Material Complementar Laboratrio Prof.

. Luiz Fsica Aplicada Experimento: Anlise Colorimtrica em Espectrofotmetro: Introduo: A espectrofotometria consiste em usar o espectro radiante para estudar as solues biolgicas e qumicas. No procedimento bsico, um feixe de energia atravessa a soluo, e sua absoro oferece informaes sobre a qualidade e quantidade dos componentes presentes. Para as anlises espectrofotomtricas, a faixa do espectro de radiao mais utilizada vai do ultravioleta ( = 200 nm) at o infravermelho ( = 1000 nm). A faixa do visvel vai de 400 a 750 nm, onde os seres humanos experimentam uma gama de sensaes visuais denominada cores (veja Figura abaixo). A luz usada em espectrofotometria chamada luz monocromtica, pois referente a um nico comprimento de onda que obtido atravs de um espectrofotmetro:

Figura 1: Esquema do Espectrofotmetro: A fonte de luz tem seu feixe focalizado pelo colimador (C) sobre um prisma de quartzo. A luz decomposta em ultravioleta (UV), violeta (VI), azul (AZ), verde (VE), amarelo (AM), laranja (LA), vermelho (VR) e infravermelho (IV). Ume fenda seletora escolhe uma fina poro desse espectro como luz monocromtica (luz MC). A luz MC passa atravs da cubeta que contm a soluo, e parte absorvida, parte transmitida. Uma fotoclula acoplada a um galvanmetro mede a luz transmitida. A diferena a luz absorvida. O galvanmetro tem uma escala especial de 0,0 a 2,00, que indica leituras lineares (aritmeticamente proporcionais absoro da luz). As fontes de

luz para ultravioleta so geralmente lmpadas de Hidrognio, ou de Deutrio. Para o visvel e infravermelho, lmpadas de tungstnio e irradiadores de cermica so usados. A decomposio da luz feita, alm de primas, por grades de difrao. Um mtodo simples de obter luz MC usar filtros, que so pedaos de vidro colorido especiais, que deixam passar a luz da sua cor. A luz MC dos filtros de qualidade inferior dos primas e grades. possvel obter comprimentos de onda que sejam especficos para certas substncias atravs da construo de uma curva de absoro espectral (varredura); onde a substncia em questo (aquela que se quer determinar) colocada na cubeta, e os comprimentos de onda do UV at o IV vo sendo passados, e a absoro de cada faixa medida. O comprimento de onda a ser ajustado no aparelho ser aquele onde tiver ocorrido a maior absorbncia, pois, em essncia se trata do pico de absoro de energia pela molcula. Ex: Para a anlise do teor de glicose deve-se ajustar o aparelho em 500 nm, pois, se trata da maior absorbncia para esta molcula. A lei de Lambert & Beer possvel, por simples comparao visual, determinar a concentrao aproximada de uma soluo colorida comparando-a com solues do mesmo soluto que tenham concentraes conhecidas. Quando dispomos de aparelhos capazes de medir a intensidade da luz transmitida pelas solues (fotocolormetros ou espectrofotmetros) podemos determinar a concentrao da soluo desconhecida pela aplicao da lei de Lambert & Beer que correlaciona a intensidade da luz transmitida com a concentrao do soluto na amostra. Lei de Lambert Quando a concentrao da substncia constante, a absoro depende do comprimento do trajeto ptico. Lei de Beer Quando o trajeto ptico constante, a absoro depende da concentrao. Combinando as duas leis, Absoro proporcional ao trajeto ptico e concentrao.

Abs = a.c.l

O que demonstra que a Absorbncia (Abs) de uma soluo proporcional (relao linear) concentrao do soluto corado (c). A partir da proporcionalidade entre absorbncia e concentrao possvel obter uma curva de calibrao, ou seja, um grfico relacionando a Abs e a Concentrao da amostra. Figura: Curva de Calibrao para Mtodo Enzimtico (GOD-POD) de deteco
Abs (nm) 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 glicose (mg/mL) y = 0,3496x - 0,0011 R2 = 0,9994

de glicose. R2 chamado de coeficiente de determinao e junto ao coeficiente de correlao R um indicativo da linearidade do mtodo desenvolvido. Mtodos devem ter linearidade alta, ou seja, prximas a 1,0000 para que possam ser utilizados em uma tcnica espectrofotomtrica. A equao da reta y=a.x + b permite a relao direta entre a absorbncia (y) e a concentrao presente na amostra (x). Assim: Abs = a.[concentrao] + b Para o exemplo acima temos: Abs = 0,3496.[glicose] 0,0011

A partir da equao de reta possvel determinar o valor de concentrao para qualquer amostra analisada no espectrofotmetro. Exemplo: Amostra resultou em Abs = 0,356. Pela equao: 0,356=0,3496x[glicose]-0,0011 0,356-0,0011 = 0,3496x[glicose] 0,3549 = 0,3496 x [glicose] 0,3549/0,3496 = [glicose] 1,015 mg/mL = [glicose]