Kit de purificao de DNA Genomic Assistente 1. Descrio........................................................................ ...........................................1 2. Produto componentes e Conditions de armazenamento............................ ..............2 3.

Protocolos para isolamento de DNA Genomico................................... .....................5 A. Isolamento do DNA Genomico do sangue total (Volume da amostra 300l ou 3 ml).5 B. Isolamento DNA Genomico do sangue (Volume da amostra 10 ml)...............7 C. isolar ADN Genomic do . o do sangue total (placa de 96 poos) ................... ...9 M. isolar ADN Genomic da cultura de tecidos clulas e tecidos animais............. .....11 E. isolar ADN Genomic da planta tecido.......................................... .....................13 F. isolar ADN Genomic da levedura............................................... ............................14 G. isolar ADN Genomic de Gram positivo e Gram negativo bactrias....16 4. Soluo de problemas............................................................. ........................................17 5. Referncias ................................................................... .........................................18 6. Apndice ...................................................................... .......................................19 R. composio dos Buffers e solues .................................................... .........19 B. Related Products............................................................. ........................................19 1. Descrio Kit de purificao de DNA Genomic que o assistente projetado para o isolamento do DN A de clulas brancas do sangue (pontos 3. a, B e C), clulas de cultura de tecidos e de tecidos animais (seco 3. d), tecido de plantas (ponto 3.E), levedura (ponto 3. F), e Gram positiva e Gram negativas bactrias (ponto 3.G). A tabela 1 lista o ren dimento tpico de DNA purificado de cada uma dessas fontes. Kit de purificao de DNA Genomic que o assistente baseado em um processo de quatro etapas (1). O primeiro passo no processo de purificao lyses as clulas e os ncleos. P ara isolamento de DNA de clulas brancas do sangue, essa etapa envolve lise de hemc ias na soluo de lise celular, seguido de lise de clulas brancas do sangue e seus ncl eos na soluo de lise de ncleos. Uma etapa de digesto RNase pode ser includa neste mom ento; opcional para alguns aplicativos. As protenas celulares, em seguida, so remo vidas por uma etapa de precipitao de sal, que precipita as protenas, mas deixa o AD N genomic de alto peso molecular em soluo. Finalmente, o ADN genomic concentrado e posto por precipitao do isopropanol. ADN purificado com este sistema adequado para uma variedade de aplicaes, incluindo a amplificao, digesto com endonucleases de restrio e hibridizaes de membrana (por exe plo, do Sul e ponto/slot borres). 2. Produto componentes e isolamento de Small-Scale de condies de armazenamento (mi nipreps) Produto Tamanho Gato. # Assistente Kit de purificao de ADN Genomic 100 isolamentos A1120 Cada sistema contm reagentes suficientes para 100 isolamentos de ADN genomic de 3 00 l de amostras de sangue total. Inclui: 100 ml Soluo de lise celular 50 ml Soluo de lise de ncleos 25 ml Soluo de precipitao de protenas 50 ml Soluo de reidratao de DNA 250l Soluo de RNase Condies de armazenamento: Loja o Kit Genomic DNA purificao do assistente temperatura ambiente (22-25 C). Consulte o rtulo do produto para data de validade.

3. Protocolos para isolao Genomic do ADN Ns testamos a purificao do ADN de genomic do fresco de sangue total coletado em EDT A, anticoagulante heparina e citrato de tubos e no detectado nenhum efeito negati vo nas manipulaes subseqentes do DNA, incluindo PCR (2). Amostras de sangue anticoa gulante podem ser armazenadas em 2 a 8 C por at dois meses, mas o rendimento do A DN ser reduzido com o aumento da durao do armazenamento. O protocolo na seo 3. foi projetado e testado para amostras de sangue de 3 ml de v olume. O protocolo na seo 3. b foi projetado e testado para amostras de sangue de 10 ml de volume. O rendimento do ADN genomic ir variar dependendo da quantidade d e glbulos brancos presentes. Sangue congelado pode ser usado nos protocolos a seg uintes, mas rendimento pode ser menor do que o obtido com sangue fresco e soluo de lise celular adicional pode ser necessria. Cuidado: Quando manipulao de amostras de sangue (pontos 3. a, B e C), siga os proc edimentos recomendados na sua instituio para materiais biohazardous ou consulte re ferncia 3.

3. A. isolar ADN Genomic de sangue total (300Volume de amostra l ou 3 ml) materia is a ser fornecido pelo usurio tubos de microcentrifuge estril 1,5 ml (para 300amostras de sangue de l) tubos de centrfuga estril 15 ml (para amostras de sangue de 3 ml) Banho-Maria 37 C isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala banho-65 C (opcional, para reidratao rpida de DNA) 1. Para 300l Volume de amostra: Adicionar 900l da soluo de lise celular para um tubo de microcentrifuge estril 1,5 ml. Para 3 ml Volume de amostra: Adicione 9,0 ml de soluo de lise celular para um tubo de centrfuga estril 15 ml. Importante: Sangue deve ser coletados em tubos anticoagulante EDTA, heparina ou citrato para evitar coagulao. 2. Movimente suavemente o tubo de sangue at que completamente misturados; ento tra nsfira o sangue para o tubo contendo a soluo de lise celular. Inverter os tempos d e 5-6 de tubo para misturar. 3. Incubar a mistura durante 10 minutos temperatura ambiente (invertido 2-3 veze s uma vez durante a incubao) para lyse as clulas vermelhas do sangue. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 20 segundos temperatura de 300amostra de l. Centrifugar a 2.000 g durante 10 minutos temperatura de amostra 3 ml. 4. Remover e descartar tanto sobrenadante possvel sem perturbar o sedimento visvel branco. Aproximadamente 10 a 20l de lquido residual permanecer no tubo de 1,5 ml ( 300amostra de l). Aproximadamente 50 100l de lquido residual permanecer no tubo de 1 5 ml (amostra de 3 ml). Se amostra de sangue foram congelada, repita as etapas 1 a 4 at que o sedimento b ranco. Pode haver alguma perda de ADN de amostras congeladas. Nota: Alguns glbulos vermelhos ou detritos de clula podem ser visveis junto com as clulas brancas do sangue. Se o sedimento parece conter somente clulas vermelhas do sangue, adicionar uma alquota adicional de soluo de lise celular aps a remoo do sobre nadante acima do sedimento de clula e, em seguida, repita passos 3-4. 5. Vortex o tubo vigorosamente at que as clulas brancas do sangue so resuspended (1 0-15 segundos). Resuspend completamente as clulas brancas do sangue para obter lise celular efici ente. 6. Adicionar soluo de lise de ncleos (300l para 300l amostra volume; 3,0 ml de volume de amostra 3 ml) para o tubo contendo as clulas ressuspenso. Pipetar a soluo 5-6 v ezes para lyse as clulas brancas do sangue. A soluo deve tornar-se muito viscosa. S e grupos de clulas so visveis aps a mistura, incube a soluo a 37 C at que os grupos am interrompidos. Se as aglomeraes so ainda visveis aps 1 hora, adicionar soluo de lis de ncleos adicionais (100l para 300l amostra volume; 1,0 ml de volume de amostra 3 ml) e repita a incubao. 7. Opcional: adicionar soluo de RNase (1.5l para 300l amostra volume; 15l volume de a mostra 3 ml) para a nuclear lisato e misturar a amostra invertendo os tempos de

