Universidade Federal da Paraba Centro de Cincias da Sade Curso de Graduao em Odontologia

Raimundo Aprgio de Menezes Junior

ANLISE DA CITOTOXICIDADE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE UM POLMERO INORGNICO PARA USO ODONTOLGICO

Joo Pessoa 2009

Raimundo Aprgio de Menezes Junior

ANLISE DA CITOTOXICIDADE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE UM POLMERO INORGNICO PARA USO ODONTOLGICO

Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao Curso de Graduao em Odontologia, da Universidade Federal da Paraba em cumprimento s exigncias para concluso.

Orientador: ngelo Brito Pereira de Melo, Prof. Doutor. Co-orientador: Fbio Correia Sampaio, Prof. Doutor.

Joo Pessoa 2009

DEDICATRIA

A todos os amigos e familiares presentes e ausentes que de alguma forma contriburam e incentivaram para esta realizao pessoal. Dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus, fora infinita, constantemente presente na vida de um ser humano, sempre impulsionando para uma formao mais plena e justa do conhecimento prprio do indivduo.

Aos professores orientadores (CCS Odontologia) ngelo Melo e Fbio Sampaio, pela constante dedicao e empenho nos ensaios biolgicos.

Aos Professores (CT Engenharia) Sandro Marden e Silvio Barros por viabilizarem as anlises do MTA, orientao sobre polmeros inorgnicos e por seus conselhos durante a concluso deste trabalho.

Obrigado.

A palavra cria a idia. A idia engendra a ao. A ao inspira novas idias. Idias novas provocam comentrios. Comentrios se repetem. As idias se propagam. E, assim, novas aes se viabilizam. Psicografia de Carlos Antnio Baccelli

Quando um homem tem incompleto da verdade, sente bastante, mas quando ele completamente a verdade, tem falta alguma coisa Dogem

conhecimento que j sabe o compreendeu certeza de que

RESUMO

O estudo da atividade antimicrobiana e citotoxicidade so o principal enfoque deste trabalho, que analisa o possvel uso de um polmero inorgnico como cimento odontolgico, originado a partir de reaes de ativao alcalina do metacaulim usando como ativadores de polimerizao o silicato de sdio e/ou hidrxido de calcio. Em principio trs grupos foram analisados: Grupo S1 - Polmero inorgnico; Grupo S2 Polmero inorgnico + Hidrxido de Clcio; Grupo S3 - Polmero inorgnico + Clorexidina. Para cada um destes grupos a atividade antimicrobiana sobre culturas bacterianas de Enterococcus Faecalis e Escherichia Coli, foi testada a partir do teste de difuso em gar. Os resultados demonstraram a presena de halos de inibio nas cepas de Enterococcus faecalis e Escherichia Coli para os grupos S2 (Polmero inorgnico + Hidrxido de Clcio) e S3 (Polmero inorgnico + Clorexidina). J para o grupo S1 (Polmero inorgnico), foi observada atividade antimicrobiana apenas contra o Enterococus Faecalis. Concluida a verificao do potencial antimicrobiano, realizou-se a anlise de citotoxicidade, observando-se o grau de agressividade contra a membrana celular de fibroblastos. O teste consiste na absoro do sal MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazlio]} pelas clulas, sendo reduzido no interior da mitocndria a um produto chamado formazana. Este produto, acumulado dentro da clula, extrado atravs da adio de um solvente apropriado (Mosmann, 1983). O experimento foi incubado por 24 horas em quadruplicata. Aps o perodo de incubao cada amostra foi medida no espectrofotmetro digital de 550 nm, de acordo com, Mosmann, 1983. Os grupos testados foram: Grupo DO1 - Polmero inorgnico; Grupo DO2 - Polmero inorgnico + Hidrxido de Clcio; Grupo DO3 - Polmero inorgnico + Clorexidina. A ordem crescente de citotoxicidade observada foi a seguinte: DO1 < DO2 < DO3 < DO4, onde o grupo DO1 foi o menos citotxico e que o grupo DO4 foi o mais citotxico. Foi observada uma mdia de viabilidade celular de 91,8% na presena de 350 ug/ml dos grupos onde concluiu-se que o polmero estudado um produto de baixa toxicidade atestando sua biocompatibilidade.

Palavras-chave: Ao antimicrobiana; Citotoxicidade; Cimentos Odontolgicos.

ABSTRACT
The study of antimicrobial activity and cytotoxicity are the main focus of this work, which analyzes the possible use of an inorganic polymer such as cement in dentistry, originated from reactions of alkaline activation of metacaulim using as polymerization activators the sodium silicate and/or calcium hydroxide. Three groups was tested: Group S1 - Polmero inorgnico; Group S2 - Polmero inorgnico + Hidrxido de Clcio; Group S3 - Polmero inorgnico + Clorexidina. For each group the antimicrobial activity on bacterial cultures of Enterococcus Faecalis and Escherichia Coli, was confirmed from the agar diffusion method. The results demonstrated the presence of halos of inhibition on Enterococcus faecalis and Scherichia coli, when the compound was the presence of calcium hydroxide. Already in the absence of calcium hydroxide antimicrobial activity was observed only against Enterococus faecalis. Complete verification of the antimicrobial potential, there was the analysis of cytotoxicity, on the degree of aggressiveness against the cell membrane of fibroblasts. The test is the absorption of bromide salt MTT ([3 - (4,5dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difeniltetrazlio]) by the cells, is reduced within the mitochondria of a product called FORMAZAN. This product, accumulated inside the cell, is extracted by the addition of an appropriate solvent (Mosmann, 1983). The experiment was incubated for 24 hours in four. After the incubation period each sample was measured in digital spectrophotometer from 550 nm in accordance with, Mosmann, 1983. The tested groups are: Group DO1 Inorganic Polymer; Group DO2 Inorganic Polymer + Calcium Hidroxyde; Group DO3 - Inorganic Polymer + Clorexidine. The crescent order of cytotoxicity is: DO1 < DO2 < DO3 < DO4, where the group was the least cytotoxic DO1 and the group was the most cytotoxic DO4. Was observed an average of 91.8% cell viability in the presence of 350 ug / ml of the compound concluding that the polymer studied is a product of low toxicity proving their biocompatibility.

Keywords: Antimicrobial activity; biocompatibility, Dental Cements

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Lista de Tabelas

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composio qumica do MTA. ......................................................................... 17 Tabela 2 Comparao da composio qumica do cimento Portland e MTA.................. 19 Tabela 3 Composio padronizada com hidrxido de clcio .......................................... 32 Tabela 4 Composio padronizada sem hidrxido de clcio .......................................... 32 Tabela 5 Composio padronizada do grupo S1 ............................................................ 33 Tabela 6 Composio padronizada do grupo S2 ............................................................ 33 Tabela 7 Composio padronizada do grupo S3 ............................................................ 33 Tabela 8 Composio padronizada do grupo S4 ............................................................ 34 Tabela 9 Mdia (DP) de halos de inibio (em mm) frente cepa de E. faecalis........... 37 Tabela 10 - Mdia (DP) de halos de inibio (em mm) frente cepa de E. Coli. .............. 38 Tabela 11 - Mdias de viabilidade celular. Teste MTT ...................................................... 40

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Sumrio

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SUMRIO

1. INTRODUO .............................................................................................................. 13 2. REFERENCIAL TERICO ............................................................................................ 16 2.1.1 - AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO MTA ................................ 20 2.1.2 - AVALIAO DA CITOTXICIDADE DO MTA .................................................... 22 2.2 - POLMEROS INORGNICOS (GEOPOLMEROS) ............................................... 25 2.2.1 Descrio ......................................................................................................... 26 2.2.2 Caractersticas ................................................................................................. 26 2.2.3 - Propriedades Mecnicas .................................................................................. 27 2.2.4 - Resistncia Compresso ............................................................................... 27 2.2.5 - Cura .................................................................................................................. 27 2.2.6 - Cor e Textura .................................................................................................... 28 2.2.7 - Mdulo de Elasticidade e Resistncia Trao ............................................... 28 2.2.8 - Massa Especfica.............................................................................................. 28 3 - PROPOSIO ............................................................................................................. 30 4 - METODOLOGIA........................................................................................................... 32 4.1 CONSIDERAES TICAS.................................................................................. 32 4.2 DETERMINAO DAS FRAES MOLARES ..................................................... 32 4.3 METODOLOGIA DA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............... 34 4.4 METODOLOGIA DA AVALIAO DA CITOTXICIDADE ..................................... 34 5 - RESULTADOS ............................................................................................................. 37 6 - DISCUSSO ................................................................................................................ 44 6.1 DISCUSSO DA METODOLOGIA DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA............... 45 6.2 DISCUSSO DA METODOLOGIA DA CITOTXICIDADE ................................... 46 6.3 DISCUSSO DOS RESULTADOS ........................................................................ 48 7 - CONCLUSES ............................................................................................................ 51 8 REFERNCIAS ........................................................................................................... 53

