Bloqueio de CD4 pode induzir proteo de anafilaxia por amendoim.

Anticorpos monoclonais tm se mostrado eficazes em induzir tolerncia imunologica em uma srie de modelos animais de autoimunidade, alergia e transplantes. Ns investigamos se o bloqueio de CD4, efetivo em induzir tolerncia em transplantes, previne respostas imunes sistemicas que levam a anafilaxia. Ns achamos que o tratamento com Ac monoclonal anti-CD4 pode prevenir anafilaxia induzida por amendoim seguindo subsequentes exposies sistmicas ao extrato de amendoim. Alem disso, o efeito do bloqueio de CD4 no interfere na competencia imunolgica geral, j que camundongos tratados com antiCD4permaneceram competente em responder a antigenos no relacionados. A proteo contra anafilaxia foi correlacionada com o aumento da frequencia de clulas T reguladoras Foxp3+, e foi anulado a depleo de Treg. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que ativao de cel T pelo extrato de amendoim na presena do bloquei de CD4 leva a expanso de clulas T reguladoras que pode prevenir anafilaxia induzida por amendoim. INTRODUO A anafilaxia uma doena aguda, com risco de vida, reaco alrgica, onde um processo fisiolgico , normalmente, atua de forma local e limitada a proteger contra a infeco que ocorre macia e sistemicamente. Alergia a amendoim uma das principais causas de anafilaxia induzida por alimentos, afetando cerca de 1% da populao, com prevalncia crescente em todo o mundo. At o momento no h cura para a alergia ao amendoim, e ao contrrio de muitas outras alergias a alimentos, ela persiste at a idade adulta. Atualmente, a preveno o nico tratamento recomendado. No h, portanto, uma clara necessidade de segura e eficaz terapias de induo de tolerncia para pacientes que podem estar expostos a reao anafiltica. Anticorpos monoclonais (mAb) que a que reconhecem co-receptores e molculas co-estimulatrias das clulas T tem sido relatadoscomo eficazes na induo de tolerncia antgenos no-prprios. Waldmann e colegas de trabalho tm mostrado que anticorpos anti-CD4 (com um isotipo que no destroem diretamente as clulas-alvo) pode induzir a longo prazo a tolerncia de transplante em camundongos. O estado de tolerncia resultante mediada pelo Foxp3 + das clulas T reguladoras, embora outros mecanismos podem tambm operar. Foi relatado que um no-esgotamento de mAb anti-CD4 foi eficaz na preveno de doenasdas vias areas alrgicas em ratos sensibilizados com ovalbumina. Temos recentemente estendido esses dados, mostrando que a tolerncia pode ser induzida em ratos para um aeroalrgeno clinicamente relevante - caros. Neste caso, os ratos tolerantes foram protegidos contra a hiper-reatividade das vias areas, eosinofilia, hiperplasia de clulas caliciformes e produo de IgG1 e IgE antgeno-especficos. Estes dados contrastam com os resultados decepcionantes de um ensaio clnico com umesgotamento mAb anti-CD4. Neste ensaio, a natureza esgotada do mAb impediu o uso de uma dose suficiente para alcanar efetivo bloqueio de CD4, j que levou supresso imunolgica. Surpreendentemente, o mesmo no esgotando-mAb anti-CD4 temos utilizado com sucesso para induzir a tolerncia ao HDM (ou OVA) foi relatada a ser menos eficazquando a tolerncia foi induzido a fator VIII sistemicamente entregues humanos nomodelo do rato de hemofilia. Portanto, decidimos explorar em que medida CD4bloqueio capaz de impedir uma resposta alrgica sistmica: anafilaxia. Aproveitamos um modelo bem estabelecido de amendoim anafilaxia induzida, onde o antgeno extrato bruto de amendoim (CPE) entregue atravs de injeo, permitindo o controle preciso da dose e tempo de exposio. Camundongos C3H/HeJ tm alta suscetibilidade ao amendoim anafilaxia induzida, comece capaz de produzir amendoim especficas altos ttulos de anticorpos. Alm disso, aodesafio atravs da i.p. rota, esses ratos desenvolvem manifestaes de choque anafiltico, incluindo uma queda acentuada da temperatura corporal, o que facilita a quantificao das manifestaes clnicas, e assemelhamse reaes anafiltica sem seres humanos. Confirmamos que camundongos C3H/HeJ podem ser sensibilizados com CPE, produzindo altos nveis de anticorpos CPE especficos Th2 dirigidos. Encontramos que o bloqueio de CD4, durante a sensibilizao, impediu a gerao de imunoglobulinas especficas de amendoim, mesmo aps a sensibilizao subseqente com CPE-alum, protegendo os camundongos da anafilaxia. O efeito protetor anulado aps a diminuio/esgotamento de clulas Treg. Importante, o bloqueio de CD4 no leva imunodeficincia, uma vez que os ratos continuam capazes de responder a diferentes antgenos.

