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PRODUO DE BIOETANOL DE BAGAO DE CANA-DE-ACAR

Julliana Ribeiro Alves dos Santos1, Ester Ribeiro Gouveia2 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a produo de bioetanol a partir do bagao de cana-deacar, aps pr-tratamento por exploso a vapor e hidrlise enzimtica para a converso de celulose em glicose. A hidrlise enzimtica tambm foi realizada com material deslignificado. As fermentaes foram realizadas em meios base dos hidrolisados enzimticos de bagao de cana-de-acar a 30C. As eficincias das hidrlises enzimticas alcanaram 44%, independente do material utilizado. Entretanto, a hidrlise com o material deslignificado foi 30% mais rpida. A deslignificao aumentou em 10% o rendimento de bioetanol em relao glicose e em 96% em relao ao bagao. Palavras-chave: bagao, hidrlise, bioetanol, Saccharomyces.

BIOETHANOL PRODUCTION FROM SUGAR CANE BAGASSE ABSTRACT The aim of this work was to evaluate the production of bioethanol from sugar cane bagasse, after pre-treatment by steam explosion and enzymatic hydrolysis to convert cellulose in glucose. The enzymatic hydrolysis also was carried out with delignified material. The fermentation were carried out in the media based on hydrolysates from sugarcane bagasse at 30 C. The efficiencies of enzymatic hydrolysis reached 44%, regardless of the material used. However, the hydrolysis with the delignified material was 30% faster. The detoxification increased 10% the yield of bioethanol in relation to glucose and in 96% on the bagasse. Keywords: bagasse, hydrolysis, bioethanol, Saccharomyces.

INTRODUO O bagao de cana-de-acar, para a maior parte dos pases tropicais, um dos principais materiais lignocelulsicos utilizados para a bioconverso em etanol, uma vez que apresentam alta concentrao de carboidratos, baixo contedo relativo de lignina, fcil

utilizao, baixo custo de colheita, de transporte e de armazenagem Pandey & Soccol (2000). Materiais lignocelulsicos, como o bagao de cana-de-acar, so os mais abundantes complexos orgnicos de carbono na forma de biomassa de planta e consistem principalmente de trs componentes: celulose, hemicelulose e lignina (Badhan et al., 2007).

_______________________ Protocolo 1132 de 20/06/2008 1 Pesquisadora, Biomdica, UFPE, Departamento de Antibiticos, Av. Prof. Moraes Rgo, Cidade Universitria, Recife-PE, julliana.santos85@gmail.com, (81) 21268346 1 Professora Adjunta, Doutora em Engenharia Qumica, UFPE, Departamento de Antibiticos, Av. Prof. Moraes Rgo, Cidade Universitria, Recife-PE, estergouveia@gmail.com, (81) 21268346

