DNA, RNA e PROTENAS

DNA

PROTENA
Carla Costa

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Servio e Laboratrio de Biologia Celular e Molecular

OBSERVAO

A descoberta do DNA foi crucial para o entendimento da biologia ao nvel molecular.

O QUE O DNA?

DNA cido desoxiribonucleco a molcula que contm a informao gentica.

DNA - MARCOS HISTRICOS

Friedrich Miescher

Phoebus Levene

Erwin Chargaff

Descoberta do DNA (1869)

Purinas

Identificou os componentes do DNA (1920s) Nucletido

T=A G=C
Pirimidinas

Desoxiribose

MARCOS HISTRICOS

Rosalind Franklin

Francis Crick

James Watson

Difraco DNA por raios-X (1952)

Modelo da dupla hlice (1953)

ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO DNA

Francis Crick mostra a James Watson o modelo do DNA em dupla hlice

DUPLA HLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA

DNA mede-se em nmero de pares de bases (bp) 1000 bp = 1 kb 1.000.000 bp = 1 Mb

10 nucletidos em uma volta da hlice

ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA

Purinas

Pirimidinas

DUPLA HLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA

Cadeias anti-paralelas

LOCALIZAO CELULAR
Ncleo: 5-8 m de dimetro DNA: 2 m de comprimento
DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

CROMOSSOMAS
NCLEO CROMOSSOMAS

NMERO DE CROMOSSOMAS
Organism Escherichia coli (bacterium) Saccharomyces cerevisae (yeast) Caenorhabditis elegans (nematode) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Drosophila melanogaster (fruit fly) Mus musculus (mouse) # of chromosomes 1 16 6 10 4 19 + X/Y DNA (Mb) 47 12 97 118 135 3,059 mug shot

Homo sapiens sapiens (human)

22 + X/Y

3,286

LOCALIZAO CELULAR
Ncleo: 5-8 m de dimetro DNA: 2 m de comprimento
DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

CROMATINA E NUCLEOSSOMA
NCLEO CROMOSSOMAS CROMATINA NUCLEOSSOMA
- Contm ~ 200 pb de DNA enrolado volta de uma regio central composta por 8 histonas (H2A, H2B, H3, H4). - Histona H1 junta a estrutura.
10 nm de dimetro

DNA + HISTONAS

- O empacotamento do DNA em fibras de cromatina de 10 nm diminui em cerca de 6 vezes o seu comprimento!

-Os nucleossomas originam uma fibra de cromatina de ~10 nm de dimetro.

- A cromatina pode ser condensada em fibras de 30 nm.

FIBRAS DE CROMATINA

EUCROMATINA E HETEROCROMATINA
EUCROMATINA HETEROCROMATINA

NCLEO EM INTERFASE MICROSCOPIA ELECTRNICA

GENES

ESTRUTURA DO DNA

Segmento de DNA que codific para a sntese protenas

- Regies reguladoras - Regies codificantes (Exes)

- Regies no codificantes (Intres Protenas

COMO QUE UMA SEQUNCIA DE DNA CODIFICA PARA UMA PROTENA?

?
DNA PROTENA
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

Ncleo

Citoplasma

REPLICAO, TRANSCRIO E TRADUO

Ncleo Citoplasma

REPLICAO DO DNA DNA MAKES DNA

- INICIAO - REPLICAO - TERMINAO

REPLICAO SEMI-CONSERVATIVA DO DNA

DUPLA HLICE ORIGINAL

MOLCULAS DE DNA APS A REPLICAO

REPLICAO - INICIAO

GARFO DE REPLICAO

- Origem de replicao (ori) sequncia particular de DNA onde a replicao iniciada. - Na ori ligam-se vrias proteinas, as cadeias de DNA so abertas, formando a replication bubble. - A replicao inicia-se no garfo de replicao. - A replicao do DNA a partir dos garfos de replicao bidireccional. DNA POLIMERASE

DNA POLIMERASE - EUCARIOTAS

Activas em clulas em diviso - replicao.

REPLICAO

-Topoisomerases desenrola a dupla hlice de DNA. - Helicase abre a molcula de DNA no topo do garfo de replicao (quebra as ligaes por pontes de hidrognio entre as bases).

