1. O gene LAC-Z, que codifica a enzima para utilizao da lactose, foi inserido em uma clula de milho atravs de bombardeamento.

Aps alguns meses verificou-se a expresso da enzima -galactosidase, que converte a lactose em glicose mais galactose. A enzima, como se verificou mais tarde, deve ser inserida na membrana plasmtica das clulas. Perguntas: Como realizada a sntese desta enzima? Explique os mecanismos envolvidos, como feita a replicao, transcrio, traduo e exportao da mesma at a membrana. Qual o envolvimento das chaperonas, chaperoninas e ubiquitinas com esta enzima? Muitos genes que codificam produtos com funes relacionadas (como por exemplo componentes de uma mesma rota metablica) ocupam posies adjacentes no cromossomo e so cotranscritos. Cada um desses grupos de genes estruturais contnuos representa, funcionalmente, uma nica unidade gnica que controlada a partir de seqncias regulatrias comuns. Esse conjunto (genes + seqncias regulatrias) recebe o nome de operon. O nmero de genes estruturais presentes e o espao entre esses genes variam de operon para operon. Os genes de um operon so transcritos em um nico RNAm , que denominado RNAm policistrmico, isso garante que quando uma enzima de uma rota metablica esto presente, as demais enzimas envolvidas tambm esto. Bactrias como a E. coli normalmente utilizam glicose como fonte de carbono, mas podem, tambm, utilizar outros aucares incluindo -galactosdeos. Quando a fonte nutritiva lactose a clula precisa desdobrar esse dissacardeo em glicose (assimilvel) e galactose, sendo que essa hidrlise feita pela enzima -galactosidase. A presena de lactose no meio de cultura induz a um aumento na quantidade de -galactosidase em E. coli, pelo aumento da sntese de novas molculas dessa enzima, sendo que a sua regulao feita em nvel de inicio de transcrio. O operon lac constitudo por trs genes estruturais: Z, Y e A que codificam as protenas galactosidase, lactose-permease (permease) e tiogalactosdeo-transacetilase (transacetilase), respectivamente. Essas protenas esto todas envolvidas no metabolismo de -galactosdeos. A protena permease uma protena de membrana, de peso molecular de 46,5 Kda, responsvel pela entrada de -galactosdeos na clula. Aps o transporte para o interior da clula, a maioria dos galactosdeos hidrolisada pela ao da enzima -galactosidase, uma enzima tetramrica, constituda por quatro subunidades idnticas de 116 KDa cada. Aqueles -galactosdeos que no foram hidrolisados, so acetilados pela enzima transacetilase. Essa enzima um dmero, composto

por duas subunidades idnticas de 22,6 KDa. Os -galactosdeos acetilados podem difundir atravs da membrana e serem, assim, eliminados pela clula. A expresso desse trs genes controlada por uma protena regulatria chamada repressor lac. Esse repressor codificado pelo gene lacl, que se localiza a 5do operon lac e transcrito separadamente. Esse repressor uma protena que atua em trans, isto , uma protena que pode difundir-se na clula bacteriana e que pode agir em stios distantes do local onde produzida. O repressor lac um tetrmero composto por quatro subunidades idnticas de 38,6 KDa. Esse repressor liga-se, fortemente, a uma regio do DNA de 25 a 30 nucleotdeos, chamada de operador. A ligao do repressor lac rgio operadora bloqueia a transcrio do operon lac por prevenir que a RNA-polimerase inicie a transcrio. Contudo, se lactose estiver presente no meio, uma pequena quantidade deste acar convertido em alolactose em uma reao catalisada pela enzima -galactosidase. A alolactose um indutor do operon lac, pois possui a capacidade de se ligar fortemente ao repressor causando uma alterao na sua conformao que reduz a afinidade do repressor pelo operador, proporcionando uma maior transcrio do gene. A transcrio do operon lac no depende somente da presena de lactose, mas tambm da concentrao de glicose no meio, quando a glicose se encontra presente ocorre um decrscimo na taxa de transcrio do operon lac, mas em todos os operons que codificam enzimas catablicas, esses operons possuem caracteristicamente promotores fracos, quando h glicose como fonte de energia. Para que haja sntese de uma determinada enzima como a -galactosidase a informao contida no gene que a codifica, no caso o gene lacZ, deve ser transcrita e depois traduzida. A enzima recm traduzida sofre ainda a ao de outras enzimas que permitem o perfeito estabelecimento de sua configurao terciria e o correto direcionamento para a regio celular onde a enzima ir atuar (no caso a membrana plasmtica).

Replicao A replicao o processo pelo qual ocorre a multiplicao de molculas de DNA permitindo que todas as clulas de um organismo originadas por sucessivas divises, a partir de uma nica clula primognita, possuam a mesma quantidade de DNA e a mesma estrutura primria (seqncia de nucleotdeos).

As clulas procariontes possuem enzimas denominadas DNA-polimerases, capazes de sintetizar DNA a partir de molculas de DNA precursores. A principal enzima na duplicao do DNA a DNA-polimerase III, que est presente com 10 molculas em cada clula, embora a DNApolimerase I (300 a 400 molculas por clula) e a DNA-polimeraseII (40 molculas por clula), sejam mais abundantes. A atividade da DNA- polimerase III se realiza da seguinte maneira: Precursores de DNA devem estar presentes sob a forma de desoxirribonucleotdeos trifosfato. Os quatro desoxirribonucleotdeos trifosfato necessrios para sntese de DNA so dATP, dCTP, dTTP e dGTP, contendo as bases adenina, citosina, timina e guanina, respectivamente. Alm de fornecerem os desoxirribonucleotdeos, os mencionados precursores proporcionam energia para sntese dos novos filamentos de DNA, por que so trifosfatos, enquanto os desoxirribonucleotdeos incorporados no DNA so monofosfatos. A ruptura das ligaes fosfato excedentes libera a energia que usada na sntese de DNA, liberando obviamente o fosfato inorgnico. A DNA-polimerase s sintetiza um filamento de DNA na presena de um filamento antigo que deve servir como modelo para a sntese (template). A sntese da dupla hlice de DNA necessariamente semi-conservativa. Para cada nova molcula de DNA corresponde uma outra que j estava pronta. Os desoxirribonucleotdeos se organizam de modo que suas bases sejam complementares (AT e CG) das bases do filamento antigo de DNA. Portanto, a seqncia de bases na nova molcula (filamento) de DNA depende exclusivamente da seqncia da molcula antiga. Ions de Mg+2 so cofatores de funcionamento da DNA-polimerase. A replicao inicia-se num ponto fixo, no qual seqncias de bases especficas atuam como sinais de reconhecimento para o complexo enzimtico. Geralmente, esse ponto tem seqncias ricas em pares A-T, mais fceis para se separar do que os pares G-C. A abertura da dupla hlice requer a ao conjunta de vrias protenas: Helicase: so enzimas que tem como funo a quebra das pontes de hidrognio existentes entre as bases das fitas complementares, separando assim as duas fitas de DNA. Essa abertura de replicao necessria para que a forquilha de replicao possa se movimentar; portanto, todas as DNApolimerases replicando DNA fita dupla dependem da ao inicial de uma helicase.

