiluminescncia em pH alcalino foi acompanhada pela
diminuio na velocidade da reao. Esta alterao cintica tambm pode ser notada
atravs do perfil de consumo de oxignio (figura 5.6).
0 1 2 3 4
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
pH 9,3
pH 11,6
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (h)
0 1 2 3 4
0
2
4
6
pH 7,4
pH 4,8
Figura 5.5- Perfil cintico de quimiluminescncia na oxidao do 2-metilindol
via HRP/H O /O em diferentes pHs. Concentraes finais: [HRP] = 0,1
2 2 2
mol/L, [2-
metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L. Tampo
2 2
citrato pH 4,8, tampo fosfato pH 7,4, tampo AMP pH 9,3, tampo fosfato pH 11,6


10 3
10 3
0 1 6 3 2 4 8 6 4
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
pH = 11,6
pH = 9,3
pH = 7,4
pH = 4,8
o

x

i

g

n

i

o

d

i

s
s

o

l

v

i

d
o
(

%

)

tempo (min)
Figura 5.6- Consumo de oxignio na oxidao do 2-metilindol via
HRP/H O /O em diferentes pHs. Concentraes finais: [HRP] = 0,1
2 2 2
mol/L, [2-
metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L. Tampo
2 2
citrato pH 4,8, tampo fosfato pH 7,4, tampo AMP pH 9,3, tampo fosfato pH 11,6



10 4
10 4
Esta significativa diferena no rendimento de quimiluminescncia em funo
do pH do meio observou-se apenas para o 2-metilindol e 2,5-dimetilindol, que so
aqueles que produziram um maior rendimento de quimiluminescncia. Para outros
derivados observou-se apenas pequenos acrscimos. A seguir, os efeitos de pH nas
oxidaes do 3-metilindol, 2,3-dimetilindol e 2,5-dimetilindol (figuras 5.7, 5.8 e 5.9).
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0 ,0
0 ,3
0 ,6
0 ,9
1 ,2
1 ,5
pH 11,6
pH 9,3
pH 7,4
2 ,3-dimetilindol
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.7- Perfil de quimiluminescncia do 2,3-dimetilindol em funo do pH
do meio de reao. Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L, [2,3-dimetilindol] = 1
mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L, tampo fosfato pH 7,4;
2 2
tampo AMP pH 9,3; Tampo fosfato pH 11,6



10 5
10 5
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0
1
2
3
4
5
6
pH 11,6
pH 9,3
pH 7,4
3 - metilindol
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.8- Perfil de quimiluminescncia do 3-metilindol em funo do pH do
meio de reao. Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L, [3-metilindol] = 1 mmol/L,
[H O ] = 5 mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L, tampo fosfato pH 7,4; tampo AMP
2 2
pH 9,3; Tampo fosfato pH 11,6



10 6
10 6
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
pH 11,6
pH 9,3
pH 7,4
2 ,5-dimetilindol
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
(

1
0

3

c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.9- Perfil de quimiluminescncia do 2,5-dimetilindol em funo do pH
do meio de reao. Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L, [2,5-dimetilindol] = 1
mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L, tampo fosfato pH 7,4;
2 2
tampo AMP pH 9,3; Tampo fosfato pH 11,6



10 7
10 7
5 .1 .2 - Efeito da concentrao do substrato na eficincia de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via HRP/H O /O
2 2 2
Para uma faixa de variao de 3 ordens de grandeza na concentrao do 2-
metilindol (0,01 at 1 mmol/L) observou-se um aumento proporcional da intensidade
mxima e da rea integrada de luz. Acima de 1 mmol/L parece ocorrer saturao do
substrato (figura 5.10).
0 1 6 3 2 4 8 6 4 8 0
1 0
0
1 0
1
1 0
2
1 0
3
1 0
4
1 0
5
E
D
C
B
A
A= 2-metilindol = 0,01 mmol/L
B= = 0,10
C = = 1,00
D = = 3,00
E= = 6,00
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.10- Efeito da concentrao do 2-metilindol na eficincia de
quimiluminescncia. Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L, [H O ] = 5 mmol/L,
2 2
3 7C, [MAP] = 50 mmol/L, pH 9,3. Obs. Aqui utilizou-se uma microplaca preta para a
realizao dos ensaios e, como conseqncia, observou-se um decrscimo de cerca
de 1 ordem de grandeza na eficincia de quimiluminescncia


10 8
10 8
5 .1 .3 - Efeito da concentrao de HRP na eficincia de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via HRP/H O /O
2 2 2
Embora tenha sido evidente o efeito cataltico desempenhado pela
HRP, existia a possibilidade de que apenas o contedo frrico (grupo heme) da
enzima fosse o responsvel pelo mesmo. De fato, a oxidao de alguns derivados
indlicos j foi conduzida utilizando-se o on Fe
+ 3
como catalisador em meio alcalino
oxidante
(102)
. Para descartar esta hiptese, realizaram-se ensaios em que a enzima
foi inativada por aquecimento (figura 5.11). Em outros ensaios foi utilizado o sistema
oxidante Fe /NaOH/H O
+ 3
2 2
e novamente no se detectou quimiluminescncia
significativa seja para o 2-metilindol, seja para o 3-metilindol ([Fe ] = 5 x 10
+ 3 4
mol/L,
[NaOH] = 0,11 mol/L, [H O ] = 0,21 mol/L
2 2
(102)
).
Obteve-se a maior eficincia de quimiluminescncia utilizando-se em torno de
0 ,1 mol/L de peroxidase. Um aumento na concentrao da mesma, em uma ordem
de grandeza, causou um acrscimo tanto na velocidade da reao quanto na
intensidade mxima de luz mas, por outro lado, provocou uma perda sensvel no
rendimento total de quimiluminescncia, o que sugere a existncia de uma reao
competitiva e que estaria sendo favorecida em altas concentraes de HRP (figura
5 . 12 ) . Um reao competitiva que deveria ser levada em considerao a
dismutao de perxido de hidrognio em gua e oxignio por meio da ao
cataltica da HRP, ou seja, esta enzima estaria atuando como a enzima
catalase
(103,104)
.



10 9
10 9
0 8 1 6 2 4 3 2
1 0
1
1 0
2
1 0
3
1 0
4
1 0
5
1 0
6
controle
HRP aps 3 h a 80C
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.11- Inativao da HRP por aquecimento. Concentraes finais: [2-
metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, [HRP] = 0,1
2 2
mol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH
9 ,3, 37C.



11 0
11 0
0 8 1 6 2 4 3 2 4 0
1 0
0
1 0
1
1 0
2
1 0
3
1 0
4
1 0
5
1 0
6
mol/L
D
A
B
C
A = HRP = 0,1
B = = 0,01
C = = 0,0
D = = 1,0
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.12- Efeito da concentrao de HRP na eficincia do sistema 2-
MI/HRP/H O /O . Concentraes finais: [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L,
2 2 2 2 2
[AMP] = 50 mmol/L, pH = 9,3, 37C


11 1
11 1
5 .1 .4 - Consumo ou produo de oxignio na reao 2 -
metilindol/HRP/H O /O
2 2 2
Como pode ser visto nas figuras 5.5 e 5.6, no se observou uma perfeita
correlao entre a cintica de emisso e de consumo de oxignio dissolvido no meio
de reao. Pelo contrrio, verificou-se que a velocidade de consumo ou produo de
oxignio dependia da relao entre as concentraes dos reagentes. A figura 5.13
mostra o perfil de consumo ou produo de oxignio em funo da concentrao de
2 - metilindol. Nota-se claramente a decomposio do perxido de hidrognio no
ensaio controle (sem 2-metilindol), o que comprova o efeito do tipo catalase
desempenhado pela HRP.
Embora mesmo sem a correlao esperada entre o consumo de
oxignio e o decaimento do sinal quimiluminescente, era incontestvel a participao
de oxignio na reao. Isto foi comprovado pela retirada de oxignio do meio de
reao, seja atravs da desaerao pela saturao com nitrognio, seja pelo uso do
sistema enzimtico glicose/glicose-oxidase, que capaz de consumir o oxignio do
meio ao oxidar a glicose. Em ambos os casos houve uma intensa supresso da
quimiluminescncia e, alm disso, intensificao da quimiluminescncia quando
oxignio foi borbulhado no sistema (figura 5 . 14 ) . A intensificao da
quimiluminescncia pelo borbulhamento de oxignio mostra tambm que a
multiplicidade dos estados excitados gerados na oxidao do 2-metilindol, ao
contrrio dos enis, no deve ser triplete.



11 2
11 2
0 3 6 9 1 2
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
A = 2-metilindol = 0,0 mmol/L
B = = 0,1
C = = 1,0
C
B
A
o

x

i

g

n

i

o

d

i

s
s

o

l

v

i

d
o
(

%

)

tempo (min)
Figura 5.13- Produo ou consumo de oxignio na reao 2-MI/HRP/H O /O .
2 2 2
Concentraes finais: [HRP] = 1 mol/L, [H O ] = 5 mmol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH =
2 2
9,3, 37C. (A) sem 2-metilindol, (B) 0,1 mmol/L, (C) 1 mmol/L .



11 3
11 3
0 2 4 6 8 1 0
0
1
2
3
N
2
Controle
O
2
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

v

)

tempo (min)
Figura 5.14- Efeito de borbulhamento de oxignio ou nitrognio na oxidao
do 2-metilindol via HRP/H O /O . Concentraes finais: [HRP] = 1
2 2 2
mol/L, [H O ] =
2 2
0,05 mmol/L, [2-metilindol] = 0,3 mmol/L, 37C, [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3


11 4
11 4
5 .1 .5 - Efeito da concentrao de perxido de hidrognio na
eficincia de quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol via
HRP/H O /O
2 2 2
Como era esperado, considerando-se a perda de perxido de hidrognio por
decomposio, re-adies do mesmo podiam restabelecer parcialmente o sinal
quimiluminescente de uma reao j esgotada. De fato, a eficincia quntica de
quimiluminescncia do sistema 2-MI/HRP/H O /O mostrou-se bastante dependente
2 2 2
da concentrao de perxido de hidrognio, sendo alcanado a eficincia mxima
utilizando-se em torno de 5 mmol/L desse reagente (figura 5.15).
A adio da enzima catalase produziu um efeito interessante, pois alm de
levar supresso da quimiluminescncia, j que causa a perda de perxido de
hidrognio, provocou tambm um aumento de eficincia quando pequenas
quantidades dessa enzima foram adicionadas (figura 5.16). No entanto, este
resultado no totalmente inesperado, considerando-se que o acrscimo na
concentrao de oxignio, provocado pela ao da catalase, aumenta a eficincia de
quimiluminescncia, como foi verificado pelo borbulhamento de O
2
no meio de
reao.



11 5
11 5
0 1 6 3 2 4 8 6 4
0
3 0 0
6 0 0
9 0 0
E
D
C
B
A
A = H O = 15 mmol/L
2 2
B = 5
C = 0 ,5
D = 0 ,05
E = 0 ,00
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.15- Efeito da concentrao de perxido de hidrognio na oxidao
do 2-metilindol via HRP/H O /O . Concentraes finais: [HRP] = 0,1
2 2 2
mol/L, [2-
metilindol] = 1 mmol/L, 37C. [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3



11 6
11 6
0 8 1 6 2 4 3 2 4 0 4 8
0
4 0 0
8 0 0
1 2 0 0
1 6 0 0
E
F
D
C
B
A
A = catalase = 0,0 u/mL
B = = 12
C= = 24
D= = 36
E = = 72
F = = 108
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.16- Efeito da adio de catalase sobre a oxidao do 2-metilindol via
HRP/H O /O . Concentraes finais: [HRP] = 0,1
2 2 2
mol/L, [2-metilindol] = 1 mol/L,
[H O ] = 5 mol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3, 37C
2 2


11 7
11 7
5 .1 .6 - Envolvimento de nion superxido na oxidao do 2-
metilindol via HRP/H O /O
2 2 2
Estudou-se tambm o envolvimento de nion superxido no mecanismo da
reao de oxidao do 2-metilindol, visto que nas condies de reao aqui
empregadas (perxido de hidrognio em grande excesso em relao a peroxidase)
esperado a formao de composto III de peroxidase (HRP-III)
(46)
. O envolvimento
dessa forma ativa de peroxidase, considerada como um complexo entre a HRP nativa
e o nion superxido (Fe
+ 3
O
2
-
) , pode ser investigado estudando-se o efeito que a
enzima superxido dismutase (SOD) exerce sobre estes sistemas. Esta enzima,
conhecida por sua capacidade de reduzir nion superxido a perxido de hidrognio,
provocou supresso da quimiluminescncia do sistema (figura 5.17).
A participao de nion superxido na quimiluminescncia observada
durante a reao de oxidao do 2 - metilindol pde ser adicionalmente
comprovada quando se adicionou superxido de potssio (KO ) ao meio de
2
reao em pH 7,4. Neste caso, houve um aumento na quimiluminescncia (10
vezes) sem qualquer alterao no seu perfil cintico (figura 5.18).