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A hidrlise enzimtica desses materiais conduzida atravs de enzimas celulases, que so altamente especficas. Celulases so usualmente uma mistura de diversas enzimas. Os trs maiores grupos de celulases que esto envolvidas no processo de hidrlise so: endoglucanases; exoglucanases e betaglucosidase (Sun & Cheng, 2002). As celulases quebram a celulose em celobiose, que subsequentemente clivada a glicose pela betaglucosidase (Palmqvist & Hahn-Hgerdal, 2000). As endoglucanases agem de forma aleatria, clivando ligaes beta, dentro da molcula da celulose; as celobiohidrolases (exoglucanases) remo-vem as unidades de celobiose a partir das extremidades da cadeia da celulose e a -glicosidase quebra celobiose em duas unidades de glicose (Lima et al., 2005). Segundo Martin et al. (2006), a hidrlise necessria para a converso de polissacardeos da lignocelulose a acares fermentescveis. A hidrlise enzimtica conduzida em condies amenas de pH e de temperatura (pH = 4,8 e temperatura = 45-50 C) e no apresenta problemas de corroso, como observado nas hidrlises com cidos e/ou com bases (Duff & Murray, 1996). Entretanto, para uma eficiente hidrlise enzimtica, necessrio primeiramente submeter o material lignocelulsico a um pr-tratamento, para disponibilizar a celulose ao ataque enzimtico. Os processos de pr-tratamentos de materiais lignocelulsicos podem ser trmicos, qumicos, fsicos, biolgicos ou uma combinao de todos esses, o que depender do grau de separao requerido e do fim proposto (Ferraz et al., 1994; Carrasco, 1992). Devido s condies empregadas nos prtratamentos trmicos e qumicos, originada uma srie de compostos que podem atuar como inibidores potenciais tanto da hidrlise enzimtica, quanto da fermentao. Os tipos de compostos txicos e suas concentraes em hidrolisados lignocelulsicos dependem tanto da matria-prima, quanto das condies operacionais empregadas no pr-tratamento. Os produtos de degradao, que so potenciais inibidores da fermentao, se agrupam em trs categorias: derivados furnicos (furfural e 5hidroximetilfurfural - HMF), cidos orgnicos fracos (como cido actico) e derivados fenlicos (Palmqvist & Hahn-Hgerdal, 2000). O objetivo deste trabalho foi comparar a produo de bioetanol utilizando hidrolisados enzimticos de dois tipos de material lignocelsico, ou seja, bagao de cana-de-

acar pr-tratado por exploso a vapor com e sem deslignificao. MATERIAIS E MTODOS Microrganismo O microrganismo utilizado nas fermentaes foi uma linhagem de levedura industrial, Saccharomyces cerevisiae UFPEDA1238, cedida pela Coleo de Culturas do Departamento de Antibiticos da Universidade Federal de Pernambuco. Meios de Cultura O meio de cultura utilizado para a conservao do microrganismo foi o meio GLP, em tubo de ensaio inclinado, contendo: glicose (20 g/L), extrato de levedura (5 g/L), peptona (3 g/L) e gar (1,5 % P/V). Na preparao do inculo, tambm foi utilizado o meio GLP, porm sem adio de gar. Os meios de fermentao base de hidrolisado enzimtico, foram suplementados com (NH4)2SO4 (1 g/L), K2HPO4 (0,5 g/L), MgSO4.7H2O (0,25 g/L), extrato de levedura (2 g/L), peptona (1 g/L). O pH do meio de fermentao foi ajustado para 5,0. Hidrlise Enzimtica Foram realizadas hidrlises enzimticas com dois tipos de bagao de cana-de-acar. Na hidrlise A, foi utilizado um bagao pr-tratado por exploso a vapor, cedido pela Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP). Na hidrlise B foi utilizado este material, mas aps deslignificao com NaOH. Antes de cada hidrlise, os bagaos foram submetidos moagem no pulverizador modelo Pulverisette 14 da FRITSCH (20 mesh). Na hidrlise enzimtica A, a concentrao de bagao utilizada, desde o incio do processo foi de 186,16 g/L. Esta hidrlise foi realizada em frascos de erlenmeyer de 500 mL, contendo 48 mL de tampo citrato (pH = 4,8), 2 mL de preparao comercial da enzima Celluclast e 10 g de bagao. Os frascos foram mantidos em mesa incubadora rotativa, modelo C25KC Incubator Shaker, marca New Brunswick Scientific, 50 C e 150 rpm, durante 67 horas. Antes da hidrlise B, foi realizada a deslignificao do bagao pr-tratado por exploso a vapor, em reator do tipo autoclave eletrnica, modelo: AU/E-20, do fabricante Regmed Indstria Tcnica de Preciso Ltda.