 Topoisomerase: so enzimas que pode cortar a fita e aliviar as tenses causadas pelo desenrolamento da dupla hlice e depois tem a capacidade do unir as fitas cortadas restabelecendo a continuidade da dupla hlice num estgio relaxado. Protena RPA (replication protein A): so protenas que se ligam a fita simples do DNA, elas possuem alta afinidade por DNA na forma de fita simples, a ligao ocorre sempre de forma cooperativa, a presena destas protenas durante a replicao importante pois elas evitam que a regio onde esto ligadas sofra tores induzindo uma conformao ideal para a replicao e pareamento das bases, impedem que as fitas voltem a associar-se antes que termine a replicao , alm de proteger a fita contra ao de nuclease. Nos procariontes esta protena chamada de SSB (single strand binding). Primase: as DNA-polimerases no possuem a capacidade de iniciar uma cadeia de nucleotdeos, necessitando de uma regio pareada (fita dupla) denominada primer ou iniciador. Esse primer constitudo de RNA com uma extremidade 3-OH livre, sintetizado por uma RNA polimerase chamada primase que em eucariotos est unida a uma DNA polimerase. Durante o processo de replicao do DNA, dois fatores devem ser considerados, as fitas do DNA tem polaridades opostas (5 3 e 3 5) e as DNA-polimerases sintetizam somente no sentido 5 3. Dessa forma, uma das fitas pode ser sintetizada de forma continua enquanto a outra s pode ser sintetizada de forma descontinua. Existem ento dois mecanismos de utilizao dos primers. A fita continua que necessita apenas de um primer inicial e a fita descontinua que utiliza vrios primers. Na fita descontinua so gerados durante a replicao vrios fragmentos (fragmentos de Okazaki) que possuem entre 1.000 e 2.000 nucleotdeos em procariotos e 100 a 200 nucleotdeos em eucariotos. Aps terem realizado sua funo de dar inicio a transcrio os primers so ento eliminados e sintetizado o DNA para preencher as lacunas entre os fragmentos, at formar a fita completa.

Transcrio A transcrio o processo pelo qual uma molcula de RNA sintetizada a partir da informao contida na seqncia de nucleotdeos de uma molcula de DNA fita dupla. O DNA no

 o molde direto para a sntese protica. Os moldes so as molculas de mRNA que so sintetizadas a partir do DNA. O processo de sntese de RNA, a partir de um molde de DNA, denominado de transcrio. Neste processo, uma fita de RNA sintetizada por um sistema enzimtico, tendo sua seqncia de bases complementar a uma das fitas de DNA. A sntese 5 para 3 se d pela ligao da extremidade 3-OH da cadeia em crescimento ao fosfato mais interno do nucleosdeo trifosfato que chega. Ao contrrio da DNA polimerase, a RNA polimerase no requer um primer e o molde de DNA totalmente conservado na sntese de RNA. Os trs tipos de RNA (mRNA, tRNA e rRNA) so sintetizados pela mesma RNA polimerase de acordo com as instrues dadas por um molde de DNA. A seqncia de bases do mRNA formado complementar ao molde de DNA, porm possui a base uracila (U) em vez de timina (T), e o acar D-ribose ao invs de D-2desoxirribose. No processo de transcrio nem todo o DNA celular transcrito. Geralmente apenas genes individuais ou grupos de genes so transcritos. Desta forma, a transcrio do DNA seletiva, iniciada por seqncias reguladoras especficas indicando o incio e o fim dos segmentos de DNA a serem transcritos. A informao gentica das cadeias de DNA transferida a uma seqncia complementar de nucleotdeos no RNA, atravs da enzima RNA polimerase. Esta enzima catalisa a formao da ligao 3- 5 fosfodister entre os nucleotdeos, porm ela s age na presena do molde de DNA. Embora a RNA polimerase use o DNA dupla fita para sintetizar o RNA, o verdadeiro molde DNA simples fita, que a enzima expe desenrolando um pedao da hlice a medida que passa. O primeiro passo na transcrio a ligao de uma holoenzima multifuncional que abre e mantm aberta a cadeia, atravs da RNA polimerase, que gera a nova fita de RNA. Este stio chamado centro promotor, e consiste em um segmento curto que reconhecido pela. Promotores diferentes possuem seqncias diferentes, que provavelmente determinam os quanto eficientemente um gene em particular transcrito. Desde que a RNA polimerase esteja corretamente posicionada no centro promotor, e tenha feito algumas ligaes fosfodister, ento o RNA alongado. O fim do gene ou genes a serem transcritos sinalizado por uma seqncia de trmino especfica do molde de DNA. Para terminar a transcrio e liberar a RNA polimerase do DNA necessria outra enzima denominada . Quando a sntese termina, o RNA se destaca rapidamente e as duas fitas do DNA voltam a se parear.

Em eucariotos, os genes so transcritos pelas RNA-polimerases I, II, III. Estas polimerases com estruturas complexas so constitudas de vrias subunidades, sendo que algumas so comuns a todas. Essas polimerases necessitam de protenas auxiliares (fatores) para iniciarem a transcrio. A regulao da transcrio pode se dar de duas formas uma a atuao direta do fator sobre as regies promotoras, a outra forma a atuao indireta via interao com outras protenas envolvidas no processo. O controle da expresso gnica pode se dar tambm atravs do splining alternativo, esse um mecanismo pelo qual a partir de um mesmo gene possveis a produo de protenas com diferentes que possibilitam a realizao de funes diferentes. Traduo A traduo a sntese de protenas a partir de um mRNA molde, cada aminocido codificado na seqncia de DNA como um cdon, contendo uma seqncia de trs nucleotdeos. Devem existir, portanto, molculas adaptadoras que transfiram a informao contida no genoma uma seqncia de aminocidos, nas protenas. Adaptadores so molculas de RNA transportador (tRNA), compreendendo pequenas seqncias de nucleotdeos de 75-85 bases, devendo existir pelo menos um tRNA para cada aminocido presente na clula. A presena de bases no usuais uma caracterstica nica dos tRNAs, no sendo encontrada em nenhuma outra molcula de acido nuclico. Bases no usuais so definidas como qualquer anel purnico ou pirimdico que no representam as quatro bases usuais A,C,G e U. Essas modificaes conferem aos tRNAs uma maior versatilidade em estrutura e podem estar relacionadas a diferentes funes. Ao tRNAs so separados em funo dos aminocidos que representam, como exemplo tRNA met que contm o anticdon da metionina. Cada um dos 20 aminocidos liga-se inteiramente a um tRNA especfico que possui um anticdon complementar e cada aminoacil-tRNA ento adicionado de acordo com a seqncia de bases do mRNA e se ligam atravs de ligaes covalentes. Os ribossomos apresentam uma estrutura compacta de ribonucleoprotenas consistindo de duas subunidades. Cada subunidade eformada por protenas associadas a molculas de RNA ribossmico (rRNA). Os rRNAs so os maiores constituintes dos ribossomos e parecem formar as estruturas bsicas das subunidades, basicamente, todas as protenas ribossomais interagem com as

molculas de rRNAs, e, portanto, sua localizao na subunidade depende do ponto de contato com os rRNAs. As protenas que compem as subunidades dos ribossomos recebem a denominao de S1 a S21, para as que fazem parte da subunidade 30S, e de L1 a L34, para as protenas da subunidade 50S. Cada subunidade dos ribossomos formada atravs da associao de um grupo de protenas com as molculas de rRNA, as quais iro induzir um rearranjo da estrutura RNA-protena e favorecer a interao com o prximo grupo de protenas. O incio da sntese de protenas em procariotos definido, basicamente, pela regio de ligao do ribossomo, que contm o stio de ligao dos ribossomos e o cdon iniciador. Normalmente o cdon iniciador um AUG, mas em bactrias podem ser observados GUG ou mais raramente UUG. Durante a sntese de protenas, os ribossomos deslocam-se ao longo do mRNA, possibilitando um pareamento entre esse e os tRNAs que carregam os diferentes aminocidos que iro compor as protenas. Os ribossomos deslocam-se ao longo do mRNA, na direo 53, sintetizando a protena no sentido amino-terminal para carboxi-terminal. Uma molcula de RNA traduzida simultaneamente por diferentes ribossomos. O inicio da sntese de protenas ocorre com a adio do primeiro aminocido da protena, sendo necessria a formao do complexo de iniciao entre o ribossomo, e o primeiro aminoacetiltRNA. A formao do complexo de iniciao dependente das subunidades separadas 30S e 50S, no sendo formado pelos ribossomos intactos (70S). Durante o processo de sntese da cadeia polipeptdica, o ribossomo permanece parado, permitindo que o peptdeo j formado, ligado ao tRNA e localizado no stio P, seja transferido para o aminoacil-tRNA no sitio A. Aps a formao da ligao peptdica, o tRNA sem aminocido permanece ligado no stio P do ribossomo e o peptidil-tRNA, no stio A. O ribossomo realiza ento um movimento de translocao, avanando trs nucleotdeos no mRNA, proporcionando que o tRNA no carregado seja liberado do stio, o peptidil-tRNA mova-se do sitio A para o sitio P, e esponto um novo triplet no sitio A, dessa forma esse est preparado para receber o aminoacetiltRNA contendo o anticdon correspondente sntese da cadeia polipeptdica. A terminao da sntese de protenas ocorre pelo aparecimento, no sitio A, de triplets especficos de terminao. No cdigo gentico, 61 cdons codificam aminocidos, enquanto os cdons UAG, UAA e UGA so os cdons de terminao.

