UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS CAMPUS ARARAQUARA

Ensaios Microbiolgicos para Anlise de Quinolonas

Edith Cristina Laignier Cazedey
2007

Quinolonas
A primeira quinolona antibacteriana identificada foi o cido nalidxico por Lesher et al, 1962, entre

produtos obtidos na sntese da cloroquina.

Nos anos 70 foram obtidos o cido oxolnico e a cinoxacina.

Nos anos 80 foram descobertos os derivados

fluorados e piperaznicos que ampliaram, de modo acentuado, a potncia e o espectro antibacteriano destes compostos.

Classificao das quinolonas

Primeira gerao:
cido nalidxico cido oxolnico

Terceira gerao:
Clinafloxacino Levofloxacino Esparfloxacino Gatifloxacino Grepafloxacino

Cinoxacina

Segunda gerao:
Norfloxacino Ciprofloxacino Enoxacina Lomefloxacino Ofloxacino

Quarta gerao:
Travofloxacino Moxifloxacino

Estrutura das quinolonas

Estrutura das quinolonas

Potncia contra Gram-negativos
Amplia espectro de ao para incluir Gram-positivos

Anel piperaznico: neurotoxicidade Atividade contra Pseudomonas aeruginosa

Mecanismos de ao
As quinolonas inibem rapidamente, atravs das enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, a sntese do DNA bacteriano, o que leva a morte das bactrias. O principal evento na ao das quinolonas o adorno da girase e/ou topoisomerase IV no DNA bacteriano como complexo terminal frmacoenzima-DNA. Este complexo terminal evita a separao da fita replicada do DNA, resultando na inibio da duplicao do DNA, levando, consequentemente, a destruio da clula bacteriana.

Quinolonas
Grupo de frmacos estruturalmente semelhantes Sintticos

Amplo espectro de atividade antimicrobiana

Excelente biodisponibilidade Boa penetrao tissular Longa meia-vida plasmtica Boa tolerabilidade, em geral, poucos efeitos colaterais

Mtodos analticos para quinolonas

Ensaio de difuso em gar cilindros em placas

Ensaio de Difuso em gar

Consideraes gerais
Relaciona o tamanho da zona de inibio com a dose da substncia ensaiada. fundamentalmente um mtodo fsico, no qual o microrganismo usado como revelador. O mtodo emprega meio de cultura slido inoculado, distribudo em placas, em sistema de bicamada, atravs do qual a substncia teste se difunde. essencial que se trabalhe com rplicas, de forma a compensar os desvios, inerentes ao ensaio ou acidentais.

Ensaio de Difuso em gar

Mtodo- Testes preliminares
A partir de parmetros especificados em ensaios anteriores para quinolonas e referentes a determinao da potncia de antibiticos descritos pela Farm. Bras. IV, USP 23 e FDA (1996), so realizados testes preliminares para padronizar as condies a serem utilizadas verificando parmetros como:

Microrganismo Meio de cultura Soluo diluente

Concentrao do inculo Concentrao do frmaco

Ensaio de Difuso em gar

Tabela 1: Parmetros utilizados para a avaliao de quinolonas por ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar

Microrganismos

Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus luteus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Meio n1 de Grove-Randall Meio n11 de Grove-Randall gua Soluo tampo fosfato pH 6,0 Soluo tampo fosfato pH 7,0 Soluo tampo fosfato pH 8,0

Meios de cultura

Soluo diluente

Ensaio de Difuso em gar

Continuao Tabela 1:

Concentraes do frmaco

Razo 2 (1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0; 32,0)g/mL Razo 2,5 (4,0; 10,0; 25,0)g/mL 0,5% 1,0% 2,0%

Concentrao do inculo

Temperatura

35C 2C

Perodo de incubao

18-20 horas

Ensaio de Difuso em gar

E. coli 1,0%, razo 2

E. coli 1,0%, razo 2,5

E. coli 2,0%, razo 2

E. coli 2,0%, razo 2,5

Ensaio de Difuso em gar

S. luteus 1,0%, razo 2,0

S. luteus 1,0%, razo 2,5

S. luteus 2,0%, razo 2,0

S. luteus 2,0%, razo 2,5

Ensaio de Difuso em gar

B. subtilis 1,0%, razo 2,0

B. subtilis 1,0%, razo 2,5

B. subtilis 2,0%, razo 2,0

B. subtilis 2,0%, razo 2,5

Ensaio de Difuso em gar

E. coli

B. subtilis

S. luteus

Ensaio de Difuso em gar

Execuo do ensaio
A partir dos resultados com os diferentes microrganismo, meios de cultura, solues diluentes, concentraes do frmaco e inculo ser possvel estabelecer os parmetros para a realizao do doseamento microbiolgico.

