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USO DE BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS: UMA ALTERNATIVA PARA A CONDUO DE BIOPROCESSOS

Resumo
A imobilizao de biocatalisadores uma estratgia que pode ser utilizada para a conduo de bioprocessos em situaes variadas. De uma forma geral, busca-se, com a imobilizao, propiciar o uso de enzimas ou clulas por perodos prolongados atravs de processos contnuos ou semicontnuos. Na presente reviso, aspectos bsicos e aplicados sobre este tema so apresentados de maneira seqencial, evidenciando-se novas tendncias na rea. Em adio, o uso de clulas imobilizadas para a produo de cerveja em processo contnuo apresentado. Palavras-chave: Imobilizao, clulas, enzimas, cerveja
Walter Carvalho*, Larissa Canilha e Silvio Silvrio da Silva Faculdade de Engenharia Qumica de Lorena, Departamento de Biotecnologia * Autor para correspondncia: Rodovia Itajub-Lorena, Km 74,5 Caixa Postal 116 CEP: 12600-970. Lorena. SP Fone: (12) 3159-5027 Fax: (12) 3153-3133 E-mail: carvalho@debiq.faenquil.br

Summary
The immobilization of biocatalysts is a strategy that can be used for the conduction of bioprocesses in a number of situations. By using an immobilization method, one is seeking to use the enzymes or the cells for prolonged periods, through continuous or semi-continuous processes. In the present review, basic and applied aspects of this subject are presented in a sequential fashion, highlighting new tendencies in the area. In addition, the use of immobilized cells for the continuous production of beer is presented. Keywords: Immobilization, cells, enzymes, beer

Introduo
Biocatalisadores, enzimas ou clulas, tm sido amplamente utilizados em diversos processos, seja em escala laboratorial ou industrial. H muitos anos, esforos intensivos tm sido empreendidos no somente no desenvolvimento de biocatalisadores com propriedades superiores, mas tambm na elucidao de tcnicas que permitam o seu uso repetido ou em processos contnuos. Apesar destes esforos intensivos, amplamente documentados na forma de publicaes tcnicas e registros de patentes, poucos processos baseados em tcnicas de imobilizao, seja de enzimas ou de clulas, foram implementados em escala industrial. Acredita-se que o desenvolvimento de novos suportes de imobilizao, aliado utilizao de tcnicas de biologia molecular, possam contribuir para o desenvolvimento de novos processos em larga escala. Os conhecimentos adquiridos at o momento sero de fundamental importncia para os progressos que venham a ser obtidos. Como objetivo final, deve-se ter em mente o planejamento de processos economicamente viveis.
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Face ao exposto, o presente trabalho tem por objetivo revisar a literatura relativa ao uso de biocatalisadores imobilizados, principalmente clulas, assim como ilustrar novas tendncias na rea. Desta forma, temas como conceito, vantagens, mtodos de imobilizao, tipos de suporte, reatores utilizados e exemplos de aplicaes industriais j implementadas so abordados. O uso de clulas imobilizadas para a produo de cerveja em sistema contnuo de fermentao, com perspectivas de aplicao em escala industrial, apresentado. Definio De acordo com a 1 Conferncia em Engenharia de Enzimas (Henniker, Estados Unidos, 1971), biocatalisadores imobilizados, enzimas ou clulas, so catalisadores fisicamente confinados ou localizados em uma regio definida do espao, com reteno de suas atividades catalticas, e que podem ser utilizados repetida ou continuamente (Katchalski-Katzir e Kraemer, 2000).
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Vantagens A dificuldade em se recuperar a enzima do meio reacional ao final da catlise, aliada instabilidade e freqente inadeqabilidade para uso em determinados solventes e/ou condies de pH, temperatura e exposio a agentes desnaturantes, podem ser superadas por meio da imobilizao. A enzima imobilizada pode ser reutilizada e normalmente mais estvel em relao enzima livre, com a vantagem adicional de possibilitar a realizao de um processo contnuo (Beynum, 1980). Uma vez que muitas reaes comercialmente importantes envolvem sistemas multienzimticos complexos, nos quais a presena de passos que requerem proviso de energia ou uso de cofatores comum, a utilizao de enzimas economicamente invivel, porque a necessidade de adio de substncias como ATP e coenzimas eleva consideravelmente o valor do produto final (Corcoran, 1985). Para estes casos, dada nfase imobilizao de clulas ao invs de enzimas propriamente ditas. Alm da regenerao de cofatores ocorrer de maneira natural, vantagens como eliminao da necessidade de extrao e purificao, estabilidade operacional geralmente maior, menor custo, maior rendimento de atividade e maior resistncia a perturbaes ambientais so descritas na literatura (Corcoran, 1985). Por outro lado, o uso de clulas imobilizadas tem sido considerado como uma alternativa para aumentar a produtividade global de fermentaes, tradicionalmente realizadas com clulas em suspenso, uma vez que permite o trabalho com elevadas concentraes celulares no reator (Ramakrishna e Prakasham, 1999). Entretanto, de acordo com Groboillot et al. (1994), o aumento de produtividade determinado pela imobilizao celular ocorre principalmente atravs da operao contnua e da reutilizao das clulas. De fato, a imobilizao celular pode ser utilizada como uma ferramenta para aumentar a eficincia de processos fermentativos, possibilitando a reutilizao dos mesmos biocatalisadores por longos perodos e estimulando processos contnuos, que podem reduzir os custos de produo (Gamarra et al., 1988), alm de poder aumentar a proteo das clulas contra inibidores e facilitar a separao dos biocatalisadores da fase lquida, onde os produtos de interesse esto presentes (Corcoran, 1985). Mtodos de imobilizao Existem quatro princpios bsicos para a imobilizao de biocatalisadores: Ligao a superfcies, aprisionamento em matrizes porosas, conteno por membranas e auto-agregao (Gerbsch e Buchholz, 1995). O mtodo de imobilizao por meio de ligao a superfcies pode ser realizado por meio de interaes inicas ou adsortivas, ou atravs de ligaes covalentes entre grupos reativos do suporte e do biocatalisador. A ligao por meio de adsoro e/ou interaes inicas um mtodo simples e barato, sendo a principal desvantagem a vulnerabilidade de perda dos biocatalisadores imobilizados para o meio reacioRevista AnalyticaJunho/Julho 2006N23