Transporte at a membrana As primeiras etapas da sntese de uma protena ocorrem sempre em ribossomas livre no citossol, mesmo se ela for destinada ao RER. A ligao do ribossoma ao RER se d logo aps o incio da traduo, quando emerge, da protena em construo, um peptdeo sinal. Um peptdeo sinal contm toda a informao necessria para localizao de uma protena alvo, que se encontra no local de destino. Este direciona e possibilita, atravs de sua ligao partcula de reconhecimento do sinal, a unio do complexo ribossomo-protena ao RER. Desta forma, toda protena que contm um peptdeo sinal liberada na luz do RER, depois de concluda a sua sntese. As protenas destinadas insero na membrana do RER tambm possuem sinais especficos. Alm do peptdeo sinal, possuem um ou mais sinais adicionais, que possibilitam a ancoragem (sinal de ancoragem) e a situao destas protenas transmembranas, quer sejam elas monopasso (atravessam a membrana bilipdica apenas uma vez), bipasso(atravessam a membrana 2 vezes) ou multipasso (atravessam a membrana mltiplas vezes). De acordo com a natureza da protena, ela permanecer na membrana do RER, ou passar, atravs do sistema de vesculas, para outra organela (CG, endossoma) ou MP. Os intinerrios seguidos pelas protenas dependem de certos sinais em suas molculas e de receptores especficos distribudos nos locais por onde elas passam. isto que faz, por exemplo, uma enzima hidroltica, recm sintetizada, se dirigir ao endossoma e no superfcie celular. O sinal GPI responsvel pelo direcionamento de molculas do complexo de Golgi para as membranas.

Chaperonas e Chaperoninas As chaperoninas so monmeros que se associam entre si, formando uma estrutura tridimensional denominada chaperona. Chaperonas so protenas que medeiam a montagem ou conformao correta de uma protena-alvo. As chaperonas influenciam o processo de enovelamento controlando a acessibilidade

das superfcies reativas. Este processo est envolvido na aquisio inicial da conformao correta, impedindo a formao de estruturas incorretas em protenas. Cada chaperona possui um compartimento central que acomoda a protena recmsintetizada, impedindo que esta tenha um dobramento prematuro e de forma inadequada. Assim, as chaperonas ajudam as protenas a se moldar, associar a outras protenas de maneira estvel e tornarem-se estruturas ativas, evitando a associao de protenas ainda no dobradas corretamente. Tambm atuam ativamente, com hidrlise de ATP e modificao conformacional de algumas protenas. As chaperonas atuam: em protenas que foram desnaturadas auxiliando em sua renaturao, no transporte de protenas atravs de membranas, mantendo-a em um estado desenovelado e flexvel; em protenas recm-sintetizadas auxiliando na sua montagem, unindo-se aos polipeptdeos durante o incio da sntese, quando ainda no se desprendeu do ribossomo, e estabelecem as conformaes corretas e prevenindo a conformao de formas anormais. Existem diferentes famlias proticas de chaperonas, como a hsp 70 e hsp 60. Elas tm este nome (hsp = heat shock protein) porque so sintetizadas em grande quantidade quando a clula submetida a altas temperaturas (> 42o C) e situaes de estresse metablico, quando a maioria das protenas celulares so desnaturadas. Em tais circunstncias, as chaperonas agem facilitando a renaturao protica. Estas famlias se diferem entre as organelas celulares. As hsp70 mitocondriais, por exemplo, so diferentes das do citossol. No RER uma hsp70 especial (BIP) ajuda a dobrar as protenas neste compartimento. As chaperonas ao realizar sua funo consumem energia na forma de ATP. Depois que a protena se libera da chaperona e fixa sua residncia no citossol, a chaperona fica livre, podendo ser reutilizada. Ubiquitinas As protenas tambm so marcadas para a destruio. A degradao programada importante na regulao da concentrao de determinadas enzimas, na remoo de protenas anormais e daquelas que sofreram danos (estresse oxidativo) ou foram indesejavelmente modificadas. A ubiquitina uma protena de 85 KDa, que possui um importante papel na marcao

de protenas para a destruio. A ubiquitina expressa em todas as clulas eucariticas, onde sintetizada a partir de genes mltiplos como produtos de fuso N-terminal com outras protenas ou oligmeros cabea-cauda e clivadas por peptidases que liberam mono-ubiquitinas. As molculas de ubiquitina se ligam aos substratos por meio de ligaes isopeptdicas entre o resduo de glicina Cterminal da ubiquitina e os grupos amino-psilon de resduos de lisina das protenas. Cadeias de poli-ubiquitina se formam a partir da adio de molculas de ubiquitina ao resduo de lisina-48 de uma outra molcula de ubiquitina. A glicina carboxi-terminal da ubiquitina fica ligada amina E da lisina de protenas destinadas a serem destrudas. Trs enzimas (E1, E2 e E3) participam na conjugao de ubiquitina a protenas. Inicialmente, o carboxilato terminal da ubiquitina fica ligado a uma sulfidrila de E1. A ubiquitina ativada ento levada a uma sulfidrila de E2. Finalmente E3 catalisa a transferncia da ubiquitina para a protena alvo. Finalmente a protena ubiquitinada digerida por um complexo de protease 26S. Esta protease multisubunitria energizada por ATP poupa a ubiquitina, que ento reciclada. Mltiplas rodadas de hidrlise de ATP capacitam a protease a desdobrar a protena e digeri-la.

2) A uma cultura de clulas foi adicionado um aminocido radioativo 2-14C- Leucina, juntamente com outros nutrientes, necessrios ao seu crescimento. Aps alguns ciclos de diviso, um decapeptdeo foi excretado para o meio por estas clulas, contendo radioatividade. Aps sua purificao e sequenciamento, identificou-se: 2 Prolinas, 3 Leucinas, 2 Alaninas, 1 Glicina e 2 Serinas. Determine a(s) possveis sequncias do RNAm que codificou este peptdeo. Explique tambm como esta sntese ocorreu, e quais as organelas e processos

envolvidos

(sequencia:

LEU-SER-GLI-ALA-LEU-ALA-PRO-SER-PRO-LEU).

que

ocorrer se a esta cultura de clulas acrescentarmos puromicina? Como poderia ser identificado o local da sntese destas protenas na clula? O glifosato teria efeito sobre o crescimento destas plantas? Por qu? Comente. Como poderia obter-se uma planta resistente? Possveis sequncias do RNAm que codificou o peptdeo: RNAm (combinaes entre esses nucleotdeos) LEU UUA UUG CUA CUG CUU CUC SER UCU UCC UCA UCG AGU AGC GLI GGU GGC GGA GGG ALA GCC GCU GCG GCA LEU UUA UUG CUA CUG CUU CUC ALA GCC GCU GCG GCA PRO CCU CCC CCA CCG SER UCU UCC UCA UCG AGU AGC PRO CCU CCC CCA CCG LEU UUA UUG CUA CUG CUU CUC

A sntese "in vivo" de uma cadeia polipeptdica depende de um molde: a molcula de mRNA. Denomina-se RNA mensageiro (mRNA), o RNA transcrito a partir de uma seqncia de DNA capaz de codificar uma protena. Para que o RNA sirva de molde para a sntese de protenas, necessrio um descodificador ou molcula adaptadora capaz de "ler" o cdigo gentico. Esta molcula um RNA especial, o RNA transportador (tRNA) cuja cadeia polinucleotdica de 75 a 85 nucleotdios apresenta uma estrutura secundria peculiar na forma de trevo. Etapas da Biossntese Protica: Ativao dos Aminocidos: Esta etapa se realiza no citossol .Refere-se ligao dos aminocidos ao(s) seu(s) RNAt especfico(s). Esta ligao catalisada pelas AMINOACIL-RNAt-SINTETASES, enzimas que reconhecem os aminocidos e seus RNAt especficos com grande especificidade A reao ocorre em 2 etapas, e dependente de energia Na primeira etapa, o aminocido liga-se ao AMP, obtido a partir da hidrlise do ATP e com liberao de PPi; Na segunda etapa, o AA-AMP liga-se extremidade 3 do RNAt, liberando o AMP e energia.