Ensaio de Difuso em gar

Tabela 2: Parmetros estabelecidos para a avaliao de difloxacino por ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar

Parmetros
Microrganismo

Descrio

Bacillus subtilis
Meio n11 de Grove-Randall
Soluo tampo fosfato pH 8,0 8,0; 16,0; 32,0 g/mL 1,0% 35C 2C 18 horas

Meio de cultura
Soluo diluente Concentraes do frmaco Concentrao do inculo Temperatura Tempo de incubao

Preparo e manuteno do inculo

Manuteno: Meio n1 de Grove-Randall Meio n3 de Grove-Randall gar casoy Soluo glicerol-salina Repique: Direto Caldo casoy Caldo BHI

Ensaio de Difuso em gar

Semanal Anual

24h/35 2C

Indireto Caldo BHI Soluo fisiolgica Meio n3 de Grove-Randall Padronizao:

Suspenso

Leitura do inculo em espectrofotocolormetro 580nm com transmitncia de 25,0 2,0%. Aps a padronizao o inculo pode ser utilizado na concentrao e meio estabelecidos, mantido em banho-maria a 47C 1C.

Ensaio de Difuso em gar

Preparo das solues padro e amostra
10mg do padro primrio ou o equivalente em relao ao peso mdio
[100g/mL]
BV 100mL

0,8mL

1,6mL

3,2mL

BV 10mL

[8g/mL]

[16g/mL]

BV 10mL

[32g/mL]

BV 10mL

Ensaio de Difuso em gar

Ensaio
Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar, transfere-se 20,0mL de meio para cada placa (camada base).

Aps a solidificao desta camada, adiciona-se 5,0mL de meio inoculado. Assim que esta camada se solidificar, distribuir os cilindros ou templates de ao inoxidvel.
Com auxlio de pipetador automtico transfere-se as alquotas de padres e amostras, 200L, para cada orifcio.
P1 A1 A3

As placas devem ser incubadas a 35C 2C e aps 18 horas realiza-se as medidas dos dimetros dos halos de inibio com auxlio de um paqumetro.

P3 A2

P2

Tabela 2: Valores dos dimetros dos halos de inibio obtidos no doseamento da aula prtica pelo ensaio microbiolgico atravs do mtodo de difuso em gar tcnica cilindros em placas.

Clculo dos resultados

Concentrao (g/mL)
P1 2,00

Ensaio de Difuso em gar

Dimetro dos halos de inibio (mm)
20,52 19,51 21,58 19,33 21,11 22,96 21,19 22,70 22,98 21,89 26,72 22,41 27,71 24,31 24,77

Dimetro mdio e.p.m

20,41 0,65

DPR(%)

4,81

P2

4,00

22,34 0,47

3,50

P3

8,00

25,18 1,11

8,27

A1

2,00

21,41 20,95 21,92 20,29 20,43

24,84 21,62 24,19 22,91 22,69 23,67 22,94 25,24 25,93 24,72

21,00 0,43

3,23

A2

4,00

23,25 0,74

5,48

A3

8,00

24,50 0,66

4,90

Clculo dos resultados

Dimetro mdio

Ensaio de Difuso em gar

Varincia absoluta Desvio padro relativo (%)

x
n

Erro padro da mdia

Potncia?
2

S2

nX

S S 2 X 100

n 1

Onde:

s n

N n N 1

mdia aritmtica das amostras

soma das amostras

nmero de amostras nmero da populao

Ensaio de Difuso em gar

Clculo dos resultados

Potncia
Pot = Antilog M x 100

M = F/b

b = E/I

I = log R

F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)] E = [(A3+P3)-(A1+P1)]

Ensaio de Difuso em gar

Clculo dos resultados
I = log R
I = log2 I = 0,301

(R=2)

E = [(A3+P3)-(A1+P1)] E = [(49,68-41,41)] E = 2,068

b = E/I b = 2,068/0,301 b = 6,87

F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)] F = 1/3[(68,75-67,95)

M = F/b M = 0,27/6,87 M = 0,039

F = 0,27

Pot = Antilog M x 100

Pot = Antilog 0,039 x 100 Pot = 109,39%

Ensaio de Difuso em gar

Ensaio de Difuso em gar

Ensaio de Difuso em gar

Quinolonas
Tabela 4 Parmetros estabelecidos para o ensaio microbiolgico difuso em gar cilindros em placas para determinao de quinolonas.