nal. Para aumentar a massa de biocatalisadores imobilizados, suportes porosos tm sido geralmente utilizados, permitindo a ligao do biocatalisador tambm estrutura superficial interna. Por outro lado, a imobilizao por meio de ligaes covalentes resulta em uma interao biocatalisador-suporte mais forte, sendo a principal desvantagem o risco de danos membrana celular, no caso de imobilizao de clulas (Groboillot et al., 1994). A imobilizao por meio de aprisionamento em matrizes porosas normalmente envolve a sintetizao in situ da matriz porosa em torno dos biocatalisadores a serem imobilizados. Este mtodo tem sido extensivamente estudado para a imobilizao de clulas viveis, devido possibilidade de uso de polmeros hidroflicos biocompatveis como suportes de imobilizao (Groboillot et al., 1994). Alm disso, as clulas imobilizadas em uma matriz hidroflica podem ser protegidas de condies no adequadas de pH, temperatura, solventes orgnicos e/ou compostos inibidores presentes no meio de fermentao (Park e Chang, 2000). Como a matriz de aprisionamento geralmente resulta em limitaes de transferncia de massa, a imobilizao na forma de esferas geralmente preferida devido elevada rea superficial (Groboillot et al., 1994). Como principais desvantagens, so citados o pequeno volume disponvel para a conteno das clulas imobilizadas, a perda de clulas para o meio de fermentao, que limitam a quantidade de clulas imobilizadas nas esferas, e a instabilidade dos suportes normalmente utilizados, que limita a utilizao dos agregados por longos perodos (Park e Chang, 2000). O mtodo de imobilizao por meio de conteno em membranas envolve a utilizao de membranas pr-formadas (reatores do tipo hollow fiber) ou a formao in situ da membrana em torno das clulas a serem imobilizadas (Karel et al., 1985). Este mtodo, tambm conhecido como encapsulamento, tem sido utilizado como uma tecnologia alternativa ao aprisionamento em matrizes porosas, uma vez que oferece vantagens como maior capacidade de conteno de clulas e preveno da perda de clulas para o meio de fermentao. Devido ausncia de ncleo gelificado, as limitaes transferncia de massa tambm so reduzidas (Park e Chang, 2000). De acordo com Gerbsch e Buchholz (1995), uma aplicao promissora deste princpio de imobilizao a conteno de biocatalisadores em micro esferas do tipo hollow fiber, formadas atravs de interaes inicas entre sulfato de celulose e cloreto de poli-dimetil-dialil-amnio. Entretanto, um equipamento especial para a imobilizao necessrio. O mtodo de imobilizao por meio de auto-agregao envolve a agregao ou a floculao das clulas de maneira natural ou artificialmente induzida. Desta forma, os biocatalisadores so ligados entre si sem a necessidade de uso de um suporte de imobilizao. A floculao natural uma propriedade de relativamente poucas clulas. Alm disso, agregados celulares naturais so geralmente instveis e sensveis a tenses de cisalhamento, sendo necessria a adio de agentes qumicos que formam ligaes cruzadas entre clulas, como glutaraldedo, durante a imobilizao (Groboillot et al., 1994).
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Tipos de suporte Existem diversos materiais que podem ser utilizados como suportes para a imobilizao de enzimas e/ou clulas atravs dos princpios de imobilizao supracitados. A reviso elaborada por Groboillot et al. (1994) apresenta diversos exemplos de materiais tradicionalmente utilizados como suportes para a imobilizao de biocatalisadores. De acordo com estes autores, a indstria alimentcia tem mostrado tendncia na utilizao de polmeros no txicos que formam estruturas semelhantes a gis, como protenas, polisssacardeos e lcoois polivinlicos, em funo da biocompatibilidade e aceitabilidade na produo de alimentos. Entre estes, merece destaque o gel de alginato de clcio, que tem sido extensivamente estudado sob o ponto de vista tecnolgico (Gerbsch e Buchholz, 1995). O desenvolvimento de novos suportes para a imobilizao de biocatalisadores, juntamente com as tcnicas elaboradas especificamente para a imobilizao nestes suportes, tem sido objeto de intenso estudo nos ltimos anos. Estima-se que estes novos suportes e tcnicas possam contribuir para a implementao de novos processos em escala industrial. Como exemplos, podem ser citados o uso de membranas catalticas biofuncionais contendo arranjos enzimticos imobilizados atravs de stios especficos (Butterfield et al., 2001), o uso de Eupergit C como um suporte de imobilizao para enzimas de interesse industrial (katchalski-Katzir e Kraemer, 2000) e o uso de criogis de poli-vinil-lcool como matrizes para a imobilizao de clulas (Lozinsky e Plieva, 1998). Uso de membranas catalticas biofuncionais O uso de membranas biofuncionais como suportes para a imobilizao de enzimas normalmente envolve a imobilizao randmica destas biomolculas atravs dos numerosos resduos de lisina presentes na sua estrutura. Entretanto, neste processo a atividade biolgica significativamente reduzida devido s diferentes orientaes da enzima em relao membrana e/ou ligaes atravs de mltiplos pontos. Para uma atividade cataltica eficiente, a imobilizao atravs de stios especficos, mantendo o stio ativo da enzima em uma orientao adequada e afastado da superfcie da membrana, essencial. A utilizao de tcnicas de biologia molecular como mutagnese direcionada a stios especficos, tecnologia de fuso de genes e mtodos de modificao ps-traducional pode promover a imobilizao de enzimas atravs de stios especficos, minimizando a reduo na atividade cataltica provocada pelos mtodos de imobilizao randmica tradicionais. Para uma abordagem detalhada do assunto, recomenda-se a leitura das revises elaboradas por Turkov (1999) e por Butterfield et al. (2001). Deve-se ressaltar tambm que tcnicas de biologia molecular tm sido utilizadas para imobilizar enzimas na superfcie celular da levedura Saccharomyces cerevisiae, de forma a permitir a utilizao direta de substratos como amido e celuoligossacardeos, entre outros (Ueda e Tanaka, 2000).