2 a 5 do tubo. Incubar a mistura a 37 C durante 15 minutos e, em seguida, arrefe cer at temperatura ambiente. 8. Adicionar soluo de precipitao de protenas (100l para 300l amostra volume; 1,0 ml de volume de amostra 3 ml) para a nuclear lisato e vrtice vigorosamente por 10 a 20 segundos. Aglomerados de pequenas protenas podem ser visveis aps vortexing. Nota: Se a soluo de lise de ncleos adicional foi adicionada na Etapa 6, adicionar u m total de 130l soluo de precipitao de protenas para 300volume de amostra de l e 1,3 m soluo de precipitao de protena para o volume de amostra de 3 ml. 9. Centrifugar a 13, 00016, 000 g por 3 minutos temperatura de 300volume de amostr a de l. Centrifugar a 2.000 g durante 10 minutos temperatura de volume de amostr a de 3 ml. Um sedimento de protena marrom escuro deve ser visvel. Se nenhum sedime nto observado, consulte a seo 4. 10. Para 300volume de amostra l, transferir o sobrenadante para um tubo de microc entrifuge limpo 1,5 ml contendo 300l de isopropanol temperatura da sala. Volume d e amostra 3 ml, transferir o sobrenadante para um tubo de centrfuga de 15 ml cont endo 3 ml-temperatura isopropanol. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe este resduo lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA om a protena precipitada. 11. Delicadamente misture a soluo por inverso at que os brancos thread-como filament os de DNA formam uma massa visvel. 12. Centrifugar a 13, 00016, 000 g por 1 minuto temperatura de 300amostra de l. Ce ntrifugar a 2.000 g durante 1 minuto na temperatura de quarto para 3 ml da amost ra. O DNA ser visvel como um pequeno sedimento branco. 13. Decantar o sobrenadante e adicionar um volume de amostra de temperatura etan ol a 70% para o DNA. Suavemente inverter o tubo vrias vezes para lavar o sediment o de DNA e os lados do tubo do microcentrifuge. Centrfuga como na etapa 12. 14. Cuidadosamente Aspire o etanol utilizando uma pipeta de Pasteur desenhada ou uma ponta da pipeta de seqenciamento. O sedimento de DNA muito solto neste momen to e cuidado deve ser usado para evitar ambidestros pellet na pipeta. Inverter o t ubo com um papel absorvente limpo e secar o sedimento durante 10 a 15 minutos. 15. Adicionar soluo de reidratao de DNA (100l para 300l amostra volume; 250l volume de amostra 3 ml) para o tubo e rehydrate o DNA por incubao a 65 C durante 1 hora. Per iodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo. Como alternativa, re-hidrat ar o DNA por incubao a soluo durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 c. 16. Armazenar o DNA 2 a 8 c. 3. B. isolar ADN Genomic de sangue total (Volume de amostra de 10 ml) Um kit de grande escala est disponvel para o processamento de at 1 litro de sangue (Cat. # A1620). Este kit no inclui soluo de RNase desde a etapa de digesto do RNase opcional. RNase a soluo (4 mg/ml) est disponvel como um item separado (Cat. # A7973) . Se ele for necessrio, um total de 5 ml do RNase uma soluo necessria para processar 1 litro de sangue. Materiais a ser fornecido pelo usurio tubos de centrfuga de estril 50 ml Banho-Maria 37 C isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala banho-65 C (opcional; para reidratao rpida de DNA) 1. Para as amostras de sangue total de 10 ml: adicionar 30 ml de soluo de lise cel ular para um tubo de centrfuga estril 50 ml. Importante: Sangue deve ser coletados em tubos anticoagulante EDTA, heparina ou citrato para evitar coagulao. 2. Movimente suavemente o tubo de sangue at que completamente misturados; ento tra nsfira 10 ml de sangue para o tubo contendo a soluo de lise celular. Inverter os t empos de 5-6 de tubo para misturar. 3. Incube a mistura durante 10 minutos temperatura ambiente (invertido 2-3 vezes uma vez durante a incubao) para lyse as clulas vermelhas do sangue. Centrifugar a 2.000 g durante 10 minutos temperatura ambiente. 4. Remover e descartar tanto so

brenadante possvel sem perturbar o sedimento visvel branco. Cerca de 1,4 ml de lqui do residual permanecer. Se a amostra de sangue foram congelada, adicionar um adic ional 30 ml de soluo de lise celular, inverter 5-6 vezes para misturar e repita os passos 3-4 at que o sedimento quase branco. Pode haver alguma perda de DNA em am ostras congeladas. Nota: Alguns glbulos vermelhos ou detritos de clula podem ser visveis junto com as clulas brancas do sangue. Se o sedimento parece conter somente clulas vermelhas do sangue, adicione uma alquota adicional de soluo de lise celular aps a remoo do sobren adante acima do sedimento de clula e, em seguida, repita as etapas 3-4. 5. Vortex o tubo vigorosamente at que as clulas brancas do sangue so resuspended (1 0-15 segundos). Resuspend completamente as clulas brancas do sangue para obter lise celular efici ente. 6. Adicione 10 ml da soluo de lise de ncleos para o tubo contendo as clulas ressuspe nso. Pipetar a soluo 5-6 vezes para lyse as clulas brancas do sangue. A soluo deve to rnar-se muito viscosa. Se grupos de clulas so visveis aps a mistura, incube a soluo a 37 C at que os grupos sejam interrompidos. Se as aglomeraes so ainda visveis aps 1 ho a, adicionar 3 ml de soluo de lise de ncleos adicionais e repita a incubao. 7. Opcional: adicionar RNase A, uma concentrao final de 20g/ml, o nuclear lisato e misturar a amostra invertendo os tempos de 2 a 5 do tubo. Incubar a mistura a 37 C durante 15 minutos e, em seguida, arrefecer at temperatura ambiente. 8. Adicione 3,3 ml de Protein Precipitation Solution para o nuclear lisato e vrti ce vigorosamente por 10 a 20 segundos. Aglomerados de pequenas protenas podem ser visveis aps vortexing. Nota: Se soluo de lise de ncleos adicional foi adicionada na Etapa 6, adicionar 4 m l de soluo de precipitao de protenas (em vez de 3.3). 9. Centrifugar a 2.000 g durante 10 minutos temperatura ambiente. Um sedimento d e protena marrom escuro deve ser visvel. Se nenhum sedimento observado, consulte a seo 4. 10. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifugao de 50 ml contendo 10 ml d e isopropanol de temperatura. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe o residual lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA c om a protena precipitada. 11. Delicadamente misture a soluo por inverso at que os brancos thread-como filament os de DNA formam uma massa visvel. 12. Centrifugar a 2.000 g durante 1 minuto temperatura ambiente.O DNA ser visvel como um pequeno sedimento branco. 13. Decantar o sobrenadante e adicionar 10 ml de etanol a 70% temperatura ambien te ao DNA. Suavemente inverter o tubo vrias vezes para lavar o sedimento de DNA e as paredes do tubo de centrifugao. Centrfuga como na etapa 12. 14. Cuidadosamente Aspire o etanol. O sedimento de DNA muito solto neste momento e cuidado deve ser usado para evitar ambidestros pellet na pipeta. Airdry o sedim ento durante 10 a 15 minutos. 15. Adicionar 800l de soluo de reidratao de DNA para o tubo e rehydrate o DNA por inc ubao a 65 C durante 1 hora. Periodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo . Como alternativa, re-hidratar o DNA por incubao a soluo durante a noite em tempera tura ambiente ou a 4 c. 16. Armazenar o DNA 2 a 8 c. 3. C. isolar ADN Genomic de sangue total (placa de 96 poos) O presente protocolo pode ser dimensionado para 20l, 30l ou 40l de sangue. Tabela 2 descreve os vrios volumes de soluo usados em cada etapa. Cinqenta-microlitro preps geralmente produzem ADN genomic no intervalo de 0.20.7g, dependendo do nmero de leu ccitos na amostra de sangue. Materiais a ser fornecido pelo usurio V-inferior 96 poos plate(s) capaz de sustentar 300l volume/poo (Costar Cat. # 3896) isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala seladores de placa de 96 poos (Costar Cat. # 3095) (opcional; para uso com sangue