Iniciao da Cadeia: Depende da presena da subunidade ribossomal 40S, do RNAm, do RNAt com o anticdon de iniciao AUG (metionina), e de uma srie de protenas denominadas "fatores de iniciao", ou eIF, em nmero de 9, no mnimo, nos eucariontes. Em etapas: O eIF-2 liga-se especificamente com uma molcula de GTP e com o Met-tRNAi. A subunidade ribossomal 40S liga-se ao eIF-3, que a separa e a mantm separada da subunidade 60S, que por sua vez se liga ao eIF-6, com o mesmo propsito. O complexo formado em (a) liga-se ao complexo 40S formado em (b), com a ajuda de vrios outros fatores de iniciao, e este novo complexo associa-se ao RNAm - complexo de priniciao. A associao do complexo de pr-iniciao com o fator de iniciao eIF-5 e com a subunidade 60S do ribossomo d origem ao complexo de iniciao propriamente dito. O GTP hidrolisado e os outros fatores de iniciao so liberados. O complexo de iniciao , portanto, formado por um ribossomo 80S associado aos eIF-5 e eIF4, ao RNAm corretamente posicionado, e ao RNAt de iniciao tambm posicionado no stio "P", com o stio "A" vazio.

Alongamento da Cadeia: Depende dos "fatores de alongamento" e do complexo de iniciao. Em etapas : O Fator de Alongamento eEF-1 dirige a seleo do RNAt correto para o posicionamento no stio "A" do complexo de iniciao. Este posicionamento depende ainda da hidrlise de 1 GTP e ocorre com posterior liberao do eEF1 .H a formao da ligao peptdica entre os 2 aminocidos adjacentes. A enzima peptidiltransferase, componente da subunidade ribossmica 60S, faz a transferncia da metionina inicial do stio "P" para o aminocido do stio "A", formando um dipeptidil-RNAt.

O ribossomo se move - s custas do GTP - na direo 5-3 em uma distncia de 3 nucleotdeos, com a ajuda do eEF-2, ou "translocase", posicionando o peptdeo no stio "P" e liberando o stio "A" para o posicionamento de um novo aminocido .O RNAt livre liberado, e o processo se repete at a traduo completa do RNAt. Liberao da Cadeia Polipeptdica: O surgimento de um cdon de trmino - UAG, UGA ou UAA - determina a ligao de um "Fator de Liberao", ou eRF, associado ao GTP. Este fator de liberao determina o rompimento da ligao entre o ltimo AA e seu RNAt .A dissociao do eRF do ribossomo depende da hidrlise do GTP. Modificaes Ps-Translacionais Vrias modificaes podem ser impostas cadeia polipeptdica aps a sua biossntese . As principais modificaes so: Reduo do Tamanho -- Converso de protenas inativas e zimognios nas suas formas ativas, por remoo de seqncias de aminocidos catalisadas por endoproteases especficas Alteraes Covalentes -- Fosforilao, glicosilao, hidroxilao, etc. Algumas protenas so ainda endereadas a organelas especficas da clula ou mesmo ao meio extracelular. Acrescentando Puromicina: A sntese de protenas uma funo central na fisiologia celular e como tal o alvo primrio de uma longa variedade de antibiticos e toxina de ocorrncia natural. Os antibiticos so importantes armas bioqumicas, sintetizadas por alguns microrganismos e extremamente txicas para outras. Os antibiticos tem se tornado ferrramentas valiosas na estudo da sntese das protenas, praticamente cada etapa na sntese das protenas,

praticamente cada etapa na sntese proteica pode ser especificamente inibida por um antibitico ou outro. Um dos inibidores antibiticos melhor conhecido a puromicina, sintetizada pelo bolor Streptomycis albomiges A puromicina possui uma estrutura muito semelhante extremidade 3 de um aminocil-tRNA. Ela liga-se ao stio A e participa de todas as etapas de alongao at inclusive na formao da ligao peptdicas, produzindo uma peptidil-puromicina. Entretanto, a puromicina no se ligar ao stio P, nem se engajaro na translocao. Ela se dissocia do ribossomo logo depois de se ligar ao carboxiterminal do peptdio, terminando prematura a sntese do polipeptdeo. Local da sntese de protena na clula Pode-se identificar o local da sntese de protenas atravs da Hibridizao in situ. Prepara-se a sonda de cDNA (especfica para o mRNA que codifica a protena desejada) marcada com um elemento radioativo. Coloca-se a sonda em contato com o tecido a ser hibridizado. A hibridizao feita em condio de temperatura e concentrao de sal que promova o pareamento entre a sonda e o alvo (mRNA). Fazer lavagens com concentrao de sal e temperatura diferentes das iniciais, promovendo a remoo das sondas que no hibridizaram. Para visualizar o resultado utiliza-se a auto-radiografia .A substncia radioativa imobilizada em papel ou em gel de agarose ou poliacrilamida detectada pela colorao de um filme de raio X sobre a amostra seguido da incubao e da revelao do filme . As reas escuras no filme revelado correspondem a reas expostas radioatividade, ou seja, area em que est o mRNA desejado, e consequentemente, onde as protenas esto sendo sintetizadas. Efeito do glifosato sobre o crescimento de plantas Atualmente, o herbicida glifosato (N-(fosfonometil)glicina), no-seletivo, sistmico, psemergente, representa 60% do mercado mundial de herbicidas no seletivos, contabilizando um total de US$ 1,2 bilho/ano com vendas do produto. Em diversos tipos de cultivo, glifosato costuma ser pulverizado sendo, em geral, absorvido na planta atravs de suas folhas e dos caulculos novos. O herbicida , ento, transportado por toda

a planta, agindo nos vrios sistemas enzimticos, inibindo o metabolismo de aminocidos. As plantas tratadas com glifosato morrem lentamente, em poucos dias ou semanas e, devido ao transporte por todo o sistema, nenhuma parte da planta sobreviver. O glifosato inibe a enzima encontrada nos cloroplastos ou plastdios denominada 5enolpiruvoilshikimate-3-fosfato sintase (EPSPs), agindo pela inibio na rota de sntese dos aminocidos aromticos essenciais, fenilalanina, tirosina e triptofano, os quais so precursores de outros produtos, como lignina, alcalides, flavonides e cidos benzicos. Os sintomas de sua ao sobre as plantas incluem amarelamento dos meristemas, necrose e morte em dias ou semanas . Sendo aplicado nas plantas desse experimento haveria uma parada do crescimento e consequentemente a morte da cultura. Obteno de uma planta resistente A transformao de plantas consiste na introduo de um fragmento de cido nuclico em um genoma. Existem duas estratgias para transformar plantas: direta e indireta. A estratgia indireta aquela que utiliza um vetor como a Agrobacterium tumefaciens (o mtodo mais usado para a obteno de plantas transgnicas) ou A. rhizogenes como veculo de entrega do DNA planta. Mtodos qumicos e fsicos possibilitam a transformao direta de genomas. Dentre eles destacam-se: biobalstica (ou acelerao de partculas), eletroporao, microinjeo e mtodos qumicos (como polietilenoglicol) e fsicos. Em bactrias existe, alm de seu cromossomo normal, um fragmento circular de DNA chamado plasmdeo. Os plasmdeos so chamados de vetores. O vetor de clonagem mais comumente usado em plantas um plasmdeo da bactria Agrobacterium tumefaciens (o plasmdeo Ti). Esse pequeno segmento de DNA o veculo que permite a introduo do gene de interesse na bactria para que ele seja transferido para a planta quando ocorrer a infeco. Exemplo de transformao indireta: gene escolhido (extrado de outro organismo) inserido no plasmdeo Ti; plasmdeo, contendo o gene de interesse, inserido na bactria;

A bactria infecta a planta, introduzindo nela o seu DNA; gene de interesse da planta associa-se ao DNA da planta; As clulas modificadas (que foram infectadas pela bactria) so isoladas e cultivadas em meio de cultura apropriado, produzindo uma nova planta; A nova planta expressa o gene da outra espcie, produzindo a caracterstica escolhida (resistncia a doenas ou produo de alguma substncia especfica); Todas as clulas da nova planta so transgnicas, o que significa que a planta toda passa a ter a nova caracterstica.