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Uso de Eupergit C Eupergit C um suporte que consiste em microesferas (dimetro entre 100-250 m) macroporosas, desenvolvido entre 1974 e 1980 pela Rhm and Haas atravs da copolimerizao de N,N-metileno-bis-metacrilamida, glicidil-metacrilato, alil-glicidilter e metacrilamida. Este suporte apresenta potencial para a imobilizao de enzimas de interesse industrial na produo de insumos finos e frmacos (Katchalski-Katzir e Kraemer, 2000). Devido sua estrutura, o Eupergit estvel quimicamente em valores de pH variando entre 0 e 14, ou seja, pode imobilizar qualquer enzima na faixa de pH na qual ela estvel e no perde a sua atividade cataltica. Da mesma forma, a sua estabilidade mecnica notvel, uma vez que no mostrou nenhum atrito aps 650 ciclos em reatores de mistura com volumes de substrato de at 1000 L. Este suporte se liga enzima atravs de ligaes covalentes feitas atravs de seus grupos oxirano, que reagem com os grupamentos amino das molculas proticas em condies neutras ou alcalinas. Alternativamente, o Eupergit pode se ligar enzima atravs de seus grupos sulfidrila e/ou carboxila em condies cidas, neutras ou alcalinas. Devido elevada densidade de grupos oxirano na superfcie das microesferas (600 mol/g suporte seco), as enzimas so imobilizadas em vrios stios da sua estrutura. Este fenmeno, conhecido como ligao multi-ponto, considerado o fator mais importante para a alta estabilidade operacional das enzimas imobilizadas em Eupergit C. Outra vantagem o procedimento de imobilizao simples, que consiste em misturar a enzima, dissolvida no tampo apropriado, com o suporte e deixar a mistura em contato a 20-25C por 24 a 100 h. Em seguida, a enzima imobilizada lavada com gua e com a soluo tampo a ser utilizada na aplicao subsequente. A capacidade de conteno de aproximadamente 100 mg enzima/ g Eupergit C (peso seco). Este suporte comercialmente disponvel em todo o mundo, em milhares de toneladas por ano, e j vem sendo utilizado por empresas individuais para a produo de biocatalisadores imobilizados. A reviso elaborada por Katchalski-Katzir e Kraemer (2000) oferece uma discusso bastante detalhada do assunto. Vrias enzimas imobilizadas em Eupergit C so revisadas em comparao com outros suportes em termos de estabilidade operacional em concentraes de substratos realsticas para processos de produo industrial. Uso de criogis de polivini lcool Criogis de polivinil lcool, preparados pelo congelamento de solues aquosas do polmero seguido de degelo, so suportes glicos promissores para a imobilizao de clulas. Como vantagens definidas da utilizao deste suporte em relao a outros hidrogis comumente utilizados com a mesma finalidade, podem ser citadas: Apresenta elevadas micro e macroporosidades, que permitem condies favorecidas para a transferncia de massa de substratos e solutos; apresenta caractersticas reolgicas de estrutura no quebradia excelente, permitindo a utilizao na maior parte dos bioreatores e exibindo insignificante eroso abrasiva em condiRevista AnalyticaJunho/Julho 2006N23

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es de agitao intensa; a termoestabilidade excede aquela observada para outros suportes glicos termoreversveis; altamente resistente a degradao microbiolgica; apresenta baixa sensibilidade composio do meio de cultura; um composto biologicamente compatvel, no txico e disponvel a baixo custo (Lozinsky e Plieva, 1998). O uso de criogis de polivinil lcool tem se tornado progressivamente popular devido principalmente sua elevada estabilidade operacional. O procedimento para imobilizao, entretanto, no to simples como aqueles utilizados para a gelificao de polissacardeos naturais, como alginato de clcio, uma vez que envolve o congelamento (geralmente, valores de temperatura inferiores a 10 C so utilizados) e o degelo das clulas suspensas na soluo de polivinil lcool. Devido s condies drsticas de temperatura utilizadas durante o procedimento de imobilizao, a adio de alguns aditivos (sais, acares, crioprotetores) para manter a viabilidade do microrganismo normalmente empregada. A velocidade de congelamento durante a imobilizao determinada pela crioresistncia do microrganismo a ser imobilizado, enquanto a velocidade de degelo o fator mais importante que influencia as propriedades fsicas do gel. Quanto mais lento o processo de degelo, maior a estabilidade mecnica e trmica do gel formado. A termoestabilidade da matriz permite trabalhos com organismos mesoflicos e termoflicos, uma vez que as temperaturas de fuso do gel excedem a 70-80 C. Outra vantagem implcita no uso deste polmero como suporte para a imobilizao de clulas se deve possibilidade de reutilizao. O carreador utilizado pode ser solubilizado por autoclavagem e a soluo obtida pode ser reutilizada para a preparao de novos biocatalisadores imobilizados com a atividade desejada aps a adio de novas clulas. Apesar de relativamente nova, esta tcnica de imobilizao celular encontra-se amplamente documentada na literatura cientfica e atravs de patentes. A reviso elaborada por Lozinsky e Plieva (1998) apresenta uma viso detalhada do assunto e referencia diversos trabalhos especficos. Impacto da imobilizao na fisiologia celular e atividade fermentativa A atividade fisiolgica das clulas imobilizadas pode variar em funo do mtodo de imobilizao empregado. Por exemplo: a auto-agregao atravs do uso de agentes qumicos modifica quimicamente a membrana celular, afetando o metabolismo e o crescimento; Clulas adsorvidas podem apresentar propriedades de membrana diferentes e o acmulo de clulas em um biofilme pode levar a limitaes de transferncia de massa; Tcnicas de aprisionamento em matrizes porosas normalmente resultam em mudanas nas propriedades fsico-qumicas do microambiente no qual as clulas se encontram, influenciando o metabolismo celular. Estas variaes na atividade fisiolgica das clulas imobilizadas, dependentes tambm das caractersticas do suporte de imobilizao utilizado, podem influenciar positiva ou negati64