) 1. Adicionar 150l soluo de lise celular a cada poo. Importante: Sangue deve ser coletados em tubos de anticoagulante EDTA, heparina ou citrato. 2. Adicionar 50l de sangue fresco a cada poo e Pipetar 2 a 3 vezes para misturar. 3. Deixe a placa na temperatura de quarto por 10 minutos, deve ser proibido pipe tar soluo duas vezes durante a incubao para ajudar lyse as clulas vermelhas do sangue . 4. Centrifugar a 800 g durante 5 minutos em um jogo de mesa centrfuga para concen trar-se as clulas. 5. Cuidadosamente, remover e descartar o mximo de sobrenadante possvel, com uma di ca de micropipeta, deixando um pequeno sedimento de clulas brancas e algumas clula s vermelhas do sangue. O uso de uma ponta da pipeta estendida, como uma dica de carregamento de gel, recomendado. Inclinando a placa de 96 poos 50-80 (dependendo da quantidade de lquido presente por poo) permite a remoo mais profunda do lquido do poo. 6. Adicionar 50l da soluo de lise de ncleos para cada poo e Pipetar 5-6 vezes para re suspend a pelota e lyse as clulas brancas do sangue. A soluo deve tornar-se mais vi scosa. Como um auxlio no DNA pelota visualizao, 2l por alvolo de uma operadora (por e xemplo, Polyacryl transportadora [Molecular Research Center, Inc., Cat. # PC152] ) pode ser adicionado a esta etapa. Os rendimentos de DNA so geralmente equivalen tes com ou sem uso de transportadora. 7. Adicionar 16,5l de soluo de precipitao de protenas por bem e Pipetar 5-6 vezes mist urar. 8. Centrifugar a 1.400 g durante 10 minutos temperatura ambiente. Um sedimento d e protena marrom deve ser visvel. Se nenhum sedimento estiver visvel, consulte a seo 4. 9. DNA precipitao/reidratao em placa de 96 poos r. transferir com cuidado as fraces sobrenadantes para limpar poos contendo 50l por poo de temperatura isopropanol e misturar pipetando. Nota: Alguns de sobrenadante podem permanecer no poo original contendo o sediment o de protena. Deixe este resduo lquido no poo para evitar contaminar a soluo de DNA co m a protena precipitada. Como no Passo 5, inclinando a chapa facilitar a remoo do lqu ido do poo. Usando uma ponta da pipeta estendida nesta etapa no permite fcil amostr a misturando com isopropanol. b. Centrifugar a 1.400 g durante 10 minutos. Remova com cuidado o isopropanol co m uma ponta de micropipeta. c. Adicionar 100l de etanol a 70% temperatura por alvolo. m. Centrifugar a 1.400 g durante 10 minutos temperatura ambiente. e. cuidadosamente Aspire o etanol utilizando uma pipeta de Pasteur desenhada ou uma ponta da pipeta de seqenciamento. Deve tomar cuidado para evitar ambidestros o sedimento de DNA. Coloque a bandeja em um ngulo de 30 45 e secarem durante 10 a 15 minutos. f. adicionar 25l de soluo de reidratao de ADN a cada poo. Permitir que o DNA para re-h idratar durante a noite a temperatura ambiente ou a 4 c. g. armazenar o DNA 2 a 8 c. Nota: Volumes pequenos de DNA podem ser facilmente coletados no fundo de um poo d e v por centrifugao brevemente a placa de 96 poos antes do uso. 3.D. isolar ADN Genomic da cultura de tecidos de clulas e tecidos animais Materiais a ser fornecido pelo usurio tubos de microcentrifuge de 1,5 ml tubos de centrfuga de 15 ml pequeno homogeneizador (Fisher tecido lacrimognea, Cat. # 15-338-55 ou equivalent e) (para tecidos animais) tripsina (para apenas clulas de cultura de tecidos aderentes) PBS nitrognio lquido (para cauda de rato) (opcional; para congelamento-descongelamento , passo 1. d e para moagem de tecido, passo 2. b, no lugar do pequeno homogeneiz ador) almofariz e pilo (opcional; para tecido moagem, etapa 2. b, no lugar do pequeno h

omogeneizador) Banho de gua a 95 C (opcional; para congelamento-descongelamento, passo 1. d) Banho-Maria 37 C isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala banho-65 C (opcional; para reidratao rpida de DNA) 0,5 M EDTA (pH 8.0) (para o rabo do rato) Proteinase K (20 mg/ml em gua; Cat. # V3021) (para o rabo do rato) 1. Cultura de tecidos clulas r. colher as clulas e transferi-los para um tubo de microcentrifuge 1,5 ml. Para clulas aderentes, trypsinize as clulas antes da colheita. b. Centrifugar a 13, 00016, 000 g por 10 segundos para agregar as clulas. c. remover o lquido sobrenadante, deixando para trs o sedimento celular plus 10l de lquido residual. d. Adicionar 200l PBS para lavar as clulas. Centrifugar como no passo 1, alnea b e remover o PBS. Vrtice vigorosamente para resuspend clulas. Nota: Para clulas que no lyse bem em ncleos Lysis Solution sozinho (por exemplo, clu las PC12), executar uma etapa adicional de congelar-descongelar como segue antes de proceder ao passo Demonstraoemanutenodascompetnciasprticas: lavar as clulas como n passo 1. d; em seguida, congelar em nitrognio lquido. Descongelar as clulas por te mperatura de 95 c. Repita este procedimento para um total de 4 ciclos. e. adicionar 600l de soluo de lise de ncleos e Pipetar para lyse as pilhas. Pipetar at que nenhuma clula visvel aglomerados permanecem. f. proceder rubrica 3. d, o passo 4. 2. Animal tecido (fgado de rato e crebro) a. adicionar 600l de soluo de lise de ncleos para um tubo de centrfuga de 15 ml e fri o no Ice. b. adicionar 1020mg de tecidos frescos ou descongelados para a soluo de lise ncleos refrigeradas e homogeneizar durante 10 segundos, usando uma pequena homogeneizad or. Transferi o lysate para um tubo de microcentrifuge 1,5 ml. Como alternativa, moer tecido no nitrognio lquido utilizando um almofariz e pilo tem sido prechilled no nitrognio lquido. Aps triturao, permitir que o nitrognio lquido evapora e transfer r aproximadamente 1020mg do tecido terreno 600l da soluo de lise de ncleos em um tubo do microcentrifuge 1,5 ml. c. incube a lisato a 65 C durante 15-30 minutos. m. avance para a seco 3. d, etapa 4. 3. Tecido animal (cauda de rato) r. para cada amostra a ser processada, adicionar 120l de uma soluo de EDTA M (pH 8. 0) 0,5 a 500l da soluo de lise de ncleos em um tubo de centrifugao. Chill em Ice. Nota: a soluo vai virar Mostly cloudy quando refrigeradas. b. Adicione 0.51cm de cauda de rato frescos ou descongelados para um tubo de micr ocentrifuge 1,5 ml. Nota: o tecido pode ser terreno a um p fino em nitrognio lquido utilizando um almof ariz e pilo tem sido prechilled no nitrognio lquido. Ento transfira o p para um tubo de microcentrifuge 1,5 ml. c. adicionar 600l da soluo de lise EDTA/ncleos da 3. a etapa ao tubo. m. adicionar 17,5l de 20 mg/ml Proteinase k. e. Incubar durante uma noite a 55 C, com agitao suave. Como alternativa, execute u ma incubao de 3 horas, 55 C (com agitao); vrtice da amostra uma vez por hora se reali zando uma incubao de 3 horas. Certifica-se de que a cauda completamente digerida. 4. Opcional para cauda de rato: adicionar 3l de RNase Solution para o nuclear lis ato e misturar a amostra invertendo os tempos de 2 a 5 do tubo. Incubar a mistur a durante 15-30 minutos a 37 c. Deixar arrefecer temperatura ambiente por 5 minu tos antes de continuar a amostra. 5. A amostra de temperatura ambiente, adicionar 200l de soluo de precipitao de protena s e vrtice vigorosamente em alta velocidade por 20 segundos. Amostra chill no gel o por 5 minutos. 6. Centrifugar durante 4 minutos a 13, 00016, 000 g. A protena precipitada ir forma r um sedimento branco apertado. 7. Cuidadosamente, remover o sobrenadante contendo o DNA (deixando o sedimento d