11 8
11 8
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
F
E
D
C
B
A
A = SOD = 0,0 u/mL
B = 0 ,05
C = 0 ,5
D = 1 ,2
E = 2 ,5
F = 5 ,1
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.17- Supresso de quimiluminescncia do sistema 2-MI/H O /HRP/O
2 2 2
pela adio de superxido dismutase. Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L,
[H O ] = 0,05 mmol/L, [2-metilindol] = 1 mmol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3
2 2




11 9
11 9
0 8 1 6 2 4 3 2
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
aps adio de KO
2
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z

(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
0 8 1 6 2 4 3 2
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
controle
Figura 5.18- Efeito da adio de KO no sistema 2-MI/HRP/H O /O .
2 2 2 2
Concentraes finais: [HRP] = 0,1 mol/L, [2-metilindol] = 1 mmol/L, [tampo fosfato]
= 50 mmol/L, pH 7,4. Controle: [H O ] = 10 mmol/L. Ensaio com superxido de
2 2
potssio: [H O ] = 5 mmol/L + KO 5 mmol/L
2 2 2


12 0
12 0
5 .1 .7 - Comparao da eficincia de quimiluminescncia na
oxidao de vrios derivados indlicos via HRP/H O /O
2 2 2
De posse de 22 derivados indlicos realizou-se uma nova comparao de
eficincia de quimiluminescncia, mas usando aquelas que pareciam ser as
melhores concentraes dos reagentes. A tabela 5.1 mostra a intensidade integrada
de luz obtida em 20 minutos na oxidao dos 22 derivados escolhidos para estudo.
Uma figura mostrando o perfil do sinal quimiluminescente para alguns dos compostos
tambm est demonstrado (figura 5.19). As reaes foram disparadas pelos
substratos. Como existe um flash de quimiluminescncia caracterstico do sistema
HRP/H O , possivelmente originada da produo de oxignio singlete
2 2
(105)
, fez- se a
adio do substrato aps a incubao prvia dos demais reagentes por 2 minutos.
Para os valores de quimiluminescncia listados na tabela 5.1 foram descontados a
emisso originria do sistema HRP/H O .
2 2
Os derivados indlicos foram escolhidos de modo a auxiliar na elucidao da
relao entre a eficincia de quimiluminescncia e o padro de substituio dos
mesmos. Dos resultados de que dispomos pode-se dizer que efeitos eletrnicos no
parecem influenciar nesta eficincia. Isto pode ser evidenciado comparando-se o
indol e os derivados substitudos pelo grupo metxila ou fenila (doadores de
eltrons), ou comparando-se a melatonina e seus derivados halogenados (sacadores
de eltrons) 6-cloromelatonina e 2-iodomelatonina. A tabela 5.1 mostra tambm que
a alta eficincia de quimiluminescncia no est relacionada apenas presena do
grupo metila na posio 2 do ncleo indlico, mas tambm ausncia de
substituntes na posio 3. Como pde ser observado, o 2,5-dimetilindol ao contrrio
do 2,3-dimetilindol, apresentou uma destacada eficincia de quimiluminescncia.


12 1
12 1
Tabela 5.1 Intensidade de luz integrada durante 20 minutos obtida na oxidao dos
derivados indlicos
DERIVADO INDLICO (INTENSIDADE DE LUZ
INTEGRADA POR 20 MINUTOS) X 10
- 5
(CPS X S)
Indol 4 . 9
N -metilidol 1 .5
2-m etilindol 8 1 9 4
2 ,5-dimetilindol 1 0 8 2
2 ,3-dimetilindol 1 1. 1
3-m etilindol 2 5. 1
5-m etilindol 2 ,3
4-m etoxindol 4 .7
5-m etoxindol 0 .4
6-m etoxindol 4 .8
7-m etoxindol 1 .0
2-f enilindol 0 ,2
cido 2-(indol-3-il)actico 0 ,9
cido 2-(5-metoxindol-3-
il)actico
1 ,5
cido 2-(2-metil-5-metxindol-
3-i l)actico
1 ,0
Melatonina 6 .9
6 - cloromelatonina 5 ,2
2-i odomelatonina 3 ,3
6 - hidroximelatonina 0
5 - hidroxitriptamina
(serotonina)
0
5 - metoxitriptamina 0
Triptofano 0



12 2
12 2
Concentraes finais: [derivado indlico] = 1 mmol/L, [HRP] = 0,1 mol/L,
[H O ] = 5 mmol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3, 37 C.
2 2
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0
0
2 5 0
5 0 0
7 5 0
1 0 0 0
2 ,5-dimetilindol
2 - metilindol
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
0 1 0 2 0
0
2
4
controle
2 ,3-dimetilindol
3 - metilindol
Figura 5.19- Perfil de quimiluminescncia de alguns derivados indlicos:
Concentraes finais: [derivados indlicos] = 1 mmol/L, [HRP] = 0,1 mol/L, [H O ] =
2 2
5 mmol/L, [AMP] = 50 mmol/L, temperatura 37C, pH 9,3, volume total 0,3 mL. O
controle possui apenas 2-metilindol, H O e tampo
2 2


12 3
12 3
5 .1 .8 - Espectros de quimiluminescncia, fluorescncia e
caracterizao de produtos
Com o objetivo de elucidar a relao entre a estrutura dos derivados
indlicos e a eficincia de quimiluminescncia das reaes, realizou-se uma
investigao que tinha como base comparar os espectros de
quimiluminescncia das reaes com os espectros de fluorescncia dos
produtos e assim identificar o produto emissor. Escolheu-se para estudo e
comparao os substratos 2-metilindol, 2,5-dimetilindol e 2,3-dimetilindol. Para
o 2-metilindol e 2,5-dimetilindol observou-se uma distribuio espectral de
quimiluminescncia com mximos em 500 nm e 525 nm, respectivamente,
quando estes substratos foram oxidados. Devido a relativamente alta eficincia
de emisso da oxidao desses compostos, os espectros foram facilmente
obtidos utilizando-se um espectrofluormetro (figuras 5.24 e 5.25). Por outro
lado, para determinar a distribuio espectral da oxidao do 2,3-dimetilindol
foi necessrio usar um contador de ftons (maior sensibilidade), ao qual foram
adaptados filtros de luz. Devido a baixa eficincia de quimiluminescncia dessa
reao e aos poucos filtros disponveis, foi possvel apenas avaliar a regio
aproximada onde encontrava-se o mximo de emisso que foi entre 400-440 nm
(figura 5.23).
A investigao dos produtos de oxidao foi realizada por HPLC, em que
se procurou comparar os produtos formados por meio de caractersticas como
tempo de reteno e propriedades espectroscpicas (fluorescncia e
absoro). Alm de um detector de UV/visvel (255 nm) utilizou-se um detector
de fluorescncia, que foi ajustado de modo evidenciar produtos com mximo
de fluorescncia em 500 nm (
ex
3 0 0 - 4 0 0 e
em
5 0 0 ) . F oram submetidos anlise
os compostos 3 - metilindol, 2,3-dimetilindol, 2,5-dimetilindol, 2 - metilindol,
melatonina, indol e 4-metoxindol. Em todos os casos constatou-se a formao



12 4
12 4
de um produto principal (chamaremos de pico1), sendo que os tempos de
reteno entre eles eram prximos. Observou-se um mximo de fluorescncia
entre 400-450 nm para estes produtos (
ex
= 310 nm). A figura 5.20 mostra os
cromatogramas antes e aps a oxidao do 2,3-dimetilindol. Como pode ser
observado, no h compostos que apresentem fluorescncia em 500 nm. Por
outro lado, exclusivamente para o 2-metilindol e 2,5-dimetilindol, alm do
produto principal (pico 1), constatou-se um segundo produto que apresentou
intensa fluorescncia em 500 nm (chamaremos de pico 2) (figuras 5.21 e 5.22).
Uma vez identificados os possveis produtos (picos) responsveis pelas
emisses de luz das reaes de oxidao dos derivados indlicos, estes foram
coletados e, ento, espectros de fluorescncia puderam ser obtidos. Para a
oxidao do 2-metilindol nota-se claramente que a distribuio espectral de
fluorescncia do pico 2 correlaciona-se com o espectro de quimiluminescncia
da reao (figura 5.24). Resultado idntico foi obtido para a oxidao do 2,5-
dimetilindol (figura 5 .2 5 ) . Como era esperado para a oxidao do 2 ,3-
dimetilindol, a correlao foi observada com o pico 1 (figura 5.23).
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
0
1 0
2 0
3 0
2 ,3-dimetilindol
pico 1
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
r

e

l

a

t

i

v
a

Tempo (min)
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
C



12 5
12 5
Figura 5.20- Cromatogramas antes e aps oxidao do 2,3-dimetilindol. (A)
2 ,3-dimetilindol (detector UV/visvel, = 255 nm); (B) aps oxidao do 2,3-
dimetilindol (detector UV/visvel, = 255 nm); (C ) aps oxidao do 2,3-dimetilindol
(detector de fluorescncia
ex
= 330,
em
= 500)
0 2 4 6 8 1 0 1 2
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
r

e

l

a

t

i

v
a

Tempo (min)
0 2 4 6 8 1 0 1 2
pico 1
pico 2
2 - metilindol
0 2 4 6 8 1 0 1 2
Figura 5.21- Cromatogramas antes e aps oxidao do 2-metilindol. (A) 2-
metilindol (detector UV/visvel, = 255 nm); (B) aps oxidao do 2-metilindol
(detector UV/visvel, = 255 nm); (C ) aps oxidao do 2-metilindol (detector de
fluorescncia
ex
= 330,
em
= 500)



12 6
12 6
0 2 4 6 8 1 0
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
r

e

l

a

t
i

v
a

Tempo (min)
0 2 4 6 8 1 0
pico 1
pico 2
B
0 2 4 6 8 1 0
2 ,5-dimetilindol
C
Figura 5.22 -. Cromatogramas antes e aps oxidao do 2,5-dimetilindol. (A)
2 ,5-dimetilindol (detector UV/visvel, = 255 nm); (B) aps oxidao do 2,5-
dimetilindol (detector UV/visvel, = 255 nm); (C ) aps oxidao do 2,5-dimetilindol
(detector de fluorescncia
ex
= 330,
em
= 500)



12 7
12 7
3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
(nm)
i

n

t

e

n

s

i

d

a

d
e

r

e

l

a

t
i

v
a


3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 5.23- Espectro de fluorescncia do produto de oxidao do 2,3-
dimetilindol (pico 1)
ex
= 320 nm. Figura inserida: distribuio espectral de
quimiluminescncia da oxidao do 2,3-dimetilindol obtida atravs de filtros de corte.
Os valores indicados nas barras representam a porcentagem da emisso total (sem
filtro) obtida acima do comprimento de onda indicado


12 8
12 8
3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0
0
2
4
6
8
(nm)

C
B
A
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
r

e

l

a

t

i

v
a

Figura 5.24- Espectro de quimiluminescncia do 2-metilindol versus
fluorescncia dos produtos de oxidao. (A) pico 1,
ex
= 320 nm; (B) pico 2
ex
=
38 0 nm; (C ) espectro de quimiluminescncia da reao



12 9
12 9
3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0
0
2
4
6
8
1 0
1 2

C
B
A
I

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e
r

e

l

a

t
i

v

a

(nm)
Figura 5.25- Espectro de quimiluminescncia do 2,5-dimetilindol versus
fluorescncia dos produtos de oxidao. (A) pico 1,
ex
= 320 nm; (B) pico 2
ex
=
38 0 nm; (C ) espectro de quimiluminescncia da reao



13 0
13 0
Os resultados obtidos indicavam claramente que a destacada eficincia dos
substratos 2-metilindol e 2,5-dimetilindol estava relacionada formao de um
produto fluorescente somente verificado na oxidao desses dois compostos. Assim,
resolveu-se fazer uma caracterizao dos dois produtos principais da oxidao do 2-
metilindol e, para efeito de comparao, do produto principal obtido na oxidao do
2 ,3-dimetilindol.
Para o 2-metilindol realizou-se a oxidao em larga escala (300 mL de
soluo), liofilizao para concentrao e isolamento dos produtos por cromatografia
rotatria preparativa de camada fina (chomatotron). Por espectrometria de massa o
pico 1 foi identificado como sendo N -(2-formilfenil)acetamida (m/z: 163 (M ,15%); 135
+
(M
+
- CO, 16%); 121 (M
+
H C=C=O, 12%); 93 (M
2
+
- CH =C=O - CO, 100%),
2
espectro 25 ). Para o pico 2 os resultados de espectrometria de massa (m/z: 290 (M
+
- 2 H, 53%); 146 ( M /2, 100%), espectro 26 ) e RMN de H (1,56 (s, 6 H); 7,62-6,90
+ 1
(m, 8 H), espectro 27 ) mostraram uma boa correlao com o composto 2,2-dimetil-
2 ,2-diindoxil
(106)
, apesar de ainda existir impureza no composto isolado. O esquema
5 . 1 mostra as estruturas dos compostos citados.
HRP/H O /O
2 2 2
N CH
3
O
O
H
H
N CH
3
H
2 - metilindol
pH = 9,3
N
O
H
CH
3
O
H
N
C H
3
N
- (2-formilfenil)acetamida
2 ,2`-dimetil-2,2`-diindoxil
Esquema 5.1- Principais produtos identificados aps oxidao do 2-metilindol


13 1
13 1
Procedimento semelhante foi realizado para o 2,3-dimetilindol. Neste caso,
aps a oxidao (300 mL de soluo), o produto (pico 1) foi isolado por extrao com
solvente (acetato de etila) concentrado e ento submetido espectrometria de
massa (m/z: 177 (M , 18%); 162 (M - CH , 6%); 145 (M - CH =C=O, 3%); 134 (M -
+ +
3
+
2
+
H CCO, 19%); 120 (M - CH H C=C=O, 100%); 92 (C H NH ,19%) espectro-24 ).
3
+
3 2 6 5 2
Os dados de massa indicaram claramente tratar-se da N -(2-acetilfenil)acetamida. O
esquema 5.2 mostra a estrutura do composto citado.
N CH
3
CH
3
H
HRP/H O /O
2 2 2
N CH
3
O
O
CH
3
H
2 ,3-dimetilindol
N
- (2-acetilfenil)acetamida
pH = 9,3
Esquema 5.2- Produto principal obtido aps oxidao do 2,3-
dimetilindol
Como foi mostrado, tanto para a oxidao do 2-metilindol quanto para a
oxidao do 2,3-dimetilindol, os produtos (pico 1) correspondem ao esperado
supondo um mecanismo intermediado por um derivado dioxetnico. Na oxidao
qumica de derivados indlicos, diversas vezes foi proposto a formao desses
intermedirios como responsveis pelo passo de quimi-excitao dessas reaes.
Alm disso, a boa correlao verificada entre o espectro de fluorescncia do
composto N -(2-acetilfenil)acetamida (pico 1) e o espectro de quimiluminescncia da
oxidao do 2,3-dimetilindol vai ao encontro dessa proposta (figura 5.23). Por outro
lado, tanto a oxidao do 2-metilindol quanto a oxidao do 2,5-dimetilindol, o
espectro de quimiluminescncia correlacionou-se perfeitamente com o espectro de
fluorescncia do pico 2 (2,2-dimetil-2,2-diindoxil no caso do 2-m etilindol).
Considerando-se que a formao direta desse diindoxil em estado excitado no pode


13 2
13 2
ser facilmente racionalizada, tomando-se como base os conhecidos passos de quimi-
excitao, resolveu-se estudar o possvel envolvimento do mesmo como um
sensibilizador da reao.
5 .1 .9 - Diindoxil atuando como um sensibilizador da reao 2-
metilindol/HRP/H O /O
2 2 2
Com o intuito de verificar se o diindoxil formado na reao de oxidao
do 2-metilindol poderia estar atuando como um aceptor fluorescente de
energia, aps isolamento, adicionou-se este composto s oxidaes de alguns
derivados indlicos. Para os derivados indol, 5-metilindol e 5-metxindol,
observou-se um aumento de cerca de uma ordem de grandeza na intensidade
de quimiluminescncia quando este composto foi adicionado. A figura 5.26
mostra o resultado obtido com o indol.
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8
0
1
2
3
4
5
6
aps adio de diindoxil
controle
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z

(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.26- Adio do diindoxil na oxidao do indol: Concentraes finais:
[indol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, [HRP] = 0,2
2 2
mol/L, [MAP] = 50 mmol/L, pH
9 ,3, 37C, diindoxil isolado 20 L (concentrao no determinada)



13 3
13 3
Verificou-se resultado semelhante quando o 2-metilindol foi oxidado
juntamente com os derivados indlicos citados acima. A figura 5.27 mostra a
amplificao da quimiluminescncia do 2-metilindol quando foi adicionado 5-
metilindol ao meio de reao.
0 1 6 3 2 4 8 6 4
0
3 0
6 0
9 0
1 2 0
1 5 0
1 8 0
C
B
A
A=2-metilindol 0,2 mmol/L
B= 2-metilindol 0,2 mmol/L + 5-metilindol 1 mmol/L
C= 5-metilindol 1mmol/L
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.27- Adio de 5-metilindol na oxidao do 2-metilindol: [H O ] = 5
2 2
mmol/L, [HRP] = 0,2 mol/L, [MAP] = 50 mmol/L, pH 9,3, 37C
Por outro lado, para derivados indlicos em que a posio trs do anel
pirrlico est substituda, como o 3-metilindol, 2,3-dimetilindol e melatonina, no se
observou efeito de sensibilizao, seja com a adio do diindoxil, seja com a
oxidao conjunta destes com o 2-metilindol.