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Foram transferidos para o reator, 0,5 Kg do bagao, 10 L de gua destilada e 100 g de NaOH. A mistura permaneceu 100 C, durante 1 hora, sob agitao de 100 rpm. Aps a deslignificao, a polpa foi separada do licor por filtrao. Foram efetuadas 7 lavagens, cada uma com 2,5 L de gua destilada 700C, para a retirada da lignina que ainda estava impregnada no material. A hidrlise B foi realizada em frascos de erlenmeyer de 500 mL, contendo 48 mL de tampo citrato 50 mM (pH = 4,8), 2mL da mesma preparao comercial de enzima utilizada na hidrlise A e 10 g de bagao prtratado com vapor e deslignificado com NaOH. Com 24 horas de hidrlise, foram adicionados 40 mL de tampo citrato, pois o volume de tampo que foi utilizado no incio da hidrlise no foi suficiente para homogeneizar a mistura. A concentrao de bagao alcanada no final da hidrlise, que durou 79 horas, foi de 105,08 g/L. No final das hidrlises A e B, cada mistura foi filtrada em papel de filtro quantitativo (de 80 g/m2; cinza 0,00005 g; permeabilidade ao ar: 3 L/s m2 e porosidade da maioria dos poros de 8 m) para separar o hidrolisado da polpa. O hidrolisado foi novamente filtrado em membrana de 0,45m para a quantificao de carboidratos, cidos orgnicos, HMF, furfural e fenis totais. Fermentaes Inicialmente, a linhagem foi repicada em tubo de ensaio contendo o meio GLP slido (pH = 7,0), o qual foi mantido a 300C durante 24 horas. Aps esse perodo, o inculo foi preparado atravs de outro repique em frasco de erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio GLP lquido (pH = 7,0), o qual foi acondicionado a 250 rpm e a 300C, por 12 horas, em mesa incubadora rotativa da New Brunswick Scientific C25KC. A fermentao A (utilizando o hidrolisado enzimtico A) foi realizada em frascos com dimenso de 8,4 cm x 2,4 cm. Um volume de 1,8 mL (10% V/V) do inculo foram transferidos para os frascos contendo 16,2 mL do meio de fermentao, base do hidrolisado enzimtico A. Os frascos foram mantidos a 30 C, sem agitao. As fermentaes utilizando o hidrolisado enzimtico B foram realizadas sem (B1) e com (B2) agitao (80 rpm). Na primeira situao (B1), foram realizadas fermentaes em frascos semelhantes aos da fermentao A,

tambm a 300C. Na segunda situao (B2), foram realizadas fermentaes em frascos de erlenmeyer de 125 mL, contendo 16,2 mL do meio de fermentao e 1,8 mL de inculo, os quais foram mantidos 30 C, sob agitao de 80 rpm em mesa incubadora rotativa da New Brunswick Scientific C25KC. Mtodos Analticos Determinao de CO2 A formao de CO2 foi determinada pela perda de peso, efetuando-se a pesagem dos frascos em balana semi-analtica da Sartorius BP3100S, aps leve agitao manual durante 1 minuto. Determinao de biomassa A determinao da biomassa foi realizada por gravimetria. Um volume de 10 mL das amostras das fermentaes, no incio e no final das fermentaes, foi filtrado em membrana de 0,45 m, previamente pesadas em balana analtica da Sartorius BB121S. A biomassa foi seca em estufa, a 80C, por 24 horas. Determinao de carboidratos, cido actico, glicerol e etanol As determinaes das concentraes de carboidratos, cido actico, glicerol e etanol foram realizadas por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), utilizando um cromatgrafo lquido da Agilent HP 1100. As condies cromatogrficas foram: coluna Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%), cido sulfrico 5 mM como fase mvel, deteco por ndice de refrao. Vazo de 0,6 mL/min e temperatura de 450 C foram utilizadas na determinao de carboidratos e de cido actico. Enquanto que, vazo de 1,0 mL/min e temperatura de 300 C foram utilizadas na determinao de glicerol e de etanol (Rocha, 2000). Determinao de fenis totais Fenis totais foram determinados pelo mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999). A 0,5 mL do hidrolisado diludo adicionaram-se 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau (10% V/V) e 2,0 mL de carbonato de sdio (7,5% P/V), incubando-se em banho termosttico a 50 C, durante 5 minutos. Para a quantificao da concentrao de fenis totais foi construda uma