vamente a performance do processo fermentativo atravs de diversos mecanismos, ainda pouco caracterizados e compreendidos (Groboillot et al., 1994). De uma maneira geral, efeitos determinados por componentes solveis da matriz de imobilizao, tolerncia e/ou proteo a compostos txicos e tipo de metabolismo, entre outros, tm sido utilizados como justificativas para a melhora ou piora na atividade cataltica determinada pela imobilizao. A escolha do mtodo de imobilizao e do tipo de suporte depende basicamente de dois fatores: Das caractersticas peculiares do microrganismo e das condies de uso do microrganismo imobilizado. Face variabilidade destes dois fatores, no existe um mtodo e nem um suporte universais, adequados para qualquer processo. De acordo com Vitolo (1988), o mtodo e o tipo de suporte a serem empregados em um determinado processo devem ser estabelecidos empiricamente, recaindo a escolha do binmio suporte-mtodo sobre aquele que apresentar maior reteno da atividade. Reatores Aps a escolha do suporte e mtodo de imobilizao adequados, uma das questes mais importantes consiste na resistncia transferncia de massa entre a fase lquida, na qual se encontram os reagentes/substratos, e a fase slida, na qual se encontram os biocatalisadores imobilizados (Karel et al., 1985). A transferncia de massa entre o meio lquido e os biocatalisadores imobilizados dividida em duas fases: a) transferncia de massa externa, que envolve a transferncia de reagentes/substratos do meio de fermentao at a superfcie do suporte de imobilizao, e b) transferncia de massa interna, que descreve a transferncia de reagentes/substratos no suporte de imobilizao. Alm das resistncias transferncia de massa externa e interna, o microambiente no qual os biocatalisadores imobilizados se encontram, determinado tambm por efeitos de partio entre a fase lquida e a matriz slida de imobilizao (Pilkington et al., 1998a). As limitaes transferncia de massa interna so de particular importncia em sistemas nos quais as clulas so imobilizadas por meio da tcnica de aprisionamento em matrizes porosas, sendo a reduo do dimetro das esferas de imobilizao uma alternativa eficiente para minimizar estas limitaes (Pilkington et al., 1998). Supondo que as limitaes transferncia de massa interna possam ser desprezadas, deve-se ter em mente que os agregados imobilizados s podem ser completamente ativos se as taxas de transferncia dos reagentes/substratos presentes na fase lquida at a superfcie do suporte de imobilizao superarem as taxas de transferncia interna e de reao (Baron et al., 1996). Desta forma, esforos devem ser direcionados no sentido de eliminar as limitaes transferncia de massa externa. Fatores como tipo, tamanho e condies de operao do biorreator utilizado iro influenciar a transferncia de massa exRevista AnalyticaJunho/Julho 2006N23

terna em sistemas com biocatalisadores imobilizados, afetando o coeficiente de transferncia de massa do filme lquido (KL) que envolve os agregados imobilizados. A otimizao da mistura entre a fase lquida e a fase slida maximiza o contato superficial entre estas fases, minimizando a espessura do filme lquido estagnante que envolve o suporte de imobilizao, maximizando o valor de KL e, conseqentemente, minimizando as limitaes impostas transferncia de massa (Pilkington et al., 1998). Embora vrios tipos de reatores possam ser selecionados para um dado sistema imobilizado, a eficincia tima requer uma escolha adequada (Baron et al.,1996). Especificamente para trabalhos com clulas imobilizadas, fatores como requerimentos de transferncia de massa (principalmente suprimento de oxignio e remoo de gases), mtodo de imobilizao e caractersticas do suporte utilizados, natureza do substrato e requerimentos para o cultivo do microrganismo devem ser levados em considerao quando da escolha de um determinado tipo ou configurao de reator (Karel et al., 1985; Fukuda, 1994; Baron et al., 1996; Pilkington et al., 1998a). Os reatores utilizados para o cultivo de clulas imobilizadas podem ser divididos em trs categorias, de acordo com o padro de fluxo: Reatores de mistura, reatores de leito empacotado e reatores de leito fluidizado. Estes reatores podem ainda ser modificados para melhorar as caractersticas de transferncia de massa e a capacidade de controle das condies de cultivo ou para minimizar o estresse imposto ao suporte de imobilizao (Fukuda, 1994; Baron et al., 1996). Os reatores de mistura representam o tipo de reator mais amplamente utilizado para o cultivo de clulas em suspenso, seja em escala laboratorial, seja em escala industrial (Baron et al., 1996). Embora vrios tipos de turbinas possam ser utilizadas, a principal desvantagem relativa ao uso deste tipo de reator para o cultivo de clulas imobilizadas refere-se tenso de cisalhamento imposta a matrizes sensveis (Groboillot et al., 1994). Este reator apresenta vantagens como fcil controle de temperatura e pH, e a sua operao em modo contnuo adequada em casos de inibio pelo substrato (Fukuda, 1994). Alm disso, oferece as melhores caractersticas de mistura e transferncia de oxignio (Groboillot et al., 1994). Nos reatores de leito empacotado, os agregados imobilizados so empacotados em uma coluna, atravs da qual o meio de fermentao passado. Apesar da simplicidade de design e baixo custo, este tipo de reator mais utilizado em fermentaes anaerbicas. Para cultivos aerados, a aerao do meio de fermentao geralmente no suficiente para oxigenar todo o reator devido depleo rpida do oxignio no incio da coluna (Groboillot et al., 1994). Alm disso, desvios do comportamento ideal de fluxo, do tipo plug flow, so constantemente observados durante as fermentaes por motivos diversos (acmulo de gases como CO2, compactao do leito, acmulo de biomassa suspensa, ambos levando formao de caminhos preferenciais), o que prejudica as taxas de produo atravs de limitaes transferncia de massa (Fukuda, 1994).