13 4
13 4
A adio do diindoxil na oxidao do prprio 2-metilindol ou do 2,5-dimetilindol
tambm no causou alterao significativa na intensidade de quimiluminescncia.
5 .1 .1 0 - Relao entre produtos de oxidao e eficincia de
quimiluminescncia da reao 2-metilindol/HRP/H O /O
2 2 2
Verificou-se que a eficincia de quimiluminescncia da oxidao do 2-
metilindol em funo do pH do meio de reao podia ser qualitativamente
correlacionada com a relao dos produtos (diindoxil (pico 2) / produto de clivagem
do anel (pico 1)). Este resultado novamente apontou para o diindoxil como
responsvel pela surpreendente quimiluminescncia do 2-metilindol, seja atuando
como um aceptor fluorescente, seja como o prprio produto primrio no estado
excitado (tabela 5.2).
Tabela 5.2- Relao entre os produtos de oxidao do 2-
metilindol e eficincia de quimiluminescncia
H
Rendimento
relativo de
quimiluminescncia
Relao de picos (Diindoxil/prod de
clivagem) fluorescncia 500 nm
,8
0,0007 0 ,84
,4
0,0020 0 ,91
,3
0 ,85 2 ,35
1,6
1 ,00 3 ,64


13 5
13 5
Concentraes finais: [HRP] = 0,2 mol/L, [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5
2 2
mmol/L, 37C, [tampes] = 50 mmol/L. Tampo citrato pH 4,8; tampo fosfato pH 7,4;
tampo MAP pH 9,3; tampo fosfato pH 11,6
Tambm observou-se um aumento da razo diindoxil/produto de clivagem do
anel, quando da adio de KO , e diminuio, quando da adio de SOD (tabela
2
5 . 3), indicando que o nion superxido favorece a formao do diindoxil e
consequentemente a eficincia de quimiluminescncia da reao.
Tabela 5.3- Efeito de SOD e KO na relao de produtos de
2
oxidao e eficincia de quimiluminecncia.
Intensidade Relativa de
Quimiluminescncia
Relao de Picos
(Diindoxil/Prod. De
Clivagem)
Controle
1
1 2 ,3
SOD 5,1
u/mL
0,2 1 ,4
Controle
2
0,09 1 ,1


13 6
13 6
KO 5
2
mmol/L
1 2 ,2
Controle 1: [HRP] = 0,2 mol/L, [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L,
2 2
3 7C, [MAP] 50 mmol/L, pH 9,3.
Controle 2: [HRP] = 0,2 mol/L; [2-metilindol] = 1 mmol/L; [fosfato] 50 mmol/L;
pH 7,4, [H O ] = 5 mmol/L.
2 2
5 .1 .1 1 - Potenciais Aplicaes do Sistema 2 -
metilindol/HRP/H O /O
2 2 2
Visto que a peroxidase de raiz forte largamente utilizada como marcador em
ensaios imunoenzimticos (conjugados de HRP), analisou-se a relao entre
quimiluminescncia e concentrao de HRP, utilizando-se o 2-metilindol como
substrato. As figuras 5. 2 8 e 5.29 mostram que a rea integrada de
quimiluminescncia pode ser correlacionada com as concentraes de HRP e HRP-
IgG respectivamente, o que viabiliza a utilizao dessa metodologia analtica nestes
campos de aplicao.



13 7
13 7
0 8 1 6 2 4 3 2 4 0 4 8 5 6
1 0
0
1 0
1
1 0
2
1 0
3
1 0
4
1 0
5
1 0
6
I

n

t

e
n

s

.

i

n

t

e

g

r

a
d

a

d
e

l

u

z

[HRP] (mol)
branco
D
C
B
A
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

c
p
s

)

tempo (min)
1 0
- 1 4
1 0
- 1 3
1 0
- 1 2
1 0
- 1 1
1 0
- 1 0
1 0
4
1 0
5
1 0
6
1 0
7
1 0
8
1 0
9
1 0
1 0
D
C
B
A
Figura 5.28- Correlao entre [HRP] e intensidade de luz. Concentraes
finais: [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, [AMP] = 0,05 mmol/L, pH 9,3,
2 2
3 7 C
0 1 6 3 2 4 8 6 4 8 0 9 6 1 1 2
1 0
1
1 0
2
1 0
3
1 0
4
1 0
5
D
C
B
A
A= HRP-IgG= 1,25 u/mL
B= =0,125
C = = 0,0125
D = = 0,0000
i

n

t

e
n
s

i

d
a
d
e

d
e

l

u
z
(

c
p
s

)

tempo (min)


13 8
13 8
Figura-5.29- Correlao entre [HRP-IgG] e intensidade de luz. Concentraes
finais: [2-metilindol] = 1 mmol/L, [H O ] = 5 mmol/L, [AMP] = 0,05 mmol/L, pH 9,3,
2 2
3 7 C
Outra potencial aplicao da oxidao quimiluminescente de indis o estudo
qualitativo ou quantitativo de outras peroxidases. Neste campo merece destaque os
estudos da quimiluminescncia nativa ou ativada em neutrfilos onde a enzima
mieloperoxidase exerce um papel fundamental
(68)
. Neste contexto foi testado a ao
cataltica de mieloperoxidase comercial extrada de neutrfilos na oxidao do 2-
metilindol. O resultado foi positivo e abre as portas para novas aplicaes desse
substrato (figura 5.30).



13 9
13 9
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0
1
2
3
4
5
6
mieloperoxidase
controle
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z

(

1
0

3
c
p
s

)

tempo (min)
Figura 5.30- Oxidao do 2-metilindol catalisada mieloperoxidase.
Concentraes por finais: [2-metilindol] = 1 mmol/L, [MPO] = 1 u/mL, [H O ] = 5
2 2
mmol/L, [AMP] = 50 mmol/L, pH 9,3, 37C
5 .2 - Discusso e Concluses
Observou-se uma grande variao no rendimento total de quimiluminescncia
em funo dos substituntes no ncleo indlico. Dos 22 derivados estudados,
destacaram-se o 2,5-dimetilindol e principalmente o 2-metilindol, cujo decaimento da
emisso pode durar at quatro horas, e sua eficincia quntica em mdia 1000
vezes maior do que a dos demais derivados. O rendimento quntico de
quimiluminescncia encontrado ((9,1 0,8) x 10
- 5
E/mol) para a oxidao do 2-
metilindol coloca o sistema entre as reaes quimiluminescentes consideradas de


14 0
14 0
moderada eficincia. Como comparao, pode-se citar as reaes de auto-oxidao
de compostos carbonlicos catalisadas por base (por exemplo, auto-oxidao de
cetonas |
CL
= 10 )
- 6 (107)
e a reao de oxidao do luminol ( |
CL
= 10 )
- 2 (108)
.
Os processos de auto-oxidao, que precedem muitas reaes
quimiluminescentes no enzimticas, normalmente so conduzidos em meio
fortemente alcalino ou atravs de iniciadores radicalares. A oxidao do luminol por
exemplo, que em meio aprtico fortemente alcalino ( t -BuOK/DMSO), onde ocorre
dupla desprotonao do substrato, emite forte quimiluminescncia quando apenas
aerado (oxidao pelo oxignio). Por outro lado, em meio aquoso (pH 11,6), onde
ocorre apenas mono desprotonao , necessria a adio de perxido de
hidrognio e catalisadores como complexos frricos ou hemina
(108)
. tambm
conhecida a oxidao qumica do indol e seus derivados por agentes oxidantes
clssicos, como KOH/H O /K Fe(CN) , DMSO/KOH/O
2 2 3 6 2
ou NaOH/K S O , sendo
2 2 8
novamente observado a importncia do meio alcalino
(49, 52, 53)
. Assim, em um primeiro
momento, era esperado que de modo geral a maior eficincia de quimiluminescncia
dos derivados indlicos fosse alcanada em pHs alcalinos. Por outro lado, apenas
para a oxidao do 2-metilindol e 2,5-dimetilindol esta intensificao atingia de duas
a trs ordens de grandeza quando realizada em meio alcalino (figuras 5.5, 5.7, 5.8 e
5 . 9). Portanto, no h dvida de que o comportamento diferenciado do 2-metilindol e
2 ,5-dimetilindol, em relao aos outros derivados indlicos, deve-se a uma
caracterstica especfica desses compostos e detectada somente nestas condies
de reao (oxidao catalisada por HRP em meio alcalino), j que a oxidao
qumica no revela esta caracterstica (figura 5.3); portanto, no encontra
precedentes nos trabalhos j desenvolvidos nesta rea.
O papel da HRP como catalisador da oxidao destes indis pode ser
assegurado pela ausncia de emisso de luz na ausncia da enzima ou pela
inativao da mesma por aquecimento a 80 C por 3 horas (figura 5.7). Os testes que
utilizam perxido de hidrognio em meio alcalino como meio oxidante e Fe
+ 3
como
catalisador, e que j foi descrito para o estudo das caractersticas
quimiluminescentes de alguns derivados indlicos, resultaram em uma extremamente
baixa quimiluminescncia, tanto para o 2-metilindol quanto para o 3-metilindol e no
mostraram diferenas significativas entre estes.


14 1
14 1
O perfil cintico das reaes varia em funo dos derivados indlicos
utilizados. Para o 3-metilindol, por exemplo, verificou-se sempre uma curva de
emisso tipo flash (subida instantnea seguida de decaimento exponencial), que
pode ser entendida supondo-se que a etapa lenta do processo seja a reao entre o
3 - metilindol e a peroxidase ou, mais precisamente, com os intermedirios ativos da
mesma. Diferentemente, para o 2-metilindol verificou-se uma curva de emisso que
indica o acmulo de algum intermedirio (subida lenta), sendo a sua decomposio a
etapa lenta do processo.
Alm de fornecer as espcies ativas que iniciam o processo oxidativo, a
peroxidase de raiz forte desempenha um efeito cataltico, que de fato conhecido,
decompondo perxido de hidrognio e fornecendo oxignio ao meio. Isto foi
facilmente comprovado por meio dos controles utilizando-se apenas peroxidase e
perxido de hidrognio nas condies de reao (figura 5.13).
Outros achados experimentais tambm podem ser explicados pela ao
cataltica desempenhada pela peroxidase. o caso, por exemplo, da falta de
correlao entre a cintica de consumo de oxignio e o decaimento do sinal
quimiluminescente. Em uma situao anloga, que a oxidao de enis via
HRP/H O /O , observa-se o oxignio dissolvido no meio (0,2 mM) como reagente
2 2 2
limitante da reao. Entretanto, isto no ocorre no caso de alta concentrao de
perxido de hidrognio, pois a reposio do oxignio, pela decomposio do
perxido, realimenta a reao. A reduo do rendimento total de quimiluminescncia
observado para concentraes de peroxidase acima de 1 mol/L pode tambm ser
explicada pela atividade cataltica da peroxidase. Neste caso, a perda de perxido
de hidrognio mais importante do que o ganho com o oxignio produzido. Este
efeito tambm foi observado no consumo do substrato, monitorado por HPLC, no
qual notou-se que a menor eficincia de quimiluminescncia, quando altas
concentraes de peroxidase foram utilizadas, estava novamente associada ao
menor consumo de 2-metilindol.
A alta dependncia do rendimento de quimiluminescncia do 2-metilindol em
funo da concentrao de perxido de hidrognio poderia sugerir o envolvimento do
mesmo em outras etapas da reao, alm de apenas formar as espcies ativas de
peroxidase (HRP-I, HRP-II). Isto foi considerado pois, em reaes a princpio
semelhantes (oxidao de enol), uma relao estequiomtrica de 1 para 2 (0,1