e protena) e transferi-lo para um tubo de microcentrifuge limpo 1,5 ml contendo 6 00l de isopropanol temperatura. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe este resduo lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA om a protena precipitada. 8. Delicadamente misture a soluo por inverso at que os brancos thread-como filamento s de DNA formam uma massa visvel. 9. Centrifugar durante 1 minuto de 13, 00016, 000 g temperatura ambiente. O DNA s er visvel como um pequeno sedimento branco. Decanta cuidadosamente o sobrenadante. 10. Adicionar 600l de etanol 70% a temperatura ambiente e inverter suavemente o t ubo vrias vezes para lavar o DNA. Centrifugar durante 1 minuto de 13, 00016, 000 g temperatura ambiente. 11. Cuidadosamente Aspire o etanol utilizando uma pipeta de Pasteur desenhada ou uma ponta da pipeta de seqenciamento. O sedimento de DNA muito solto neste momen to, e cuidado deve ser usado para evitar ambidestros pellet na pipeta. 12. Inverter o tubo com um papel absorvente limpo e secar o sedimento durante 10 a 15 minutos. 13. Adicionar 100l de soluo de reidratao de DNA e rehydrate o DNA por incubao a 65 C rante 1 hora. Periodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo. Como alter nativa, re-hidratar o DNA por incubao a soluo durante a noite em temperatura ambient e ou a 4 c. 14. Guarde o DNA 2 a 8 c. 3.E. ADN Genomic isolando de tecidos vegetais Materiais a ser fornecido pelo usurio tubos de microcentrifuge de 1,5 ml microcentrifuge tubo pilo ou almofariz e pilo banho-65 C Banho-Maria 37 C isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala 1. Tecido folha pode ser processado por congelamento com nitrognio lquido e moagem em um p fino usando um pilo de tubos do microcentrifuge ou um almofariz e pilo. Ad icione 40 mg de p esta folha para um tubo de microcentrifuge 1,5 ml. 2. Adicionar 600l de soluo de lise de ncleos e vrtice 1-3 segundos para molhar o teci do. 3. Incubar a 65 C durante 15 minutos. 4. Adicionar 3l de RNase Solution para clula lisato e misturar a amostra invertend o os tempos de 2 a 5 do tubo. Incube a mistura a 37 C durante 15 minutos. Deixar arrefecer temperatura ambiente por 5 minutos antes de continuar a amostra. 5. Adicionar 200l de soluo de precipitao de protenas e vrtice vigorosamente em alta ve ocidade por 20 segundos. 6. Centrifugar durante 3 minutos a 13, 00016, 000 g. As protenas precipitadas iro f ormar um sedimento apertado. 7. Cuidadosamente, remover o sobrenadante contendo o DNA (deixando o sedimento d e protena) e transferi-lo para um tubo de microcentrifuge limpo 1,5 ml contendo 6 00l de isopropanol temperatura. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe este resduo lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA om a protena precipitada. 8. Delicadamente misture a soluo por inverso at que a thread-como filamentos de DNA formam uma massa visvel. 9. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 1 minuto temperatura ambiente. 10. Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar 600l de etanol a 70% temper atura e suavemente inverter o tubo vrias vezes para lavar o DNA. Centrifugar a 13 , 00016, 000 g durante 1 minuto temperatura ambiente. 11. Cuidadosamente Aspire o etanol utilizando uma pipeta de Pasteur desenhada ou uma ponta da pipeta de seqenciamento. O sedimento de DNA muito solto neste momen to e cuidado deve ser usado para evitar ambidestros pellet na pipeta. 12. Inverter o tubo em papel absorvente limpo e secar o sedimento durante 15 min utos.

13. Adicionar 100l de soluo de reidratao de DNA e rehydrate o DNA por incubao a 65 C rante 1 hora. Periodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo. Como alter nativa, re-hidratar o DNA por incubao a soluo durante a noite em temperatura ambient e ou a 4 c. 14. Guarde o DNA 2 a 8 c. 3.F. ADN Genomic isolamento de levedura Materiais a ser fornecido pelo usurio tubos de microcentrifuge de 1,5 ml Caldo de YPD 50 mM EDTA (pH 8.0) lyticase de 20 mg/ml (Sigma Cat. # L2524) Banho-Maria 37 C isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala banho-65 C (opcional; para reidratao rpida de DNA) 1. Adicione 1 ml de uma cultura cultivada por 20 horas no caldo de YPD para um t ubo de microcentrifuge 1,5 ml. 2. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 2 minutos agregar as clulas. Remova o so brenadante. 3. Resuspend as clulas completamente em 293l EDTA de 50 mm. 4. Adicionar 7,5l de lyticase de 20 mg/ml e suavemente Pipetar 4 vezes para mistu rar. 5. Incube a amostra a 37 C durante 30 a 60 minutos digerir a parede celular. Arr efecer temperatura ambiente. 6. Centrifugar a amostra de 13, 00016, 000 g durante 2 minutos e, em seguida, rem over o sobrenadante. 7. Adicionar 300l da soluo de lise de ncleos para o sedimento de clula e suavemente P ipetar misturar. 8. Adicionar 100l de soluo de precipitao de protenas e vrtice vigorosamente em alta ve ocidade por 20 segundos. 9. Deixe o exemplo sentar-se no gelo por 5 minutos. 10. Centrifugar a 13, 00016, 000 g por 3 minutos. 11. Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um tubo de microcentrifuge lim po 1,5 ml contendo 300l de isopropanol temperatura. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe este resduo lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA om a protena precipitada. 12. Delicadamente misture por inverso, at que o segmento-como filamentos de DNA fo rmam uma massa visvel. 13. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 2 minutos. 14. Decantar o sobrenadante e drenar o tubo com um papel absorvente limpo cuidad osamente. Adicionar 300l de etanol a 70% temperatura e suavemente inverter o tubo vrias vezes para lavar o sedimento ADN. 15. Centrfuga de 13, 00016, 000 g durante 2 minutos. Aspire cuidadosamente todo o etanol. 16. Drenar o tubo com um papel absorvente limpo e permitir que o sedimento para secarem durante 10 a 15 minutos. 17. Adicionar 50l de soluo de reidratao ADN. 18. Adicionar 1,5l de RNase Solution para a amostra de DNA purificada. Vrtice a am ostra de 1 segundo. Centrfuga brevemente em um microcentrifuge por 5 segundos par a recolher o lquido e incubar a 37 C durante 15 minutos. 19. Re-hidratar o DNA por incubao a 65 C durante 1 hora. Periodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo. Como alternativa, re-hidratar o DNA por incubao a s oluo durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 c. 20. Guarde o DNA 2 a 8 c. 3.G. isolar ADN Genomic de Gram positivo e Gram negativo bactrias Materiais a ser fornecido pelo usurio tubos de microcentrifuge de 1,5 ml Banho-Maria a 80 C Banho-Maria 37 C

 isopropanol, temperatura ambiente etanol a 70%, a temperatura da sala banho-65 C (opcional; para reidratao rpida de DNA) 50 mM EDTA (pH 8.0) (para bactrias gram positivas) lisozima de 10 mg/ml (Sigma Cat. # L7651), (para bactrias gram positivas) 10 mg/ml lysostaphin (Sigma Cat. # L7386) (para bactrias gram positivas) 1. Adicione 1 ml de uma cultura durante a noite para um tubo de microcentrifuge 1,5 ml. 2. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 2 minutos agregar as clulas. Remova o so brenadante. Gram positivas bactrias, prossiga na etapa 3. De Gram negativo bactria s ir diretamente para a etapa 6. 3. Resuspend as clulas completamente em 480l EDTA de 50 mm. 4. Adicionar o apropriado enzyme(s) ltica para o sedimento ressuspenso clula em um volume total de 120l e suavemente Pipetar para misturar. Este tratamento prvio de stina-se a enfraquecer a parede celular para que lise de clula eficaz pode ocorre r. Nota: Para certas espcies de Staphylococcus , uma mistura de 60l de lisozima de 10 mg/ml e 60l de 10 mg/ml lysostaphin necessrio para lise eficiente. No entanto, mu itos Gram positivo estirpes bacterianas (por exemplo, Bacillus subtilis, icroco ccus luteus, otitidiscaviarum de Nocardia, Rhodococcus rhodochrouse Brevibacteri um albidium) lyse eficientemente usando lisozima sozinha. 5. Incube a amostra a 37 C durante 30 a 60 minutos. Centrifugar durante 2 minuto s a 13, 00016, 000 g e remover o sobrenadante. 6. Adicionar 600l da soluo de lise de ncleos. Suavemente Pipetar at que as clulas so r suspended. 7. Incubar a 80 C, durante 5 minutos para lyse pilhas; em seguida, arrefecer at t emperatura. 8. Adicionar 3l da soluo de RNase a clula lisato. Inverter os tempos de 2 a 5 do tub o misturar. 9. Incubar a 37 C por 1560 minutos. Arrefecer a amostra temperatura ambiente. 10. Adicionar 200l da soluo de precipitao de protena para a clula tratada com RNase li ato. Vrtice vigorosamente em alta velocidade por 20 segundos para misturar a soluo de precipitao de protenas com a clula lisato. 11. Incube a amostra em gelo por 5 minutos. 12. Centrifugar a 13, 00016, 000 g por 3 minutos. 13. Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um tubo de microcentrifuge lim po 1,5 ml contendo 600l de isopropanol temperatura. Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de protena. Deixe este resduo lquido no tubo para evitar a contaminao da soluo de DNA om a protena precipitada. 14. Delicadamente misture por inverso, at que o segmento-como filamentos de DNA fo rmam uma massa visvel. 15. Centrfuga de 13, 00016, 000 g durante 2 minutos. 16. Decantar o sobrenadante e drenar o tubo com um papel absorvente limpo cuidad osamente. Adicionar 600l de etanol a 70% temperatura e suavemente inverter o tubo vrias vezes para lavar o sedimento ADN. 17. Centrifugar a 13, 00016, 000 g durante 2 minutos. Aspire cuidadosamente o eta nol. 18. Drenar o tubo com um papel absorvente limpo e permitir que o sedimento para secarem durante 10 a 15 minutos. 19. Adicionar 100l de soluo de reidratao de DNA para o tubo e rehydrate o DNA por inc ubao a 65 C durante 1 hora. Periodicamente misture a soluo suavemente tocando o tubo . Como alternativa, re-hidratar o DNA por incubao a soluo durante a noite em tempera tura ambiente ou a 4 c. 20. Guarde o DNA 2 a 8 c. 4. Soluo de problemas Para questes no abordadas aqui, entre em contato com seu Promega filial ou o distr ibuidor local. Entre em contato com informao disponvel em: www.promega.com. E-mail: techserv@prome ga.com