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Os reatores de leito fluidizado representam um compromisso entre os reatores de mistura e os reatores de leito empacotado, aliando boas condies de mistura (caracterstica dos reatores de mistura) a baixas tenses de cisalhamento (caracterstica dos reatores de leito empacotado). Em contraste com os reatores do tipo leito empacotado, os reatores do tipo leito fluidizado facilitam a mistura entre as fases lquida e slida, a remoo de gases e minimizam a presso sobre o leito de agregados imobilizados (Groboillot et al., 1994). Para a obteno de boas caractersticas de fluidizao, a diferena de densidade entre os agregados celulares e o meio de fermentao deve ser a maior possvel. Desta forma, gis de hidrocolides hidratados, como alginato de clcio, no so recomendados devido semelhana de densidades entre o polmero e o meio de fermentao aquoso. Dependendo do tamanho e densidade do suporte, das taxas de fluxo de gases e lquidos e da geometria do leito, diversos padres de mistura podem ser obtidos nos quais as fases lquidas e slidas podem estar sendo adequadamente misturadas ou no. Desta forma, deve-se ressaltar que, dependendo das condies hidrodinmicas do sistema, os agregados celulares podem sofrer limitaes de transferncia de massa, o que ir prejudicar as taxas de produo. De acordo com Gerbsch e Buchholz (1995), o desenvolvimento, modificao e otimizao de reatores foi objeto de intensos estudos de engenharia e desenvolvimento de processos nos ltimos anos. A despeito destes esforos, nenhum sucesso substancial foi obtido no sentido de introduzir processos biotecnolgicos economicamente comparveis a processos qumicos, se negligenciadas algumas poucas excees. De acordo com estes autores, a principal tarefa da bioengenharia para o futuro , em cooperao com a biologia molecular, superar este obstculo, no atravs do desenvolvimento de novos tipos de reatores, mas atravs do planejamento e desenvolvimento de processos economicamente viveis.

Aplicaes Industriais
Apesar do grande volume de literatura publicada sobre imobilizao de biocatalisadores, a aplicao desta tecnologia em escala industrial ainda limitada (Gerbsch e Buchholz, 1995). Como exemplos clssicos, podem ser citados: 1) Enzimas imobilizadas: A produo de xarope de milho rico em frutose, atravs da isomerizao contnua de glicose com a enzima glicose isomerase pela Clinton Corn Producing, Estados Unidos; A produo contnua de L-aminocidos com a enzima aminoacilase pela Tanabe Seiyacu, Japo; A produo de cido 6-amino-penicilnico a partir de penicilina G ou V com a enzima penicilina acilase pela Bristol-Myer Squibb, Inglaterra. 2) Clulas imobilizadas: A produo de acrilamida a partir de acrilonitrila por clulas no viveis de Rhodococcus rhodochrous pela Nitto Chemical Industries, Japo (Katchalski65

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Katzir e Kraemer, 2000). Com exceo de algumas aplicaes na produo de vinagre e no tratamento de efluentes, no se tem notcias do uso de clulas viveis imobilizadas em outros processos industriais (Virkajrvi, 2001); Exceo deve ser feita para o cultivo de clulas superiores, especialmente clulas animais, que necessitam ser imobilizadas e so muito utilizadas na produo de insumos farmacuticos (Wandrey, 1996). A produo de biosensores tambm uma rea na qual tcnicas de imobilizao tm sido aplicadas com sucesso. De acordo com Dong e Chen (2002), estes equipamentos, baseados na incorporao de elementos biolgicos (enzimas ou clulas) em uma camada sensitiva intimamente conectada com um transdutor, tm sido amplamente aplicados em diversos campos, como monitoramento de processos industriais, testes de deteco clnicos e controle ambiental, entre outros. Como vantagens da utilizao destes equipamentos, podem ser citadas simplicidade de uso, alta sensibilidade e habilidade para medidas em tempo real e in loco. Produo de cerveja A produo de cerveja geralmente mencionada como um exemplo tpico de biotecnologia velha, devido sua longa histria. Entretanto, a cervejaria moderna aplica um amplo espectro de novas invenes tcnicas, bioqumicas, microbiolgicas e genticas. Exemplos de progressos contemporneos podem ser encontrados ao longo de toda a cadeia de produo: O desenvolvimento de novos cultivares de cevada tem propiciado a obteno de maltes que geram altos rendimentos de extrato e apresentam atividades adequadas de enzimas amilolticas e proteolticas; A adio de bactrias lticas durante a fase de maltagem, alm de minimizar o desenvolvimento de microrganismos prejudiciais como Fusarium sp., leva a melhoras na eficincia de filtrao do mosto obtido; Ao invs de solventes orgnicos, tcnicas de extrao com CO2 supercrtico tm sido utilizadas para a obteno de extratos de lpulo, garantindo uma melhor qualidade ao extrato final sem resduos de solventes; A utilizao de mostos de alta densidade no incio da fermentao principal, conhecida por processo high gravity, promove um significativo aumento da capacidade de produo; Leveduras geneticamente modificadas tm sido desenvolvidas com a finalidade de: a) manter a concentrao de diacetil em valores inferiores ao limite de deteco sensorial, b) facilitar a filtrao da cerveja, e c) produzir cervejas com baixos teores de carboidratos (Linko et al., 1998). O processo de produo de cervejas do tipo lager, predominante em todo o mundo nos dias atuais, pode ser resumido em quatro fases, conforme descrito abaixo (Virkajrvi, 2001). O primeiro passo consiste na obteno do malte de cevada, obtido atravs da germinao de gros de cevada em condies especiais. Este malte modo ou triturado e misturado com gua. As enzimas presentes no prprio malte, ativadas de acordo com um perfil de temperaturas controlado pelo