Materiais e mtodos Animais experimentais Camundongos C3H/HeJ foram criados e mantidos em condies livres de patgenos especficos. Animais foram combinados por sexo e usados em 6-10 semanas de idade. Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pela Direo Geral Veterinria (aprovao 018.831). A sensibilizao foi conseguida pela administrao de 0,5 mg CPE em 2 mg de hidrxido de alumnio (alum, Alu-gel-S, Serva, Heidelberg, Alemanha) ip nos dias 1, 7 e 21. Os camundongos foram posteriormente desafiados com 10 mg CPE no ip PBS. Avaliao Clnica da anafilaxia Os ratos foram avaliados durante 45 minutos aps o desafio com CPE. A temperatura corporal foi medida nos horrios indicados com uma sonda trmica retal. A classificao clnica foi feita de acordo com outros autores (LI et al., 2000): 0 nenhuma manifestao; 1 coceira ao redor do nariz e na cabea; 2 inchao ao redor da boca e olhos, reduo da atividade, diarreia e arrepios ( ereo dos pelos). 3 chiado, respirao forada, cianose ao redor da boca e na cauda. 4 nenhuma atividade aps estmulos, ou tremor e convulses. 5 morte. A classificao foi feita a cega por dois pesquisadores independentes.

Preparao de CPE A farinha de amendoim foi desengordurada extensamente com ter dietlico, e a essa j seca foi extrada em gelo com PBS 10X de um dia para o outro a 4C, centrifugada a 30.000g por 60 minutos, e o filtrado foi esterilizados. A concentrao de protenas foi medida por mtodo de BCA e alquotas foram armazenadas a -20C. Anticorpos monoclonais A no depresso de anti-CD4 (YTS177), o isotipo controle (YKIX302), e anti-CD25 (PC61). Anticorpos monoclonais foram produzidos no nosso laboratrio usando frascos de Integra CL1000 (IBS, Chur, Switzerland), purificado com um precipitado de 50% de sulfato de amnio, dialisado contra PBS, e a pureza foi verificada por nativos e atravs do gel de eletroforese de SDS. Os hibridomas foram generosamente fornecidos pelo Professor Herman Waldmann (Oxford, UK). Culturas in vitro Esplencitos (1 X 10 elevado a 6) foram cultivadas por trs dias em 96 placas, com cultura mdia completa (RPMI 1640 com Glutamax, suplementado com 10% FBS, 1% hepes, 1% pinicilina/streptomicina, 1% sodio piruvato, 0,1% B-mercaptoethanol; invitrogen ), com adio de 20 g OVA ou CPE. No terceiro dia, as clulas foram centrifugadas e os sobrenadantes foram recuperados e mantidos a -80 C at a quantificao de citocina. ELISA O soro IgE e CPE, ou OVA-especifico IgG1 foram medidos em placas de microtitulao revestidas com 50 g/ml de CPE ou OVA. IgE foi quantificado com um kit Opteia (BD PharMingen) e IgG1 com um kit do Southern Biotech. A quantificao de citocinas em clulas sobrenadantes na cultura foi realizada utilizando kits IL - 10 e IL - 13 (Peprotech, London,UK), e IL - 5 Opteia kits (BD PharMingen). Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instrues do fabricante. Citometria de fluxo Algumas clulas suspensas foram analisadas com o procedimento fluorocromo marcado mAb: CD3 Percp-Cy5.5 (1452C11), CD4 PE (GK1.5), CD8 APC-Cy7 (53-6.7), CD25 Pe-Cy7 (PC61.5), e Foxp3 (FJK165; eBiosciences). As amostras foram executados em um FACS Canto (citmetro de fluxo) e analisadas com o programa FlowJo. Analises estatsticas A significncia estatstica foi determinada usando o teste U de Mann-Whitney bicaudal no-paramtrico e valores de P < 0.05 foram considerados