- Single-Stranded DNA binding proteins (SSB) ligam-se a regies do DNA em cadeia simples para prevenir a re-ligao em cadeia dupla.
Sntese 5-> 3

- DNA Polimerase inicia a sntese da nova cadeia de forma contnua. - Sintetizada descontinuamente sobre a forma de fragmentos de Okasaki que so pequenas molculas de DNA (1 a 3kb). - RNA primase liga-se ao local de iniciao no DNA.

- DNA Polimerase sintetiza os fragmentos de Okazaki..

- DNA ligase liga os fragmentos de Okazaki.

SNTESE DA CADEIAS LEADING E LAGGING

FRAGMENTOS DE OKAZAKI

Primase

DNA Pol

DNA Polimerase

SNTESE DA CADEIAS LEADING E LAGGING

DNA Polimerase Polimerase 5->3 Exonuclease 3->5

PROOFREADING (capacidade de verificao)

1 base em 109-1010 bases incorporadas adicionada incorrectamente

REPLICAO - TERMINAO

- Ocorre quando os garfos de replicao se encontram. - DNA Ligase. - Topoisomerase enrola o DNA.

REPLICAO DO DNA - RESUMO

MUTAES NO DNA

- ESPONTNEAS - INDUZIDAS
- RADIAES - QUMICOS

MUTAES ESPONTNEAS NO DNA

Para alm dos erros de incorporao de bases que podem ocorrer durante a replicao. Vrias modificaes qumicas na molcula de DNA podem ocorrer espontneamente.

(perda de purinas)

Resultando na quebra da ligao entre as bases puricas e a desoxirribose deixando um local apurinico no DNA.

MUTAES INDUZIDAS POR RADIAES OU QUMICOS

A radiao UV induz a formao de dmeros de pirimidina, em que duas timinas adjacentes so unidas por um anel ciclobutano.

A formao destes dmeros distorce a estrutura do DNA e bloqueia a transcrio e replicao.

Benzo-apyrene reagem com as bases adio de grupos alquilo (metil ou etil) a vrias posies nas bases de DNA de DNA adicionando grandes grupos qumicos molcula de DNA.

MECANISMOS DE REPARAO DO DNA

RADIAES

REPARAO
QUMICOS

- DIRECTA - EXCISO DE BASE

ESPONTNEA

- EXCISO DE NUCLETIDO - REPARAO MISMATCH

REPARAO DIRECTA DO DNA

O processo de reparao dos dmeros de timina designa-se fotoreactivao uma vez que energia proveniente da luz visvel utilizada para quebrar a estrutura de ciclobutano. As pirimidinas originais permanecem na molcula de DNA, agora no seu estado normal.

REPARAO POR EXCISO

- EXCISO DE UMA BASE - EXCISO DE NUCLETIDOS - REPARAO POR MISMATCH

EXCISO DE UMA BASE

O uracilo pode ser erradamente incorporado no DNA em vez da timina durante a replicao ou pode ser formado por desaminao da citosina.

A exciso do uracilo catalizada pela DNA glicosilase, uma enzima que cliva a ligao entre a base e a desoxirribose, formando-se um local apirimidinico (apurinico se for outro tipo de base a ser removida).

O local AP reparado por uma AP endonuclease que remove a desoxirribose.

O espao vazio de um nucleotido preenchido pela DNA polimerase e estabelecidas as ligaes pela ligase.

REPARAO POR EXCISO

- EXCISO DE UMA BASE - EXCISO DE NUCLETIDOS - REPARAO POR MISMATCH

EXCISO DE NUCLETIDOS
Mecanismo de reparao em todo o genoma As bases modificadas so removidas como parte de um oligonucleotido contendo a leso Reconhecimento da base alterada por um complexo contendo a protena XPC e a hHR23B.

A esta interaco segue-se a ligao das protenas XPB, XPD (so componentes do factor de transcrio TFIIH necessrio para o inicio da transcrio) e XPG ao DNA danificado.

Actuam como helicase desenrolando 30 pb de DNA volta do local danificado.

A protena XPA confirma a mutao e recruta a XPF em heterodmero com ERCC1 ao complexo de reparao. As XPF/ERCC1 e XPG so endonucleases que clivam o DNA a 5 e 3 do local danificado.