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mestre cervejeiro, iro hidrolisar os polmeros presentes: amido em dextrinas, mono, di e trissacardeos, e protenas em peptdeos e aminocidos. Esta primeira fase do processo denominada mosturao. A frao insolvel do mosto obtido ento filtrada, normalmente utilizando-se a prpria casca do malte como camada filtrante. O prximo passo consiste no cozimento do mosto filtrado por 1 a 2 horas, aps a adio de lpulo. O cozimento ir assegurar a assepticidade necessria, e promover a precipitao de complexos entre protenas e polifenis, a solubilizao/isomerizao de componentes do lpulo, a remoo de compostos que determinam sabores desagradveis no produto final e a obteno da concentrao desejada de acares. As enzimas presentes so inativadas durante o cozimento. O material precipitado, conhecido como trub, ento removido. Aps a remoo do trub, o mosto resfriado, transferido para o fermentador e aerado at saturao na concentrao de oxignio dissolvido. A fermentao da cerveja do tipo lager dividida em duas fases: Fermentao principal (ou primria) e fermentao secundria. A fermentao principal dura entre 6 e 10 dias, temperaturas entre 7 e 15C sendo utilizadas. Durante a fermentao principal, a maior parte dos compostos responsveis pelas caractersticas organolpticas do produto final so formados. Ao final desta fase, a cerveja resfriada para aproximadamente 4C e a maior parte das leveduras so retiradas pela base do fermentador. A fermentao secundria pode ser realizada no mesmo tanque da fermentao principal ou a cerveja pode ser transferida para um segundo tanque. O principal objetivo da fermentao secundria a remoo do diacetil, que causa um sabor desagradvel no produto final. Esta fase, tambm conhecida como maturao, dura entre 1 e 2 semanas. Finalmente, a cerveja estabilizada pelo resfriamento a temperatura igual ou inferior a 0C por um perodo de at 3 dias. Diferentes agentes estabilizantes, como silica gel e taninos, podem ser utilizados. Leveduras e complexos entre protenas e polifenis iro precipitar, sendo filtrados posteriormente. A carbonatao e o envase finalizam o processo de produo. A fermentao a fase mais demorada no processo de produo da cerveja. Desta forma, o uso eficiente dos tanques de fermentao um elemento crucial na economia global do processo. Tendo em vista que uma das formas de se aumentar a produtividade de um processo em batelada convert-lo em um processo contnuo, muitas cervejarias devotaram esforos para a estabilizao de processos contnuos em escala industrial nas dcadas de 50 e 60. Na dcada de 70, entretanto, esta linha de pesquisa foi abandonada por diversas dificuldades encontradas para a estabilizao da tecnologia de produo. Na dcada de 80, a tecnologia de imobilizao celular comeou a ser utilizada com a finalidade de solucionar os problemas previamente encontrados, tendo levado a aplicaes industriais na fase de fermentao secundria (Virkajrvi, 2001). De acordo com Masschelein et al. (1994), a tecnologia de imobilizao celular oferece tambm um
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cenrio bastante atrativo e eficiente em termos de custos para aplicao na fase de fermentao principal. Impactos importantes do desenvolvimento desta tecnologia no desenvolvimento de novos processos so esperados como conseqncia. Flavour A cerveja um produto para o qual a imagem muito importante. Qualquer mudana no processo de produo com vistas reduo de custos deve preservar as caractersticas organolpticas do produto final (Virkajrvi, 2001), tradicionalmente denominadas de flavour e consideradas neste trabalho como sabor ou aroma. A cerveja uma soluo aquosa complexa, contendo CO2, etanol, diversos sais inorgnicos e cerca de 800 compostos orgnicos (Hardwick, 1995). O sabor da cerveja determinado pela matria-prima, pelo tipo de processo e pela levedura utilizados, alm dos compostos produzidos durante a fermentao, que exercem o maior impacto (Virkajrvi, 2001). Entre os compostos produzidos pela levedura, que influenciam marcadamente o sabor da cerveja obtida, encontram-se lcoois, steres, cidos orgnicos, compostos carbonilados e compostos sulfurados. O etanol o lcool encontrado em maior concentrao na cerveja, exercendo portanto um impacto no sabor do produto final. Entre os lcoois superiores, merecem destaque os lcoois amlico e isoamlico pelo impacto determinado no sabor do produto. De acordo com Hardwick (1995), os demais lcoois superiores afetam o sabor da cerveja atravs de efeitos cumulativos, uma vez que as concentraes normalmente presentes raramente ultrapassam os limites de deteco individuais. De acordo com Virkajrvi (2001), como os lcoois apresentam limites de deteco sensorial aproximadamente 10 vezes superiores aos steres e 1000 vezes superiores aos compostos carbonilados, os impactos provocados por estes compostos no sabor final da cerveja no so to importantes, a despeito das elevadas concentraes normalmente presentes. steres so compostos importantes no sabor da cerveja produzida. De acordo com Virkajrvi (2001), acetato de etila, acetato de isoamila, caproato de etila e caprilato de etila so os principais steres encontrados na cerveja. A cerveja levemente cida. De acordo com Hardwick (1995), cido carbnico e cidos orgnicos so os prinicpais responsveis pelo sabor levemente azedo da cerveja. Os cidos orgnicos so todos subprodutos do metabolismo, essencialmente excretados pela levedura. Entre os cidos orgnicos que mais influenciam o sabor da cerveja encontram-se os cidos actico, cprico, caprico e caprlico. Entre os compostos carbonilados, acetaldedo e diacetil so os mais importantes. O acetaldedo pode exceder o valor de deteco sensorial durante a fase ativa da fermentao, mas normalmente reduzido a etanol na fase de maturao. Por outro lado, o diacetil o composto chave na determinao das caractersticas organolpticas do produto final. O principal objetivo da fermentao secundria a remoo do