14 2
14 2
mmol/L da H O para 0,2 mmol/L de oxignio) normalmente observada
2 2
(41)
. A seguir
analisaremos algumas possibilidades:
i) oxidao direta do 2-metilindol pelo perxido de hidrognio em meio
alcalino : esta possibilidade, embora factvel, pois como j foi mostrado a oxidao
qumica pode ocorrer em condies semelhantes quelas aqui empregadas, foi
descartada, devido a necessidade da peroxidade como catalisador;
ii) reao entre os radicais indoila previamente formados e perxido de
hidrognio : supondo o mecanismo peroxidtico clssico e a conseqente
formao dos radicais indoila, poderia-se imaginar que o perxido de hidrognio
atuasse diretamente sobre estes, ou pelo menos houvesse uma competio entre
o perxido de hidrognio e o oxignio molecular pelos radicais formados, j que
no se pode descartar o consumo de oxignio. No entanto, esta hiptese foi
descartada visto que a desaerao do meio, seja por saturao com nitrognio,
seja pelo uso do sistema enzimtico glicose/glicose-oxidase, suprimiu quase
totalmente a emisso (figura 5.14), indicando que perxido de hidrognio em alta
concentrao no condio suficiente para que haja quimiluminescncia.
Inclusive, o uso de glicose/glicose-oxidase, sistema capaz de consumir oxignio
s custas da oxidao de glicose e formao de perxido de hidrognio ,
poderia levar a intensificao da quimiluminescncia, caso o perxido tivesse a
funo aqui citada.
iii) perxido de hidrognio atuando como fonte de oxignio : os ensaios em que
catalase foi adicionada ao sistema mostraram no apenas a supresso, mas
tambm a intensificao da quimiluminescncia quando em baixas concentraes
da mesma (figura 5.16). Como a enzima catalase decompe perxido, deveria ser
observada apenas a supresso de quimiluminescncia, caso houvesse apenas o
desfavorecimento da formao de composto-I de HRP. No entanto, observou-se
que, para baixas concentraes de catalase, ocorria o inverso, ou seja, um
aumento de eficincia. Isto pode ser explicado considerando-se que a formao
de oxignio pela decomposio do perxido pode, em determinado momento, ser
mais importante do que a perda de perxido de hidrognio.
Estes resultados indicam que o perxido de hidrognio pode ter duas funes
principais no mecanismo da reao: (i) formar as espcies ativas de peroxidase ;
(ii) fornecer oxignio ao meio de reao por decomposio . Outra evidncia


14 3
14 3
dessa ltima funo, e que explica a menor eficincia de quimiluminescncia em
concentraes baixas de perxido de hidrognio, est na observao de que o
mesmo era o reagente limitante da reao. Ficou evidente, com a anlise de
produtos, que a menor eficincia observada para concentraes mais baixas de
perxido estava relacionada ao baixo consumo do 2-metilindol. Aps o decaimento
do sinal quimiluminescente, mesmo utilizando 5 mM de perxido para 1mM de
substrato, era possvel restabelec-lo (parcialmente), atravs de re-adies de
perxido. O esquema 5.3 mostra as possveis funes do perxido de hidrognio na
oxidao do 2-metilindol.
A supresso da quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol pela adio
de SOD sugere o envolvimento do nion superxido no mecanismo da reao. De
fato, a formao e estabilizao de nion superxido podem ser favorecidas nas
condies de reao utilizadas neste trabalho. Em primeiro lugar, o nion superxido
so estabilizados em meio alcalino e em segundo lugar, sua formao poderia ser
favorecida nestas condies pela seguinte razo: dentre as possibilidades de
compostos ativos de peroxidase, esperados e apresentados no esquema 5.3,
sabido que o potencial de reduo do par HRP-II/HRP, ao contrrio de HRP-I/HRP-II,
fortemente dependente de pH, variando de aproximadamente 1,0 V em pH 6,0 para
0 ,5 V em pH 11,0
(109)
. Este fato sugere que em pH alcalino haveria o favorecimento
da formao de composto-III devido a inibio, total ou parcial, do passo de
converso da HRP-II HRP nativa. A HRP-III, por sua vez, poderia gerar nion
superxido por decomposio
(110)
. A relao entre a eficincia e o envolvimento de
nion superxido foi posteriormente comprovada pela adio de superxido de
potssio (KO ) na reao em meio neutro, e o conseqente aumento em uma ordem
2
de grandeza na quimiluminescncia (figura 5.18).
A competio entre estes diferentes ciclos da peroxidase tambm poderia
explicar o efeito cintico observado em funo do pH na oxidao do 2-metilindol.
Observou-se uma diminuio da velocidade da reao em pH alcalino, o que,
segundo a nossa proposta, seria devido inibio da constante de velocidade do
passo HRP-II HRP nativa. Uma comprovao dessa proposta foi verificada no
experimento em que se adicionou superxido de potssio na reao em pH 7,4.
Neste caso, apesar da significativa intensificao da quimiluminescncia, no houve



14 4
14 4
uma alterao no perfil cintico da reao. Isto era esperado, visto que no ocorreu
mudana no pH e conseqentemente nos ciclos da peroxidase.
O envolvimento de nion superxido foi posteriormente observado na
oxidao da melatonina via HRP/H O /O , estudo que encontra-se em andamento em
2 2 2
nosso laboratrio. O esquema 5.3 mostra os ciclos da peroxidase que podem estar
envolvidos na oxidao do 2-metilindol.
Fe
+ 3
Nativa
H O
2 2
H O
2
Fe
+5
composto I
2 - MI
2 - MI
, H
+
Fe
+4
composto II
2 - MI, 2 H
+
Fe
+5
. H O
2 2
H O
2 2
H O + O
2 2
H O
2 2
H O
2
(Fe
+ 3
- - - O )
2
O
2
ciclo
peroxidtico
ciclo
cataltico
gerao de
composto III
Composto III
Fe
+6
2 - MI , H O
2
Esquema 5.3- Provveis ciclos da peroxidase na oxidao do 2-metilindol


14 5
14 5
Antes de discutir os resultados obtidos na identificao de alguns produtos de
oxidao, cabe ressaltar os produtos normalmente encontrados nas oxidaes
qumicas de alguns indis.
Derivados indlicos que possuem substituies na posio 3, quando
submetidos a diferentes sistemas oxidativos produzem os mais variados compostos
e, entre eles, destacam-se aqueles em que o anel pirrlico clivado. O exemplo
abaixo mostra os produtos obtidos na oxidao do 2,3-dimetilindol com cido
peridico ou periodato de sdio e 3-metilindol com cido perbenzico ou oznio
(esquema 5.4)
(111)
. importante ressaltar que apesar de o produto final depender do
sistema oxidativo, em nenhum dos casos citados em literatura encontram-se
produtos do tipo indoxil, como seria esperado, devido estrutura desses compostos.
N
CH
3
H
C H CO H
6 6 3
COCH
3
NHCHO
N
CH
3
CH
3
H
NaIO
4
COCH
3
NHCOCH
3
HIO
4
N
CH
3
CHO
H
ou O
3


14 6
14 6
Esquema 5.4- Exemplos de oxidaes qumica de indis substitudos na posio 3
Para a oxidao de derivados indlicos, substitudos na posio 2 por grupos
alqulicos e no substitudos na posio 3, alm dos produtos de clivagem oxidativa
do anel pirrlico, formam-se derivados de indoxil e diindoxil
(111,112)
. Alguns exemplos
so mostrados abaixo (esquema 5.5).
N CH
3
H
H C
3
NHCOCH
3
CO H
2
H C
3
N CH
3
H
N
O
N H
CH
3
H C
3
H
derivado de indoxil
N Pr
H
H O /AcOH
2 2
Pr
N
O
N
O
Pr
H H
derivado de diindoxil
H O /AcOH
2 2
KMnO
4
ou H O
2 2
Esquema 5.5- Exemplos de oxidaes qumica de indis substitudos na posio 2
A formao de derivados de diindoxil parece ser exclusiva para
derivados indlicos substituidos por grupos alqulicos na posio 2 e livres de
substituio na posio 3 . Quando derivados indlicos com ambas posies livres
so oxidados, formam-se principalmente indoxils que posteriormente sero re-
oxidados a derivados do corante indigo (esquema 5.6)
(111)
. De fato, no presente
estudo, para os derivados indol, 5-metilindol, 4-metoxindol entre outros, que


14 7
14 7
apresentam as posies 2 e 3 livres, verificou-se a formao de compostos coloridos
que no foram identificados.
I ndigo
N
H
N
O
H
N
N
O
H
H
O
[O]
C H CO H
6 5 3
ou H O
2 2
indoxil
Esquema 5.6- Exemplo de oxidao qumica do indol
Neste trabalho, durante a oxidao do indol, 2,5-dimetilindol, 2,3-dimetilindol,
2 - metilindol, 3-metilindol, 4-metoxiindol e melatonina, ocorreu a formao de um
composto principal, provavelmente tratam-se dos produtos formados pela abertura
oxidativa do anel pirrlico desses compostos. A comprovao dessa hiptese foi
obtida atravs do isolamento e identificao dos produtos oriundos da oxidao do 2-
metilindol ( N -(formilfenil)acetamida), e do 2,3-dimetilindol ( N -(acetilfenil)acetamida)
por espectrometria de massa. Para os demais derivados no foi realizado
identificao de produtos.
Para o 2,3-dimetilindol, a correlao observada entre a distribuio espectral
de quimiluminescncia e o espectro de fluorescncia indica que a formao da o-
acetamina-acetofenona em estado excitado deve ser o responsvel pela
quimiluminescncia (figura 5. 2 3). Uma proposta mecanstica para a
quimiluminescncia observada na oxidao do 2,3-dimetilindol, e que poderia ser
generalizada para a maioria dos derivados indlicos, apresentada no esquema 5.7.


14 8
14 8
N
H
CH
3
CH
3
HRP-Iou
HRP-II
CH
3
CH
3
N
O ou O
2 2
N
H
OOH
CH
3
H C
3
N
H
CH
3
O
O
H C
3
O
CH
3
N
H
O
CH
3
O
CH
3
N
H
O
CH
3
Luz +
Esquema 5.7- Esquema reacional proposto para oxidao do 2,3-dimetilindol
via HRP/H O /O
2 2 2
Como seria esperado para indis substitudos por grupos alqulicos na
posio 2 e hidrognio na posio 3 (esquema 5.5), tambm neste sistema oxidativo,
para o 2-metilindol e 2,5-dimetilindol, observou-se a provvel formao de derivados
de diindoxil. Para o 2-metilindol as evidncias analticas apontam para o composto
2 ,2-dimetil-2,2-diindoxil. Obteve-se este composto na dcada de 60 quando se
tentava sintetizar a 2-metilindolinona, descrita como sendo um composto instvel e
nunca isolado
(106)
.
A perfeita correlao entre a distribuio espectral de quimiluminescncia do
2 - metilindol e o espectro de fluorescncia do diindoxil, no deixa dvida de que a
alta eficincia de quimiluminescncia obtida na oxidao desse derivado indlico
deve-se formao do mesmo (figura 5.24). O mesmo pode ser dito para o 2,5-
dimetilindol, embora no tenha sido feita a caracterizao estrutural do possvel
diindoxil formado (figura 5.25).
A correlao existente entre o aparecimento do diindoxil com o aumento
dramtico da quimiluminescncia mostrou-se evidente em vrios ensaios. O maior
rendimento quntico de quimiluminescncia observado em pH alcalino ou promovido
pela adio de KO
2
coincide com o aumento relativo na formao da diindoxil
(tabelas 5.2 e 5.1). Na mesma direo apontam a diminuio da quimiluminescncia
e a diminuio do diindoxil quando se faz adio de superxido dismutase.


14 9
14 9
So duas as possibilidades de envolvimento do diindoxil na
quimiluminescncia do 2-metilindol e 2,5-dimetilindol. Uma possibilidade a sua
formao diretamente em estado excitado, no entanto, no temos uma proposta que
explique qual seria o passo de quimi-excitao dessa reao. A segunda
possibilidade a formao do produto de abertura do anel indlico ( N -
(formilfenil)acetamida) no estado excitado seguido da transferncia de sua energia
para o diindoxil. De fato, esta hiptese foi parcialmente confirmada pela
intensificao de quimiluminescncia quando da adio do diindoxil durante a
oxidao do indol, 5-metilindol e 5-metoxindol. Na oxidao conjunta de derivados
indlicos no substitudos com 2-metilindol tambm observou-se a intensificao
(figuras 5.20 e 5.21). Por outro lado, este efeito s foi observado nas oxidaes de
derivados indlicos livres de substituies na posio 3, ou seja, para compostos
como o 3-metilindol ou o 2.3-dimetilindol no foi observado a intensificao. Mesmo
para a oxidao do 2-metilindol e 2,5-dimetilindol no se observou sensibilizao
quando da adio do diindoxil. Assim, embora esta proposta no possa ser
descartada, ela sozinha no explica de forma definitiva o alto rendimento de
quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol. No caso da no sensibilizao do
prprio 2-metilindol, quando da adio do diindoxil isolado, possvel que a
quantidade adicionada (concentrao no determinada) seja inferior ao mesmo
produzido na prpria reao de oxidao do 2-metilindol.
O destino do radical indola pode determinar o tipo de produto e,
conseqentemente, a eficincia de quimiluminescncia. Nossos resultados
estabelecem de forma inequvoca o envolvimento de oxignio molecular e nion
superxido, uma vez que ambos podem ser adicionados aos radicais indola,
produzindo um intermedirio perxido ou perxido radical. No esquema 5.8, o
hidroperxido formado pela adio do nion superxido poderia ciclizar um
intermedirio dioxetnico por um ataque nucleoflico intramolecular. A decomposio
deste dioxetano levaria ao N -(formilfenil)acetamida. Alternativamente, o
hidroperxido pode desidratar-se a uma indolinona, uma reao factvel para
hidroperxidos secundrios
(113)
. Como j foi dito, tentativas de sntese desse
composto levaram produo de dmeros (diindoxil). Por outro lado, a adio de
oxignio levaria exclusivamente ao radical alquilperoxila e, por ciclizao, a um
radical dioxetnico e, posteriormente, ao N -(formilfenil)acetamida. De fato, em um


15 0
15 0
caso similar foi detectado, por experimentos de EPR, a ciclizao de um radical
alquilperoxil a um radical dioxetnico intermedirio
(114)
.
N
H
CH
3
HRP-I ou
HRP-II
O
2
+ H
+
CH
3
N
O
2
N CH
3
OO
N CH
3
O
O
O
H
N
H
O
CH
3
A
N CH
3
OOH
N CH
3
O
O
H
- H O
2
N CH
3
O
N
O
H
CH
3
N
H
C
O
H
3
B
A + B
A + B + Luz
Esquema 5.8- Esquema reacional proposto para oxidao do 2-
metilindol
Como j foi exposto na introduo, a peroxidase de raiz forte uma das
enzimas mais utilizadas nos chamados ensaios imunoenzimticos. O 2-metilindol
um novo substrato quimiluminescente para a revelao desses ensaios, que alm de
eficiente e barato, est disponvel comercialmente. A figura 5.28 mostra que mesmo
quando ligada em imunoglobulina, a peroxidase capaz de catalisar a reao,
viabilizando o seu uso nesta rea.
Derivados de indoxil O -protegidos foram utilizados como substratos
para o desenvolvimento de metodologias quimiluminescentes para determinao de
vrias enzimas. O princpio dessa tcnica a gerao do indoxil livre aps a