O espao vazio resultante preenchido pela DNA polimerase e unidos pela ligase.

EXCISO DE NUCLETIDOS

REPARAO POR EXCISO

- EXCISO DE UMA BASE - EXCISO DE NUCLETIDOS - REPARAO POR MISMATCH

REPARAO POR MISMATCH

Reconhece bases no emparelhadas que so incorporadas durante a replicao e escapam ao controlo do mecanismo de Proofreading faz um scaning ao DNA replicado de novo. 6 homlogos de MutS e 5 homlogos de MutL, designados por MSH e MLH, respectivamente. Os factores melhor caracterizados em reparao MMR so o MSH2, MSH3 e MSH6.

Reparao ps replicativa de erros e essencial para a manuteno da integridade do genoma.

REPARAO POR MISMATCH

- Incorporao mismatch durante a replicao.

- Reconhecimento.

- Exciso.

- Sntese.

DEFEITOS NOS SISTEMAS DE REPARAO DO DNA

REPLICAO, TRANSCRIO E TRADUO

Ncleo Citoplasma

TRANSCRIO

- INICIAO - ELONGAO
Citoplasma

- TERMINAO - PROCESSAMENTO DO mRNA

TRANSCRIO - OVERVIEW

RNA CIDO RIBONUCLECO

Estruturalmente semelhante ao DNA contudo:

- Ribose em vez de desoxiribose - Uracilo em vez de timina - Molculas de RNA so mais pequenas - RNA em cadeia simples

TIPOS DE RNA

TRANSCRIO DE UMA NICA CADEIA DE DNA

3 5

Cadeia molde Anti-sense 3

RNA Polimerase

RNA POLIMERASES EM EUCARIOTAS

INICIAO DA TRANSCRIO: REGIO PROMOTORA

REGIO PROMOTORA: sequncia no DNA onde a RNA Polimerase II inicia a transcrio

TRANSCRIO - INICIAO
Inmeras protenas envolvidas designadas por factores de transcrio. - Formao de um complexo de transcrio da RNA polimerase II envolve a ligao do factor TFIID (Transcription Factor II) TATA Box. O factor TFIID composto por vrias subunidades, incluindo uma TBP (TATA binding protein) e aproximadamente 10 outros polipeptideos designados TBP-associated factors (TAFs).

- A ligao do TFIID seguida pelo recrutamento de um segundo factor de transcrio, o TFIIB que serve como ponte para a RNA polimerase II, que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associao com outro factor, o TFIIF.

- Ao complexo ligam-se mais dois factores, o TFIIE e TFIIH.

- A RNA Polimerase II separa a dupla cadeia de DNA e inicia a transcrio do mRNA.

TRANSCRIO - ELONGAO
ELONGAO: O mRNA vai-se formando ligado ao DNA, na transcription bubble, atravs da adio de bases (Ex: adenina a uracilo e guanina a citosina) na direco 5' 3. Processo mediado pela RNA Polimerase II.

http://www.synapses.co.uk/genetics/repflow.ht

TRANSCRIO - TERMINAO
TERMINAO: - Um sinal stop no DNA faz com que a RNA Polimerase II seja removida. - O mRNA sintetizado libertado. - A transcription bubble no DNA fechada.

Pr-mRNA

TRANSCRIO - RESUMO

TRANSCRIO: PROCESSAMENTO DO mRNA

O pr-mRNA sofre 3 grandes modificaes antes de sair do ncleo e ser traduzido em protena

2 3 1

- CAPPING

- POLIADENILAO - SPLICING

PROCESSAMENTO DO mRNA

1) Capping uma metilguanosina adicionada extremidade 5' do mRNA. Esta modificao necessria para a estabilizao do mRNA e para a eficiente iniciao da sntese proteca.

2) Poliadenilao o mRNA poliadenilado na extremidade 3. Adio de uma cadeia de 150-200 adeninas que aumenta a estabilidad e o tempo de semi-vida de molcula de mRNA. 3) Splicing remoo de intres (sequncias no codificantes) do pr-mRNA para formar mRNA, contendo somente a estrutura codificante, exes, para serem traduzidos em protena. Este processo ocorre no spliceossoma.