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diacetil, que determina um sabor de manteiga no produto final (Angelino, 1991). Os compostos sulfurados so provenientes principalmente do malte, embora o lpulo tambm possa conter resduos destes compostos. Entre os compostos sulfurados derivados do metabolismo da levedura, encontram-se o sulfeto de hidrognio e o dixido de enxofre (Hardwick, 1995). Normalmente, estes compostos so removidos da cerveja durante a fermentao. Entretanto, em algumas situaes, como baixa atividade celular e fermentao lenta, a presena de compostos sulfurados pode determinar um aroma de ovo podre no produto final (Angelino, 1991). Fermentao principal A fermentao principal da cerveja em sistema contnuo com clulas imobilizadas pode se tornar uma realidade na cervejaria moderna em um curto espao de tempo (Pilkington et al., 1998). De acordo com Linko et al. (1998), grandes cervejarias produzem tipicamente 500 milhes de litros de cerveja/ano. Estas cervejarias precisam ser eficientes para sobreviver em um mundo competitivo e globalizado, estando obviamente interessadas em todas as novidades tcnicas que possam levar a processos com menor custo e maiores facilidade e segurana. De fato, grandes cervejarias em todo o mundo j vm empreendendo esforos no sentido de se implementar processos contnuos com clulas imobilizadas em escala industrial, podendo-se citar como exemplos: Kirin Brewery Company, Japo; Labbat Breweries, Canad; Meura Delta, Blgica; Sapporo Breweries, Japo; Hartwall Plc, Finlndia (Virkajrvi, 2001). De acordo com Pilkington et al. (1998b), os principais fatores que motivam a mudana na tecnologia de produo so a significativa reduo no tempo necessrio para a produo da cerveja pronta para consumo, a reduo dos inventrios necessrios, a reduo do espao ocupado pela planta e a obteno de um produto com caractersticas uniformes. Estudos preliminares demonstraram que sistemas com clulas imobilizadas operados de forma contnua podem reduzir o tempo necessrio de fermentao principal para apenas 1 dia (Mensour et al., 1996). Conforme ser discutido posteriormente, a fase de maturao conduzida com clulas imobilizadas acoplada a um processo de tratamento trmico j realizada em escala industrial em apenas 2 horas. Alguns obstculos necessitam ainda serem superados para que esta tecnologia seja implementada em escala industrial. Os principais so descritos a seguir: O primeiro deles se refere s alteraes no metabolismo da levedura determinadas pela imobilizao. Na produo de cerveja, o objetivo principal a obteno de um sabor/aroma balanceado e no somente a realizao de uma fermentao eficiente com elevado rendimento em etanol (Linko et al., 1998). A maior parte dos compostos responsveis pelas caractersticas organolpticas do produto final so formados durante a fermentao principal. A imobilizao geralmente leva a um consumo reduzido
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de aminocidos, provavelmente devido s limitaes ao crescimento celular, determinando uma menor produo de lcoois superiores e steres e valores de pH demasiadamente elevados, alm de elevados teores de diacetil (Virkajrvi, 2001). A questo crtica : Como o sabor/aroma tradicional desejado pode ser obtido, baseado em um balano adequado de numerosos compostos. A resposta no fcil, tendo em vista as relaes complexas entre o crescimento do microrganismo e a formao dos produtos. De acordo com Linko et al. (1998), para a obteno de uma cerveja com caractersticas organolpticas adequadas, geralmente aceito que a fermentao contnua deveria ser realizada atravs de estgios, mimetizando a fermentao em batelada convencional. Esta condio poderia ser obtida atravs da utilizao de um padro de fluxo do tipo plug flow atravs do reator ou, alternativamente, atravs de uma srie de reatores de mistura em cascata. Desta forma, as clulas poderiam experienciar condies aerbias nos estgios iniciais da fermentao, utilizando o oxignio disponvel para crescimento, e condies anaerbias ao final da fermentao. Uma tese de doutorado concluda no Centro de Pesquisas Tcnicas da Finlndia (Virkajrvi, 2001) comprovou a possibilidade de se produzir cerveja com caractersticas organolpticas adequadas em modo contnuo de fermentao com clulas imobilizadas, utilizando-se o princpio de estgios de fermentao. Atravs da variao na composio e quantidade de gases injetados no reator, foi possvel controlar a formao de compostos aromticos durante a fermentao primria. O segundo obstculo se refere ao preparo do mosto para as fermentaes propriamente ditas. As fases de preparo do mosto, coletivamente denominadas de brassagem, constituem ainda uma srie de operaes em bateladas. Uma brassagem continuamente operada seria atrativa, especialmente se os estgios subseqentes (fermentaes primria e secundria) fossem realizados em modo contnuo de operao. De acordo com Linko et al. (1998), a combinao de estgios contnuos e em bateladas geralmente problemtica. Tanques de armazenamento com grandes volumes so necessrios, o que poderia diminuir as vantagens econmicas e criar problemas adicionais em termos de contaminao microbiana, uma vez que o mosto bastante vulnervel ao ataque de microrganismos antes da inoculao. O terceiro obstculo diz respeito ao preo do suporte de imobilizao. De acordo com Linko et al. (1998), o preo do suporte de imobilizao o fator que exerce a limitao econmica mais severa implantao de processos em escala industrial. Os resultados obtidos at o momento apontam para a utilizao de suportes pr-formados e regenerveis como os mais promissores, podendo ser a imobilizao celular processada atravs de adsoro ou ligaes covalentes (Masschelein et al., 1994). Atualmente, existem diversos grupos ao redor do mundo trabalhando com o objetivo de implementar esta tecnologia