15 1
15 1
hidrlise enzimtica e ento sua oxidao via HRP, gerando quimiluminescncia
(85,86)
.
Trata-se de um ensaio interessante em que o perxido de hidrognio, gerado
juntamente com o indigo, pode ser utilizado tanto para oxidar luminol quanto o
prprio substrato, ambos por meio da ao cataltica da peroxidase (esquema 5.9).
Acreditamos que, neste caso, a substituio do substrato derivado do 6-bromo-5-
cloroindol pelo equivalente do 2-metilindol poder resultar em um enorme ganho na
sensibilidade dessas tcnicas, configurando-se assim como mais uma importante
aplicao desse composto. Esta possibilidade ser explorada em um projeto futuro
em nosso laboratrio.
Cl
Br
N
O
O
OH
CH OH
2
OH
OH
H
|
- D-Galactosidase
Cl
Br
N
O
N
O
Cl
Br
H
H
+
H O
2 2
H O
2 2
+
HRP
Cl
Br
NHCHO
O
O
+
Luz
Cl
Br
N
O
O
OH
CH OH
2
OH
OH
H
O
OH
CH OH
2
OH
OH
Esquema 5.9- Utilizao de derivados indlicos na determinao de B -D -
Galactosidase
Outra potencial aplicao do 2-metilindol ou algum outro derivado
indlico poder ser o uso como sonda alternativa ao uso de luminol e lucigenina no
estudo de burst oxidativo. Como foi descrito na introduo, h um grande interesse
por mtodos analticos que possam distinguir as diferentes espcies reativas de
oxignio geradas pelos neutrfilos estimulados. Alm do 2-metilindol ser reconhecido
como substrato quimiluminescente de mieloperoxidase de neutrfilos (figura 5.29),
existe uma clara evidncia de sua especificidade por nion superxido, o que poder
ser de grande valia na distino entre as espcies reativas de oxignio.


15 2
15 2
Derivados indlicos biolgicos
Em pH fisiolgico, diversos compostos indlicos, biologicamente relevantes,
podem sofrer oxidao catalisada por dioxigenases. Na via metablica do triptofano o
primeiro passo compreende sua oxidao catalisada pela triptofano 2 ,3-
dioxigenase
(115)
. A dioxigenase inespecfica indoleamina 2,3-dioxigenase atua sobre
outros indis, incluindo melatonina e serotonina
(116)
. Em todos estes casos, ocorre a
quebra do anel indlico, o que pode facilmente ser formulado imaginando o
envolvimento de um intermedirio dioxetnico, embora no tenham sido relatado
indcios de quimiluminescncia nestas reaes.
Em trabalhos recentes diversos derivados indlicos biolgicos foram
submetidos oxidao por meio de H O /OH e hemina como catalisador
2 2
- (55,57)
. Nestes
trabalhos foram descritos a formao de produtos de abertura oxidativa do anel
(produtos quinurennicos). Particularmente para a melatonina obteve-se
quimiluminescncia nessas reaes, o que sugere o envolvimento de um
intermedirio dioxetnico como responsvel pela quimiluminescncia. Como j
descrito na introduo, o hormnio vegetal cido 2-(indol-3-il)actico quando
submetido ao sistema HRP/H O /O2 tambm sofre oxidao quimiluminescente
2 2
(34, 35)
.
Nas condies de reao aqui empregadas, dos indis biolgicos testados
apenas a melatonina e alguns de seus derivados, como a 6-cloromelatonina,
mostraram-se quimiluminescentes quando submetidos oxidao (figura 5.2 e tabela
5 . 1). Comparando a estrutura dos compostos melatonina, 6-hidroximelatonina, 5-
metoxitriptamina e serotonina, pode-se supor que a presena de grupos hidrxi ou
amino livres seja o responsvel pela ausncia de quimiluminescncia quando os
mesmos foram submetidos oxidao. Realmente sabido que substratos fenlicos
podem ser oxidados pela ao cataltica da HRP atravs de um mecanismo escuro
produzindo quinonas
(117)
. De fato, no presente trabalho, observou-se um
escurecimento do meio de reao quando substatos com grupos hidroxila livres
foram submetidos oxidao, indicando a ocorrncia de reao, embora sem
emisso. tambm conhecido o efeito supressor que as aminas exercem sobre
estados excitados, assim a presena de grupos aminos livres nos substratos 5-
metoxitriptamina e triptofano podem ser suficientes para suprimir a emisso.


15 3
15 3
6 - Sntese e Estudo de oo o o - Hidroperxi-aldedos
Protegidos como Substratos Quimiluminescentes de
Enzimas
6 .1 - Resultados
Como j foi dito na introduo, muitos compostos o -hi droperxi-carbonlicos j
foram sintetizados por meio de auto-oxidao, e suas decomposies em meio
alcalino geram quimiluminescncia
(57, 58)
. Assim, com o objetivo de desenvolver uma
metodologia quimiluminescente para quantificao de esterases, os trabalhos foram
iniciados sintetizando-se um o - hidroperxi-aldedos protegido por um grupo acila. A
seguir ser descrito como este composto foi obtido.
6 .1 .1 - Tentativa de sntese de 2-acetilperxi-2-metilpropanal
Em um projeto de ps-doutoramento realizado neste laboratrio,
desenvolveu-se uma rota sinttica para produo de um o - hidroperxi-aldedo
protegido por um grupo acila (esquema 6.1). Das etapas propostas apenas para a
ozonlise no se obteve sucesso. Segundo o autor, apesar da ozonlise ter ocorrido,
o que foi comprovado pela ausncia de prtons olefnicos na mistura final de
produtos (anlise por RMN H ), houve decomposio do produto final
1 (118)
.


15 4
15 4
O
O H
+
NaOH 10%
O
5 - metil-3-hexen-2-ona
+ H O
2
perxido de benzola/O
2
O
HOO
5- hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
CH COCl/piridina
3
CH Cl
2 2
O
O
O
O
5- acetilperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
1) O /CH OH/-78 C
3 3
2) (CH3) S
2
+
HCl
O
O
O
O
H
+
O
O
H
2- acetilperxi-2-metilpropanal
Esquema 6.1- Rota sinttica para preparao do 2-acetilperxi-2-
metilpropanal
Acreditando que o problema poderia estar na etapa de reduo dos
produtos da ozonlise, iniciou-se esta parte do trabalho reproduzindo a rota
esquematizada acima e alterando as condies de ozonlise. A seguir ser
apresentado um pequeno estudo sobre as reaes de ozonlise.
Uma grande variedade de compostos tm sido utilizados como agentes
redutores nas reaes de ozonlise. A reduo, quando reagentes como
trifenilfosfina, uria, dimetilsulfeto, etc., so utilizados, tem como mecanismo
proposto o ataque nucleoflico destes sobre o intermedirio ozondio ou sobre o
carbonil-xido formado pela sua decomposio
(119)
. Em particular, a utilizao de
solventes prticos pode levar gerao de hidroperxidos a partir do carbonil-xido
intermedirio. Este, ento, pode ser reduzido com os reagentes j mencionados.
Assim, o mais conveniente e eficiente mtodo utilizado para ozonlise de olefinas
emprega metanol como solvente e dimetilsulfeto como agente redutor
(120)
(esquema


15 5
15 5
6 . 2). Nessas reaes, inicialmente o oznio injetado no meio de reao baixa
temperatura e os agentes redutores so adicionados posteriormente.
O
3
+
O O
O
O
O
O
OCH
3
OOH
CH OH
3
(CH ) S
3 2
O CH OH + (CH ) SO
3 3 2
+
Esquema 6.2- Mecanismo proposto para ozonlises em metanol e
dimetilsulfeto como agente redutor
Esta rota prope a reduo de um hidroperxido e, conseqentemente,
poderia ser este o motivo da decomposio do o - hidroperxido-aldedo, visto que
este possui uma funo qumica anloga. Outra tcnica para realizar-se uma
ozonlise utiliza solventes aprticos e o agente redutor adicionado no incio da
introduo de oznio. Trata-se do uso de tetracianoetileno (TCNE), o qual no reduz
funes peroxdicas e assim foi proposto que o mesmo atuasse diretamente sobre o
carbonil-xido intermedirio (esquema 6 .3 ) . De fato, foram realizados testes
agitando-se o composto 5-acetilperxi -5-metil-3-hexen-2-ona na presena de TCNE
e, realmente, no houve perda de sua atividade peroxdica (teste com iodeto de
potssio em meio cido).


1 5 6
1 5 6
O
3
+
+
O O
O
O
O
O
O
CN
CN NC
NC
TCNE
O
Esquema 6.3- Mecanismo proposto para ozonlises utilizando solventes
aprticos e tetracianoetileno como agente redutor
Iniciando-se, ento, as preparaes (esquema 6.1), o composto 5-metil-
3 - hexen-2-ona foi preparado a partir da condensao aldlica do isobutanal com a
propanona em meio alcalino
(121)
. O rendimento dessa reao foi de 21%. A auto-
oxidao desse composto, promovida pelo iniciador radicalar perxido de benzola,
resultou no composto 5-hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona com um rendimento de
4 1 %
(122)
. A reao desse hidroperxido com cloreto de acetila e piridina resultou no
produto acilado 5-acetilperxi-5-metil-3-hexen-2-ona com um rendimento de 25%
(123)
.
A ozonlise do 5-acetilperxi-5-metil-3-hexen-2-ona foi ento realizada
utilizando-se acetato de etila como solvente, temperatura de -78C e TCNE como
agente redutor. A capacidade do ozonizador, determinada por titulao do oznio
produzido, foi de 2,5 x 10
- 3
mol/h. A partir desse valor, pelo qual foi possvel calcular
o tempo mnimo de reao, vrias tentativas foram realizadas, sem sucesso. A
anlise por RMN H
1
do produto final isolado indicou a decomposio do o -
hidroperxi-aldedo desejado.


1 5 7
1 5 7
6 .1 .2 - Preparao de 2 - acetilperoxiadamantano-2-
carboxialdedo
Buscando novas alternativas para a preparao de um o - hidroperxi-
aldedo partiu-se para a sntese do 2-acetilperxiadamantano-2-carboxialdedo. Este
composto foi sintetizado em um trabalho sobre a reatividade de oxignio singlete
frente a enis- teres
(124)
. Aqui foram feitos alteraes nos passos iniciais at a
obteno do adamantano-2-carboxialdedo
(125)
. A seguir ser descrito como este
composto foi obtido.
6 .1 .2 .1 - Preparao do iodeto de trimetilsulfoxnio
Preparou-se este composto atravs da reao entre iodeto de metila e
dimetilsulfxido (DMSO). O rendimento foi de 70% (esquema 6.4).
H C
3
S
H C
3
O + CH I
3
S O
CH
3
CH
3
H C
3
I
-
iodeto de trimetilsulfoxnio
Esquema 6.4- Preparao de iodeto de trimetilsulfoxnio
6 .1 .2 .2 - Preparao do xido de 2-metilenoadamantano
O iodeto de trimetilsulfoxnio foi convertido em um ilida de enxofre
(metilideno-dimetilsulfoxnio) atravs da desprotonao por hidreto de sdio em
meio de DMSO seco. Este composto atua como um doador de grupo metileno a
grupos carbonlicos, no enolizveis, gerando epxidos. Assim, 2-adamantanona foi
adicionada ao meio de reao gerando o xido de 2-metilenoadamantano (esquema
6 .5 ) . O rendimento foi de 52%.


1 5 8
1 5 8
S O
CH
3
CH
3
H C
3
I
-
+ NaH
DMSO
S O
CH
3
CH
3
H C
2
S O
CH
3
CH
3
H C
2
+ NaI + H
2
O
O
+
S O
H C
3
H C
3
xido de 2-metilenoadamantano
Esquema 6.5- Preparao do xido de 2-metilenoadamantano
6 .1 .2 .3 - Preparao do adamantano-2-carboxialdedo
O passo seguinte foi a converso do xido de 2-metilenoadamantano
em adamantano-2-carboxialdedo por meio de um rearranjo catalisado pelo cido de
Lewis trifluoreto de boro eterado (esquema 6.6). Este composto no foi isolado, pois
poderia ser oxidado a cido, mas por cromatografia gasosa observou-se converso
quase quantitativa do epxido. Assim, aps lavagem para retirada do trifluoreto de
boro, o aldedo foi mantido em benzeno, que foi evaporado no momento da
realizao do passo seguinte.