SPLICING

PROCESSAMENTO DO mRNA RESUMO

DO NCLEO PARA O CITOPLASMA

mRNA

ENVELOPE NUCLEAR

Heterocromatina Eucromatina Nuclolo Complexo Poro nuclear

TRANSPORTE DO mRNA DO NCLEO PARA O CITOPLASMA

TRANSPORTE DO mRNA DO NCLEO PARA O CITOPLASMA

A molcula de mRNA transportada atravs do poro nuclear. Antes da translocao comear, algumas protenas (Ex: componentes de splicing) so dissociadas do mRNA.

Protenas envolvidas na exportao ligam-se ao mRNA e posteriormente a receptores no complexo poro nuclear.

O mRNA translocado pelo poro nuclear, com a extremidade 5 CAP na frente.

Quando o mRNA chega ao lado citoplasmtico do poro nuclear, muitas protenas se dissociam deste Como as protenas de exportao que regressam ao ncleo. A molcula de mRNA est pronta para o prximo passo - TRADUO

MICROSCOPIA ELECTRNICA TRANSPORTE DO mRNA

mRNA transportado com a extremidade 5 na frente mRNA torna-se alongado de modo a facilitar o transporte atravs da abertura do CPN.

mRNA associado ao CPN.

Ncleo Citoplasma

Quando chegado ao lado citoplasmtico os ribossomas ligam-se ao mRNA e a sntese proteca iniciada.

Microscopia electrnica mRNA associado a protenas durante o transporte atravs do complexo poro nulear (CPN). Barra= 100 nm.

MICROSCOPIA ELECTRNICA TRANSPORTE DO mRNA

Vista tangencial no lado citoplasmtico do CPN. As setas mostram a passagem de mRNA. mRNA

Microscopia electrnica Transporte do mRNA atravs do complexo poro nulear (CPN) vista do lado citoplasmtico.

TRANSCRIO
- DNA transfere informao para o mRNA sob a forma de uma sequncia de nucletideos

TRADUO
- A molcula de mRNA lida por sequncias de 3 nucletidos, CODES, de 5->3.

CDIGO GENTICO
Sequncia de tripletos de nucletidos, codes, ao longo do mRNA e que determinam a sequncia de aa numa protena. 20 aminocidos (aa) usados na construo de protenas, e os codes que codificam para cada aa.

O cdigo gentico degenerativo ou redundante 2 ou mais codes codificam para o mesmo aa.

TRADUO

MOLCULAS ENVOLVIDAS NA TRADUO

A traduo catalizada por ribossomas que so constitudos por protenas e rRNA (RNA ribossomal), responsvel pela ligao entre os aminocidos. Maquinaria bsica para o processo de traduo. A traduo envolve molculas de tRNA (RNA de transferncia) que liga anti-codes aos codes do mRNA. Cada anti-codo est ligado a um aminocido (aa) particular.

O ribossoma liga-se ao primeiro codo AUG (codo de iniciao) no mRNA. Este codo codifica para o aa metionina (Met).

TRADUO: INICIAO

- A unidade pequena do ribossoma liga-se a um local "upstream" na extremidade 5do incio do mRNA. - Prosegue para dowstream (5->3) at encontrar o codo de iniciao AUG. - Liga-se o anti-codo complementar atravs do tRNA iniciador. - A unidade maior do ribossoma junta-se ao complexo. - O tRNA iniciador codifica para o aa metionina (Met).

TRADUO: ELONGAO
Met

-O aa inicial, Met, covalentemente ligado atravs de rRNA ao aa seguinte, resultado da ligao do segundo anti-codo ao codo complementar. - O tRNA iniciador libertado. -O ribossoma move-se ao longo do mRNA fazendo a ligao de anticodes a codes, adicionando aa cadeia polipeptdica.

TRADUO: ELONGAO

Quando o ribossoma atinge um codo stop no mRNA, o polipeptdeo e o mRNA so libertados.

TRADUO - RESUMO

TAKE HOME MESSAGE

PROCESSOS DE REPARAO DE DANOS ESSENCIAL PARA A MANUTENO DA INTEGRIDADE DO DNA

MUTAES NOS PROCESSOS DE REPARAO ESTO ASSOCIADOS A DIVERSAS PATOLOGIAS