Exemplo de transformao direta: Bombardeio de genes a maneira de se introduzir genes de interesse numa planta de maneira direta. Atravs do canho de genes, um aparelho de acelerao de microprojteis, misturase o gene a microprojteis de ouro ou tungstnio, que so acelerados em alta velocidade contra os tecidos de planta, incorporando-se ao DNA dela. O aumento da resistncia de plantas a pragas e molstias pela ao de produtos naturais com auxlio da engenharia gentica a oportunidade importante. A maioria dos genes inseridos em plantas inclui aqueles que conferem resistncia a insetos, fungos, vrus e herbicidas. Com o advento das tcnicas de DNA recombinante, uma das primeiras iniciativas que surgiu foi a de se criar plantas transgnicas tolerantes aos herbicidas. Essa tolerncia pode ser conseguida produzindo-se plantas dotadas da enzima alvo ( EPSPS) tolerante ao herbicida ou superproduzindo essas enzimas de forma a gerar quantidade suficiente da enzima que escape a ao inibitria do herbicida. A soja (Glycine max) um exemplo de planta geneticamente modificada, linhagem derivada GTS 40-3-2, denominada Roundup Ready, contm nico gene (cp-4 epsps) originrio da bactria do solo Agrobacterium sp que codifica a enzima CP4-epsps naturalmente tolerante ao do glifosato. A enzima Epsps de bactrias exibe diferentes tolerncias ao glifosato e a CP4-epspsa representa, portanto, uma dessas diferentes EPSPSs encontradas na natureza. A insero do gene que codifica essa enzima no genoma da planta no muda em nada seu comportamento mas deixa-a livre da ao do ingrediente ativo glifosato do herbicida. Na verdade, quando o herbicida Roundup aplicado s plantas Roundup Ready, estas no so afetadas devido a

ao contnua da enzima CP4-EPSPS que supre as necessidades da planta de aminocidos aromticos.

3) Durante um ensaio biolgico, plantas de feijo foram crescidas em soluo nutritiva contendo trs tratamentos de nitrognio: nitrato, amnia e uria. Explique em cada caso, quais as enzimas presentes e necessrias para a assimilao em cada um dos tratamentos. Como voc poderia analisar a atividade das enzimas envolvidas? Qais os mtodos disponveis e como seriam conduzidos os procedimentos para tais analises? (descreva os procedimentos prticos). Quais enzimas so constitutivas e quais so indutivas? Quais os cofatores envolvidos nas reaes de assimilao. Quais as formas principais de transporte de compostos nitrogenados nas leguminosas, e como so sintetizados estes transportadores? A centrifugao recomendada em um dos mtodos 15000 g, mas a centrfuga s tem rpm, como converter? Assimilao do Nitrato Com nitrato (NO3-) como a forma mais abundante de nitrognio no solo, as plantas e os organismos do solo desenvolveram a capacidade para utilizar o nion como a fonte de nitrognio exigida para seu crescimento e desenvolvimento. A principal via para a incorporao de nitrognio inorgnico em nitrognio orgnico a reao catalisada pela desidrogenase glutmica. Portanto, as plantas superiores e microrganismos que usam NO3- devem reduzi-los primeiro a NH3, para ser incorporado em protena celular. Esse processo de utilizao do nitrognio chamado assimilao do NO3-, e um processo de reduo, que culmina com a formao de NH3, no qual duas enzimas esto envolvidas: a nitrato redutase (enzima citoplasmtica) e a nitrito redutase (enzima existente nos plastdeos ou cloroplastos). O NO3- reduzido inicialmente a nitrito (NO2-) atravs da ao da nitrato redutase e, em seguida, o nitrito reduzido a NH3 pela ao da nitrito redutase: NO3nitrato redutase

NO2nitrito redutase

NH3

A amnia (NH4+) obtida por bactrias e plantas a partir do nitrognio atmosfrico ou dos nitritos e nitratos presentes no solo. Bactrias, como as do gnero Rhizobium, promovem a reduo

biolgica de N2 a NH4+. Essa converso, chamada fixao do nitrognio, realizado por um sistema enzimtico complexo, denominado nitrogenase, que utiliza NADPH como doador de eltrons e processa-se com grande consumo de ATP. A reao global do processo : N2 + 6e- + 12 APT + 12 H2O 2 NH4+ + 12 (ADP + Pi) + 4 H+

A outra forma de obteno de NH4+ a reduo de nitratos e nitritos presentes no solo, pela nitrato redutase e nitrito redutase: NO3- + NADPH + H+ NO2- + 3 NADPH + 4 H+ NO2- + NADP+ + H2O NH3 + 3 NADP+ + 2 H2O

Na natureza, NH3 prontamente oxidado a NO3-, o qual, por sua vez, deve ser novamente reduzido a NH3 antes de sua incorporao em aminocidos. Uma vantagem, naturalmente, que NO3- representa uma forma de armazenamento mais estvel do que algo voltil NH3, apesar de que a existncia dessa ltima como NH4+ mais provvel em solos cidos e neutros. Uma segunda vantagem que a molcula de amnia bastante txicae, portanto, no pode ser armazenada como tal nos tecidos, enquanto que o nitrato relativamente no-txico, podendo acumular-se em grandes quantidades no suco da planta. Assimilao da amnia O NH4+ assimilado pelas enzimas glutamina sintetase e glutamato desidrogenase, formando os aminocidos glutamina e glutamato. Nas plantas no leguminosas, principalmente sob a forma de glutamina que o nitrognio exportado para os rgos vegetais, a fim de ser incorporado nas molculas nitrogenadas. A sntese de glutamato constitui a nica incorporao direta de nitrognio, a partir de NH4+, como grupo -amino de aminocido. Todas as outras snteses de aminocidos no-essenciais utilizam-se de transaminaes, isto , transferncias de grupo -amino, sempre a partir do grupo amino do glutamato. A sntese de glutamato feita a partir de NH4+ e -cetoglutarato, em uma reao catalisada pela glutamato desidrogenase citoplasmtica que, em oposio enzima mitocondrial, utiliza NADP+ como coenzima:

A glutamina sintetizada a partir de glutamato e NH4+, numa reao catalisada pela glutamina sintetase:

Neste caso, a incorporao de NH4+ foi feita como um grupo amida e portanto, este nitrognio no pode ser utilizado para transaminaes. A glutamina tem um papel importante como veculo para o transporte de NH4+ entre os diferentes rgos. Vrios tecidos so ricos em glutaminase, a enzima que catalisa a hidrlise do grupo amina da glutamina: Glutamina + H2O Assimilao da uria H duas vias possveis para a absoro de uria em plantas nas quais se faz a aplicao dessa substncia. Primeiro, a planta pode absorver uria e esta ser degradada a amnia por ao de ureases, e ento a amnia ser assimilada a compostos orgnicos pela via glutamina sintetase/glutamato desidrogenase. Uma outra via, em caso de substrato slido, onde pode haver bactrias amonificantes, a uria pode ser degradada a amnia no solo, e ento a planta absorver o nitrognio como amnia. Neste segundo caso, a amnia no solo pode ser absorvida desta forma e entrar diretamente na via glutamina sintetase/glutamato desidrogenase, ou sofrer ao de bactrias nitrificantes e ser absorvida como nitrato, necessitando assim ser reduzida a amnia. Anlise da atividade das enzimas Glutamato + NH4+