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Introduo

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1. INTRODUO H muitas dcadas a odontologia tem desenvolvido e utilizado um nmero diverso de materiais em procedimentos operatrios de rotina do consultrio, dentre estes, aqueles que envolvem restauraes, capeamento pulpar, curativos provisrios, selamento de canais radiculares etc. Devido a mudana de pensamento para uma odontologia menos invasiva e ao comprometimento com os problemas de sade coletiva, desde o final do ltimo sculo, a busca por materiais que preservem e recuperem a estrutura dental remanescente, tem sido um campo de pesquisa em desenvolvimento constante. A Crie dental reconhecida como doena multifatorial, onde a susceptibilidade do hospedeiro, dieta rica em carboidratos e a microbiota acidognica tornam-se responsveis por leses que comprometem os tecidos dentrios. Assim, com a possibilidade de desenvolvimento de materiais capazes de prevenir leses cariognicas, atravs de atividade antimicrobiana e captao de minerais perdidos no mecanismo de desremineralizao esperado um controle mais eficiente da doena quando associado s estratgias de educao continuada sobre a preveno e higienizao do meio bucal. O surgimento de novos materiais freqente na odontologia. Esta renovao em parte, fruto da busca pela excelncia tcnico-cientfica e tem contribudo para a evoluo continuada das especialidades odontolgicas, principalmente nas duas ltimas dcadas. O aprimoramento da odontologia se d pela unio dos conhecimentos do profissional a instrumentos, aparelhos de alta tecnologia e materiais. Antes de chegar ao mercado, existe uma srie de requisitos que os materiais devem preencher e para isso so realizadas pesquisas cientficas exaustivas acerca de suas propriedades fsicas, qumicas e biolgicas, para que seu uso clnico seja seguro e eficiente. O ponto de partida para o desenvolvimento e a seleo de materiais a comprovao de que estes sejam biocompatveis, e se possvel, possuam atividade antimicrobiana contra organismos patgenos bucais e que suportem as condies adversas do sistema estomatogntico, entre elas as inmeras bactrias que compe a flora bucal. Para Estrela (2005), biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade de um material exercer funes especficas quando aplicado em contato com tecidos vivos de determinado hospedeiro, sem, contudo, causar danos ou prejuzos aos mesmos. Para uma correta avaliao dos materiais odontolgicos, uma srie de metodologias foram regulamentadas e padronizadas por organizaes governamentais ou no como:

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Federation Dentaire Internationale, (FDI), International Standard Organization (ISO), e American Dental Association (ADA). Dentre os cimentos odontolgicos o Trixido Agregado Mineral ou MTA tem sido um dos mais estudados. Muitas vantagens tem sido atribudas ao MTA frente aos muitos cimentos odontolgicos disponveis no mercado. Algumas dessas propriedades so a atividade antimicrobiana, a biocompatibilidade, capacidade de selamento, entre outras. Devido ao seu alto custo, muitos grupos de pesquisa tem se dedicado a encontrar materiais com propriedades semelhantes ao MTA e que sejam de custo mais acessvel. Alguns estudos tem sugerido que o cimento Portland, por exemplo, possui caractersticas muito prximas ao Trixido Agregado Mineral e que este poderia ser uma alternativa vivel. No presente trabalho, uma nova alternativa ao MTA diferente do cimento Portland estudada, investigando o seu potencial antimicrobiano e citotxicidade. Conhecidos como polissialatos ou poli-silico-aluminatos, os polmeros inorgnicos foram descritos pela primeira vez pelo Prof. Davidovits em 1981. Apresentam caractersticas particulares que revelam grande potencial de aplicao como aglomerante, em substituio ao cimento Portland. Uma propriedade em particular que o difere de todos os cimentos odontolgicos a capacidade da reao de presa ocorrer quando o mesmo encontra-se imerso em gua. Outras caractersticas podem ser citadas como: pega rpida, boa trabalhabilidade, coeso e acabamento e resistncia ao ataque qumico. Convm notar que a facilidade para obteno dos produtos que compe a matriz formadora destes polmeros, tornam este ainda um produto de baixo custo quando comparado ao Trixido Agregado Mineral.

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Referncial Terico

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2. REFERENCIAL TERICO O tratamento odontolgico curativo quase sempre resulta na necessidade de se utilizar agentes cimentantes. Para cada caso, utiliza-se um determinado tipo de cimento. O termo cimentao definido como o uso de uma substncia moldvel que tem como o objetivo selar ou cimentar duas partes mantendo-as juntas (PHILLIPS 1993). Em geral, define-se cimento como uma substncia que une duas superfcies (CAMPOS et al., 1999). Na odontologia, os cimentos podem ser utilizados para restauraes permanentes ou temporrias, como bases para isolamento trmico sobre restauraes metlicas, para capeamento e forramento pulpar, para construo de ncleos, como agentes para cimentao de restauraes indiretas, de aparelhos ortodnticos ou pinos intraradiculares. Os cimentos dentrios so frequentemente utilizados, tanto para selar a fenda existente entre o dente e a coroa correspondente, como tambm para aumentar sua fixao ao dente preparado. (CAMPOS et al., 1999). Existem vrios tipos de cimentos na odontologia, dentre eles podemos citar o hidrxido de clcio, xido de zinco eugenol, fosfato de zinco, cimento de silicato, ionmero de vidro, ionmero de vidro modificado por resina, cimento de policarboxilato, cimento base de xido de zinco e eugenol e cimentos resinosos. O cimento de fosfato de zinco um dos mais populares dentre os cimentos odontolgicos. Sua formulao permanece semelhante quela introduzida h mais de um sculo (GODOROVSKY, ZIDAN, 1992). Ainda hoje, o cimento de fosfato de zinco o mais utilizado para as cimentaes de coroas por apresentar baixo custo, facilidade de trabalho e boas propriedades

mecnicas, entretanto, White et al. (1992) alertam que um cimento crtico quanto solubilizao em meio bucal, sendo contra-indicado em restauraes estticas indiretas. J o cimento de ionmero de vidro vem sendo utilizado com muita freqncia em cimentaes de peas protticas, principalmente em coroas totais, em metalocermica, coroas em porcelana pura reforadas (DIJKEN, HOGLUND-ABERG, OLOFSSON, 1998; GATEAU, SABEK, DAILEY, 2001). A resistncia adesiva desse material

comprovadamente adequada, evitando uma possvel recorrncia de crie na regio da margem do preparo, alm de liberar flor e ser biocompatvel (HOGLUND, DIJKEN, OLOFSSON, 1992). Porm, o maior problema deste material est relacionado com o seu tempo de presa, pois, verifica-se que a ltima fase do processo muito lenta, durando mais de 24 horas (NAVARRO, PASCOTTO, 1998). Considerando que este cimento no fica totalmente endurecido nas primeiras 24 horas aps sua aplicao, o seu uso se torna

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crtico, visto ser susceptvel a alterao higroscpica do meio (VIEIRA et al., 2006). Esse tipo de cimento demonstra assim, um alto potencial de solubilidade com suas propriedades mecnicas no alcanando um padro satisfatrio (MOUNT, 1998; MEJARE, MJOR, 1990).

2.1 - TRIXIDO AGREGADO MINERAL

No inicio dos anos 90 Mahmoud Torabinejad, pesquisador e professor da universidade de Loma Linda, California (EUA), desenvolve o trixido agregado mineral tendo como aplicaes clnicas o capeamento pulpar, pulpotomia, polpas necrosadas, reparao de perfuraes radiculares, reabsoro interna ou como material retroobturador. O Agregado de Trixido Mineral (MTA) um cimento composto por finas partculas hidroflicas que toma presa na presena de umidade cujos principais componentes qumicos so o triclcio silicato, o triccio aluminato, o triclcio xido silicato, alm de outros xidos minerais (LEE et al.,1993), ver Tabela 1.

Tabela 1 - Composio qumica do MTA.