significativos Resultados CPE induzido por uma resposta anafiltica em camundongos C3H/HEJ sensibilizados Camundongos C3H/HeJ tem sido amplamente utilizados como modelo experimental de doenas alrgicas, que tem maior propenso para o desenvolvimento de respostas imunes como Th2, ou seja, anafilaxia induzida por amendoim. Descobrimos que, sob sensibilizao com CPE-alum, uma resposta anafiltica foi observada aps o desafio com CPE administrada. Camundongos fmeas apareceram para mostrar maior gravidade da doena, no entanto, tanto machos como fmeas desenvolveram manifestaes clnicas de anafilaxia, atingindo um estado onde no respondem a estmulos externos. Alm disso, estes camundongos apresentaram uma queda acentuada da temperatura corporal, durante os primeiros 45 minutos aps o desafio com o CPE. Concentrao srica de imunoglobulinas Th2-dirigidas, como IgE e IgG1 CPE-especificas, foi significativamente aumentada em camundongos CPE-sensibilizados, em comparao com controles no-expostos. Estes dados so semelhantes aos relatrios anteriores, apoiando o uso de camundongos C3H/HeJ como um modelo adequado para o estudo da anafilaxia. No-esgotamento de anticorpos monoclonais anti-CD4 previne anafilaxia CPE-induzida Ns temos mostrado recentemente que o no-esgotamento de anticorpos monoclonais anti-CD4 pode prevenir doenas alrgicas das vias areas em camundongos de uma forma antgeno-especifica. Para avaliar se este anticorpo monoclonal foi igualmente eficiente na preveno de uma resposta sistmica Th2-dirigida, ns investigamos se o tratamento anti-CD4 poderia causar anafilaxia em camundongos C3H/HeJ. Ns encontramos que o tratamento anti-CD4, no tempo de sensibilizao, era efetivo na preveno no desenvolvimento de manifestaes anafilticas observadas durante 45 minutos seguindo o desafio com CPE. Camundongos tratados com anti-CD4 tambm mantiveram suas temperaturas corporais, ao contrrio dos animais de controle, onde a temperatura corporal caiu rapidamente. A produo de IgE e IgG1 CPE-especfica tambm foi prejudicada em camundongos tratados com anti-CD4. Anti-CD4 nao preveniu a anafilaxia em camundongos pr-sensibilizados com alto indice de IgE A seguir avaliou-se o impacto do tratamento com anti-CD4 em ratos.Nota-se que a exposio para CPE nos dias 3658.Provavelmente devido ao uso de sulfato de Aluminio ( nao achei traduo de alum,no entanto conclui q possa ser sulfato de

aluminio),induziu-se manifestaes clinicas moderadas da doena,mesmo na ausencia de anti-CD4. (Nao mostrada)Alem disso,o que desrespeito a manifestaes clinicas moderadas sobre anafilaxia,todos desenvolveram esta reao quando exposto ao CPE sem sulfato de aluminio no dia 73. Ns achamos que os ratos sensibilizaram com antecedencia com o CPE,e com o tratamento anti-CD4,ou seja nenhum protegeu o desenvolvimento de manifestaes clinicas de reduo de anfilaxia isto da temperatura do corpo(Figura 3B,C).Ratos tratados com anti CD4 tinham niveis de IgE total e CPE IgG1 similarmente especifico para controles de CPE-sensibilizados.Estes resultados sugerem que em individuos pr-sensibilizados por IgE,a produo existente na hora da sensibilizao tera manifestaes clinicas de anafilaxia em uma cel T de maneira independente. No depletores Anti-CD4 Proteo Anticorpo Monoclonal Induzida da exposio subsequente a CPE No depletores anti-CD4 mAB foram usados para induzir a