Pode-se analisar a atividade da enzima, utilizando como parmetro a atividade da enzima nitrato redutase in vivo. Assim, pode-se verificar a habilidade dos tecidos vegetais em reduzir nitrato, podendo-se avaliar ainda o efeito da luminosidade na atividade da enzima. A atividade da enzima estimada pela quantidade de nitrito formada, a qual dosada colorimetricamente. Metodologia: coleta de discos foliares de folhas mantidas em condies de luz e de escuro e transferidos para tubos de ensaio contendo soluo tampo fosfato com KNO3 (fonte de nitrato para a enzima); incubao dos tubos a 37C por 1 hora; paralizao da reao pela adio de soluo de sulfanilamida; adio de soluo de -naftilenodiamino e agitao dos tubos. Aguardar 5 minutos (perodo em que ocorre a reao cromognica); remoo dos discos foliares; leitura espectrofotomtrica a 540 nm; avaliao da quantidade de nitrito produzida por comparao com uma curva padro de soluo nitrito. No caso de assimilao de amnia em glutamina, pode-se medir a atividade desta reao pelo mtodo para determinao da atividade da enzima glutamina sintetase in vitro, que funciona tambm biossinteticamente produzindo -glutamilhidroxamato a partir de glutamato; funcionando ainda como transferase produzindo -glutamilhidroxamato a partir de glutamato e hidroxilamina. Metodologia: extrao da enzima, que deve ser feita no gelo, com tampo de extrao apropriado; centrifugao para coleta do material sobrenadante (amostra); incubao da amostra, acrescentando-se ATP, cido glutmico, sulfato de magnsio, hidroxilamina, cistena e tampo, em banho-maria a 30C por 30 minutos; interrupo da reao por adio de cloreto de ferro; centrifugao por 5 minutos a temperatura ambiente;

 leitura em espectrofotmetro a 540 nm. A atividade enzimtica comparada com valores de leitura para uma curva padro de soluo -glutamilhidroxamato. Enzimas constitutivas e indutivas As enzimas nitrito redutase de nitrito, glutamina sintetase (GS), glutamina oxoglutarato amidotransferase (GOGAT), glutamato desidrogenase (GDH), e possivelmente a urease, so enzimas constitutivas. A nitrato redutase uma enzima indutiva, pois sua sntese depende da presena do substrato nitrato no meio. Cofatores envolvidos nas reaes de assimilao A enzima nitrato redutase requer FAD, que um grupamento heme-Fe, e um complexo molibdnio para sua perfeita atividade, alm de ser a reao dependente de NADH ou NADPH como doadores de eltrons. A nitrito redutase cloroplastidial requer ferredoxina como doador de eltrons, enquanto a proplastidial requer NADH ou NADPH; ainda constata-se a necessidade de um grupo ferro-enxofre e um grupo heme-Fe especializados para sua perfeita atividade. A enzima GDH requer a presena de NADH como doador de eltrons, enquanto a GOGAT requer ferredoxina (forma fotossinttica da enzima) ou NADH/NADPH como doadores de eltrons (forma no-fotossinttica). Principais formas de transporte de compostos nitrogenados nas leguminosas Plantas da famlia das leguminosas, como alfafa, ervilha, soja, feijo, etc., podem obter nitrognio fixado como produto da associao simbitica com bactrias do grupo Rhyzobium, processo conhecido como fixao biolgica. As bactrias suprem a planta com uma forma de nitrognio que pode ser usada na sntese das protenas. A plantas, por sua vez, supre as bactrias com uma fonte de energia para sua atividade de fixao de nitrognio e com molculas que contm carbono, as quais so necessrias para a produo de compostos nitrogenados. Na agricultura moderna comum fazer rotao de uma planta cultivada no-leguminosa com uma leguminosa, pois estas, ao serem colhidas deixam para trs as razes ricas em nitrognio.

As bactrias entram nos plos radiculares dessas plantas quando elas ainda esto no estgio de plntulas. A invaso dos plos radiculares e clulas corticais subjacentes pelos rizbios ocorre por meio da formao de canais de infeco. Quando os rizbios aumentam de tamanho e tornam-se realmente fixadores de nitrognio, so chamados de bacteriides. A proliferao contnua tanto dos bacteriides como das clulas corticais da raiz resulta na formao de ndulos. Tanto clulas infectadas quanto no-infectadas participam da produo de uredeos (derivados de uria), o produto final da fixao de nitrognio que veiculado do ndulo para a planta. A concentrao de O2 nas clulas infectadas pelos bacteriides deve ser cuidadosamente regulada, j que o O2 um potente inibidor irreversvel da enzima nitrogenase. Ao mesmo tempo, o oxignio necessrio respirao aerbica, sendo esta importante para suprir o ATP demandado pela nitrogenase e por outras atividades metablicas tanto nas bactrias quanto nas clulas vegetais. A regulao do O2 realizada, em grande parte, pela presena de uma protena heme que se liga ao oxignio, a leghemoglobina. A capacidade de fixao do nitrognio est intimamente ligada a concentrao de leghemoglobina, o que no significa que ambas estejam linearmente correlacionadas. A sacarose, antes de entrar no bacteriide sofre transformao a cido mlico (devido a baixa tenso de oxignio), atuando como substrato para a sntese redutiva dos cido carboxlicos (C4), fumarato e succinato, os quais so transportados para dento do bacteriide servindo como substrato de energia para a nitrogenase. Outros esqueletos carbnicos da gliclise servem como substratos para a assimilao do NH3 no citossol. Muito do que respirado pelo bacteriide perdido como CO2. Entretanto, grande parte do CO2 que sai do bacteriide incorporado pela PEPcase produzindo malato e/ou aspartato que pode ser utilizado na assimilao do NH3 e no transporte nas plantas. O nitrognio fixado nos bacteriides dos ndulos radiculares liberado como NH 3 no citossol da planta hospedeira, por difuso simples. Apesar das duas vias, absoro de nitrato e fixao biolgica, terem como produto final a amnia, ocorrem mudanas profundas no metabolismo de nitrognio dependendo da fonte primria. Quando a amnia provm de associao simbitica os produtos nitrogenados

exportados pelo sistema radicular, via xilema, so preferencialmente uredeos, por outro lado, quando provm da reduo assimilatria do nitrato, os produtos exportados so amidas, asparagina e glutamina, principalmente. Estas alteraes tm sido utilizadas para avaliar a participao da associao simbitica no balano total de nitrognio no vegetal atravs da abundncia relativa de uredeos na seiva do xilema. A difuso do nitrato da soluo do solo at o apoplasto da raiz acontecer a partir das clulas epidrmicas e corticais. Uma vez no simplasto o nitrato pode ser reduzido ou mobilizado atravs das estrias de Caspary para dentro do xilema, sendo transportado para os brotos jovens da planta. A entrada inicial atravs da membrana plasmtica regulada por um processo de transporte ativo. Plantas utilizam mecanismos de alta e baixa afinidade para a importao do nitrato. O sistema de transporte de alta afinidade (tambm chamado HATS ou mecanismo I) mostra as cinticas de Michaelis-Menten, saturando de 0,2 a 0,5 mM de nitrato com Km tipicamente entre 10 e 100 M. O sistema de alta afinidade regulado por componentes constitutivos, os quais so expressos na ausncia do nitrato, e componentes indutivos os quais so induzidos em tratamento com nitrato. O sistema de transporte de baixa afinidade (LATS ou mecanismo II) mais observado quando as concentraes de nitrato esto abaixo da concentrao de 0,5 mM e normalmente no apresentam saturao cintica. Essas variaes metablicas permitem o ajuste da planta as variantes concentraes de nitrato no meio externo (5 M a 50 mM) sem apresentar deficincia nutricional ou toxicidade. Os dois transportadores de nitrato da famlia gentica NRT1 e NRT2 j foram descobertos a muito tempo. A famlia NRT2 codifica transportadores que contribuem para o sistema de transporte induzvel, de alta afinidade, sendo regulada por diferentes formas de nitrato reduzida, incluindo amnia e glutamina. A famlia NRT1 mais complexa, incluindo transportadores de nitrato de dupla afinidade (ambos de baixo e alto Km) ou baixa afinidade. Membros da famlia NRT1 foram identificados primeiramente em estudos de mutantes resistentes ao clorato (ClO3-), a clorina anloga ao nitrato txica quando em alta concentrao e reduzida a clorito pela NR. As clulas da planta importam e acumulam nitrato contra um gradiente eletroqumico, gerado pela bomba de prtons (ATPase) na membrana plasmtica. A bomba de prtons retira H+ do interior da clula com gasto de energia (ATP), gerando uma carga negativa. A importao de nitrato realizada por um mecanismo de co-transporte eletrognico onde foi proposto que dois