Frmaco Norfloxacino Ciprofloxacino Perfloxacino Esparfloxacino Ofloxacino Moxifloxacino Enrofloxacino Gatifloxacino Lomefloxacino

Forma farmacutica comprimido comprimido comprimido p/comprimido injetvel comprimido injetvel comprimido comprimido

Soluo diluente gua Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 8,0 Tampo fosfato pH 6,0 Tampo fosfato pH 6,0

Continuao da Tabela 4:
Frmaco Camada base GroveRandall n11 GroveRandall n1 GroveRandall n11 GroveRandall n1 GroveRandall n11 GroveRandall n11 GroveRandall n1 GroveRandall n11 GroveRandall n11

Quinolonas
Camada inoculada Microrganismo Concentrao do inculo (%) 0,5 1,0 1,0 2,0 0,5 1,0 1,0 2,0 2,0

Meio de cultura

Nor Cipro Pe Espar Oflo Moxi Enro Gati Lome

Grove-Randall n11 Grove-Randall n1 Grove-Randall n11 Grove-Randall n11 Grove-Randall n11 Grove-Randall n11 Grove-Randall n1 Grove-Randall n11 Grove-Randall n11

Bacillus subtilis (ATCC 6633) Staphylococcus epidermidis

(ATCC 12228) (ATCC 12228) (ATCC 12228)

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus (ATCC 9341) Micrococcus luteus (ATCC 9341) Staphylococcus aureus (ATCC
6538P)

Bacillus subtilis (ATCC 9372) Bacillus subtilis (ATCC 9372)

Continuao da Tabela 4:
Frmaco Solues padro (g/mL) 10; 20; 40 4; 8; 16 8; 16; 32 4; 10; 25 12; 18; 27 4; 8; 16 3,2; 6,4; 12,8 4; 8; 16 2; 4; 8

Quinolonas
Temperatur a de incubao (C)
35 2 35 2 35 2 35 2 35 2 35 2 35 2 35 2 35 2

Tempo de incuba o (h)

18 18 18 18 18 18 18 18 18

Alquota adicionada (L) 200 200 200 200 200 200 100 200 200

Bibliografia FROEHLICH et al, 1990 FRATINI, 1993 SOUZA, 1995 MARONA et al, 1998 EV et al , 2002 BONILLA, 2004 eSOUZA et al, 2004 SALGADO et al, 2006 GOMES et al, 2006

Nor Cipro Pe Espar Oflo Moxi Enro Gati Lome

Concluso
A necessidade de confirmao da eficcia teraputica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupao. E ainda h que se considerar o aspecto econmico, assim como o de falsificao com molculas estruturalmente similares. Os bioensaios so extremamente necessrios para que se tenha um controle de qualidade eficaz destes antimicrobianos de uso to difundido.

Referncias Bibliogrficas
BONILLA, F.L.G. Validao de metodologia para anlise de moxifloxacino em comprimidos. Porto Alegre: UFRGS. Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, 2004. Tese (Mestrado em Cincias Farmacuticas) ESMERINO, L.A.; PEREIRA, A.V.; SCHELESKY, M.E. Doseamento da potncia da ciprofloxacina em comprimidos orais. Ver. Bras. Farm., 86(1): 17-20, 2005. eSOUZA, M.J.; BITTENCOURT, C.F.; eSOUZA FILHO, P.S. Microbiological assay for enrofloxacin injection. Int. J. Pharm. 2004 Mar 1; 271(1-2): 287-91. EV, L.S.; SCAPOVAL, E.E.S. Microbiological assay for determination of ofloxacin injection. J. Pharm. Biomed. Anal. 2002 Jan 1; 27(1-2): 91-6. Farmacopia Brasileira, 4. ed. So Paulo: Atheneu, 1988. FDA (Food and Drug Administration, HHS) 21 CFR Ch.1 (4-1-96 Edition). FRATINI, L. Estudo de mtodos fsico-qumicos e microbiolgico para anlise do ciprofloxacino. Porto Alegre: UFRGS. Programa de Psgraduao em Cincias Farmacuticas, 1993 Tese (Mestrado em Cincias Farmacuticas). FROEHLICH, P.E.; SCHAPOVAL, E.E.S. Doseamento do norfloxacino, mtodo de difuso em gar (cilindros em placas). Rev. Cinc. Farm. V. 12, p. 161-65, 1990.

Referncias Bibliogrficas
GOMES, G.C.; SALGADO, H.R.N. Microbiological assay for lomefloxacin in coated tablets. J. AOAC Int 2006 Jul-Aug; 89(4): 1077-9. MARONA, H.R.N; SCHAPOVAL, E.E.S. Desarollo de anlisis microbiologico para la determinacin de esparfloxacino en polvo y en tabletas. Informacin Tecnologica (1998), 9(5), 251-254. PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; OHARA, M.T. Controle biolgico de qualidade de produtos farmacuticos, correlatos e cosmticos. 2. ed. So Paulo: Atheneu Editora, 2003. SALGADO, H.R.N.; LOPES, C.C.G.O.; LUCCHESI, M.B.B. Microbiological assay for gatifloxacin in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Biomed. Anal. (2006), 40(2), 443-446. SILVA, P. Farmacologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. SOUZA, F.M.B. Mtodos fsico-qumicos e microbiolgico para controle de qualidade e estudo de estabilidade do perfloxacino. Porto Alegre: UFRGS. Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, 1995 Tese (Mestrado em Cincias Farmacuticas). UNITED States Pharmacopoeia National Formulary, 27ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, INC, 2004.