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curva de calibrao com diferentes concentraes de cido glico, nas mesmas condies do mtodo colorimtrico de folinciocalteau. Determinao de hidroximetilfurfural e de furfural Para a determinao de HMF e de furfural tambm foi realizada por CLAE em cromatgrafo lquido da Agilent HP 1100. Foram utilizadas as seguintes condies cromatogrficas: coluna C-18 (Beckman), acetonitrila 11,2% V/V e cido actico (1%) 88,8% V/V como fase mvel, deteco UV em 274 nm, vazo de 0,8 mL/min e 25C (Rocha, 2000). Determinao da atividade enzimtica A determinao da atividade enzimtica foi baseada na metodologia proposta por Ghose (1987), que mede a atividade celuloltica em termos de unidades de papel de filtro por mililitro da soluo enzimtica original. Os tubos de ensaios continham 50 mg do substrato (Papel de filtro quantitativo de 80 g/m2; cinza 0,00005 g; permeabilidade ao ar: 3 L/s m2 e porosidade da maioria dos poros de 8 m), 1 mL do tampo citrato de sdio (50 mM, pH = 4,8) e 0,5 mL da enzima diluda. Os tubos controles da enzima no continham o substrato e o tubo controle do substrato no continha a enzima. Os tubos padres de glicose continham 0,5 mL da diluio de glicose e 1 mL do tampo. Os tubos foram incubados em banho termostatizado a 50C por 60 min. Aps o perodo de incubao, adicionaram-se 3 mL do cido dinitrossaliclico (DNSA) para interromper a reao enzimtica. Para dosar os acares redutores totais os tubos foram colocados exatamente por 5 min em banho de gua fervente. A leitura da absorvncia foi feita em espectrofotmetro da Agilent HP 8453 a 540 nm. Usando a curva de calibrao da glicose foi possvel determinar a concentrao de glicose liberada em cada reao enzimtica. A concentrao da enzima foi estimada para exatamente 2 mg de glicose liberada durante a reao enzimtica (definio de Filter Paper Unity - FPU), atravs da equao da reta entre as concentraes de glicose aps cada reao e os logaritmos das respectivas diluies da enzima.

RESULTADOS E DISCUSSO Hidrlise enzimtica do material sem e com deslignificao Antes de realizar as hidrlises enzimticas, foi necessrio medir a atividade da preparao enzimtica comercial para poder calcular as quantidades de enzima que seriam utilizadas nas hidrlises. A atividade enzimtica (AE) da enzima Celluclast utilizada nas hidrlises enzimticas foi igual a 86,14 FPU/mL. A partir do resultado da atividade enzimtica, foi possvel calcular a quantidade necessria de enzima para as hidrlises, considerando que a dosagem de enzima comumente utilizada nas hidrlises est entre 7 e 33 FPU/g substrato (Sun & Cheng, 2002). Neste trabalho foram utilizados 17,2 FPU/g de bagao. Entretanto, aps 46 horas, foram adicionados mais 2 mL da enzima na hidrlise B, uma vez que a converso de celulose em glicose j tinha alcanado o mesmo valor encontrado para a converso com o material no deslignificado (hidrlise A). Supunha-se que se aumentando a quantidade de enzima poderia aumentar a converso, entretanto, aps mais 33 horas, a converso manteve-se constante. O clculo da eficincia de hidrlise foi obtido a partir da quantidade de glicose formada (Tabela 1), que foi convertida em celulose pela multiplicao por 0,9 (Rocha, 2000), bem como pelo conhecimento dos teores de celulose nas polpas de bagao com (85,6 %) e sem deslignificao (49,9%), utilizadas nas hidrlises enzimticas. Tabela 1. Composio dos hidrolisados enzimticos Componente (g/L) Glicose Xilose Fenis totais cido actico A 44,11 2,32 0,77 0,30 B 45,65 0,77 0,09 0,005 Martin et al. (2002) 23,5 9,0 4,1 4,0