Sintomas Comentrios Cogulos de sangue presentes em amostras de sangue O tubo pode ter sido arm azenado incorretamente; o sangue no foi completamente misturado ou tubos inadequa dos foram utilizados com sangue. Descarte o sangue coagulado e desenhar novas am ostras utilizando tubos de anticoagulante EDTA, heparina ou citratetreated. Pobre rendimento do ADN A amostra de sangue pode conter muito poucas clulas branc as do sangue. Desenhe amostras de sangue novo. O sedimento de clulas brancas do sangue no era completamente resuspended n a etapa 5 da seo 3. a ou b. O sedimento de clulas brancas do sangue deve ser vortex ed vigorosamente a resuspend as clulas. A amostra de sangue foi muito antiga. Melhores rendimentos so obtidos com sangue fresco. Amostras que tenham sido armazenadas a 2 5 C por mais de 5 dias podem dar a diminuio do rendimento. O sedimento de DNA foi perdido durante a precipitao do isopropanol. Use ex tremo cuidado ao remover o isopropanol para evitar perder o sedimento. Degradado DNA (< 50 kb em tamanho) Coleo imprpria ou armazenagem da amostra de sangue. Obter uma nova amostra em condies adequadas. DNA pobre rendimento usando Gram positiva bactriaprotocolo Culturas cultiva das por um tempo prolongado contm uma alta proporo de clulas que lyse facilmente aps exposio ao tratamento lysostaphin.Iniciar purificaes com uma cultura saudvel. Nenhuma pelota de protena A amostra no foi resfriada temperatura ambiente a ntes de adicionar a soluo de precipitao de protenas. Arrefecer a amostra temperatura ambiente (pelo menos 5 minutos) ou chill no gelo por 5 minutos, vrtice 20 segundos, centrifugar durante 3 minutos a 13, 00016, 000 g (10 minutos a 2.000 g por volume de amostra 3 ml) e prosseguir com o protocol o. A soluo de precipitao de protenas no foi completamente misturados com o nuclear lisato. Sempre misturar o nuclear lisato e protena Soluo de precipitao completamente. Sedimento de DNA difcil de dissolver Amostras de podem ter sido overdried. Re -hidratar DNA por incubao de 1 hora a 65 C e, em seguida, deixar a amostra tempera tura ambiente ou 4 C durante a noite. Cuidado:No deixe o ADN 65 C durante a noite . Amostras de no foram misturadas durante a etapa de reidratao. Lembre-se de misturar as amostras periodicamente durante a etapa de reidratao.

Wizard Genomic DNA Purification Kit 1. Description.................................................................. .................................................1 2. Product Components and Storage Conditions. ..................................... .......2 3. Protocols for Genomic DNA Isolation ............................................ ............5 A. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (300l or 3ml Sample Volume)............ 5 B. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (10ml Sample Volume) ............7 C. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (96-Well Plate)......................9 D. Isolating Genomic DNA from Tissue Culture Cells and Animal Tissue ........... .......11 E. Isolating Genomic DNA from Plant Tissue ..................................... ..........................13 F. Isolating Genomic DNA from Yeast............................................. ..............................14 G. Isolating Genomic DNA from Gram Positive and Gram Negative Bacteria ......... ....16 4. Troubleshooting.............................................................. .......................................17 5. References .................................................................. ..........................................18 6. Appendix .................................................................... .........................................19 A. Composition of Buffers and Solutions .......................................... ...................19 B. Related Products............................................................. ........................................19 1. Description The Wizard Genomic DNA Purification Kit is designed for isolation of DNA from whi te blood cells (Sections 3.A, B and C), tissue culture cells and animal tissue ( Section 3.D), plant tissue (Section 3.E), yeast (Section 3.F), and Gram positive and Gram negative bacteria (Section 3.G). Table 1 lists the typical yield for D NA purified from each of these sources. The Wizard Genomic DNA Purification Kit is based on a four-step process (1). The first step in the purification procedure lyses the cells and the nuclei. For iso lation of DNA from white blood cells, this step involves lysis of the red blood cells in the Cell Lysis Solution, followed by lysis of the white blood cells and their nuclei in the Nuclei Lysis Solution. An RNase digestion step may be inclu ded at this time; it is optional for some applications. The cellular proteins ar e then removed by a salt precipitation step, which precipitates the proteins but leaves the high molecular weight genomic DNA in solution. Finally, the genomic DNA is concentrated and desalted by isopropanol precipitation. DNA purified with this system is suitable for a variety of applications, includi ng amplification, digestion with restriction endonucleases and membrane hybridiz ations (e.g., Southern and dot/slot blots).

2. Product Components and Storage Conditions Small-Scale Isolation (minipreps) Product Size Cat.# Wizard Genomic DNA Purification Kit 100 isolations A1120 Each system contains sufficient reagents for 100 isolations of genomic DNA from 300l of whole blood samples. Includes: 100ml Cell Lysis Solution 50ml Nuclei Lysis Solution 25ml Protein Precipitation Solution 50ml DNA Rehydration Solution 250l RNase Solution Storage Conditions: Store the Wizard Genomic DNA Purification Kit at room tempera ture (2225C). See product label for expiration date. 3. Protocols for Genomic DNA Isolation We tested the purification of genomic DNA from fresh whole blood collected in ED TA, heparin and citrate anticoagulant tubes and detected no adverse effects upon subsequent manipulations of the DNA, including PCR (2). Anticoagulant blood sam ples may be stored at 28C for up to two months, but DNA yield will be reduced with increasing length of storage. The protocol in Section 3.A has been designed and tested for blood samples up to 3ml in volume. The protocol in Section 3.B has been designed and tested for blo od samples up to 10ml in volume. The yield of genomic DNA will vary depending on the quantity of white blood cells present. Frozen blood may be used in the foll owing protocols, but yield may be lower than that obtained using fresh blood, an d additional Cell Lysis Solution may be required. Caution: When handling blood samples (Sections 3.A, B and C), follow recommended procedures at your institution for biohazardous materials or see reference 3. 3.A. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (300l or 3ml Sample Volume) Materials to Be Supplied by the User sterile 1.5ml microcentrifuge tubes (for 300l blood samples) sterile 15ml centrifuge tubes (for 3ml blood samples) water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature water bath, 65C (optional, for rapid DNA rehydration) 1. For 300l Sample Volume: Add 900l of Cell Lysis Solution to a sterile 1.5ml micr ocentrifuge tube. For 3ml Sample Volume: Add 9.0ml of Cell Lysis Solution to a sterile 15ml centri fuge tube. Important: Blood must be collected in EDTA, heparin or citrate anticoagulant tub es to prevent clotting. 2. Gently rock the tube of blood until thoroughly mixed; then transfer blood to the tube containing the Cell Lysis Solution. Invert the tube 56 times to mix. 3. Incubate the mixture for 10 minutes at room temperature (invert 23 times once during the incubation) to lyse the red blood cells. Centrifuge at 13,00016,000 g for 20 seconds at room temperature for 300l sample. Centrifuge at 2,000 g for 10 minutes at room temperature for 3ml sample. 4. Remove and discard as much supernatant as possible without disturbing the vis ible white pellet. Approximately 1020l of residual liquid will remain in the 1.5ml tube (300l sample). Approximately 50100l of residual liquid will remain in the 15m l tube (3ml sample). If blood sample has been frozen, repeat Steps 14 until pelle t is white. There may be some loss of DNA from frozen samples. Note: Some red blood cells or cell debris may be visible along with the white bl ood cells. If the pellet appears to contain only red blood cells, add an additio nal aliquot of Cell Lysis Solution after removing the supernatant above the cell pellet, and then repeat Steps 34. 5. Vortex the tube vigorously until the white blood cells are resuspended (1015 s

