Eletroforese

Eletroforese para separar e s vezes purificar macromolculas protenas e cidos nuclicos diferentes tamanhos, carga ou conformao

Quando molculas so colocadas em um campo eltrico, migram para o plo positivo ou negativo. Protenas (carga lquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel submerso em um tampo que possui ons para a corrente passar E tambm para manter o pH mais ou menos constante.

Gel: composto de agarose ou poliacrilamida

Agarose um polissacardeo extrado de alga marinha. Usada em concentraes de 0,5 to 2%. Fcil de preparar. No-txico.

Gis de Agarose possuem ampla capacidade de separao mas baixa resoluo Dependendo da concentrao podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.

Poliacrilamida um polmero de ligao cruzada de acrilamida. Comprimento das cadeias do polmero dependem da concentrao usada (3,5 a 20%). So mais difceis de preparar. Como oxignio inibe a polimerizao precisam ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e mscaras devem ser usadas para pesar o p. A poliacrilamida considerada no txica mas luvas devem ser usadas pela possvel presena de acrilamida livre

Gis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separao mas alta capacidade de resoluo. Para DNA a poliacrilamida usada para separar fragmentos de menos de 500 bp. s vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferena. Tambm usados para separao de protenas.

Equipamento e reagentes para gel de agarose:

Uma cuba de eletroforese e um fonte de fora Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plstico transparente UV. As extremidades so abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese Pentes para fazer poos aonde as amostras sero aplicadas Tampo de eletroforese (corrida), Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE). Tampo de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra Migrao: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) Brometo de Etdeo, corante fluorescente usado para corar cidos nuclicos. Ateno: Luvas sempre pois o brometo de etdeo um agente mutagnico Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com EtBr Ateno: sempre usar proteo nos olhos (UV)

http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg

Tampo de amostra

VISUALIZAO APS A ELETROFORESE

O corante mais comum para gis de agarose o brometo de etdio (EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA (ou RNA) Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.

http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis

SYBR Green > Molecular Probes 1995

> Revolucionou a deteco de DNA em gis A intensidade da fluorescncia do SYBR Green aumentada em 100X quando se liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas de DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: - muito menos mutagnico, - Pode ser adicionado diretamente amostra antes da eletroforese.

Eletroforese Vertical

VISUALIZAO APS SDS-PAGE

Coomassie Blue Coomassie Brilliant Blue R250, se liga inespecificamente a praticamente todas as protenas. menos sensvel que corar com a prata mas efetivo tambm, alm de ser fcil de corar.

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22772/22772049.jpg

Mtodo da Prata
A maior vantagem a sensibilidade sobre os outros mtodos. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250. Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e anlise de amostra diluda. A prata pode detectar tambm cidos nuclicos, glicoprotenas e lipoprotenas.