As eficincias das hidrlises enzimticas alcanaram valores de aproximadamente 44% em ambos os casos. No caso da hidrlise B, foi encontrado este valor com apenas 46 horas, mantendo-se assim at 79 horas. Entretanto, a presena de lignina provavelmente diminuiu o acesso das enzimas ao substrato, quando se utilizou o material no deslignificado (hidrlise A). Dessa forma, o processo foi mais lento que

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aquele observado quando foi utilizado o material deslignificado (hidrlise B). Por outro lado, a presena de lignina no foi o fator limitante da hidrlise enzimtica B, mas, provavelmente a alta concentrao de glicose com 46 horas, que pode ter inibido a ao das celulases. A atividade das endoglucanases inibida pela celobiose e menos extensivamente pela glicose. As enzimas beta-glucosidases so inibidas pela glicose (Phlipidis et al., 1993). Sun & Cheng (2002) sugeriram diversos mtodos que tm sido desenvolvidos para reduzir a inibio, incluindo a suplementao de beta-glucosidases, durante a hidrlise, e a remoo de acares durante a hidrlise, atravs da ultrafiltrao. Na Tabela 1, observam-se as composies dos hidrolisados A, B e de um hidrolisado de bagao de cana-de-acar obtido por Martin et al. (2002). No presente trabalho, no foram encontradas quantidades detectveis de furfural e de HMF. Isso provavelmente ocorreu devido o material lignocelulsico ter sido exaustivamente lavado aps o tratamento por exploso a vapor e aps a deslignificao. No hidrolisado obtido por Martin et al. (2002), alm dos compostos apresentados na Tabela 1, tambm foram encontrados compostos furnicos (furfural 1,1 g/L; HMF 0,2 g/L). Os hidrolisados enzimticos A e B apresentaram concentraes de xilose, cido actico e fenis muito menores que quelas encontradas por Martin et al. (2002), quando realizaram hidrlise com bagao de cana-deacar tambm pr-tratado por exploso vapor. Comparando-se os hidrolisados A e B, observa-se que houve uma reduo de 88% de fenis, de 98% de cido actico e de 67% de xilose, quando o material foi deslignificado. Martin et al. (2002), quando realizaram um tratamento qumico de deslignificao com Ca(OH)2, encontraram redues de 80% e 18%, para fenis e cido actico, respectivamente. Esses autores no encontraram reduo no teor de xilose. Saccharomyces cerevisiae apresenta uma nica desvantagem que a incapacidade de metabolizar xilose (Jeffries & Shi, 1999; HahnHgerdal et al., 2001). Entretanto, em concentrao de 3 g/L de xilose, no foi observado queda no rendimento em etanol em fermentaes utilizando a mesma levedura do presente trabalho (Santos & Gouveia, 2007). Dentre os inibidores da fermentao identificados nos hidrolisados dos materiais

lignocelulsicos, os compostos fenlicos, gerados a partir da degradao da lignina, so os mais txicos (Palmqvist & Hahn-Hgerdal, 2000). Como na hidrlise B foi utilizado um material deslignificado, quantidade muito pequena de fenis totais foi encontrada. Fermentaes dos hidrolisados enzimticos Aps a obteno dos hidrolisados enzimticos A e B, os mesmos foram utilizados na preparao dos meios das fermentaes, denominadas de A e B, respectivamente. As fermentaes foram realizadas em duplicata e as amostras foram retiradas no incio e no final de cada fermentao. O acompanhamento da formao de CO2, por perda de peso, alm da observao visual de espuma (Foto 1), serviu para estimar o tempo final da fermentao. O perfil de CO2 (g) em todas as fermentaes foi crescente at 17 horas. Entretanto, nas fermentaes B (hidrolisado de polpa com deslignificao), os valores de CO2 foram aproximadamente 4 vezes maiores que queles observados nas fermentaes A (hidrolisado enzimtico de polpa sem deslignificao). Na fermentao A (Tabela 2), observou-se uma menor produo de biomassa, provavelmente, porque nesta fermentao foi utilizado um hidrolisado enzimtico que continha uma maior concentrao de compostos fenlicos, uma vez que cidos orgnicos fracos diminuem a produo de biomassa, mas somente a partir de concentraes maiores que 6 g/L (Palmqvist & Hahn-Hgerdal, 2000).