TORABINEJAD et al., em 1995 descreveram as propriedades qumicas e fsicas do MTA. Trata-se de um p constitudo de finas partculas hidrfilas de silicato triclcico, aluminato triclico, xido triclcico e xido de silicato. Tambm contm pequenas quantidades de outros xidos minerais que modificam suas propriedades fsicas e qumicas. A hidratao do p resulta em gel colide que se solidifica em aproximadamente trs horas. Tem sido adicionado p de xido de bismuto para que o agregado se torne radiopaco. Sua composio qumica foi estudada atravs de um espectmetro de raios-X e microscpio eletrnico, fazendo uma anlise quantitativa de

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raio-X. Observou-se que a maioria das molculas presentes no MTA so ons de clcio e de fosfato. O pH inicial 10,2 e sobe para 12,5 trs horas aps a manipulao, valores esses mensurados com um medidor de pH. Sua radiopacidade foi determinada de acordo com o mtodo descrito pela Organizao Mundial de Estandardizao. Observando-se que o MTA mais radiopaco que o Super-EBA e que o IRM. Seu tempo de presa e sua resistncia compreenso foram determinados de acordo com os mtodos

recomendados pelo Instituto Britnico de Estandardizao. Foi verificado que o MTA apresenta tempo de presa longo - 2h 45m e que aps 24 horas apresenta resistncia compreenso de 40 MPA, valor que, aps 21 dias, subiu para 67 MPA. Quanto solubilidade, mostrou-se satisfatrio. KOH et al. em 1998 descreveram o MTA (anlise em microscpio eletrnico) como um material que apresenta duas fases especficas na sua composio, parecendo ser dividido em clcio e fosfato de clcio, sendo que o primeiro aparece como discretos cristais e op segundo como uma estrutura amorfa, sem crescimento aparente de cristais, mas com aparncia granular. Este material em inmeras investigaes (ESTRELA et al., 2000; HOLLAND et al., 2001; HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 2002; LEE et al., 1993; SAIDON et al., 2003; TORABINEJAD et al., 1994) mostrou apresentar adequadas caractersticas fsicoqumicas e biolgicas, o que permitiu sua sugesto como material de escolha para o tratamento das diversas situaes clnicas na odontologia. Como conseqncia, o emprego do MTA pode ser justificado em situaes clnicas como o tratamento conservador da polpa (em casos de pulpotomia e capeamento pulpar), como material estimulador da apecificao, tratamento de perfuraes resultantes de reabsores internas e externas comunicantes, barreira intracoronria prvia ao clareamento dental e como tampo apical em casos de dificuldades de travamento do cone principal. Alm dessas indicaes, o MTA tambm tem sido comumente usado com material retrobturador. ESTRELA et al, 2000, analisaram os elementos qumicos do MTA e duas amostras de cimento Portland. Os cimentos apresentaram os mesmos elementos qumicos que o MTA (ver Tabela 2), excetuando que o MTA tambm apresenta na sua constituio, o xido de bismuto como agente radiopacificador. A semelhana na composio qumica do cimento portland com o MTA e o seu reduzido custo, vem despertando o interesse para a sua utilizao na odontologia, embora a sua baixa radiopacidade seja um fator limitante

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para esses fins. Ainda existe uma grande carncia de estudos cientficos que atestem principalmente suas propriedades biolgicas antes da sua aceitao na clnica.

Tabela 2 Comparao da composio qumica do cimento Portland e MTA

Na seo de resultados (pginas 41 e 42), pode ser observado um estudo complementar, onde realizou-se uma anlise atravs de difratometria de Rx de uma amostra de MTA Angelus no NEPEM (CT-UFPB), com a assessoria de professores e tcnicos para qualificar a sua composio qumica. Percebe-se claramente que o cimento Portland possui os mesmos elementos que compe o MTA e que a adio de substncias radiopacificadoras ao cimento Portland, desde que mantida sua caracterstica de biocompatibilidade, alm da manuteno de suas propriedades fsico-qumicas, mecnicas e antimicrobianas, poderia viabilizar o seu uso na odontologia. (TRINDADE, OLIVEIRA e FIGUEIREDO, 2003). WUCHERPFENNING & GREEN (1999) publicaram um resumo de um trabalho chamando a ateno para as caractersticas similares entre o MTA e o Cimento Portland que acessvel nas casas de material para construo.

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2.1.1 - AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO MTA

TORABINEJAD et al, 1995, utilizando placas de gar sangue e gar Brucella inoculadas com nove espcies de bactrias facultativas e sete anaerbias, investigaram os efeitos antibacterianos no Amlgama, xido de zinco e eugenol, cimento Super-EBA e MTA. Nenhum dos materiais testados tiveram qualquer efeito contra Streptococcus faecalis, Streptococcus aureus e Bacillus subtilis, e to pouco contra Prevotella (Bacteroides) buccae, Bacteroides fragilis, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Prevotella (Bacteroides) melaninogenica e Peptostreptococcus anaerobius. ESTRELA et al, 2000, objetivaram analisar a ao antimicrobiana de alguns materiais como: MTA, Dycal, pasta de hidrxido de clcio, Sealapex e cimento Portland. Os elementos qumicos do MTA e de 2 cimentos Portland foram analisados. Foram utilizados 4 cepas bacterianas (Staphilococcus aureus, Enterococcus faecalis,

Pseudomas aeruginosa e Bacillus subtitis) e uma de fungo (Candida albicans) e uma mistura destes. Utilizadas 30 placas de Petri, com o uso de um cilindro de cobre, foram confeccionadas 4 cavidades em cada placa de 4mm de profundidade e 4mm de dimetro. As cavidades foram preenchidas com as substncias testes. As placas foram princubadas por 1 hora em temperatura ambiente e depois incubadas a 37 C por 48h. Os dimetros das zonas de inibio e difuso foram medidos. A anlise dos elementos qumicos presentes no MTA e em 2 amostras do cimento Portland foi realizada por meio de um espectrmetro de florescncia de raios X. Os resultados mostraram que a atividade antimicrobiana da pasta de hidrxido de clcio foi superior ao MTA, Portland, Sealapex e Dycal para os microorganismos testados, com zonas de inibio de 6-9, 5mm e de difuso de 10 a 18mm. O MTA, Portland e Sealapex apresentaram zonas de difuso, sendo que o Sealapex apresentou a maior delas. Para o Dycal no houve zonas de inibio ou difuso. Os cimentos Portland apresentaram as mesmas caractersticas qumicas do MTA, exceto que o MTA contm bismuto. DUARTE et al, 2002 averiguaram a contaminao existente entre o cimento MTA da ngelus sem esterilizao e do cimento de Portland. Os materiais testados foram: MTA ngelus cinza e branco, sem estarem esterilizados; e o cimento Portland de um saco recm aberto e de um aberto h dois meses. Atravs da anlise dos resultados pode-se concluir que o MTA de ngelus e cimento Portland de um saco recm aberto e de outro aberto de dois meses no apresentaram contaminao.

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Com a proposta de investigar in vitro o efeito antifngico do MTA, AL-NAZHAN e AI-JUDAI em 2003, realizaram uma pesquisa onde o MTA foi testado assim que manipulado e depois de 24 horas de tomar presa em relao Cndida albicans. O MTA foi incubado com a Cndida Albicans por 1h, 24h e 3 dias. Os resultados mostraram que o MTA recm manipulado foi efetivo na morte do fungo testado depois de 1 dia de contato, ao passo que o MTA que havia tomado presa depois de 24h, foi efetivo depois de 3 dias da incubao. A C. Albicans pode ser resistente a materiais como MTA por um perodo curto de tempo, isso pode justificar o crescimento positivo do fungo em ambos os grupos experimentais durante o perodo de 1h de observao. Os autores concluram que o MTA nos dois perodos testados, foi efetivo contra a Cndida Albicans. STOWE, 2004, determinou in vitro se a substituio de digluconato de clorexidina por gua estril atingiria atividade antimicrobiana do MTA (cor de dente) contra Actinomyces odontolyticus, F. nucleatum, S. sanguis, E. faecalis, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa e Candida albicans. Duas amostras com dimetro de 5 mm foram colocada em placas de petri com gar inocular com suspenses de cada microrganismos. Ento haviam duas amostras para cada microrganismos. O MTA (33g) misturado com clorexidina (12 microns) ou com gua estril (12 microns) foram acrescentadas em cada amostra preenchendo a placa de petri. As placas foram incubadas a 37C, como requerido para o crescimento bacteriano. As zonas de inibio foram mensuradas. Todas as amostras de MTA inibiram o crescimento bacteriano, assim como as misturas. O MTA / clorexidina mostrou zonas de inibio maiores (p < 0,0002) do que as outras amostras. Concluindo, a substituio de gua por clorexidina 0,12% atingiu a atividade antimicrobiana do MTA (da cor do dente). SIPERT, 2005, determinou a atividade antimicrobiano in vitro do Fill Canal, Sealapex, MTA, Portland e EndoRez em vrias espcies microorganismos. Mtodo de difuso em Muller-Hinton gar (MH) foi empregado. Uma camada base usando Mhagar e cinco amostras foram feitas por remoo de gar em pontos eqidistantes. O selamento foi feito nas amostras imediatamente aps a manipulao. Os microorganismos E. faecalis, E. coli, Micrococcus luteus, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa e C. Albicans foram semeados nas placas. As placas foram pr incubadas ficaram sem temperatura ambiente por duas horas para predifuso e incubadas a 37C por 24 horas. Inculo de 10 mL de gel cloridrato triphenyltetrazolium a 0,05% foram adicionados para melhorar as 24 horas de inibio medidas. O Sealapex e Fill Canal demonstraram atividade antimicrobiana em todos espcimes. Para o MTA e Portland somente E. coli no