prtons so co-transportados para dentro da clula, para cada molcula de nitrato, gerando uma rede de carga positiva. Mtodos de purificao de enzimas Precipitao isoeltrica: devido ao carter inico das protenas, o ajustamento do pH ao ponto onde no h cargas resultantes produzir um mnimo de solubilidade e, possivelmente, precipitao da protena. Precipitao por solvente orgnico: tanto acetona fria como etanol so freqentemente usados para precipitar protenas diferencialmente de uma soluo, pela diminuio da constante dieltrica da soluo. Isso resulta numa maior interao entre as protenas e uma diminuio na solubilidade. Colunas de derivados de celulose: esses derivados, tais como a carboximetilcelulose (CMC) e a dietilaminoetilcelulose (DEAE), so extremamente teis na purificao de protenas. Precipitao fracionada com sulfato de amnio: atravs da adio de soluo saturada de sulfato de amnio, as protenas precipitaro e sero separadas por centrifugao. Se as condies forem mantidas constantes, obtm-se uma boa reprodutibilidade. Adsoro seletiva e eluio em gis de fosfato de clcio: as protenas so prontamente adsorvidas nesses gis e so, ento, diferencialmente eludas, pelo aumento das concentraes de sal. Inativao diferencial, por calor, de protenas contaminantes: a exposio de solues proteicas a temperaturas crescentes, em pHs diferentes, uma tcnica til. Freqentemente podese selecionar condies adequadas, para as quais a protena desejada permanece estvel e as protenas contaminantes so desnaturadas e removidas. Colunas de Sephadex: tcnicas de filtrao em gis, usando gis no modificados ou gis com cadeias laterais de DEAE ou de CM na molcula do polissacardeo - so largamente empregadas para a purificao de enzimas. Converso de g para rpm A centrifugao recomendada em um dos mtodos 15 mil g, e a centrfuga tem apenas rpm. Se a distncia do tubo ao eixo do rotor (x) for de 15 cm, faz-se a converso da seguinte forma:

RCF = 1,119 x 10-5 x (rpm)2 x (x) 15000 g = 1,119 x 10-5 x (rpm)2 x (15 cm) rpm = 9453 rpm

4) Comente sobre a hiptise da origem endossimbintica das organelas cloroplasto e mitocndria. D as evidncias que comprovam ateoria e comente a idia de ser o RNA a molcula ancestral da clula atual. (comentando tambm as evidncias). O conceito para a origem de mitocndrias como cloroplastos conhecida como origem endossimbitica em srie, assim denominada uma vez que os eventos no ocorreram simultaneamente, acredita-se que as mitocndrias antecederam os cloroplastos, o que explica a grande variedade de pigmentos e propriedades existentes nos diversos cloroplastos de plantas e algas. Seus ancestrais foram caracterizados como endossimbiontes, ou seja, um organismo que vive dentro de outro organismo diferente. A endossimbiose teve uma profunda influncia sobre a diversificao dos eucariotos. Na teoria da endosimbiose acredita-se que as mitocndrias e cloroplastos so organelas derivadas da interao entre um organismo procarioto ancestral aerbio e um organismo eucarioto unicelular anaerbio. Essa simbiose se deu a partir do momento que a atmosfera comeou a apresentar uma concentrao substancial de oxignio e com o surgimento de organismos aerbios com uma maior produo de energia. Segundo esta teoria, uma clula procaritica teria perdido sua parede, ganhando flexibilidade na membrana, a qual sofreu diversas invaginaes, dando origem ao envoltrio nuclear e s organelas membranosas de um eucarioto. A clula derivada desta transformao teria ganho tambm a capacidade de endocitar clulas vizinhas e se alimentar delas. Um descendente desta clula transformada teria, segundo esta hiptese, endocitado clulas de uma bactria altamente eficiente em respirao aerbia (alpha-proteobactria), mas no teria realizado sua digesto, e sim passado a viver numa relao de simbiose com esta bactria. A clula hospedeira forneceria abrigo bactria, e o endossimbionte forneceria energia para a clula. Durante o desenvolvimento desta relao a bactria teria perdido seus genes referentes ao desenvolvimento independente , doado alguns para o ncleo do hospedeiro e mantido alguns, como o que codifica a

SSU rRNA da mitocndria. Da mesma maneira teriam surgido os cloroplastos, a partir da endocitose de cianobactrias por um eucarioto j possuidor de mitocndria. Mais tarde essa hiptese viria a ser confirmada, atravs do sequenciamento de alguns dos genes que codificam a SSU rRNA, encontrados nas mitocndrias e nos cloroplastos , que teriam se originado das alphaproteobactria e cianobactrias, respectivamente. Carl R. Woese iniciou seus trabalhos com a subunidade menor de RNAr (SSU rRNA). Esta subunidade constituinte dos ribossomos que fazem parte da maquinaria de sntese de protenas, e por serem constitudos de RNAr tm uma relao direta com o DNA do organismo. Estas caractersticas faziam com que a SSU rRNA fosse um cronmetro molecular universal, ou seja, esta era capaz de dizer a seqncia com que as espcies evoluram.

Os dados iniciais da anlise de SSU rRNA confirmaram a distino entre procariotos e eucariotos, que havia sido estabelecida na dcada de 60, tendo como critrio a presena ou no de um envoltrio nuclear, alm de reforar a hiptese da endossimbiose. A estrutura da membrana celular, assim como de protenas responsveis por processos vitais para as clulas, so diferentes em Archea. Dessa maneira, processos como transcrio e traduo ocorrem diferentemente nessas ltimas. Estudando esses processos, descobriu-se que o RNA mensageiro de Arqueobactrias estava muito mais prximo do de Eucariotos do que das Eubactrias. Alm disso foi observada uma grande semelhana na maquinaria da transcrio e traduo entre as Arqueobactrias e os Eucariotos, sugerindo que esses ltimos originaram-se de

Archea. Em 1989, estudos feitos com DNA e protenas vieram comprovar a semelhana entre esses dois grupos. . Com base nessas pesquisas, era esperado que o nico DNA bacteriano presente em uma clula Eucariota fosse o advindo das bactrias que originaram as mitocndrias e os cloroplastos. Conseqentemente, os outros genes seriam originrios das Arqueobactrias (supostos ancestrais dos Eucariotos). Mas essas expectativas foram refutadas com a descoberta de que os Eucariotos possuem em seu ncleo genes de Eubactrias alm dos provenientes da endossimbiose que originou as mitocndrias e os cloroplastos. Do mesmo modo, Arqueobactrias possuem uma grande quantidade de genes de Eubactrias. A melhor explicao para esses fatos que a evoluo no um acontecimento linear, como Darwin imaginava. Apesar de os genes tambm serem transmitidos verticalmente de gerao para gerao, esse no o nico evento importante na evoluo. Existem transmisses horizontais de genes, que fazem a interao entre grupos distintos (o que pode explicar como Arqueobactrias possuem genes encontrados em Eubactrias, por exemplo). Algo muito interessante na provvel origem da vida que o sistema de catlise qumica (muito importante nas clulas vivas), j mostrava sua feio antes mesmo da origem do primeiro procarioto. As famlias de molculas de RNA (cido ribonuclico) na sopa primordial j podiam promover sua autocatlise. To interessante quanto esse fato que essas molculas foram vtimas da seleo natural (base da evoluo dos organismos vivos), como essas eram diferentes entre s, cada qual possuia estabilidades e velocidades de catlise diferentes entre s. Dentro desse cenrio algumas molculas de RNA eram capazes de mediar a polimerizao de alguns aminocidos, ainda que de uma maneira primitiva e auto-suficiente, nada parecido com o aparato complexo de sntese protica atual. Alguns desses polmeros de aminocidos (peptdeos e/ou protenas) devem ter sido importantes para a replicao do RNA, ento espontaneamente (com base em eventos evolutivos de sucesso e erros) riou-se um cdigo no qual uma seqncia especfica de RNA criava uma de protenas. Nessa sopa existiam tambm fosfolipdeos que com suas propriedade amfipticas ( substncia que possui regies hidroflicas e hidrofbicas) num ambiente aquoso , associavam-se e formavam estruturas globulares, uma bicamada lipdica com as pores hidrofbicas associadas umas s outras e as cabeas hidroflicas expostas gua. Essa membrana fosfolipdica englobou uma poro dessa sopa pr-bitica com RNA autoreplicante e outras substncias. A partir desse momento, esse conjunto sofreu seleo, o RNA

agora no era mais selecionado com base apenas em sua estrutura mas, tambm com seu efeito nas outras estruturas presentes no compartimento. O compartimento e sua seqncia de nucleotdeos poderia ser expressa como uma unidade celular viva. Conforme o acmulo de protenas catalticas foi permitindo a formao de clulas mais complexas, a molcula de DNA (cido desoxirribonuclico) substituiu a de RNA por ser uma molcula mais estvel para a estocagem de grandes quantidades de informao gentica necessrias para essas clulas.