Foto 1. Fermentaes com o hidrolisado B sem agitao. A maior produo de biomassa e o maior rendimento (YX/G) ocorreram na fermentao B2. A oxigenao favoreceu a formao de materiais necessrios produo de biomassa. Em aerobiose, o acar transformado em biomassa, CO2 e gua, e, em anaerobiose, a maior parte convertida em etanol e CO2 (Lima et al., 2001). Os rendimentos em biomassa (YX/G) concordam com aqueles obtidos por Martin et al. (2002),

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para material sem e com deslignificao. Esses autores tambm obtiveram maiores rendimentos

em biomassa deslignificado.

quando

utilizaram

material

Tabela 2. Resultados das fermentaes com os hidrolisados sem e com deslignificao. Fermentao Gc Ed YE/G Xe YX/G YE/B (g/L) (g/L) (g/g) (g/L) (g/L) (g/g) A 32,8 9,5 0,29 0,24 0,007 0,051 Martina 20,8 6,0 0,29 0,61 0,002 0,10 B1 34,1 10,8 0,32 1,07 0,031 0,10 B2 34,2 9,1 0,27 1,89 0,055 0,09 Martinb 20,8 9,5 0,46 1,43 0,067 0,16
a

Fermentao de hidrolisado no deslignificado Fermentao de hidrolisado deslignificado Glicose, d Etanol e Biomassa

b c

Com relao produo de bioetanol, houve um aumento de cerca de 10% no rendimento em etanol (YE/G) da fermentao no hidrolisado B1 (0,32 g/g), em relao ao hidrolisado A (0,29 g/g). Por outro lado, na fermentao com agitao (B2), o rendimento foi inferior quele obtido na fermentao com o hidrolisado sem deslignificao (A). O rendimento em etanol em relao ao bagao utilizado (YE/B) tambm foi maior nas fermentaes com deslignificao. Na verdade, observa-se um aumento de 96%, entre os resultados da fermentao A (0,051 g etanol/ g bagao seco ) e da fermentao B (0,1-0,09 g etanol/ g bagao seco). Comparando-se os resultados obtidos durante a fermentao B1 com os resultados obtidos por Martin et al. (2002), utilizando um material tambm deslignificado, observa-se que estes autores encontraram um rendimento de etanol em relao ao bagao, 60 % maior, provavelmente por terem utilizado uma levedura recombinante capaz de metabolizar xilose, uma vez que o material continha alta concentrao deste acar (Tabela 1). Por outro lado, o rendimento de 0,10 g etanol/g bagao obtido na fermentao B1 foi igual quele obtido por Martin et al. (2002), quando utilizaram material no deslignificado. CONCLUSES A presena de lignina na hidrlise do material no deslignificado foi um fator limitante ao acesso das enzimas e, conseqentemente, a presena de compostos fenlicos provenientes da presena de lignina no hidrolisado A, desfavoreceu a produo de bioetanol. Por outro lado, a deslignificao aumentou em 10% o rendimento de etanol em

relao glicose e em 96% em relao ao bagao. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem FINEP (Financiadora de Estudos e Projetos) e FACEPE (Fundao de Amparo Cincia e Tecnologia do Estado de Pernambuco) pelo apoio financeiro. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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