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foi inibida. Nenhuma atividade de antimicrobiana foi de detectada pelo EndoRez. Neste estudo a Fill Canal, Sealapex, MTA e Portland apresentaram atividade antimicrobiana, enquanto o EndoRez no apresentaram.

2.1.2 - AVALIAO DA CITOTXICIDADE DO MTA

TORABINEJAD et al., em 1995, analisaram in vitro a cititoxicidade de quatro materiais retro-obturadores. Amlgama, Super-EBA, IRM e MTA recm-manipulados e aps 24 horas de manipulao, foram postos em contato com clulas L929 cultivadas em gar. As zonas de lise do MTA fresco e do MTA com presa completa no se mostraram significativamente diferentes. O MTA fresco mostrou-se menos txico que o IRM e o Super-EBA, e o MTA com presa completa, mais txica que o amlgama, mas menos que o Super-EBA e o IRM. Porm, atravs de um outro mtodo utilizando clulas tratadas com 51 Cr no mesmo trabalho, o amlgama e o Super-EBA recm manipulados mostraram-se menos txicos que o MTA e o IRM (este o mais txico). Aps 24 horas de incubao o MTA fresco foi menos txico. TORABINEJAD et al, em 1995, examinaram a reao tecidual ao MTA e ao SuperEBA implantados em mandbula de cobaias. Foram abertos retalhos em 7 cobaias e feitas duas cavidades de 2mm de dimetro e 2mm de profundidade no osso mandibular. Em metade das cavidades de 6 cobaias foram implantados anis de teflon com MTA e na outra metade com Super-EBA. Aps dois meses foi feita a anlise histolgica, observando-se presena de inflamao, tipos de clulas predominantes e espessura de tecido fibroso conectivo ao redor dos implantes. Ambos os materiais mostraram-se biocompatveis , mas 3 das 5 amostras do MTA no apresentaram inflamao, enquanto todas as amostras do Super-EBA apresentaram. TORABINEJAD et al, 1995, implantaram tubos de teflon preenchidos com SuperEBA e MTA em cavidades sseas feitas em mandbulas de seis porcos. Aps dois meses, a anlise histolgica com hematoxilina e eosina mostrou que a reao tecidual aos implantes de MTA foi levemente mais branda que aquelas encontradas nos implantes de Super-EBA. KEISER & TIPTON 1998, determinaram a citotoxicidade do MTA utilizando a viabilidade celular medida pela atividade da dehidrogenase mitocondrial de fibroblastos pulpares (culturas obtidas de trs molares humanos). Aps a terceira passagem, as clulas foram semeadas em culturas contendo extratos de vrias concentraes de MTA,

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e Dycal, ambos logo aps serem manipulados e aps 24 horas de serem manipulados. Metil metacrilato serviu como grupo controle positivo, enquanto um extrato do veculo testado serviu como grupo controle negativo. A colorimetria obtida pela atividade da dehidrogenase mitocondrial pode ser quantificada pela determinao da densidade ptica encontrada no espectrofotmetro. As diferenas dos valores de toxicidade entre os grupos foram medidas por um sistema de anlise. No houve diferena significativa na citotoxicidade do MTA quando comparado ao Dycal. OSRIO et al. em 1998 mensuraram, atravs de modelo de cultura de clulas L929 e fibroblastos humanos a citotoxicidade de materiais endodnticos, testando os cimentos obturadores Endomet, CRCS e AH26 e os materiais retro-obturadores amlgama, Gallium GF2, Ketac Silver, MTA e Super-EBA. Os efeitos cititxicos foram avaliados atravs de ensaios MTT de atividade enzimtica mitcondrial e ensaio CV para nmero de clulas. A anlise estatstica dos resultados mostrou que o CRCS foi o cimento obturador menos txico, seguido do Endomet e AH26. Quanto aos materiais retroobturadores, o MTA no se mostrou citotxico, o Gallium GF2 apresentou pouca citotoxicidade e o Ketac Silver, Super-EBA e amlgama apresentaram graus mais altos de citotoxicidade concluindo-se que os melhores resultados foram conseguidos com o CRCS e com o MTA. MITCHELL et al, 1999 testaram a biocompatibilidade de trs variaes de MTA e as compararam com substitutos sseos e material dental. O estudo foi conduzido pela cultura de clulas humanas na presena de material, contagem do nmero de clulas e quantificao da expresso de citocinas. A biocompatibilidade do MTA foi investigada, pela cultura celular osteosarcoma humana MG63 na presena do material, observando a citomorfologia e crescimento celular, e testando a expresso de citocinas pelas clulas. Os resultados mostraram um bom crescimento com o MTA Ento os autores concluram que as variaes do MTA, aparentemente, so biocompatveis e adequadas para uso clnico. KEISER et al, 2000, compararam a citotoxicidade do MTA e outros dois materiais comumente usados como material retrobturador. A atividade metablica celular foi testada aps a exposio a extratos dos materiais teste. Foram utilizados fibroblastos do Ligamento Periodontal (LP) obtidos de razes de trs molares superiores humanos impactados. Os materiais usados foram MTA, Super-EBA e Amlgama. O metil metacrilato (MMA) 2% foi usado como controle positivo. Os materiais foram manipulados de acordo com as recomendaes dos fabricantes e colocados em placas de cultura de

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tecidos. As amostras foram divididas em dois grupos: 1- materiais logo aps terem sido manipulados; 2- materiais mantidos por 24 horas a 37 em 100% de umidade relativa. A C seqncia de toxicidade da viabilidade celular foi Amlgama > Super-EBA > MTA. No grupo de 24 horas de presa, nos extratos de menores concentraes, a seqncia de toxicidade foi Super-EBA > MTA e Amlgama; e nos extratos de maior concentrao, Super-EBA > Amlgama> MTA. ZHU et al, 2000, verificaram a adeso de osteoblastos humanos em materiais retroobturadores como agregado trixido mineral (MTA), IRM, comsito e amlgama, observada atravs de microscopia eletrnica. Esses materiais foram condensados em discos de aproximadamente 1 mm de espessura e 1 mm de dimetro. Aps a pres a , eles foram colocados em placas de cultura de 96 poos. Foram semeados osteoblastos humanos na cavidade das placas a 1.5 x 10 clulas. Depois de 1 dia em cultura, foram examinados os discos dos materiais retroobturadores junto com as clulas crescidas na superfcie deles com o microscpio eletrnico. Resultados mostraram que os osteoblastos se fixam e difundem-se sobre o MTA e compsito pela formao de uma monocamada. Osteoblastos tambm se prenderam em amlgama, mas com poucas clulas estendidas. Na presena de IRM, osteoblastos apareceram ao redor sem nenhuma extenso. Estes resultados indicam que osteoblastos tm uma resposta favorvel ao MTA e ao compsito quando comparado com o IRM e amlgama.