1 5 9
1 5 9
O
(C H ) O
2 5 2
. BF
3
O
H
adamantano-2-carboxialdedo
Esquema 6.6- Preparao de adamantano-2-carboxialdedo
6 .1 .2 .4 - Preparao do acetato de 2-metiladamantilideno
O aldedo foi convertido em acetato de 2-metiladamantilideno pela
formao inicial de seu enolato, utilizando-se hidreto de potssio em meio de
dimetoxietano (DME) anidro. A reao desse enolato com excesso de anidrido
actico conduziu a formao do composto desejado (esquema 6.7).
O
H
+ KH
DME
O
H
O
-
H
+ H
2
K
+
H C C
3
O
O
C
O
H C
3
H
O
O
+
H C C
3
O
O K
- +
acetato de 2-metiladamantilideno
Esquema 6.7- Preparao de acetato de 2-metiladamantilideno


1 6 0
1 6 0
6 .1 .2 .5 - Preparao do 2 - acetilperoxiadamantano-2-
carboxialdedo
Finalizando esta rota sinttica, o acetato de 2 - metiladamantilideno foi
submetido reao de foto-oxigenao utilizando-se como solvente acetona-d
6
e
azul de metileno como sensibilizador (esquema 6.8). Trata-se de uma reao com
oxignio singlete semelhante a uma reao do tipo ene, caracterizada pelo
deslocamento 1-3 do grupo acila. O uso de solvente deuterado justifica-se pelo maior
tempo de vida que o oxignio singlete apresenta nestes meios. O isolamento desse
composto, embora tenha sido realizado em uma coluna cromatogrfica de slica a -
3 5 C, provocou a sua parcial decomposio, como pode ser observado pelo espectro
de RMN H . Mesmo assim, ele foi submetido aos testes de quimiluminescncia.
1
H
O
O
1
O
2
acetona-d
6
O
H
O
O
O H
2 - acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo
Esquema 6.8- Preparao de 2-acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo


1 6 1
1 6 1
6 .1 .3 - Estudo do potencial quimiluminescente do 2 -
acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo
Os testes com o o - hidroperxi-aldedo derivado do adamantano foram
iniciados submetendo-o hidrlise catalisada por esterase de fgado de porco
comercial, em meio tamponado pH 7,4 (esquema 6.9).
O H
O
O
O
+
H O
2
esterase
O H
O
OH
+
OH
O
H
O
O
HO
O
+ HCOOH +
Lu z
Esquema 6.9 - Proposta de uso do 2-acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo
como substrato quimiluminescente para esterases


1 6 2
1 6 2
Nestas condies, este composto mostrou-se instvel gerando
quimiluminescncia mesmo na ausncia de enzima. Alm disso, a adio da enzima
provocou um aumento na velocidade de decomposio do o - hidroperxi-aldedo,
sem, no entanto, aumentar a intensidade de quimiluminescncia (figura 6.1).
- 3 0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
esterase 10 u/mL
esterase 5 u/mL
controle
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e
l

u

z
(

V

)

tempo (min)
Figura 6.1- Ao de esterase sobre a intensidade de quimiluminescncia do
2 - acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo. Concentraes finais: [tampo fosfato ] =
0 ,1 mol/L, pH 7,4, [ o - hidroperxi-aldedo]
_
0 ,1 mmol/L, 37C



1 6 3
1 6 3
Obteve-se resultado semelhante quando foi alterado o pH do meio de reao
na ausncia da enzima (figura 6.2). Estes resultados mostraram a existncia de uma
reao escura competitiva, o que inviabilizou a tcnica.
0 2 4 6 8 1 0
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
pH 2,5
pH 9,3
pH 7,4
i

n

t

e
n

s

i

d
a
d
e

d
e

l

u

z
(

V

)

tempo (min)
Figura 6.2- Hidrlise 2-peracetxi-2-adamantanocarboxialdedo em diferentes
pHs. Concentraes finais: [tampo fosfato ] = 0,1 mol/L, pH 7,4; [tampo fosfato] =
0 ,1 mol/L, pH 2,5; [tampo AMP] = 0,1 M, pH 9,4; [ o - hidroperxi-aldedo]
_
0 ,1 mM,
3 7 C


1 6 4
1 6 4
6 . 2 - Discusso e Concluses
A rota sinttica que tem como etapa final uma reao de ozonlise para
obteno dos o - hidroperxi-aldedos no se mostrou eficaz. O problema parece estar
na necessria etapa de reduo dos produtos da ozonlise, visto que o produto
desejado tambm pode ser reduzido. Seja utilizando dimetilsulfeto como j foi
descrito, seja utilizando tetracianoetileno, que no reduz perxidos, observou-se total
decomposio do produto final. Esta decomposio foi concluda com base nas
seguintes evidncias:
i) perda de atividade peroxdica do produto (teste com iodeto de potssio);
ii) anlise do espectro de RMN de H que revelou (espectro 17):
1
a) ausncia do prton aldedico;
b) ausncia das metilas que deveriam aparecer em torno de 1,4 ppm, conforme
produto de partida (espectro 16);
A rota para a preparao do o - hidroperxi-aldedo derivado do
adamantano (2-acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo) mostrou-se eficaz, apesar
da dificuldade de isolamento do mesmo devido a sua instabilidade. Quando este
composto foi dissolvido em tampo fosfato pH 7,4, observou-se a sua decomposio
gerando quimiluminescncia mesmo na ausncia de enzima. Somente este fato seria
suficiente para comprometer esta metodologia, visto que seria difcil estabelecer um
protocolo analtico com um composto to instvel. Alm disso, e totalmente ao
contrrio do esperado, a adio de esterase provocou uma drstica queda no sinal
de luz (figura 6.1). Obteve-se o mesmo resultado quando alterado o pH do meio de
reao, seja para a faixa cida, seja para a faixa alcalina (figura 6.2). Em ambos os
casos, tanto pela adio da enzima, quanto alterando o pH (catlise cida ou bsica
geral), h o favorecimento da remoo do grupo acila, portanto, os resultados so


1 6 5
1 6 5
compatveis. Estes resultados sugerem a existncia de um mecanismo escuro de
decomposio do o - hidroperxi-aldedo, favorecido pela desproteo do mesmo.
importante ressaltar que tambm para as o - hidroperxi-cetonas foi proposto um
mecanismo acclico e no quimiluminescente de decomposio quando estas eram
submetidas a meio alcalino
(59)
. Assim, algo semelhante deve estar ocorrendo tambm
para os o - hidroperxi-aldedos. Estes resultados podero ser objeto de um estudo
mecanstico em um projeto futuro em nosso laboratrio, no entanto esto fora dos
objetivos imediatos desse trabalho.
Estes resultados, aliados s dificuldades de sntese e instabilidade
desses compostos fizeram-nos abandonar esta linha de trabalho.


1 6 6
1 6 6
7 - Parte Experimental
7 .1 - Reagentes
Todos os reagentes a seguir so de grau analtico e, com exceo daqueles usados nas
preparaes, foram utilizados sem tratamento prvio:
_
cido clordrico, hidrxido de sdio, cido ctrico, fosfato monocido de potssio, fosfato dicido
de potssio, fosfato de potssio e carbonato de sdio foram obtidos da Cintica Qumica; 2-amino-
2 - metil-1-propanol, bicarbonato de sdio, dietanolamina, sulfato de magnsio e sulfato de sdio
foram obtidos da Ecibra; Tris, cloreto de magnsio e superxido de potssio foram obtidos da
Merck;
_
indol, 2 -m etilindol, 3-metilindol, 5 - metilindol, 4-metxindol, 5-metxindol cido 2 - (indol-3-
il)actico, cido 2 - (2-metil-5-metxindol-3-il)actico, melatonina, 6 -h idroximelatonina, 2 -
iodomelatonina, 6-cloromelatonina, triptofano, serotonina, 5-metoxitriptamina foram obtidos da
Sigma;
_
N-metilindol, 2,5-dimetilindol e 2,3-dimetilindol foram obtidos da ACROS;
_
perxido de benzola, 2-adamantanona, tetracianoetileno foram obtidos da Aldrich;
_
perxido de hidrognio 60% foi obtido da INTEROX;
_
HRP (EC 1.11.1.7, tipo IV), SOD (EC 1.15.1.1, de eritrcitos bovino), catalase (EC 1.11.1.6, de
fgado bovino), glicose oxidase (EC 1.1.3.4), esterase (EC 3.1.1.1, de fgado de porco), ALP (EC
3 . 1 . 3 . 1 , de mucosa de intestino bovino), ACP (EC 1.11.1.7, de smen humano), ALP-IgG
(conjugado de fosfatase alcalina com imunoglobulina do tipo G, produto n A 9919), HRP-IgG
(conjugado de peroxidase de raiz forte com imunoglobulina do tipo G, produto n A 6029) e
mieloperoxidase (E.C. 1.11.1.7, de leuccitos humano nM 6908) foram obtidos da Sigma;
_
Quimiotripsina (EC 3.4.21.1, Sigma) e o substrato Pro-Phe-Phe-MCA ( prolina-fenilalanina-
fenilalanina-metilcoumarina) foram gentilmente cedidos pelo Prof. Jair Chagas da Escola Paulista
de Medicina (atualmente Universidade de Mogi das Cruzes);
_
kit para determinao qualitativa de anticorpos IgG para vrus Epstein-Barr em soro sangneo
humano foi obtido da Sigma (nSIA130-A);
_
Kit para determinao de atividade enzimtica da fosfatase alcalina em soro sangneo humano
foi obtido da Boehringer Mannheim;
_
dibromoantraceno-2-sulfonato de sdio (DBAS) foi preparado como descrito por Catalani et al.
(27)
;


1 6 7
1 6 7
Os reagentes utilizados em sntese foram tratados, seguindo-se procedimentos usuais
(126)
:
_
cloreto de sulfurila, cloreto de acetila, cloreto de trimetilsilano, piridina, fosfito de metila e iodeto
de metila foram obtidos da Aldrich e destilados antes do uso;
_
hexano, acetona e acetato de etila foram obtidos da Merck e destilados antes do uso;
_
benzeno (Merck) foi destilado, adicionado sdio/benzofenona e destilado no momento de uso;
_
anidrido actico (Merck) foi neutralizado com quinolina e destilado;
_
DMSO (Merck) foi destilado a presso reduzida, seco com duas pores de peneira molecular 4A
(5% p/v, 12h) e estocado sobre peneira molecular;
_
trifluoreto de boro eterado (Aldrich) foi refluxado com hidreto de clcio e destilado;
_
1 ,2-dimetoxietano, tetrahidrofurano e ter etlico, todos obtidos da Merck, foram destilados de
sdio/benzofenona antes do uso;
_
isobutanal (Aldrich) foi destilado sob atmosfera de nitrognio;
_
diclorometano (Merck) foi refluxado sobre hidreto de clcio e destilado.
7 .2 - Equipamentos e Mtodos
Os espectros de RMN foram registrados em um espectrmetro Brucker AC-200-F ou DPX-
3 0 0 . Os deslocamentos qumicos foram relatados em ppm, em relao ao padro tetrametilsilano
(TMS);
- Os espectros de massa foram obtidos a 70 eV em um aparelho CG-MS Hewlett Packard 5988A
(massa) e 5890 (cromatgrafo);
- O espectro de massa do composto 2,2-dimetil-2,2-diindoxil, em particular, foi obtido por injeo
direta utilizando o equipamento acima operando a 35 eV.
- O monitoramento das reaes e anlise de pureza dos compostos sintetizados foram realizados,
sempre que possvel, por meio de cromatografia gasosa utilizando um cromatgrafo Shimadzu


1 6 8
1 6 8
GC-14A com detector de ionizao de chama (coluna megabore apolar CBP1 W25 100 (0,53 mm
de dimetro, 25 m) ou por cromatografia de camada fina;
- As destilaes de pequenas massas foram realizadas em um destilador tipo Kugelrohr Buchi GHR-
5 1 (destilaes bulbo a bulbo);
- A monitorao dos produtos de oxidao dos derivados indlicos e a obteno dos espectros de
fluorescncia dos produtos principais foram realizados, utilizando-se um HPLC SHIMADZU LC-10A
com detectores UV-VIS SPD-10A e Fluorescence HPLC Monitor RF535. A coluna utilizada era de
fase reversa (SUPERCOSIL LC-18 (25 x 4,6, 5 m)) operando em modo isocrtico. A fase mvel
normalmente utilizada era gua-acetonitrila (2:1) em um fluxo de 0,8 mL/min;
- As determinaes espectrofotomtricas foram realizadas em um espectrofotmetro Hitachi U-2000;
- O isolamento e a purificao dos produtos de oxidao do 2-metilindol (reao em grande escala,
3 0 0 mL) foi realizado atravs de cromatografia rotatria preparativa de camada fina
(Chomatotron), usando-se uma camada de slica (Merck, cat. 1.07749) de 2 mm e acetato de etila
como eluente;
- Para seguir o curso das reaes quimiluminescentes foram utilizados dois aparelhos: (i) um
luminmetro adaptado para leitura em microplacas (EG&G Berthold LB96V microplate
Luminometer). Trata-se de um aparelho automatizado em que parmetros como temperatura,
tempo de medida e adies de reagentes so pr-estabelecidos. O volume final das solues
ensaiadas foi de 0,3 mL e o disparo das reaes foi feito pela adio das enzimas ou dos
substratos. (ii) um contador de ftons composto de um Amplificador-discriminator (EG&G Par
1 1 2 1 A) e uma fotomultiplicadora (Thorm EMI 9658AM) refrigerada a -12C por um refrigerador
(Thorn EMI FACT-50 MKIII thermoeletric cooler). Neste aparelho, o volume final das solues
ensaiadas foi de 3,0 mL e o disparo das reaes foi feito atravs de uma cnula e microsseringa.
Este aparelho tambm foi utilizado para obteno do espectro de quimiluminescncia da oxidao
do 2,3-dimetilindol (atravs de filtros de corte colocados em frente da fotomultiplicadora);
- Os espectros de quimiluminescncia (oxidao do 2-metilindol e 2,5-dimetilindol) foram obtidos em
um fluormetro SPEX-FLUOROLOG 1681 com fotomultiplicadora refrigerada;
- Os estudos envolvendo deteco e acompanhamento da cintica de consumo de oxignio foram
realizados com a utilizao de um sistema polarogrfico de monitorao de oxignio dissolvido
(Yellow Spring Instruments 5300);
- O preparo de tampes foi feito utilizando-se um pH-metro (Corning pH meter 430).