econds). Completely resuspend the white blood cells to obtain efficient cell lysis. 6. Add Nuclei Lysis Solution (300l for 300l sample volume; 3.0ml for 3ml sample vo lume) to the tube containing the resuspended cells. Pipet the solution 56 times t o lyse the white blood cells. The solution should become very viscous. If clumps of cells are visible after mixing, incubate the solution at 37C until the clumps are disrupted. If the clumps are still visible after 1 hour, add additional Nuc lei Lysis Solution (100l for 300l sample volume; 1.0ml for 3ml sample volume) and repeat the incubation. 7. Optional: Add RNase Solution (1.5l for 300l sample volume; 15l for 3ml sample vo lume) to the nuclear lysate, and mix the sample by inverting the tube 25 times. I ncubate the mixture at 37C for 15 minutes, and then cool to room temperature. 8. Add Protein Precipitation Solution (100l for 300l sample volume; 1.0ml for 3ml sample volume) to the nuclear lysate, and vortex vigorously for 1020 seconds. Sma ll protein clumps may be visible after vortexing. Note: If additional Nuclei Lysis Solution was added in Step 6, add a total of 13 0l Protein Precipitation Solution for 300l sample volume and 1.3ml Protein Precipi tation Solution for 3ml sample volume. 9. Centrifuge at 13,00016,000 g for 3 minutes at room temperature for 300l sample volume. Centrifuge at 2,000 g for 10 minutes at room temperature for 3ml sample volume. A dark brown protein pellet should be visible. If no pellet is observed, refer to Section 4. 10. For 300l sample volume, transfer the supernatant to a clean 1.5ml microcentri fuge tube containing 300l of room-temperature isopropanol. For 3ml sample volume, transfer the supernatant to a 15ml centrifuge tube containing 3ml room-temperat ure isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave this residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solu tion with the precipitated protein. 11. Gently mix the solution by inversion until the white thread-like strands of DNA form a visible mass. 12. Centrifuge at 13,00016,000 g for 1 minute at room temperature for 300l sample. Centrifuge at 2,000 g for 1 minute at room temperature for 3ml sample. The DNA will be visible as a small white pellet. 13. Decant the supernatant, and add one sample volume of room temperature 70% et hanol to the DNA. Gently invert the tube several times to wash the DNA pellet an d the sides of the microcentrifuge tube. Centrifuge as in Step 12. 14. Carefully aspirate the ethanol using either a drawn Pasteur pipette or a seq uencing pipette tip. The DNA pellet is very loose at this point and care must be used to avoid aspirating the pellet into the pipette. Invert the tube on clean absorbent paper and air-dry the pellet for 1015 minutes. 15. Add DNA Rehydration Solution (100l for 300l sample volume; 250l for 3ml sample volume) to the tube and rehydrate the DNA by incubating at 65C for 1 hour. Period ically mix the solution by gently tapping the tube. Alternatively, rehydrate the DNA by incubating the solution overnight at room temperature or at 4C. 16. Store the DNA at 28C. 3.B. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (10ml Sample Volume) A large-scale kit is available for processing up to 1 liter of whole blood (Cat. # A1620). This kit does not include RNase Solution since the RNase digestion ste p is optional. RNase A solution (4mg/ml) is available as a separate item (Cat.# A7973). If it is needed, a total of 5ml of RNase A solution is required to process 1 lit er of blood. Materials to Be Supplied by the User sterile 50ml centrifuge tubes water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature water bath, 65C (optional; for rapid DNA rehydration)

1. For 10ml whole blood samples: Add 30ml of Cell Lysis Solution to a sterile 50 ml centrifuge tube. Important: Blood must be collected in EDTA, heparin or citrate anticoagulant tub es to prevent clotting. 2. Gently rock the tube of blood until thoroughly mixed; then transfer 10ml of b lood to the tube containing the Cell Lysis Solution. Invert the tube 56 times to mix. 3. Incubate the mixture for 10 minutes at room temperature (invert 23 times once during the incubation) to lyse the red blood cells. Centrifuge at 2,000 g for 10 minutes at room temperature. 4. Remove and discard as much supernatant as possi ble without disturbing the visible white pellet. Approximately 1.4ml of residual liquid will remain. If blood sample has been frozen, add an additional 30ml of Cell Lysis Solution, invert 56 times to mix, and repeat Steps 34 until pellet is n early white. There may be some loss of DNA in frozen samples. Note: Some red blood cells or cell debris may be visible along with the white bl ood cells. If the pellet appears to contain only red blood cells, add an additio nal aliquot of Cell Lysis Solution after removing the supernatant above the cell pellet, and then repeat Steps 34. 5. Vortex the tube vigorously until the white blood cells are resuspended (1015 s econds). Completely resuspend the white blood cells to obtain efficient cell lysis. 6. Add 10ml of Nuclei Lysis Solution to the tube containing the resuspended cell s. Pipet the solution 56 times to lyse the white blood cells. The solution should become very viscous. If clumps of cells are visible after mixing, incubate the solution at 37C until the clumps are disrupted. If the clumps are still visible a fter 1 hour, add 3ml of additional Nuclei Lysis Solution and repeat the incubati on. 7. Optional: Add RNase A, to a final concentration of 20g/ml, to the nuclear lysa te and mix the sample by inverting the tube 25 times. Incubate the mixture at 37C for 15 minutes, and then cool to room temperature. 8. Add 3.3ml of Protein Precipitation Solution to the nuclear lysate, and vortex vigorously for 1020 seconds. Small protein clumps may be visible after vortexing . Note: If additional Nuclei Lysis Solution was added in Step 6, add 4ml of Protei n Precipitation Solution (instead of 3.3ml). 9. Centrifuge at 2,000 g for 10 minutes at room temperature. A dark brown protei n pellet should be visible. If no pellet is observed, refer to Section 4. 10. Transfer the supernatant to a 50ml centrifuge tube containing 10ml of room t emperature isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave the residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solut ion with the precipitated protein. 11. Gently mix the solution by inversion until the white thread-like strands of DNA form a visible mass. 12. Centrifuge at 2,000 g for 1 minute at room temperature. The DNA will be visible as a small white pellet. 13. Decant the supernatant and add 10ml of room temperature 70% ethanol to the D NA. Gently invert the tube several times to wash the DNA pellet and the sides of the centrifuge tube. Centrifuge as in Step 12. 14. Carefully aspirate the ethanol. The DNA pellet is very loose at this point a nd care must be used to avoid aspirating the pellet into the pipette. Airdry the pellet for 1015 minutes. 15. Add 800l of DNA Rehydration Solution to the tube, and rehydrate the DNA by in cubating at 65C for 1 hour. Periodically mix the solution by gently tapping the t ube. Alternatively, rehydrate the DNA by incubating the solution overnight at ro om temperature or at 4C. 16. Store the DNA at 28C. 3.C. Isolating Genomic DNA from Whole Blood (96-well plate) This protocol can be scaled to 20l, 30l or 40l of blood. Table 2 outlines the vario us solution volumes used in each step. Fifty-microliter preps generally yield ge