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2.2 - POLMEROS INORGNICOS (GEOPOLMEROS)

Os polmeros inorgnicos, geopolmeros ou polissialatos, terminologia adotada para abreviatura de poli-silico-aluminatos, foram descritos pela primeira vez em patentes pelo Prof. J. Davidovits em 1981, onde so apresentados vrios exemplos de mistura de reagentes e processos de obteno. Os polissialatos apresentam caractersticas particulares que revelam o seu grande potencial de aplicao como aglomerante, em substituio ao cimento Portland. Segundo o autor, trata-se de uma adaptao moderna dos processos de estabilizao de solos caulinticos ou laterticos com cal(Ca[OH]), feita pelos antigos Romanos e Egpcios na confeco de peas estruturais. Em sua publicao, intitulada The Pyramids: An Enigma Solved, afirmou que as grandes pirmides do Egito foram erguidas, h 4.500 anos, com blocos moldados com este material. Estudos mineralgicos e qumicos constataram que os blocos no so de pedra calcria natural, e sim de um concreto feito a partir da mistura de pedregulhos de calcrio caulintico oriundos de Giz com NaOH, produzido in situ pela mistura de cal (Ca[OH]), barrilha (NaCO) e gua. Segundo as anlises, as pedras calcrias naturais so compostas por folhas fossilizadas dispostas paralelamente entre si, em camadas sedimentares. (DAVIDOVITS et al 1988). Nos blocos das pirmides, no entanto, as camadas so orientadas aleatoriamente, como ocorre quando pedregulhos de calcrio so aglomerados dentro do concreto. Realmente a composio qumica das pedras das pirmides similar a das estruturas geopolimricas feitas pelo homem atualmente. Estudos de difrao de raios X de amostras removidas dos blocos das pirmides de Cheops, Chefren, Teti e Sneferu indicam que a calcita (CaCO) a fase cristalina predominante. (DAVIDOVITS et al 1988). Entretanto, um material amorfo composto por silicatos e aluminossilicatos complexos e um material criptocristalino (zelita do tipo analcima,NaO.Al O 4SiO .2H O), acompanham a microestrutura. Estes compostos tambm so comumente encontrados em amostras de estruturas antigas existentes na Grcia, Chipre e Itlia, algumas com quase 9.000 anos de idade e em outras estruturas do perodo da Antiguidade. Considerase que a excelente durabilidade dessas estruturas est relacionada com a existncia de tais compostos. A preservao das pirmides atravs de milhares de anos a prova da extrema durabilidade dos materiais geopolimricos. (DAVIDOVITS et al 1988).

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Um cimento polimrico inorgnico base de filossilicatos naturais, de ultra-alta resistncia inicial e curvel temperatura ambiente, foi desenvolvido a partir destes estudos, pela variao das razes molares entre os seus principais xidos reagentes. Essas caractersticas fsico-qumicas garantem propriedades especiais, como: pega rpida, boa trabalhabilidade, coeso e acabamento superficial, que so observadas no estado fresco, associadas ao rpido desenvolvimento de resistncia mecnica e dureza superficial. Outras propriedades de destaque so: resistncia ao ataque qumico, ao calor, a chama e a melhor tenacidade fratura quando reforado por fibras. (DAVIDOVITS et al 1988). 2.2.1 Descrio Os geopolmeros so polmeros inorgnicos cuja obteno se d pela polimerizao de matrias primas naturais de origem geolgica contendo

aluminossilicatos. O termo foi introduzido por Davidovits para representar polmeros minerais resultantes da geoqumica. O processo de polimerizao envolve a reao qumica sob condies altamente alcalinas dos minerais Al-Si, produzindo a ligao polimrica Si-O-Al-O. A composio qumica dos materiais do geopolmero similar a das zelitas cristalinas, mas eles revelam uma estrutura atmica amorfa. O processo de polimerizao pode ser assistido por aplicao de calor seguido de secagem. A reao qumica rpida e a cura inicial requer um perodo entre 24 a 48 horas. 2.2.2 Caractersticas

um material considerado de baixo impacto ambiental, contribuindo para o desenvolvimento ecolgico. Alm das altas resistncias iniciais, as principais

propriedades do concreto de cimento geopolimrico, que superam os concretos tradicionais, so as qumica e abraso. O cimento geopolimrico no obtido pela fuso de calcrio e argila como o cimento Portland e sim formado pela reao qumica a temperaturas ordinrias de resduos e material virgem contendo quantidades suficientes de componentes reativos de alumina e slica.Os materiais geopolimricos so favorveis ao meio ambiente e resistncias s altas temperaturas, ao choque trmico, corroso

necessitam somente de energia moderada para ser produzido. Eles tambm podem ser produzidos usando subprodutos disponveis na indstria como material fonte. No concreto

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de cimento geopolimrico, a pasta geopolimrica serve para aglutinar os agregados grados e midos e qualquer material no reativo. (DAVIDOVITS et al 1988). Possui caractersticas especiais, pois foi desenvolvido com tecnologia inovadora, empregando principalmente argilominerais naturais e sintticos de forma distinta em relao indstria cimenteira tradicional, que tem como principal fonte, matria calcria para gerar o Clnquer Portland. Essa nova tecnologia contribui amplamente para

diminuio do impacto ambiental, j que h queda de 80% de emisso de gs carbnico para a atmosfera. (DAVIDOVITS et al 1988). Outra caracterstica relevante que, apesar de ser base de gua, os produtos de reao no so hidratos clcicos como nos cimentos convencionais. Isto traz como conseqncia a formao de uma matriz amorfa, mas estvel quimicamente. Assim, possui excelente durabilidade, no sofrendo os processos intensos de degradao que so observados em outros cimentos. 2.2.3 - Propriedades Mecnicas

Variam em funo da especificao das relaes composicionais do geopolmero. Uma vez estabelecida tais relaes, a resistncia mecnica e outras propriedades de interesse, podem sofrer alteraes em funo do trao. (DAVIDOVITS et al 1988).

2.2.4 - Resistncia Compresso

Pode variar de 30 a 100 MPa, em argamassa normal, de acordo com a composio da pasta, da temperatura e do tempo de cura. Apresenta resistncia compresso de 15 MPa a 20 e 22,5 / 24 MPa a 23/25 em 4 horas ap s a sua aplicao. O calor radiante C C acelera a pega e o endurecimento (a 65 apresentae m 1 hora 6,89 MPa e em 4 horas C 41,34 MPa). (DAVIDOVITS et al 1988).

2.2.5 - Cura

Para obter processamento ultra-rpido, podem ser utilizados: forno eltrico, exposio vapor dgua ou microondas. Nesses casos a temperatura no deve ultrapassar 100 (para evitar a evaporao da gua de amassamento). Essas curas C

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geram produtos com excelentes propriedades mecnicas em curtssimo tempo, sem o inconveniente de gerar fases instveis, como ocorre no cimento Portland curado termicamente. (DAVIDOVITS et al 1988).

2.2.6 - Cor e Textura

Apresentam tonalidades variadas, de acordo com as relaes composicionais, indo do bege ao cinza claro. Podem receber pigmentos para desenvolver inclusive tons pastis. A superfcie lisa e em alguns casos, quando se usam moldes de plstico ou de fibra de vidro, reflexiva, por causa da pelcula de silicato gerada. (DAVIDOVITS et al 1988).

2.2.7 - Mdulo de Elasticidade e Resistncia Trao

O mdulo de elasticidade do concreto de cimento geopolimrico um pouco mais alto que do Portland, equivalendo ao do concreto de alto desempenho (~28 GPa). A resistncia trao indireta (medida por com presso diametral) tambm cerca de 10% da resistncia compresso uniaxial, como no Portland. (DAVIDOVITS et al 1988).

2.2.8 - Massa Especfica

Mais baixa que a do cimento Portland, mas no concreto devido presena do agregado, esta diferena, torna-se pouco significativa. (DAVIDOVITS et al 1988).

(pasta de cimento Portland) = 2,55 kg/dm; (pasta de cimento geopolimrico) = 1,95-2,30 kg/dm.

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Proposio

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3 - PROPOSIO Objetivo Geral

Avaliar in vitro o potencial antimicrobiano e a citotoxicidade de trs grupos de um polmero inorgnico.

Objetivos Especficos

- Avaliar o potencial antimicrobiano de trs grupos de um polmero inorgnico atravs do teste de difuso em gar sobre os microrganismos Enterococcus Faecalis e Escherichia Coli.

- Avaliar a citotoxicidade de trs grupos de um polmero inorgnico atravs do seu grau de agressividade sobre a membrana celular de fibroblastos.