1 6 9
1 6 9
7 .3 - Metodologias Analticas _
Titulao do oznio- Aps pr-estabelecida a potncia e o fluxo de entrada de oxignio no
ozonizador, o oznio foi borbulhado em uma soluo de iodeto de potssio em cido actico
(10%)
(119)
. O iodo formado foi titulado com uma soluo padronizada de tiossulfato de sdio
0 ,1mol/L (esquema 7.1). O fluxo de oznio produzida foi de 2,3 x 10
- 3
mol/h.
O
3 + I
2
+ 2 H
+
I
-
+
O
2
H O
2
+ 2
I
2 + S O
2 3
- 2
2 I
-
+ S O
4 6
- 2
2
Esquema 7.1- Esquema de reao para titulao do oznio
_
Determinao da concentrao de perxido de hidrognio e atividade perxidica dos
composto sintetizados- A concentrao das solues de perxido de hidrognio foram
determinadas por meio da oxidao de iodeto a iodo, segundo tcnica descrita (esquema 7.2)
(127)
.
Em uma cubeta contendo soluo 0,05 mol/L de iodeto de potssio em tampo cido
actico/acetato (pH 3,8), foi adicionada peroxidase de raiz forte (5 L, concentrao final 10
- 8
mol/L) e uma alquota de 50 L de perxido de hidrognio (volume final 3 mL). A concentrao de
perxido foi encontrada a partir da medida da absorbncia medida em 353 nm e calculada tendo
como base o coeficiente de absortividade molar do iodo neste comprimento de onda (2,55 x10 M
4 - 1
cm ). A atividade peroxdica dos compostos sintetizados foi determinada qualitativamente apenas
- 1


1 7 0
1 7 0
borrifando uma soluo acidificada de iodeto de potssio nas placas de cromatografia de camada
fina, onde eram monitorados.
H O
2 2
+
2 I
-
H
+
I
2
H O
2 2
2 +
+
Esquema 7.2- Esquema de reao para determinao da concentrao de perxido de
hidrognio
_
Determinao espectrofotomtrica de fosfatase alcalina- A metodologia comercial utilizada
para determinao quantitativa de atividade de ALP est baseada na hidrlise do p-
nitrofenolfosfato a p-nitrofenol que absorve em 405 nm (esquema 7.3). Uma alquota de 50 L soro
foi adicionada em 3 mL de uma soluo contendo: tampo dietanolamina 1 mol/L, pH 9,8, MgCl
2
0 ,5 mmol/L, p-nitrofenolfosfato 10 mmol/L, 37C. A variao de absorbncia por minuto
multiplicado por um fator fornecido pelo fabricante do kit, que est relacionado a absortividade
molar do p-nitrofenol e as diluies, resulta na atividade de ALP em u/L;
OPO Na
3 2
NO
2
+ H O
2
ALP
pH 9,8
OH
NO
2
+
Na HPO
2 4
Esquema 7.3- Esquema de reao para medida colorimtrica de fosfatase alcalina (mtodo
comercial)
_
Determinao qualitativa de anticorpos IgG contra vrus Epstein-Barr em soro sangneo
humano- Como j esclarecido anteriormente, esta metodologia foi seguida at o passo de adio
do revelador colorimtrico (p-nitrofenolfosfato), que foi substitudo pelo substrato sdio-MPP e os
demais reagentes necessrio ao ensaio quimiluminescente em desenvolvimento. Trata se de um
kit do tipo ELISA (enzyme linked immunosorbed assay) que consta dos seguintes passos: diluio
(reagente diluidor) e incubao durante 20 minutos a 20-25C das amostras a serem ensaiadas
(soros e padres) em cubetas onde os antgenos de Epstein-Barr esto aderidos; lavagem por trs
vezes (tampo de lavagem); incubao com o conjugado ALP-IgG por 20 minutos; lavagem por
trs vezes e adio dos reagentes reveladores.


1 7 1
1 7 1
_
Ensaios com a enzima quimiotripsina- 20 L de uma soluo 1 mg/mL do substrato Pro-Phe-
Phe-MCA, dissolvido em DMSO/gua (1:1), foram incubados a 37C em 2 mL de soluo tampo
(Tris pH 8,0). Adicionou-se 5 L de uma soluo 0,01 mg/mL de quimiotripsina e foi medido a
variao de fluorescncia (
ex
= 360,
em
= 480).
_
Determinao do rendimento quntico de quimiluminescncia da oxidao do 2-metilindol-
Para medir o rendimento quntico de quimiluminescncia de uma reao necessrio calibrar a
fotomultiplicadora (do espectrofluormetro, neste trabalho) de modo que a unidade arbitrria
fornecida pelo aparelho (cps) possa ser transformada em Einstein (1 Einstein = 6,02 x 10
2 3
ftons).
Foi utilizado o padro de luminol que ao ser oxidado em pH 11,6, perxido de hidrognio em
excesso e hemina como catalisador, apresenta um rendimento quntico ( |) bem definido e
reprodutivo, igual a (1,14 0 ,06)x10 E/mol
- 2 (128)
. Assim, medindo a quantidade de luz (Q) emitida por
uma dada quantidade de luminol (n) ao ser oxidado, possvel calcular um fator (f) que
transformar a luz emitida (cps) em Einstein. O fator utilizado (5,045x 10
-1 7
E/cps) foi gentilmente
cedido pela aluna de mestrado Sandra M. da Silva. Para uma reao, volume final 3 mL e
utilizando as condies otimizadas (HRP = 0,1 mol/L. H O
2 2
= 5 mmol/L, tampo MAP = 50
mmol/L, pH 9,3, 37C e 2-metilindol = 1 mmol/L), mediu-se a quimiluminescncia durante 3 horas
no espectrofluormetro (tenso da fotomultiplicadora: 750 kV, fenda de 1 mm e grade de difrao
em posio espelho). Antes e aps a reao, alquotas de 30 L foram submetidas anlise
cromatogrfica (HPLC), assim foi possvel medir o consumo de substrato que foi de 55%. De posse
da intensidade total de luz (integrao do grfico intensidade de emisso versus tempo), do fator
de converso e do nmero de mols de 2-metilindol consumido, calculou-se o rendimento quntico
de quimiluminescncia utilizando a frmula:
| = (Q x f)/n
7 .4 - Preparo de Solues Estoque _
Enzimas- ALP, ACP, esterase, ALP-IgG e HRP-IgG eram diludas, a partir de suas solues
originais, no momento do uso em soluo fisiolgica (NaCl 0,9%);
_
Perxido de hidrognio- Uma soluo estoque 1 mol/L (analisada semanalmente) era
adequadamente diluda no momento do uso;
_
HRP- Uma soluo estoque (1 mL, 120 mol/L) em gua destilada era preparada no dia do uso ou
1 2 mol/L para os ensaios com 2-metilindol;


1 7 2
1 7 2
_
DBAS- A massa adequada era diluda em DMSO;
_
Substratos- A massa adequada de Sdio-MPP era diluda em gua destilada, imina e enamida
eram diludas em lcool etlico, derivados indlicos eram diludos em lcool etlico.
7 .5 - Preparaes
7 .5 .1 - 2 - cloro-2-metilpropanal
(91)
Em um balo de trs bocas com capacidade de 250 mL foram adaptados um funil de adio,
um termmetro e um condensador de refluxo. Na sada do condensador foi adaptado um sistema para
reteno do cido clordrico e o dixido de enxofre formados na reao. Este sistema constava de um
tubo de vidro e uma mangueira que levava os gases produzidos para um frasco de segurana e
posteriormente para um recipiente com gua onde eram borbulhados. Ao balo foram adicionados


1 7 3
1 7 3
3 6 ,06 g (0,5 mol) de 2-metilpropanal e, lentamente, sob agitao, 67,5 g (0,5 mol) de cloreto de
sulfurila. A temperatura deve ser mantida entre 25-40C devendo ser resfriado se necessrio (obs.
reao bastante exotrmica). Aps o trmino da adio, a reao foi aquecida em refluxo por duas
horas e ento agitada por mais quatro horas. O produto bruto foi submetido destilao simples e
destilao fracionada (84-86C) rendendo 2 6 ,09 g ( 0 ,245 mol) de 2 - cloro-2-metilpropanal.
Rendimento: 49%.
Dados analticos:
O H
Cl
RMN- H (
1
o ppm/CDCl )
3
(Espectro 1): 1,64 (s, 6 H); 9,43 (s, 1 H).
7 .5 .2 - Fosfato de dimetila e 2-metil-1-propenila
(92)
Em um balo de duas bocas com capacidade de 125 mL foram adaptados um funil de adio
e um condensador de refluxo munido de tubo secante. No balo foram adicionados 10,6 g (0,1 mol) de
2 - cloro-2-metilpropanal e 30 mL de benzeno. Ento, lentamente e sob refluxo foram adicionados 12,4
g (0,1 mol) de fosfito de metila. Aps a adio, o refluxo foi mantido por mais trs horas e ento o
solvente foi evaporado. O produto bruto foi submetido destilao (100-105C, 5 mmHg), rendendo
1 4 ,8 g (0,082 mol) de um lquido incolor identificado como fosfato de dimetila e 2-metil-1-propenila.
Rendimento: 82%.
Dados analticos:


1 7 4
1 7 4
O OCH
3
P
OCH
3
O
RMN- H (
1
o ppm/CDCl /TMS)
3
(Espectro 2): 1,61 (s, 3 H); 1,68 (s, 3 H); 3,80 (d, 6 H, J = 11 Hz, P-O-C-H); 6,23 (m, 1 H).
RMN- C (
1 3
o ppm/CDCl /TMS)
3
(Espectro 3): 15,07; 19,08; 54,55 (d, J = 6 Hz, C-O-P) ; 120,10 (d, J = 10 Hz, C-C-O-P);
1 2 9 ,90 (d, J = 6 Hz, C-O-P).
Espectrometria de massa (m/z)
Espectro 4: 180 (M , 28%); 165 (M - CH , 2%); 110 (HOP(OCH ) , 100%); 95 (HOP(OCH )
+ +
3 3 2 3 2
CH , 25%); 79 (HOP(OCH ) - OCH ,30%).
3 3 2 3
7 .5 .3 - Fosfato de bis(trimetilsilila) e 2-metil-1-propenila
(94)
Em um balo de duas bocas com capacidade de 50 mL foram adaptados um funil de adio,
um condensador de refluxo munido de borbulhador e linha de argnio. No balo foram adicionados 6,0
g (33,3 mmol) de fosfato de dimetila e 2-metil-1-propenila e, lentamente, sob agitao e temperatura
ambiente, 7,7 g (73,3 mmol) de cloreto de trimetilsilano. Aps a adio, iniciou-se um refluxo
mantendo a temperatura entre 60 - 80C. Aps 22 horas, a anlise por cromatografia gasosa revelou o
consumo de cerca de 50% do reagente de partida e a formao do produto monossililado (conforme
anlise por CG-MS). Ento, foi adicionado 1 g de iodeto de potssio previamente seco, mais 7,7 g
(73,3 mmol) de cloreto de trimetilsilila, mantendo-se o refluxo. A reao foi monitorada por CG
diariamente e, no fim de seis dias, foi constatado a converso total do reagente no produto desejado.
O solvente foi evaporado e o produto bruto, submetido destilao (138-141C/5 mmHg) rendendo
5 ,5 g (18,6 mmol) de um lquido incolor identificado como fosfato de bis(trimetilsilila) e 2-metil-1-
propenila. Rendimento: 56%.
Dados analticos:


1 7 5
1 7 5
O
P
O
OSi(CH )
3 3
OSi(CH )
3 3
RMN- H (
1
o ppm/CDCl /TMS)
3
(Espectro 5): 0,23 (s, 18 H); 1,52 (s, 3 H); 1,58 (s, 3 H); 6,15 (m, 1 H).
RMN- C (
1 3
o ppm/CDCl /TMS)
3
(Espectro 6): 0,39; 15,00; 18,94; 118,23 (d, J = 10 Hz, C-C-O-P); 130 (d, J = 5,0 Hz, C-O-P).
Espectrometria de massa (m/z)
Espectro 7: 296 (M , 10%); 281 (M
+ +
- CH ,18%); 211 (HOP(OSi(CH ) )
3 3 3 2
CH , 100%); 73
3
(Si(CH ) ,15%).
3 3
7 .5 .4 - Hidrogenofosfato de anilnio e 2-metil-1-propenila
(94)
Em um balo de duas bocas com capacidade de 50 mL foram adaptados um condensador de
refluxo e um funil de adio. Ao balo foi adicionada uma mistura de 0,74 g (8 mmol) de anilina, 6 mL
de etanol e 5 mL de ter etlico. Ento, lentamente e sob agitao, foram adicionados 2,37 g (8 mmol)
do derivado sililado, dissolvido em 5 mL de ter etlico. O precipitado formado foi filtrado, lavado com
ter e seco sobre pentxido de fsforo em um dessecador a vcuo. O slido branco obtido, 1,37 g (5,6
mmol), foi identificado como hidrogenofosfato de anilnio e 2-metil-1-propenila. Rendimento: 70%.
Dados analticos:
O
P
O
O
-
OH
NH
3
+
RMN- H (
1
o ppm/ DMSO-d /TMS)
6
(Espectro 8): 1,52 (s, 3 H); 1,54 (s, 3 H); 4,42 (s, largo); 6,15 (m, 1 H); 6,65 (m, 3 H, H ); 7,06
a r
(m, 2 H, H ).
a r


1 7 6
1 7 6
7 .5 .5 - Fosfato dissdico de 2-metil-1-propenila
(95)
Em um balo de duas bocas com capacidade de 50 mL foram adaptados um
condensador de refluxo e um funil de adio. Ao balo foram adicionados 2,0 g (6,75 mmol) do fosfato
de bis(trimetilsilila) e 2-metil-1-propenila dissolvidos em 30 mL de ter etlico seco. Ento, lentamente
e sob agitao foram adicionados 4,9 mL de uma soluo de etxido de sdio (14,2 mmol) dissolvida
em 10 mL de ter seco (preparada e titulada previamente). O precipitado formado foi filtrado, lavado
com ter etlico e seco sobre pentxido de fsforo em um dessecador a vcuo. O slido obtido, 1,02 g
(5,2 mmol), foi identificado como fosfato dissdico de 2-metil-1-propenila. Rendimento: 77%.
Preparao e titulao da soluo de etxido de sdio:
Em um balo totalmente seco e sob atmosfera de argnio foi pesado
aproximadamente 0,65 g (28,2 mmol) de sdio metlico. Neste balo foram adicionados 10 mL de
etanol seco e colocado sob refluxo. Aps 3 horas, todo o sdio foi consumido. Um mililitro da soluo
resultante foi submetido evaporao, redissolvido em 20 mL de gua destilada e titulada contra uma
soluo de cido clordrico 0,1 mol/L e fenolftalena como indicador. O resultado indicou que a
soluo original continha 29 mmols de etxido de sdio.
Dados analticos:
O
P
O
O
-
O
-
2 Na
+
RMN- H (
1
o ppm/ D O/TMS)
2
(Espectro 9): 1,58 (s, 3 H); 1,61 (s, 3 H); 4,81 (sinal de HDO);. 6,20 (m, 1 H).
RMN- C (
1 3
o ppm/ D O/TMS)
2