nomic DNA in the range of 0.20.7g, depending upon the number of leukocytes in the blood sample. Materials to Be Supplied by the User V-bottom 96-well plate(s) able to hold 300l volume/well (Costar Cat.# 3896) isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature 96-well plate sealers (Costar Cat.# 3095) (optional; for use with human blood) 1. Add 150l Cell Lysis Solution to each well. Important: Blood must be collected in EDTA, heparin or citrate anticoagulant tub es. 2. Add 50l of fresh blood to each well and pipet 23 times to mix. 3. Leave the plate at room temperature for 10 minutes, pipetting the solution tw ice during the incubation to help lyse the red blood cells. 4. Centrifuge at 800 g for 5 minutes in a tabletop centrifuge to concentrate the cells. 5. Carefully remove and discard as much of the supernatant as possible with a mi cropipette tip, leaving a small pellet of white cells and some red blood cells. The use of an extended pipette tip, such as a gel loading tip, is recommended. T ilting the 96-well plate 5080 (depending on the amount of liquid present per well) allows more thorough removal of liquid from the well. 6. Add 50l of Nuclei Lysis Solution to each well and pipet 56 times to resuspend t he pellet and lyse the white blood cells. The solution should become more viscou s. As an aid in DNA pellet visualization, 2l per well of a carrier (e.g., Polyacr yl Carrier [Molecular Research Center, Inc., Cat.# PC152]) can be added at this step. DNA yields are generally equivalent with or without carrier use. 7. Add 16.5l of Protein Precipitation Solution per well and pipet 56 times to mix. 8. Centrifuge at 1,400 g for 10 minutes at room temperature. A brown protein pel let should be visible. If no pellet is visible, refer to Section 4. 9. DNA Precipitation/Rehydration in 96-Well Plate a. Carefully transfer the supernatants to clean wells containing 50l per well of room temperature isopropanol and mix by pipetting. Note: Some of supernatant may remain in the original well containing the protein pellet. Leave this residual liquid in the well to avoid contaminating the DNA s olution with the precipitated protein. As in Step 5, tilting the plate will faci litate removal of liquid from the well. Using an extended pipette tip in this st ep does not allow easy sample mixing with isopropanol. b. Centrifuge at 1,400 g for 10 minutes. Carefully remove the isopropanol with a micropipette tip. c. Add 100l of room temperature 70% ethanol per well. d. Centrifuge at 1,400 g for 10 minutes at room temperature. e. Carefully aspirate the ethanol using either a drawn Pasteur pipette or a sequ encing pipette tip. Care must be taken to avoid aspirating the DNA pellet. Place the tray at a 3045 angle and air-dry for 1015 minutes. f. Add 25l of DNA Rehydration Solution to each well. Allow the DNA to rehydrate o vernight at room temperature or at 4C. g. Store the DNA at 28C. Note: Small volumes of DNA can be easily collected at the bottom of a V-well by briefly centrifuging the 96-well plate before use. 3.D. Isolating Genomic DNA from Tissue Culture Cells and Animal Tissue Materials to Be Supplied by the User 1.5ml microcentrifuge tubes 15ml centrifuge tubes small homogenizer (Fisher Tissue Tearor, Cat.# 15-338-55, or equivalent) (for an imal tissue) trypsin (for adherent tissue culture cells only) PBS liquid nitrogen (for mouse tail) (optional; for freeze-thaw, Step 1.d, and for t issue grinding, Step 2.b, in place of small homogenizer) mortar and pestle (optional; for tissue grinding, Step 2.b, in place of small ho

mogenizer) 95C water bath (optional; for freeze-thaw, Step 1.d) water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature water bath, 65C (optional; for rapid DNA rehydration) 0.5M EDTA (pH 8.0) (for mouse tail) Proteinase K (20mg/ml in water; Cat.# V3021) (for mouse tail) 1. Tissue Culture Cells a. Harvest the cells, and transfer them to a 1.5ml microcentrifuge tube. For adh erent cells, trypsinize the cells before harvesting. b. Centrifuge at 13,00016,000 g for 10 seconds to pellet the cells. c. Remove the supernatant, leaving behind the cell pellet plus 1050l of residual l iquid. d. Add 200l PBS to wash the cells. Centrifuge as in Step 1.b, and remove the PBS. Vortex vigorously to resuspend cells. Note: For cells that do not lyse well in Nuclei Lysis Solution alone (e.g., PC12 cells), perform an additional freeze-thaw step as follows before proceeding to Step 1.e: Wash the cells as in Step 1.d; then freeze in liquid nitrogen. Thaw th e cells by heating at 95C. Repeat this procedure for a total of 4 cycles. e. Add 600l of Nuclei Lysis Solution, and pipet to lyse the cells. Pipet until no visible cell clumps remain. f. Proceed to Section 3.D, Step 4. 2. Animal Tissue (Mouse Liver and Brain) a. Add 600l of Nuclei Lysis Solution to a 15ml centrifuge tube, and chill on ice. b. Add 1020mg of fresh or thawed tissue to the chilled Nuclei Lysis Solution and homogenize for 10 seconds using a small homogenizer. Transfer the lysate to a 1. 5ml microcentrifuge tube. Alternatively, grind tissue in liquid nitrogen using a mortar and pestle that has been prechilled in liquid nitrogen. After grinding, allow the liquid nitrogen to evaporate and transfer approximately 1020mg of the g round tissue to 600l of Nuclei Lysis Solution in a 1.5ml microcentrifuge tube. c. Incubate the lysate at 65C for 1530 minutes. d. Proceed to Section 3.D, Step 4. 3. Animal Tissue (Mouse Tail) a. For each sample to be processed, add 120l of a 0.5M EDTA solution (pH 8.0) to 500l of Nuclei Lysis Solution in a centrifuge tube. Chill on ice. Note: The solution will turn cloudy when chilled. b. Add 0.51cm of fresh or thawed mouse tail to a 1.5ml microcentrifuge tube. Note: The tissue may be ground to a fine powder in liquid nitrogen using a morta r and pestle that has been prechilled in liquid nitrogen. Then transfer the powd er to a 1.5ml microcentrifuge tube. c. Add 600l of EDTA/Nuclei Lysis Solution from Step 3.a to the tube. d. Add 17.5l of 20mg/ml Proteinase K. e. Incubate overnight at 55C with gentle shaking. Alternatively, perform a 3-hour 55C incubation (with shaking); vortex the sample once per hour if performing a 3 -hour incubation. Make sure the tail is completely digested. 4. Optional for mouse tail: Add 3l of RNase Solution to the nuclear lysate and mi x the sample by inverting the tube 25 times. Incubate the mixture for 1530 minutes at 37C. Allow the sample to cool to room temperature for 5 minutes before procee ding. 5. To the room temperature sample, add 200l of Protein Precipitation Solution and vortex vigorously at high speed for 20 seconds. Chill sample on ice for 5 minut es. 6. Centrifuge for 4 minutes at 13,00016,000 g. The precipitated protein will form a tight white pellet. 7. Carefully remove the supernatant containing the DNA (leaving the protein pell et behind) and transfer it to a clean 1.5ml microcentrifuge tube containing 600l of room temperature isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave this residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solu

tion with the precipitated protein. 8. Gently mix the solution by inversion until the white thread-like strands of D NA form a visible mass. 9. Centrifuge for 1 minute at 13,00016,000 g at room temperature. The DNA will be visible as a small white pellet. Carefully decant the supernatant. 10. Add 600l of room temperature 70% ethanol, and gently invert the tube several times to wash the DNA. Centrifuge for 1 minute at 13,00016,000 g at room temperat ure. 11. Carefully aspirate the ethanol using either a drawn Pasteur pipette or a seq uencing pipette tip. The DNA pellet is very loose at this point, and care must b e used to avoid aspirating the pellet into the pipette. 12. Invert the tube on clean absorbent paper, and air-dry the pellet for 1015 min utes. 13. Add 100l of DNA Rehydration Solution, and rehydrate the DNA by incubating at 65C for 1 hour. Periodically mix the solution by gently tapping the tube. Alterna tively, rehydrate the DNA by incubating the solution overnight at room temperatu re or at 4C. 14. Store the DNA at 28C. 3.E. Isolating Genomic DNA from Plant Tissue Materials to Be Supplied by the User 1.5ml microcentrifuge tubes microcentrifuge tube pestle or mortar and pestle water bath, 65C water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature 1. Leaf tissue can be processed by freezing with liquid nitrogen and grinding in to a fine powder using a microcentrifuge tube pestle or a mortar and pestle. Add 40mg of this leaf powder to a 1.5ml microcentrifuge tube. 2. Add 600l of Nuclei Lysis Solution, and vortex 13 seconds to wet the tissue. 3. Incubate at 65C for 15 minutes. 4. Add 3l of RNase Solution to the cell lysate, and mix the sample by inverting t he tube 25 times. Incubate the mixture at 37C for 15 minutes. Allow the sample to cool to room temperature for 5 minutes before proceeding. 5. Add 200l of Protein Precipitation Solution, and vortex vigorously at high spee d for 20 seconds. 6. Centrifuge for 3 minutes at 13,00016,000 g. The precipitated proteins will for m a tight pellet. 7. Carefully remove the supernatant containing the DNA (leaving the protein pell et behind) and transfer it to a clean 1.5ml microcentrifuge tube containing 600l of room temperature isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave this residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solu tion with the precipitated protein. 8. Gently mix the solution by inversion until thread-like strands of DNA form a visible mass. 9. Centrifuge at 13,00016,000 g for 1 minute at room temperature. 10. Carefully decant the supernatant. Add 600l of room temperature 70% ethanol an d gently invert the tube several times to wash the DNA. Centrifuge at 13,00016,00 0 g for 1 minute at room temperature. 11. Carefully aspirate the ethanol using either a drawn Pasteur pipette or a seq uencing pipette tip. The DNA pellet is very loose at this point and care must be used to avoid aspirating the pellet into the pipette. 12. Invert the tube onto clean absorbent paper and air-dry the pellet for 15 min utes. 13. Add 100l of DNA Rehydration Solution and rehydrate the DNA by incubating at 6 5C for 1 hour. Periodically mix the solution by gently tapping the tube. Alternat ively, rehydrate the DNA by incubating the solution overnight at room temperatur e or at 4C. 14. Store the DNA at 28C.