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Metodologia

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4 - METODOLOGIA 4.1 CONSIDERAES TICAS A realizao da presente pesquisa foi devidamente aprovada em reunio do Comit de tica de Pesquisa em Animais da Universidade Federal da Paraba, encontrando-se documentada sob o nmero de registro e identificao: CEPA N. 0211/08 4.2 DETERMINAO DAS FRAES MOLARES Inicialmente foi feita a padronizao da quantidade dos elementos que compem o cimento em funo de suas fraes molares, considerando-se a formao de gua na mistura e a adio do hidrxido de clcio. Por estequiometria, foram obtidas as seguintes quantidades mostradas nas tabelas 3 a 8:

Tabela 3 Composio padronizada com hidrxido de clcio

Na ausncia do hidrxido de clcio as quantidades foram assim determinadas:

Tabela 4 Composio padronizada sem hidrxido de clcio

Segundo PALOMO et

al, 1999, o acrscimo de hidrxido de clcio, embora

atuando como um ativador da reao alcalina, modifica sensivelmente as propriedades fsicas do material aps a presa. Neste estudo trabalhou-se com um limite de 20% de hidrxido de clcio buscando preservar estas propriedades.

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Aps chegar a estas propores, misturou-se os componentes para analisar a consistncia e em seguida calculou-se os valores das massas para 1/10 dos valores referidos nas tabelas anteriores. Admitiu-se 1/10 das massas calculadas por comodidade de manipulao e diluio da mistura. Sendo assim chegou-se s seguintes quantidades dos produtos para o grupo s1 (com hidrxido de clcio):

Tabela 5 Composio padronizada do grupo S1

Para o grupo s2 (sem hidrxido de clcio) obteve-se as seguintes propores: Tabela 6 Composio padronizada do grupo S2

Para a verificao da influncia do Hidrxido de Clcio, foi criado Grupo S3 que possui uma quantidade maior dessa substncia. As propores obtidas para o Grupo S3 so mostradas na tabela abaixo.

Tabela 7 Composio padronizada do grupo S3

O grupo s4 foi tratado como grupo controle. Em substituio ao hidrxido de clcio utilizou-se clorexidina adicionada ao silicato de sdio.

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Tabela 8 Composio padronizada do grupo S4

4.3 METODOLOGIA DA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Para avaliar a ao antimicrobiana do polmero dois microrganismos foram utilizados (Enterococcus Faecalis Escherichia Coli) em placas de gar com dupla camada. A base da camada foi composta por 10ml de gar Mueller Hinton (Difco, Detroit, USA) em placas de petri 20X100mm esterelizadas. Aps a solidificao do gar 5ml de meio de cultura Mueller Hinton foi adicionado contendo uma concentrao 106 UFC/ml dos microrganismos teste. Foram confecciondos quatro poos em cada placa em partes equidistantes. Os materiais foram manipulados de acordo com as instrues de GROSSMAN (1983) para cimentos. As placas foram mantidas a temperatura ambiente por duas horas para melhor difuso dos produtos. Aps foram incubadas por 24 horas a 37C em estufa bacteriolgica. Aps a incubao uma alquota de 5ml preparada com gar a 1% contendo 0,05% trifeniltetrazolium clorido (TTC) foi adicionado as placas, onde aps a solidificao dessa alquota as placas incubadas por 30 minutos em estufa bacteriolgica, de acordo com TANUMARO et al. (2007). Todo o teste foi realizado em triplicata.

4.4 METODOLOGIA DA AVALIAO DA CITOTXICIDADE

Para avaliar a citotoxicidade verificou-se a viabilidade celular atravs do teste que consiste na absoro do sal MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazlio]} (Sigma) pelas clulas, sendo reduzido no interior da mitocndria a um produto chamado formazana. Este produto, acumulado dentro da clula, extrado atravs da adio de um solvente apropriado (Mosmann, 1983). A suspenso celular de fibroblastos normais na concentrao de 2x106 clulas/mL foi distribuda em uma placa de 16 poos, 90 L por poo, e incubadas a 37 C em incubadora a 5% de CO2, juntamente com mais 10 L da amostra teste. O experimento foi incubado por 24 horas em

quadruplicata. Aps o perodo de incubao adicionou-se mais 10 L do corante MTT (5 mg/mL, Sigma) e as clulas foram novamente incubadas por mais 4 h. Em seguida, o

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meio foi retirado cuidadosamente e adicionaram-se 100 L de dimetilsulfxido (DMSO, Sigma) para solubilizao dos cristais de formazana. As placas foram agitadas durante 5 minutos e a absorvncia correspondente a cada amostra foi medida no espectrofotmetro digital de 550 nm, de acordo com MOSMANN 1983.

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Resultados

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5 - RESULTADOS

Os dados referentes s mdias dos dimetros da zona de inibio microbiana de cada grupo frente ao Enteroccocus Faecalis, obtidos no teste de difuso em gar, esto exibidos na Tabela 9. Os resultados mostram que os grupos testados apresentaram halos de inibio contra o Enteroccocus Faecalis sendo mais efetivos os grupos S1 e S4.

Tabela 9 Mdia (DP) de halos de inibio (em mm) frente cepa de E. faecalis.

Figura 1 - Halos de inibio frente cepa de E. faecalis.

J as mdias dos dimetros da zona de inibio microbiana de cada grupo frente a Escherichia Coli, esto exibidos na Tabela 10. Convm notar que os grupos S2 e S3 no

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apresentaram qualquer efeito antimicrobiano contra a Escherichia Coli. Os grupos S1 e S4 foram os mais ativos frente a este microorganismo.

Tabela 10 - Mdia (DP) de halos de inibio (em mm) frente cepa de E. Coli.

Figura 2 - Halos de inibio frente cepa de E. Coli.

O grfico na Figura 3 mostra os resultados da atividade antimicrobiana para quatro composies do Polmero Inorgnico:

S1 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Calcio S2 Polmero Inorgnico S3 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Clcio (Acrscimo de 10%) S4 Polmero Inorgnico + Clorexidina

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Figura 3 - Medida dos halos de inibio frente ao E. Faecalis e E. Coli.

Os resultados mostraram que S1, S2, S3 e S4 so grupos que possuem atividade antimicrobiana frente a cepa Enteroccocus Faecalis e dentre estes S1 e S4 apresentam maior halo de inibio.

Considerando-se os a ao dos grupos S1, S2, S3 e S4 em relao a cepa Escherichia Coli apenas S1 e S4 apresentaram halos de inibio. Os Grupos S2 e S3 no apresentaram qualquer atividade frente a cepa Escherichia Coli. A substituio do Hidrxido de Clcio por Clorexidina (Grupo S4), mostrou que a atividade antimicrobiana pode ser potencializada com a incorporao de antimicrobianos.

Na Tabela 11 pode-se visualizar as mdias de viabilidade celular dos seguintes grupos para diferentes concentraes:

DO1 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Calcio DO2 - Polmero Inorgnico DO3 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Clcio (Acrscimo de 10%) DO4 Polmero Inorgnico + Clorexidina

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Tabela 11 - Mdias de viabilidade celular. Teste MTT

A maior mdia de viabilidade celular para os Grupos DO1, DO2, DO3 e DO4 de 91,8% e ocorre na quantidade de 350 ug/ml conforme grfico na Figura 4.

Figura 4 - Citotxicidade dos grupos.

Tomando como referncia o valor de 91,8% para a viabilidade celular e a quantidade de 350 ug/ml, a seqncia crescente de toxicidade dos grupos a seguinte:

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DO1 < DO2 < DO3 < DO4. Verifica-se que o grupo DO1 foi o menos citotxico e que o grupo DO4 foi o mais citotxico. Vide Figura 5.

12 10 8 6 4 2 0
1 2 DO DO 3 DO DO 4

C itotxicidade

Figura 5 Ordem crescente de citotxicidade.

Considerando a excluso do Hidrxido de Clcio da formulao a adio de Clorexidina tornam o Polmero Inorgnico mais eficaz sob o ponto de vista antimicrobiano. Embora DO4 apresente o maior patamar de atividade antimicrobiana, deve-se considerar que uma composio com menor grau de citotxicidade mais interessante e assim uma formulao contendo Geopolmero + Hidrxido de Clcio se apresenta como uma possvel formulao para este cimento (DO1). Diante das caractersticas fsico-qumicas j conhecidas e biolgicas encontradas por este estudo verifica-se que este polmero, diferente do MTA, expande suas possibilidades de aplicao para muitas outras reas da odontologia sugerindo novos estudos que desenvolvam estas novas aplicaes. Para anlise do Trixido agregado mineral e estudo comparativo com o cimento Portland utilizou-se a tcnica de difratometria de raios X de uma amostra (MTA Angelus), fornecida pelo laboratrio de endodontia da UFPB. Na Figura 6 pode ser visto os valores das cartas de difratometria de elementos que compem o cimento portland.