1 7 7
1 7 7
(Espectro 10): 14,73; 18,99; 115,66 (d, J = 9,0 Hz, C-C-O-P); 132,64 (d, J = 5,0 Hz, C-O-P).
Micro-anlise: Calculado C = 20,71, H = 3.02, encontrado C = 21,09, H = 3,42.
7 .5 .6 - N-(2-metilpropilideno)etilamina
(97)
Em um balo de duas bocas com 125 mL de capacidade foram adaptados um agitador
mecnico, um funil de adio e um condensador de refluxo munido de tubo secante. Ao balo foram
adicionados 26,2 mL (0,4 mol) de etilamina. Ento, mantendo a temperatura a 0 C e sob agitao
foram adicionados 36,3 mL (0,4 mol) de 2-metilpropanal durante 2 horas. Aps a adio, esperou-se
1 5 minutos e ento foram adicionados 10 g de hidrxido de sdio em lentilhas. Aps cerca de 10
minutos sob agitao apareceram duas fases. Aps a separao das fases, foram adicionados 5 g de
hidrxido de potssio em p na fase orgnica e deixado em repouso por 2 dias. O lquido amarelado
resultante foi filtrado e submetido a destilao (77 C). O lquido incolor obtido, 19,4 g (0,196 mol), foi
identificado como N-(2-metilpropilideno)etilamina. Rendimento: 48%.
Dados analticos:
N
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 11): 1,06 (d, 6 H, J = 6,5 Hz ); 1,17 (t, 3 H, J = 7,5 Hz); 2,40 (m, 1 H); 3,38 (q, 2 H, J
= 7,5 Hz); 7,52 (m, 1 H).
7 .5 .7 - N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida
(98)
Em um balo de duas bocas com 125 mL de capacidade foram adaptados um agitador
mecnico, um funil de adio e um condensador de refluxo munido de tubo secante. Ao balo foram


1 7 8
1 7 8
adicionados 25 mL de benzeno, 8,3 mL (70,7 mmol) de cloreto de benzola e 11,2 mL (80,4 mmol) de
trietilamina. Ento, lentamente, sob agitao e temperatura controlada (7 a 15 C), foram adicionados
7 ,0 g (70,7 mmol) de N-(2-metilpropilideno)etilamina dissolvidas em 12 mL de benzeno. Aps a adio
ter sido completada, a mistura foi refluxada por 1 hora, resfriada e filtrada. O filtrado foi submetido
evaporao, filtrado novamente e destilado (170 - 174C, 3 mmHg). O lquido incolor obtido, 7,32 g
(36,1 mmols), foi identificado como N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida. Rendimento: 51%.
Dados analticos:
N
O
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 12): 1,13 (t, 3 H); 1,29 (s, 3 H); 1,50 (s, 3 H); 3,60 (q, 2 H); 5,80 (s, 1 H); 7,27-7,49
(m, 5 H, H ).
a r
Espectrometria de massa (m/z)
(Espectro 13): 203 (M , 8%); 188 (M - CH , 19%); 105 (C H CO, 100%); 77 (C H , 30%).
+ +
3 6 5 6 5
7 .5 .8 - 5 - metil-3-hexen-2-ona
(121)
Em um balo de 3 bocas com 500 mL de capacidade foram adaptados um agitador mecnico,
um funil de adio e um condensador de refluxo. Ao balo foram adicionados 104 mL (1,41 mol) de
acetona e 250 mL de uma soluo de hidrxido de sdio 10 %. Ento, lentamente e sob agitao,
foram adicionados 100 g (1,39 mol) de isobutanal. A agitao foi mantida por mais 48 horas e ento
as fases foram separadas. A fase aquosa foi extrada com diclorometano (duas pores de 50 mL) e
os extratos orgnicos foram combinados e secos com sulfato de sdio. O solvente foi evaporado e o
produto bruto submetido destilao (65-70 C/ 30 mmHg). O lquido incolor obtido, 32,6 g (0,29
mols), foi identificado como 5-metil-3-hexen-2-ona. Rendimento: 21%.
Dados analticos:


1 7 9
1 7 9
O
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 14): 1,08 (d, 6 H, J = 6,5 Hz); 2,25 (s, 3 H); 2,46 (m, 1 H); 6,08 (d, 1 H, J = 17 Hz);
6 ,78 (dd, 1 H, J =17 Hz e J = 6,5 Hz ).
7 .5 .9 - 5 - hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
(122)
Em um balo de 3 bocas com 125 mL de capacidade foram adaptados um agitador mecnico,
um condensador de refluxo e uma cnula, pela qual o oxignio foi borbulhado no meio de reao. No
balo foram adicionados 30 g (0,27 mol) de 5-metil-3-hexen-2-ona e 100 mg de perxido de benzola.
Na mistura, agitada vigorosamente e sob temperatura controlada (60C), foi borbulhado oxignio
durante trs dias. A mistura foi ento submetida destilao (60 C/ 3 mmHg) rendendo 16 g (0,11
mol). O lquido oleoso resultante foi identificado como 5 - hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona.
Rendimento: 41 %.
Dados analticos:
O
OOH
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3


1 8 0
1 8 0
(Espectro 15): 1,41 (s, 6 H); 2,30 (s, 3 H);. 6,22 (d, 1 H, J =16,5 Hz); 6,88 (d, 1 H, J = 16,5 Hz);
8 ,50 (-OOH).
7 .5 .1 0 - 5 - acetilperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
(123)
Em um balo de 3 bocas com 50 mL de capacidade foram adaptados um agitador magntico,
uma cuba de refrigerao e um condensador de refluxo adaptado linha de argnio. No balo foram
adicionados 0,8 mL (10 mmol) de piridina, 20 mL de diclorometano e 1,44 g (10 mmol) de 5-
hidroperxi-5-metil-3-hexen-2-ona. A temperatura deve ser mantida em 0 C. A seguir, adicionou-se
0 ,73 mL (10 mmol) de cloreto de acetila. A mistura de reao foi agitada por 30 minutos, sendo a
seguir vertida em 40 mL de uma soluo saturada e fria de bicarbonato de sdio. As fases foram
separadas e a fase aquosa foi extrada com hexano. Os extratos orgnicos foram combinados e secos
com sulfato de sdio. O solvente foi evaporado e o resduo submetido purificao por cromatografia
em coluna refrigerada a 10C (slica gel e diclorometano/hexano 1:10 como eluente) rendendo 0,47 g
(2,5 mmol). O lquido oleoso obtido foi identificado como 5-peracetxi-5-metil-3-hexen-2-ona.
Rendimento: 25%.
Dados analticos:
O
OO
O


1 8 1
1 8 1
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 16): 1,14 (s, 6 H); 2,02 (s, 3 H); 2,30 (s, 3 H); 6,16 (d, 1 H, J = 17 Hz); 6,78 (d, 1 H, J
= 17 Hz).
7 .5 .1 1 - Ozonlise do 5-acetilperxi-5-metil-3-hexen-2-ona
O oznio produzido pelo ozonizador foi inicialmente titulado como descrito anteriormente.
No frasco de reao do ozonizador foram adicionados 0,186 g (1 mmol) de 5-acetilperxi-5-
metil-3-hexen-2-ona, 0,128 g (1 mmol) de tetracianoetileno e 5 mL de acetato de etila. A mistura de
reao foi refrigerada a -78C e oznio foi borbulhado por 3 horas. Aps o trmino da reao, o
excesso de oznio foi removido com uma corrente de nitrognio e em seguida permitiu-se que a
temperatura se elevasse at ambiente. O produto bruto foi evaporado e submetido anlise antes e
aps purificao por destilao presso reduzida. Os espectros de RMN revelaram a decomposio
do produto (espectro 17, ver item 6.2).
7 .5 .1 2 - Iodeto de trimetilsulfoxnio
(125)
Em um balo de 250 mL adaptado com condensador de refluxo foram adicionados 44 mL
(0,62 mol) de dimetilsulfxido e 90 mL (1,44 mol) de iodeto de metila. A mistura foi refluxada por 56
horas. O slido formado foi filtrado vcuo e lavado com clorofrmio. O slido foi submetido
recristalizao, usando gua como solvente, resultando em cristais amarelados que foram secos sobre
pentxido de fsforo em um dessecador vcuo. O rendimento foi de 95,5 g (0,44 mol). Os cristais
foram identificados como iodeto de trimetilsulfoxnio. Rendimento: 70%.
Dados analticos:


1 8 2
1 8 2
S
O
CH
3
H C
2
CH
3
I
-
Microanlise: Calculado: C = 16,37%, H = 4,11%, S = 14,57%, I = 57,66%. Encontrado C =
1 6 ,14%, H = 3,81%, S = 14,20%, I = 46,90%.
7 .5 .1 3 - Preparao do xido de 2-metilenoadamantano
(125)
Em um balo de 3 bocas com 50 mL de capacidade foram adaptados um agitador magntico,
um condensador de refluxo adaptado a uma linha de argnio e um funil de adio. Ao balo foram
adicionados 1,4 g (35 mmol) de uma suspenso de hidreto de sdio em leo mineral (60%). Esta
suspenso foi lavada com 3 pores (20 mL) de pentano. O pentano remanescente foi evaporado pela
passagem de argnio. A seguir, foram adicionados 55 mL de dimetilsulfxido seco e, lentamente (5
minutos), 7,5 g (34 mmol) de iodeto de trimetilsulfoxnio. Quinze minutos aps cessar a liberao de
hidrognio, o balo foi resfriado (reao exotrmica) e 4 g (26,6 mmol) de adamantanona, foi
adicionada por um perodo de 5 minutos. A mistura de reao foi agitada por 1 hora temperatura
ambiente e ento por mais 1,5 horas a 55 C. Verteu-se a mistura de reao sobre 150 mL de gua
gelada, o precipitado formado foi dissolvido em hexano e as fases, separadas. A fase aquosa foi
extrada com hexano e os extratos orgnicos foram combinados e secos com sulfato de sdio. A
evaporao do solvente resultou em 2,22 g (13,6 mmol) de um slido com 96% de pureza (por CG)
que foi identificado como xido de 2-metilenoadamantano. Rendimento: 52%.
Dados analticos:
O
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 18): 1,39-2,06 (m, 14 H); 2,64 (s, 2 H).
Microanlise: Calculado C = 80,44 %, H = 10,15%. Encontrado C = 80,22%, H = 9,89%.
Espectrometria de massa (m/z)
(Espectro 19): 164 (M , 65%); 135 (M - HCO; 100%).
+ +


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1 8 3
7 .5 .1 4 - Adamantano-2-carboxialdedo
(125)
Em um funil de separao com 50 mL de capacidade foram adicionados 12 mL de benzeno
seco e 1g (6,1 mmol) de xido de metilenoadamantano. Em seguida adicionou-se 0,45 mL (3,8 mmol)
de trifluoreto de boro e a mistura foi agitada vigorosamente. Aps agitao, a mistura foi deixada em
repouso por dois minutos e ento extrada com gua gelada. A fase aquosa foi extrada com benzeno
e os extratos orgnicos foram combinados e secos com sulfato de sdio. Aps filtrao, manteve-se o
aldedo em soluo de benzeno at o momento de uso. A converso foi de 95% (por CG). O produto
foi identificado como adamantano-2-carboxialdedo.
Dados analticos:
O
H
Espectrometria de massa (m/z)
(Espectro 20): 164 (M, 65%); 135 (M - HCO; 100).
7 .5 .1 5 - Acetato de 2-metiladamantilideno
(124)
Em um balo de 3 bocas com 50 mL de capacidade foram adaptados um agitador magntico,
um condensador de refluxo adaptado a uma linha de argnio e um funil de adio. Ao balo foram
adicionados 0,86 g (75 mmol) de uma suspenso de hidreto de potssio em leo mineral (35%). Esta
suspenso foi lavada com 3 pores (15 mL) de pentano. O pentano remanescente foi evaporado pela


1 8 4
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passagem de argnio. Em seguida, lentamente e sob agitao, foi adicionada uma soluo de 0,82 g
(5 mmol) de adamantano-2-carboxialdedo dissolvidos em 20 mL de DME seco. A suspenso
resultante foi agitada por mais 10 minutos e a seguir vertida, lentamente e sob agitao, em outro
balo contendo 3,5 mL, 3,78 g (37,1 mmol) de anidrido actico. Aps a adio, a mistura foi agitada
por mais 10 minutos e ,em seguida, foram adicionados 25 mL de hexano, 25 mL de gua e,
cuidadosamente, bicarbonato de sdio slido o suficiente para formar uma soluo saturada. Aps 15
minutos de agitao as fases foram separadas e a fase aquosa, extrada com 3 pores de 10 mL de
hexano. Os extratos orgnicos foram combinados e o resultante, seco com sulfato de magnsio. O
solvente foi evaporado e o produto bruto submetido destilao bulbo-a-bulbo (197-201 C/ 5 mmHg).
O lquido oleoso resultante, 0,34 g (1,65 mmol), foi identificado como acetato de 2 -
metiladamantilideno. Rendimento: 33%.
Dados analticos:
H
O
O
RMN- H (
1
o ppm/ CDCl /TMS)
3
(Espectro 21): 1,73-1,97 (m, 12 H); 2,12 (s, 3 H); 2,37 (s, 1 H); 3,01 (s, 1 H); 6,88 (s, 1 H).
Espectrometria de massa (m/z)
Espectro 22: 206 (M , 10%); 164 (M - H C=C=O, 100%); 135 ( M - H C=C=O HCO, 8%).
+ +
2
+
2
7 .5 .1 6 - 2 - acetilperoxiadamantano-2-carboxialdedo
(124)
Em um tubo tipo dedo frio foi adaptado um tubo de ressonncia. No tubo foram adicionados
5 6 mg (0,28 mmol) de acetato de 2-metiladamantilideno e 0,50 mL de uma soluo saturada de azul
de metileno em acetona deuterada. A soluo resultante foi foto-oxigenada a -10 C por 4 horas,
empregando-se uma lmpada de tungstnio de 80 W e borbulhando oxignio atravs de uma cnula
de plstico. A soluo resultante foi submetida a cromatografia de coluna a -35 C (slica gel e uma
soluo de acetato de etila 5% em hexano como eluente). Pode-se notar pela inspeo dos espectros
2 1 e 23 que a converso do acetato de 2-metiladamantilideno ao aldedo foi quase completa
(desaparecimento do prton olefnico em 6,88 ppm e aparecimento do prton aldedico em 9,46 ppm).
Por outro lado, a falta de correlao na integrao dos sinais mostrou que este produto foi
parcialmente decomposto (espectro 23).


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O O
O
O
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