longo prazo de tolerncia em transplantes (Waldmann e Cobbold, 2001).Encontramos tambm que proteo a longo prazo para HDM pode ser induzida com este mAb em camundongos. Portanto, avaliamos se o tratamento com no-depletores anti-CD4 no momento da sensibilizao CPE poderia proteger ratos de anafilaxia a amendoim induzida aps uma sensibilizao subseqente. Como conseqncia, duas semanas aps o tratamento, os ratos foram re-sensibilizada com alum-CPE como mostrado na Figura 4A. A duas semanas so suficientes para permitir a depurao do mAb abaixo dos nveis teraputicos, como ns encontramos ao tratar ratos com anti-CD4 com 2 semanas de antecedncia de fornecer o antgeno (em experincias anteriores usando como antgeno OVA, os dados no mostrados). (Manifestaes de anafilaxia foram evidentes aps o desafio na CPE-sensibilizadas ratos)*, enquanto que camundongos tratados com anti-CD4 foram protegidos de manifestaes clnicas graves (Figura 4B). Alm disso, ttulos sricos de IgE e IgG1especficas CPE mantiveram-se baixos nos ratos tratados com anti-CD4 (Figura 4C). Injeo de alum sozinho (na ausncia deantgeno e anti-CD4) no impediu resposta subseqente provocou sensibilizao seguinte (no mostrado). Ns comparamos a produo de citocinas tipo th2 por celulas T com ratos tratados com anti CD4. Ns fizemos cultura de celulas T do bao por trs dias na presena de CPE estimulao, e quantificamos as citocinas sobrenadantes na cultura. Clulas T de rados tratados com CD4 mAB, ao contratios das celulas do bao no produziram niveis detectaveis de Il-5 e IL13.Diversas reportagens tem relatado a Il-10 na proteo de alergias. Contudo, produo de Il-10 in vitro com estimulao com CPE foi tambm reduzido em celulas de camundongos tratados com anti cd4. Na verdade, a produo de IL-10 foi maior em celulas de animais sensibilizadas com CPE na ausencia do tratamento com anti Cd4. Muitos estudos com transplantes tem mostrando que o termo de tolerancia induzida com bloqueio de Cd4 est associado com a expressao Foxp3 Treg. Ns descobrimos que embora as anti CD4 mAB tem um isotipo nao- ausente/ excluido, e nao lisa diretamente as celulas T cd4, o numero absoluto de celulas T cd4 no bao tratado com anti cd4 foi menor que os controles( ratos). Entretando, a frequencia do Foxp3 treg celulas com populao de celulas T era reduzido significativamente em ratos tratados com anti cd4. Para confirmar ainda mais a participao de clulas Treg na proteo induzida seguindo o tratamento anti-CD4, ns avaliamos a eficcia do bloqueio CD4 em camundongos CD25-deficientes. Ns descobrimos que camundongos deficientes de clulas T CD25, no momento do bloqueio-CD4, no estavam protegidos da anafilaxia induzida por amendoim, aps imunizao subsequente com CPE-ahum, como descrito na Figura 4A. Na verdade, os camundongos CD25-deficientes apresentaram nveis elevados de IgE total, semelhante ao que foi observado em camundongos no tratados com anti-CD4 (Figura 4F). Estes dados sugerem que clulas Treg Fox3 + participam de proteo contra anafilaxia induzida por amendoim seguida do bloqueio-CD4. Alm disso, comparamos o efeito da deficincia de CD25 quando aplicada antes ou depois da induo de tolerncia com anti-CD4. Ns descobrimos que o tratamento com anti-CD25 com a induo de tolerncia j avanada no foi to eficaz em anular tal induo como quando a deficincia de CD25 foi realizada aps o