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Figura 6 Valores de Rdx para cimento Portland na literatura. Verificando-se a presena dos picos mostrados na Figura 6 contra valores obtidos pelo espectrmetro possvel atestar a presena dos mesmos compostos do cimento Portland na amostra do MTA ngelus alm do composto xido de bismuto reconhecido como agente radiopacificador. Vide Figura 7.

Figura 7 Rdx de Amostra de MTA Angelus.

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Discusso

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6 - DISCUSSO

A busca de novas alternativas para abordagem dos problemas em odontologia e o desenvolvimento da cincia e tecnologia, tem influenciado expressivamente a qualidade dos materiais odontolgicos. Pode-se observar ao longo dos anos o aparecimento de inmeros materiais com excelentes qualidades para reestruturar tecidos dentrios. De acordo com a histria dos materiais odontolgicos o primeiro cimento desenvolvido foi o xido de zinco eugenol introduzido em 1860, sendo utilizado inicialmente como material de preenchimento para restauraes e cimentao. No entanto, mostrou-se pouco eficaz para tal finalidade sendo hoje bastante utilizado como cimento curativo provisrio. J em 1879, o cimento de fosfato de zinco foi utilizado pela primeira vez em procedimentos odontolgicos e na atualidade, mais de cem anos aps a sua descoberta, ainda largamente utilizado na cimentao de prteses (SCHULEIN 2005). No inicio do sculo passado, em 1908, o cimento de silicato apresentado a odontologia, sendo utilizado nos estados unidos como material restaurador e considerado na poca um cimento restaurador semi-esttico. Uma das vantagens do cimento de silicato era a liberao do flor que contribua para o controle da perda mineral do tecido dental, entretanto a alta solubilidade desse cimento diminua a longevidade das restauraes feitas com o mesmo. Nygren props a utilizao do hidroxido de clcio para o tratamento de fistulas dentais, enquanto que Codman em 1851, o empregava nos casos de amputaes radiculares de polpas vivas. Somente em 1920 por intermdio de Bernhard W. Hermann que o hidrxido de clcio passou a ser cientificamente empregado, pesquisado e difundido como cimento (SIQUEIRA E LOPES 2004). Em 1968 surge o cimento de ionmero de vidro onde Wilson e Kent descrevem o mesmo em 1971 como silicato de baixa solubilidade com liberao de flor. Na atualidade tem sido utilizado no capeamento pulpar, restaurao de dentes decduos, como curativo provisrio alm de outras extensas aplicaes (SCHULEIN 2005). Alm destes materiais um destaque merecido deve ser dado ao surgimento do Trioxido Agregado Mineral, desenvolvido na Universidade de Loma Linda pelo Prof. Mahmoud Torabinejad. Os resultados dos estudos apresentados na literatura mostram que o Trioxido Agregado Mineral possui um futuro promissor dentro da Odontologia, mas o seu acesso aos profissionais, que muitas vezes sabem de suas propriedades e vantagens em relao a outros materiais, limitado em decorrncia de seu custo elevado. (TORABINEJAD et al., 1993).

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No presente trabalho, props-se estudar in vitro o efeito antimicrobiano e a citotxicidade de um polmero inorgnico resultante de ativao alcalina. Determinar o potencial uso deste cimento na odontologia pode significar a descoberta de uma alternativa estratgica ao Trixido Agregado Mineral. Estudou-se o efeito antimicrobiano do Polmero Inorgnico frente a diferentes cepas (Enteroccocus Faecalis, Escherichia Coli), por meio do teste de difuso em Agar e a citotoxicidade atravs do teste MTT em fibroblastos. A metodologia desenvolvida foi tambm empregada em outras investigaes, sendo cuidadosamente obedecida (TANUMARO et al. 2007).

6.1 DISCUSSO DA METODOLOGIA DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA A metodologia de difuso em placa Petri com mensurao dos halos de inibio bastante utilizada em laboratrio mesmo nos dias atuais, entretanto, existem crticas a esse mtodo por no demonstrar o verdadeiro potencial da substncia devido falta de solubilidade e de espalhamento da substncia em teste. Estrela et al. (2001) discutiram a importncia e a influncia da metodologia nos diferentes resultados que so alcanados nas investigaes. Os resultados de muitos estudos so diferentes em decorrncias das diferenas metodolgicas. Parmetros similares para a atuao de algumas substncias com caractersticas antimicrobianas devem ser requeridos. Os testes de difuso em gar, utilizando-se como referncia parmetros de medida dos halos de inibio de crescimento microbiano, muitas vezes no oferecem condies de igualdade quando se comparam determinadas substncias com solubilidade e difusibilidade diferentes. Aspectos como concentrao do gar, temperatura, pH, ausncia de pr-incubao, ressecamento do meio de cultura, manuteno em perodos que excedam os permitidos para a correta anlise favorecem a obteno de resultados discutveis. O teste de difuso em agar que adota o tamanho das zonas de inibio do crescimento microbiano como parmetro de referncia, freqentemente no oferece condies de igualdade para comparao de algumas substncias com solubilidade e difusibilidade distintas. Fatores como princubao, ressecamento do meio de cultura, manuteno por perodos que excedam o tempo ideal permitido para a correta anlise podem levar a resultados questionveis (ESTRELA et al., 2001). Siqueira Jr e Uzeda (1997) relatam que o teste de difuso em agar comumente usado para avaliar a atividade antibacteriana de materiais endodnticos. Entretanto os resultados obtidos so analisados com reserva. As zonas de inibio bacteriana dos

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medicamentos dependem da toxicidade dos medicamentos em relao s bactrias testes, bem como a capacidade de difusibilidade do medicamento no meio. Tanomaru Filho, Leonardo e Silva (2002), afirmam que, dentre os inmeros mtodos de avaliao da atividade antimicrobiana de materiais utilizados em endodontia, o mtodo de difuso em agar, um dos mais utilizados. No entanto, algumas peculiaridades desses testes devem ser consideradas tais como o contato do material experimental com o agar, o peso, o tamanho e a forma molecular do agente antimicrobiano, pois so fatores relevantes capacidade de difuso dos materiais em agar. Ainda os microorganismos utilizados, o volume, e profundidade do agar, temperatura de incubao das placas. Escolheu-se a cepa Enteroccocus Faecalis e Escherichia Coli por estarem fortemente ligados ao insucesso do tratamento endodntico assim, encontrar possveis produtos que auxiliem na efetividade antimicrobiana desse microrganismo seria clinicamente muito importante. A seleo dos microorganismos tambm teve como base a investigao em experimentos anteriores de outros autores utilizando outros cimentos para fins comparativos.

6.2 DISCUSSO DA METODOLOGIA DA CITOTXICIDADE De acordo com as categorias nas quais os materiais dentrios so classificados, diferentes protocolos de pesquisa devem ser desenvolvidos, a fim de avaliar e determinar os comportamentos biolgicos, e suas possveis indicaes para uso clnico. Para um cimento odontolgico obter sucesso clinicamente, todo o sistema deve ser biocompatvel. Por isto, devem ser recomendados testes para avaliar a biocompatibilidade. Estes testes avaliam de maneira preliminar um determinado material dentrio, caracterizando seu perfil de toxicidade em um sistema biolgico especfico. Para que todos estes testes sejam realizados e avaliados, so necessrios profissionais capacitados nas mais diferentes reas do conhecimento, visando eliminar qualquer produto ou componente que tenha potencial para causar dano tecidual. Os testes podem ser feitos tanto in vitro quanto in vivo. Nos testes in vitro avaliam-se as propriedades do material diretamente em cultura de clulas que reagem aos efeitos dos produtos analisados. Um exemplo o teste MTT que consiste na absoro do sal MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio]} pelas clulas, sendo reduzido no interior da mitocndria a um produto chamado formazana. Este produto, acumulado