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em escala industrial. Para que o objetivo final seja alcanado, uma equipe altamente interdisciplinar de pesquisadores aplicados com slidos conhecimentos em engenharia bioqumica, microbiologia, qumica e bioqumica ser necessria (Pilkington et al., 1998b). Fermentao secundria A remoo de diacetil (2,3-butanodiona) e 2,3-pentanodiona, coletivamente denominados dicetonas vicinais, e de seus precursores, -aceto-lactato e -aceto-hidrxi-butirato, respectivamente, um dos principais objetivos da fermentao secundria da cerveja (Masschelein et al., 1994). Trs passos esto envolvidos na formao e remoo de dicetonas vicinais: 1) sntese e excreo de -aceto-hidrxi-cidos pela levedura, 2) descarboxilao oxidativa de -aceto-hidrxi-cidos at as respectivas dicetonas, e 3) reduo das dicetonas vicinais pela levedura (Masschelein et al., 1994). Embora ambos compostos (diacetil e 2,3-pentanodiona) sejam importantes no controle da maturao da cerveja, o diacetil o composto que apresenta maior impacto no sabor/aroma do produto final. De acordo com Linko et al. (1998), o limite de deteco sensorial do diacetil de apenas 0,05 mg/L ou menos. O controle eficiente da concentrao de diacetil pode ser obtido de duas maneiras: a) preveno da formao do precursor (-aceto-lactato), ou b) aumento da taxa de descarboxilao qumica do precursor. A preveno da formao do precursor -aceto-lactato pode ser alcanada atravs da utilizao de leveduras que contm o gene que codifica a sntese da enzima -aceto-lactato-descarboxilase integrado em seu genoma. Desta forma, o excesso de -aceto-lactato produzido atravs da via de biossntese do aminocido valina convertido diretamente a acetona pela enzima incorporada ao genoma da levedura (Linko et al., 1998). Estudos em escala piloto confirmaram a possibilidade de uso desta estratgia (Kronlf e Linko, 1992). Entretanto, a aplicao da tecnologia de DNA recombinante na cervejaria moderna pode ser retardada, ou at mesmo rejeitada, por regulaes governamentais e/ou rejeio por parte do consumidor (Masschelein et al., 1994). A fase limitante na maturao da cerveja a baixa taxa de converso espontnea (no enzimtica) de -acetolactato em diacetil. Esta reao, como todas as reaes, procede mais lentamente a baixas temperaturas, sendo limitada pela temperatura de maturao de 4C (Linko et al., 1998). Baker e Kirsop (1973) foram os primeiros pesquisadores a reportar o emprego de tratamento trmico da cerveja para a rpida converso de precursores de diacetil a diacetil, e a subsequente remoo do diacetil formado por clulas imobilizadas. Este conceito o fundamento atravs do qual processos contnuos de fermentao secundria so utilizados em escala industrial hoje em dia. Aps a fermentao principal, a levedura residual
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removida por meio de uma centrfuga hermeticamente fechada, e a cerveja verde aquecida a 90C por 10 minutos utilizando-se trocadores de calor. Este tratamento trmico suficiente para converter todo o -aceto-lactato presente em diacetil e acetona. Aps resfriamento, o diacetil remanescente ento convertido em acetona atravs de um sistema contnuo, operado em reator de leito empacotado, com clulas imobilizadas em DEAE celulose, um derivado granular da celulose. Um tempo de residncia no reator de apenas 2 horas suficiente para completar a maturao da cerveja e alcanar nveis de diacetil inferiores ao limite de deteco sensorial (Masschelein et al., 1994; Linko et al., 1998). Deve-se ressaltar que no foram detectadas mudanas significativas nos espectros analticos e sensoriais impostas por esta nova tecnologia de maturao, podendo-se citar como exemplo de aplicao industrial deste processo a produo de cerveja pela Sinebrychoff Kerawa Brewery, Finlndia (Virkajrvi, 2001).

Concluso
A tecnologia de imobilizao trouxe novas perspectivas para a aplicao de enzimas e clulas em processos industriais. Aliada as novas invenes tcnicas, bioqumicas, microbiolgicas e genticas, esta tecnologia pode ser utilizada como uma ferramenta para aumentar a eficincia de processos biotecnolgicos e, consequentemente, reduzir custos de produo. Por outro lado, apesar da tendncia de se pensar em agregados macroscpicos que permitem a fcil separao da fase slida presente no meio reacional (agregado enzimtico) ou no meio de fermentao (agregado celular), no se deve esquecer dos recentes progressos trazidos pela tecnologia de membranas. Atualmente, tcnicas modernas j permitem a fcil separao dos biocatalisadores a partir de uma suspenso (clulas) ou de uma soluo (enzimas) atravs do uso de membranas de microfiltrao ou ultrafiltrao, respectivamente (Kragl e Dwars, 2001).

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