tratamento anti-CD4 (Figura4G). Estes dados sugerem a participao de clulas Treg adaptativas, ativadas no momento do tratamento anti-CD4, na induo de tolerncia. Tratamento anti-CD4 induziu proteo antgeno- especfico. Finalmente avaliamos se o tratamento anti-CD4 estava afetando a imunocompetncia global, ao estudar a capacidade dos camundongos tratados com mAb para responder a diferentes antgenos. Portanto, aps o tratamento de ratos C3H/HeJ com CPE na presena de anti-CD4, alguns ratos foram re-sensibilizados com o mesmo (CPE) ou com um antgeno (OVA) diferente (Figura 5 A). Camundongos tratados com anti-CD4 permaneceram plenamente competentes para responder a sensibilizao com OVA-olum, desenvolvendo uma responta imune Th2, levando a produo de elevados ttulos de IgE (Figura 5-b). Na verdade, os nveis de IgE eram comparveis aos que foram observados em camundongos sensibilizados no controle com CPE. Por outro lado, quando tratamos camundongos com anti-cd4, juntamente com OVA, evitamos a produo de IGe seguindo a sensibilizao subsequente com OVA. Em conjunto, todos estes dados mostraram que o tratamento com anti-cd4 induz insensibilidade aos antigenos administrados no mesmo momento do bloqueio de cd4, sem evitar subsequentes respostas imunes a antigenos diferentes. Portanto, camundongos tratados com anti cd4 permanecem imuno competentes. Discussao Nossos dados mostram que o bloqueio de CD4 efetivo na induode antigenos especficos tolerantes ao CPE, evitando assim a sensibilizao subsequente com os mesmos antgenos. Esta concusao contrata com a aparente dificuldade para induzir tolerancia

em camundongos para fatores viii e ix usando o mesmo mAb.Estamos investigando os mecanismos que podem explicar a razao para que proteinas distintas so toleradas com capacidade diferente. Anti-CD4 um anticorpo monoclonal non-depleting que tem sido extensivamente estudada em vrios modelos animais de patologia imune. No transplante e artrite auto-imune, non-depleting anti-CD4 eficaz na preveno da rejeio do transplante e induzindo, a longo prazo, tolerncia em ratos. Experimentos com ratos TCR- transgnicos tm mostrado que o estado tolerante mantido por clulas Treg Foxp3 + que podem ser induzidas a partir de precursores Foxp3-. Como clulas T podem manter ativamente a tolerncia, atravs do recrutamento de clulas no-tolerantes no reservatrio de regulamentao, o fenmeno denominado tolerncia infecciosa. De fato, os ratos transplantados sob a capa de non-depleting mAb anti-CD4, no se tornam tolerantes (eles rejeitam o transplante) quando tratados com anti-CD25. Ns seguimos a mesma abordagem para mostrar que camundongos tratados com anti-CD25 permaneceram competentes para produzir CPE-anticorpos especficos, sugerindo um mecanismo de ao semelhante. No podemos excluir que parte do efeito de bloqueio CD4 devido ativao de morte celular induzida de clulas T especficas para o antgeno presente no momento da induo de tolerncia - um mecanismo bem descrito na tolerncia a transplante, induzida por bloqueio de co-estimulao. Em qualquer caso, as clulas Treg parecem desempenhar o papel-chave em nossos experimentos, algo sugerido no s pela experincia Treg'depletion, mas tambm pelo aumento significativo na freqncia de clulas T Foxp3 + em camundongos tratados com anti-CD4. Alm disso, descobrimos que a depleo Treg antes do tratamento