5) Um experimento foi realizado empregando-se glicose radioativa. Aps algumas horas, identificou-se um aminocido marcado (triptofano). Como se explica tal acontecimento? Tambm a radioatividade foi encontrada em ligninas e fitoalexinas que se tornaram marcadas. Qual a relao destas substncias com a glicose radioativa empregada? A radioatividade poderia ser esperada em outros compostos? Quais? Poderia o arogenato estar tambm marcado? Qual a fonte de N encontrado nestas substncias? Elabore um experimento para provar a origem deste N nos compostos mencionados. O emprego de precursores marcados radiativamente, como por exemplo C, podemos acompanhar o destino individual de cada tomo de carbono. O fluxo metablico pode ser monitorado em tecidos vivos por meio de precursores marcados com C e espectroscopia NMR (ressonncia nuclear magntica) em tecidos totais. Como o sinal NMR caracterstico do composto C, podemos acompanhar o deslocamento dos carbonos marcados em precursores intermedirios da via e em compostos deles derivados. Assim temos a glicose radioativa com seus respectivos carbonos marcados. Os precursores dos aminocidos aromticos so intermedirios glicoliticos do fosfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato que um intermedirio da rota da pentose-fosfato.

TRIPTOFANO GLICOSE TIROSINA FENILALANINA

FRUTOSE 1,6 BIFOSFATO

ANTRANILATO PREFENATO

3 FOSFOGLICERATO ERITROSE 4 FOSFATO

CORISMATE

FOSFOENOLPIRUVATO

DAHP

SHIKIMATE

A glicose com seus carbonos marcados estar presente na formao do fosfoenolpiruvato, que um intermedirio metablico e participar na formao da sntese dos aminocidos aromticos em plantas (triptofano, fenilalanina e tirosina). A fenilalanina e a tirosina so precursores da sntese de lignina que estar marcada. O triptofano marcado, o precursor da sntese de fitoalexinas e que tambm vo estar marcadas. Os seguintes compostos podem tambm estar marcados ndole glucosinolates, acridone, alcalides, flavonodes, isoflavonoides. O arogenato um intermedirio metablico na sntese de fenilalanina e tirosina, tendo o fosfoenolpiruvato como precursor, ele pode perfeitamente estar marcado. A via ramificada que leva aos aminocidos triptofano, fenilalanina e tirosina que ocorre nas bactrias e vegetais, a principal rota biolgica de formao do anel aromtico. Ela ocorre pelo fechamento em anel de um percussor aliftico, seguido de adies sucessivas de duplas ligaes. Os primeiros quatros passos resultam na formao de shikimato, no qual uma molcula de sete carbonos que derivada da eritrose-4-fosfato e do fosfoenolpiruvato. O shikimato convertido em corismato em trs passos subseqentes que incluem a adio de mais trs carbonos de outra molcula de PEP (marcado). O corismato o primeiro ponto de ramificao, com um ramo que leva ao triptofano, e o outro a fenilalanina e tirosina. A ao da enzima prefenato aminotransferase transfere o radical amino do glutamato para o prefenato, havendo liberao do -cetoglutarato e sntese do arogenato. A ao da enzima antranilato sintase transfere o radical amino da glutamina para o corismato, havendo liberao de glutamato e piruvato e sntese de antranilato. A ramificao que leva ao triptofano, o corismato convertido primeiro em antanilato. Nessa reao, a glutamina fornece nitrognio. Assim a fonte de nitrognio de substancias obtidas dos aminocidos aromticos so arogenato e antranilato.
formao de antranilato
CORISMATO C C C C HO H C C H O CH 2 C C OO antranilate sintetase Glutamina Glutamato Piruvato C OO + C C C C C ANTRANILATO C NH
3

C OO

C O O CORISMATO C C C C H 2

C C HO

C O O

H H corism ato m utase

CO O C C

CH2

C O O

O C PREFENATO

C C

HO

H glutam ato

am ino transferase cetoglutarato

C O O

C H

C O O

C C C

NH

AROGENATO

C NADP NADPH NH + OH arogenato desidrogenase arogenato desidratase CO 2 H 2 O

NH

3 C O O

3 C H C O O C 2 C H

C H

C H

FENILALANINA C

C C C C C C C TIROSINA C

..

OH

FOSFOENOLPIRUVATO + ERITROSE 4 FOSFATO DHAP-SINTETASE

SHIKIMATO

CORISMATO CORISMATO MUTASE

ANTRANILATO SINTETASE

ANTRANILATO

AROGENATO

TRIPTOFANO

TIROSINA E FENILALANINA

FITOALEXINAS

HIDROXICINAMATO ALCALOIDES FLAVONOIDES LIGNINA

Experimento para provar a origem do N nos compostos mencionados: Emprega-se amnia radioativa com substrato contendo uma planta. O NH4+ marcado ser assimilado pelas enzimas GS e GOGAT, formando os aminocidos glutamina e glutamato que tambm estaro marcados. Provando que o arogenato e o antranilato so as fontes de nitrognio para a formao dos compostos mencionados, dever ser feita a extrao de seiva das plantas aps um tempo e separao das protenas por cromatografia ou separao em coluna, e posterior anlise da presena do nitrognio marcado atravs da espectrofotometria de massa. Os primeiros compostos da via de sntese de aminocidos aromticos sero o arogenato e o antranilato, provando a origem do nitrognio.

Referncias Bibliogrficas Brasileiro, A.C.M. 1998 Manual de transformao gentica de plantas. Editado por Ana Cristina Miranda Brasileiro; Vera Tavares de Campos Carneiro. Braslia : Embrapa-SPI/EmbrapaCernagem. 309p. Conn, E.E. 1972 Manual de Bioqumica. Trad. Malavolta, E.; Silva, D.M.; Crocomo, O.J. Universidade de So Paulo. p.p.331-337. Junqueira, L.C.; Carneiro, J. 1997 Biologia Celular e Molecular. Editora Guanabara Koogan S.A. 299p. Lehninger, A.L. 1990 Princpios de Bioqumica. Trad. Lodi, W.R & Simes, A.A. Universidade de So Paulo, p.p.453-455. Lewin, B. 2001 Genes VII. [Trad] Porto Alegre: Artmed 955p. Marzzoco, A. & Torres, B.B. 1990 Bioqumica Bsica. Ed. Guanabara. p.p.162-163. Raven, P.H.; Evert, R.F.; Eichhorn, S.E. 2001 Biologia Vegetal. 6 Edio, Ed. Guanabara Koogan, 906p. Wilkinson, D.G. 1999 In Situ Hibridization : a practical aproach.The practical aproach series. Editor: B. D. Hames. New York. 224p. Zaha, A. 1996 Biologia Molecular Bsica. Porto Alegre: Mercado Aberto, 336p. Zaha, A. 2000 Biologia Molecular Bsica. Editora Afiliada. 2 Edio. Porto Alegre. 336p.

Sites consultados: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS http://www.icb.ufmg.br/~lbcd/grupo4/ubi.html 03/06/03

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SO PAULO http://www.rbi.fmrp.usp.br/proteol/proteol.htm 03/06/03