3.F. Isolating Genomic DNA from Yeast Materials to Be Supplied by the User 1.5ml microcentrifuge tubes YPD broth 50mM EDTA (pH 8.0) 20mg/ml lyticase (Sigma Cat.# L2524) water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature water bath, 65C (optional; for rapid DNA rehydration) 1. Add 1ml of a culture grown for 20 hours in YPD broth to a 1.5ml microcentrifu ge tube. 2. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes to pellet the cells. Remove the sup ernatant. 3. Resuspend the cells thoroughly in 293l of 50mM EDTA. 4. Add 7.5l of 20mg/ml lyticase and gently pipet 4 times to mix. 5. Incubate the sample at 37C for 3060 minutes to digest the cell wall. Cool to ro om temperature. 6. Centrifuge the sample at 13,00016,000 g for 2 minutes and then remove the supe rnatant. 7. Add 300l of Nuclei Lysis Solution to the cell pellet and gently pipet to mix. 8. Add 100l of Protein Precipitation Solution and vortex vigorously at high speed for 20 seconds. 9. Let the sample sit on ice for 5 minutes. 10. Centrifuge at 13,00016,000 g for 3 minutes. 11. Transfer the supernatant containing the DNA to a clean 1.5ml microcentrifuge tube containing 300l of room temperature isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave this residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solu tion with the precipitated protein. 12. Gently mix by inversion until the thread-like strands of DNA form a visible mass. 13. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes. 14. Carefully decant the supernatant and drain the tube on clean absorbent paper . Add 300l of room temperature 70% ethanol and gently invert the tube several tim es to wash the DNA pellet. 15. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes. Carefully aspirate all of the eth anol. 16. Drain the tube on clean absorbent paper and allow the pellet to air-dry for 1015 minutes. 17. Add 50l of DNA Rehydration Solution. 18. Add 1.5l of RNase Solution to the purified DNA sample. Vortex the sample for 1 second. Centrifuge briefly in a microcentrifuge for 5 seconds to collect the l iquid and incubate at 37C for 15 minutes. 19. Rehydrate the DNA by incubating at 65C for 1 hour. Periodically mix the solut ion by gently tapping the tube. Alternatively, rehydrate the DNA by incubating t he solution overnight at room temperature or at 4C. 20. Store the DNA at 28C. 3.G. Isolating Genomic DNA from Gram Positive and Gram Negative Bacteria Materials to Be Supplied by the User 1.5ml microcentrifuge tubes water bath, 80C water bath, 37C isopropanol, room temperature 70% ethanol, room temperature water bath, 65C (optional; for rapid DNA rehydration) 50mM EDTA (pH 8.0) (for gram positive bacteria) 10mg/ml lysozyme (Sigma Cat.# L7651) (for gram positive bacteria) 10mg/ml lysostaphin (Sigma Cat.# L7386) (for gram positive bacteria) 1. Add 1ml of an overnight culture to a 1.5ml microcentrifuge tube.

2. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes to pellet the cells. Remove the sup ernatant. For Gram Positive Bacteria, proceed to Step 3. For Gram Negative Bacte ria go directly to Step 6. 3. Resuspend the cells thoroughly in 480l of 50mM EDTA. 4. Add the appropriate lytic enzyme(s) to the resuspended cell pellet in a total volume of 120l, and gently pipet to mix. The purpose of this pretreatment is to weaken the cell wall so that efficient cell lysis can take place. Note: For certain Staphylococcus species, a mixture of 60l of 10mg/ml lysozyme an d 60l of 10mg/ml lysostaphin is required for efficient lysis. However, many Gram Positive Bacterial Strains (e.g., Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Nocardi a otitidiscaviarum, Rhodococcus rhodochrous, and Brevibacterium albidium) lyse e fficiently using lysozyme alone. 5. Incubate the sample at 37C for 3060 minutes. Centrifuge for 2 minutes at 13,0001 6,000 g and remove the supernatant. 6. Add 600l of Nuclei Lysis Solution. Gently pipet until the cells are resuspende d. 7. Incubate at 80C for 5 minutes to lyse the cells; then cool to room temperature . 8. Add 3l of RNase Solution to the cell lysate. Invert the tube 25 times to mix. 9. Incubate at 37C for 1560 minutes. Cool the sample to room temperature. 10. Add 200l of Protein Precipitation Solution to the RNase-treated cell lysate. Vortex vigorously at high speed for 20 seconds to mix the Protein Precipitation Solution with the cell lysate. 11. Incubate the sample on ice for 5 minutes. 12. Centrifuge at 13,00016,000 g for 3 minutes. 13. Transfer the supernatant containing the DNA to a clean 1.5ml microcentrifuge tube containing 600l of room temperature isopropanol. Note: Some supernatant may remain in the original tube containing the protein pe llet. Leave this residual liquid in the tube to avoid contaminating the DNA solu tion with the precipitated protein. 14. Gently mix by inversion until the thread-like strands of DNA form a visible mass. 15. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes. 16. Carefully pour off the supernatant and drain the tube on clean absorbent pap er. Add 600l of room temperature 70% ethanol and gently invert the tube several t imes to wash the DNA pellet. 17. Centrifuge at 13,00016,000 g for 2 minutes. Carefully aspirate the ethanol. 18. Drain the tube on clean absorbent paper and allow the pellet to air-dry for 1015 minutes. 19. Add 100l of DNA Rehydration Solution to the tube and rehydrate the DNA by inc ubating at 65C for 1 hour. Periodically mix the solution by gently tapping the tu be. Alternatively, rehydrate the DNA by incubating the solution overnight at roo m temperature or at 4C. 20. Store the DNA at 28C. 4. Troubleshooting For questions not addressed here, please contact your local Promega Branch Offic e or Distributor. Contact information available at: www.promega.com. E-mail: techserv@promega.com Symptoms Comments Blood clots present in blood samples The tube may have been stored improperly ; the blood was not thoroughly mixed, or inappropriate tubes were used for drawi ng blood. Discard the clotted blood and draw new samples using EDTA-, heparin- o r citratetreated anticoagulant tubes. Poor DNA yield The blood sample may contain too few white blood cells. Draw new blood samples. The white blood cell pellet was not resuspended thoroughly in Step 5 of Section 3.A or B. The white blood cell pellet must be vortexed vigorously to res uspend the cells. The blood sample was too old. Best yields are obtained with fresh blood. Samples that have been stored at 25C for more than 5 days may give reduced yields

. The DNA pellet was lost during isopropanol precipitation. Use extreme c are when removing the isopropanol to avoid losing the pellet. Degraded DNA (<50kb in size) Improper collection or storage of the blood samp le. Obtain a new sample under the proper conditions. Poor DNA yield using Gram positive bactria protocol Cultures grown for an ex tended time contain a high proportion of cells that lyse easily upon exposure to lysostaphin treatment. Start purifications with a healthy culture. No protein pellet The sample was not cooled to room temperature before add ing the Protein Precipitation Solution. Cool the sample to room temperature (at least 5 minutes) or chill on ice for 5 m inutes, vortex 20 seconds, centrifuge for 3 minutes at 13,00016,000 g (10 minutes at 2,000 g for 3ml sample volume) and proceed with the protocol. The Protein Precipitation Solution was not thoroughly mixed with the nuclear lysate. Always mix the nuclear lysate and Protein Precipitation Solution completely. DNA pellet difficult to dissolve Samples may have been overdried. Rehydra te DNA by incubating 1 hour at 65C, and then leave the sample at room temperature or 4C overnight. Caution: Do not leave the DNA at 65C overnight. Samples were not mixed during the rehydration step. Remember to mix the samples periodically during the rehydration step.