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dentro da clula, extrado atravs da adio de um solvente apropriado (Mosmann, 1983) e observadob atravs de um spectrofotmetro digital. (ANUSAVICE, 2004). Muitos componentes julgados inicialmente como citotxicos podem ser modificados ou ter seu uso controlado pelos fabricantes para prevenir a citotoxicidade. Os testes in vivo baseiam-se principalmente na implantao dos materiais em reas subcutneas de ratos ou intramusculares de coelhos, avaliando-se a resposta do tecido ao material implantado aps determinado tempo de observao (ANUSAVICE, 2004). Para realizao deste teste, necessrio o envolvimento tanto de cientistas da rea de sade (bilogos, patologistas, microbiologistas, histologistas, veterinrios, entre outros) para

desenvolvimento da metodologia da pesquisa e avaliao da resposta tecidual, quanto estudiosos relacionados ao desenvolvimento dos materiais e suas propriedades (engenheiros, farmacuticos, qumicos e fsicos) e ainda estaticistas para a elaborao da anlise dos resultados. Lemmons e Natiella (1986) concluram que as propriedades funcionais e a biocompatibilidade so questes bsicas no desenvolvimento dos biomateriais e salientaram que existem vrias metodologias para analisar essas propriedades, entretanto, em todos os casos o hospedeiro humano tem sido o teste final. Norman e Wright (1986) realizaram testes de uso para comparar materiais cimentantes, quanto sensibilidade ps-operatria, avaliando dados subjetivos e objetivos em pacientes. Nota-se a importncia dos testes biolgicos, visto que um material para ser usado na cavidade oral deve ser atxico, no absorvvel pelo sistema circulatrio e no deve provocar injrias nos tecidos orais. Materiais no biocompatveis podem mostrar-se mutagnicos ou ainda influenciar mediadores da inflamao provocando respostas sistmicas, incluindo toxicidade, teratogenias ou efeitos carcinognicos. Tais materiais devem ser isentos de agentes que possam causar respostas alrgicas a indivduos sensveis a essas substncias (ANUSAVICE, 2004). De acordo com o relatado, questiona-se a possibilidade de um profissional de uma nica rea de atuao realizar anlises to distintas para avaliar se um material preenche os requisitos da biocompatibilidade. Esta situao pode ocasionar estudos com metodologia duvidosa e anlises imprecisas, levando a resultados equivocados. Sendo assim, o pesquisador pode enfrentar dificuldades na realizao de seu estudo e necessitar de profissionais com conhecimentos variados para permitir o desenvolvimento do trabalho, posterior interpretao dos dados e oferecer maior credibilidade complexa pesquisa sobre a biocompatibilidade de um material.

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Estudos in vitro so importantes por gerar conhecimento, alm de potencializar modificaes na estrutura da substncia antes de empreg-la em modelo animal e em seres humanos. No entanto, a extrapolao dos resultados limitada, pois ensaios laboratoriais no so capazes de representar a realidade do meio interno dos estudos in vivo. Desta forma, estudos em animais e ensaios clnicos so necessrios para comprovar a real citotoxicidade do Polmero Inorgnico.

6.3 DISCUSSO DOS RESULTADOS

Quatro composies do Polmero Inorgnico foram propostas para anlise da Atividade Antimicrobiana:

S1 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Calcio S2 Polmero Inorgnico S3 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Clcio (Acrscimo de 10%) S4 Polmero Inorgnico + Clorexidina

Os grupos S1, S2, S3 e S4 constitudos, foram selecionados para estudo de comparao dentro de um enfoque antimicrobiano e de citotoxicidade afim de determinar a composio mais vantajosa. Os resultados mostraram que S1, S2, S3 e S4 so grupos que possuem atividade antimicrobiana frente a cepa Enteroccocus Faecalis e dentre estes S1 e S4 apresentam maior halo de inibio. Considerando-se os a ao dos grupos S1, S2, S3 e S4 em relao a cepa Escherichia Coli apenas S1 e S4 apresentaram halos de inibio. A substituio do Hidrxido de Clcio por Clorexidina (Grupo S4), mostrou que a atividade antimicrobiana pode ser potencializada com a incorporao de antimicrobianos.

Aps atestar o potencial antimicrobiano, procurou-se analisar a citotoxicidade dos seguintes grupos:

DO1 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Calcio DO2 Polmero Inorgnico DO3 Polmero Inorgnico + Hidrxido de Clcio (Acrscimo de 10%) DO4 Polmero Inorgnico + Clorexidina

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Observando-se o grau de agressividade contra a membrana celular de fibroblastos, aps um perodo de incubao de 24 horas, foi observada uma mdia de viabilidade celular de 91,8% na presena de 350 ug/ml do composto concluindo-se que o polmero estudado um produto de baixa toxicidade. A seqncia crescente de toxicidade dos grupos foi a seguinte: DO4 > DO3 > DO2 > DO1. Verificou-se que o grupo DO1 foi o menos txico e que o grupo DO4 foi o mais txico. Os resultados deste estudo mostram que o Polmero Inorgnico apresenta potencial biolgico em grau comparvel queles obtidos por outros estudos realizados sobre o MTA, Cimento Portland e outros cimentos odontolgicos. Alguns destes estudos j foram citados como TORABINEJAD et al, 1995, utilizando placas de gar sangue e gar Brucella inoculadas com nove espcies de bactrias facultativas e sete anaerbias, investigaram os efeitos antibacterianos no Amlgama, xido de zinco e eugenol, cimento Super-EBA e MTA. Nenhum dos materiais testados tiveram qualquer efeito contra Streptococcus aureus e Bacillus subtilis, e to pouco contra Prevotella (Bacteroides) buccae, Bacteroides fragilis, Prevotella (Bacteroides) intermedia, Prevotella (Bacteroides) melaninogenica e Peptostreptococcus anaerobius.ESTRELA et al. (2000) em que a

atividade antimicrobiana da pasta de hidrxido de clcio foi superior a todas as outras substncias (MTA, cimento Portland, Sealapex e Dycal), sobre todos os microrganismos testados. AL-NAZHAN e AI-JUDAI em 2003, mostraram que o MTA recm manipulado foi efetivo na morte do fungo C. Albicans testado depois de 1 dia de contato, ao passo que o MTA que havia tomado presa depois de 24h, foi efetivo depois de 3 dias da incubao. SIPERT, 2005, determinou a atividade antimicrobiana in vitro do Fill Canal, Sealapex, MTA, Portland e EndoRez em vrias espcies microorganismos. O Sealapex e Fill Canal demonstraram atividade antimicrobiana em todos espcimes. Para o MTA e Portland somente E. Coli no foi inibida. Nenhuma atividade de antimicrobiana foi de detectada pelo EndoRez. Neste estudo a Fill Canal, Sealapex, MTA e Portland apresentaram atividade antimicrobiana, enquanto o EndoRez no apresentaram. Certamente novos estudos devem ser desenvolvidos com o intuito de se alcanar mais resultados palpveis, mais informaes sedimentadas, que mais se aproximem em maior abrangncia do contexto de possveis usos clnicos deste Polmero Inorgnico, visto que apenas ensaios de efeitos antimicrobianos e testes de biocompatibilidade inicial foram investigados. No momento cabe-se a expectativa positiva de uso futuro deste novo material nos vrios campos da odontologia face aos resultados encontrados.

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Concluses

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7 - CONCLUSES

Considerando as condies experimentais deste estudo, os resultados obtidos permitem concluir que:

a) O composto S1 apresentou atividade antimicrobiana frente s cepas de E. coli e E. faecalis sendo esta ltima a mais susceptvel. b) Os compostos S2 e S3 no inibiram o crescimento da cepa E. coli indicando ausencia de atividade antimicrobriana para esta espcie. c) Os compostos S2 e S3 inibiram o crescimento da cepa E. faecalis indicando ao antimicrobiana destes compostos. d) O composto S4 apresentou atividade antimicrobiana frente s cepas de E. coli e E. faecalis sendo esta ltima a mais susceptvel. e) A presena de gluconato de clorexidina na preparao de S4 indica que a atividade antimicrobiana dos compostos S1, S2,e S3 pode ser potencializada incorporando antimicrobianos. f) O composto DO1 apresentou viabilidade celular de 95,89% sendo considerado o menos citxico, na quantidade de 350 ug/ml. g) O composto DO4 apresentou viabilidade celular de 88,87% sendo considerado o mais citxico, na quantidade de 350 ug/ml. h) A mdia de viabilidade celular dos compostos DO1, DO2, DO3 e DO4 de 91,8% na quantidade de 350 ug/ml. i) Os Grupos DO1, DO2, DO3, DO4 possuem baixa cittxicidade e portanto so biocompatveis.

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