anti-CD4 no teve um impacto importante na induo de tolerncia. Pelo contrrio, o esgotamento CD25 aps tratamento anti-CD4 revogou induo de tolerncia. Embora estes dados no sejam conclusivos, pois no podemos seguir o destino de clulas antgeno-especficas, eles sugerem que as clulas Treg induzidas so, provavelmente, os participantes-chave na induo de tolerncia. Esses mecanismos de tolerncia so tambm diferentes de outros protocolos de induo de tolerncia imunolgica que dependem da produo de IL-10 ou deslocando a resposta na direo Th1. Quando ns tratamos os camundongos previamente sensibilizado com o anti-CD4 mAb, no podemos evitar as manifestaes de anafilaxia na presena de altos ttulos (concentraes, quantidades) de IgE. Resta, no entanto, ser mostrado se neutralizaes teraputicas da IgE, pode permitir uma tolerncia de forma a impedir que ocorra uma produo de IgE. Na verdade, nossos resultados com modelos de ratos com doena alergia nas vias areas, mostraram que a tolerncia pode ser atingindo uma pr-sensibilazao do camundongo, mesmo aps um episodio de inflamao das vias areas. (Agua-Doce e Graca, 2011). Tomadas em conjunto, as buscas sugeriram que IgE no previne a tolerncia de serem alcanada dentro de um grupo de clulas T, mas altos nveis de IgE so suficientes para levar manifestaes agudas da doena. Alm disso, clulas de memria tem sido a maior barreira para induo teraputica da tolerncia. Em alguns casos, a tolerncia imunolgica pode ser induzida em alguns modelos experimentais com anti-CD4, na presena de clulas de memria. (Agua-Doce e Graca, 2011). A respeito da tolerncia com CPE, no podemos concluir se, altos nveis de IgE ou a presena de clulas de memria em camundongos pr-sensibilizados constituram uma barreira para induzir a tolerncia. Curiosamente, encontramos camundongos sensibilizados que s teve manifestaes anafilticas leve quando injetou-se CPE-ALUM, enquanto que o CPE sozinho provocou uma severa resposta anafiltica com uma acentuada queda de temperatura. Quando nos injetamos ALUM puro, ou ALUM associado com diferentes antgenos (OVA), ns no observamos uma proteo efetiva para uma subseqente sensibilizao com CPE. Encontrar uma terapia eficaz e especfica para a anafilaxia induzida por amendoim tem sido um grande desafio. Uma vez que o diagnstico estabelecido, o curso de ao restrito a eliminao estrita do alrgeno causador da dieta do paciente, e estima-se que cerca de 50% dos indivduos afetados desenvolvem uma reao acidental durante um perodo de dois anos. Abordagens distintas para induzir a tolerncia aos alrgenos alimentares foram ou esto sendo estudadas. No entanto, ainda no claro se a evidncia clnica ir apoiar a adoo de qualquer dessas estratgias tolerognicas. Ns acreditamos que nossos dados fornecem evidncias de que a segmentao clulas T-CD4 pode fornecer uma maneira de conseguir ou facilitar a induo de tolerncia aos antgenos sistmicos, tais como aqueles que podem desencadear anafilaxia. Somos gratos a A. Wesley Burks (Universidade de Dake) pelos teis conselhos e por fornecer amostras de CPE paravalidao do CPE que produzimos em nosso laboratrio. Agradecemos a Herman Waldmann (Universidade de Oxford) peloshibridomas de anti-CD4 e anti-CD25, financiado pela Fundao para Cincia e Tecnologia Portugal-PTDC/SAUMIT/64279/2006.Os autores no tm apresentam conflitos de interesses financeiros.