RODRIGO ROCHA LATADO

PRINCIPAIS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

MICROPROPAGAO DE PLANTAS

PROPAGAO DE PLANTAS Semente (via sexuada): espcies com poucas sementes espcies sem sementes perda da germinao prognie heterognea Vegetativa (via assexual) in vivo: estaca, enxertia, borbulha processo lento propagao de doenas sazonalidade espao fsico in vitro: meristema apical segmento nodal estmulo a gemas axilares
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MICROPROPAGAO: propagao clonal de gentipos selecionados, utilizando tcnicas de cultura de tecidos, visando a produo de plantas em massa, a um preo competitivo
uso de explantes com meristemas pr-existentes
meristema apical: dome com clulas totipotentes diviso constante no tem conexo com xilema e floema pice meristemtico: dome meristemtico + primrdios foliares
Vantagens: > nmero de mudas rapidez rejuvenescimento livre de doenas espao fsico reduzido sazonalidade Desvantagens: variao somaclonal contaminao aclimatizao custo protocolo 5

meristema x pice meristemtico

MICROPROPAGAO: descoberta das citocininas descrio do meio MS EXPLANTES pice meristemtico segmento nodal: alongamento de ramo com vrios ns proliferao de gemas axilares: quebra de dominncia apical brotos axilares so explantes secundrios para prximos ciclos Principais culturas: Banana, Cana-de-acar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais
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ETAPAS DA MICROPROPAGAO

Introduo do explante

Induo de brotaes

Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro

Aclimatizao das plantas

Micropropagao de baunilha

Micropropagao de mandioca 9

MICROPROPAGAO
Estdio 0: seleo da planta matriz sanidade estdio fisiolgico estado nutricional Estdio 1: estabelecimento da cultura assptica e vivel poca de retirada do explante posio do explante na planta matriz baixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina Estdio 2: multiplicao alta [ ] de citocinina nmeros de subcultivos

Estdio 3: alongamento e enraizamento cido giberlico, auxinas (IBA, NAA)

Estdio 4: aclimatizao controle de umidade e luz
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MICROPROPAGAO

Meio de Cultura Slido: gar, gel melhor aerao absoro de nutrientes deficiente
Meio de Cultura Lquido: estacionrio, agitao maior disponibilidade de nutrientes maior disponibilidade de gua oxigenao suporte: papel de filtro, espuma Imerso Temporria: alternncia de meio de cultura lquido com ausncia de meio de cultura melhor aerao maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)
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CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VRUS

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LIMPEZA DE VRUS
Doenas de Plantas: fungos, bactrias, vrus transmitidas na propagao vegetativa White (1934): vrus esto distribudos de maneira desuniforme em raiz de fumo reduo da concentrao em direo extremidade pice radicular livre de vrus Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentrao de vrus na parte area Morel & Martin (1952): plantas de dlia livres de vrus

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LIMPEZA DE VRUS - Sequncia

Principais culturas: Cana-de-acar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

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LIMPEZA DE VRUS - Sequncia

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LIMPEZA DE VRUS
termoterapia + cultura do pice meristemtico ex: vrus do mosaico da cana-de acar cultura de meristema: explante 0,3 mm cultura pice meristemtico (1 2,5 cm) + termoterapia (45oC / 8 horas)

quimioterapia + cultura do pice meristemtico incorporao de antivirais no meio de cultura

Indexao: avaliao da presena do vrus ensaios biolgicos microscopia eletrnica serologia (ELISA) hibridao com cido nucleico
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CULTURA DE CALOS

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CULTURA DE CALOS 1. ASSEPSIA FASES

2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...) 3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO - INDUO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas) Calos em citros (meio contendo BAP) 4. DESDIFERENCIAO CELULAR - retorno das clulas ao estado meristemtico Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo

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CULTURA DE CALOS
5. SUBCULTIVOS MENSAIS - mesmo meio de induo - outros meios 6. DIFERENCIAO CELULAR- utilizando uma das duas vias, - Organognese somtica - Embriognese somtica 7. REGENERAO DE PLANTAS 8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE
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CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO

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CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO

FASES 1. EXPLANTES (calos - clulas meristemticas, alta taxa de diviso celular) 2. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO LQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos 3. AGITAO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenao do meio 4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias

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CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO

SELEO in vitro - adio de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumnio, PEG (seca) e outros

5. ALTA TAXA DE CONTAMINAO - motivo: meio lquido

6. TRANSFERNCIA PARA MEIO SLIDO - obteno de calos 7. REGENERAO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE

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CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO

Clulas

Clulas em meio contendo alta osmolaridade

Agitador orbital

Clulas em suspenso 23

CULTURA DE CLULAS HAPLIDES

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CULTURA DE CLULAS HAPLIDES 1. ASSEPSIA FASES

2. EXPLANTES (anteras (micrsporo), plen, vulos, ovrios vegetais) 3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO (pr-tratamento)

4. INDUO DE ORGANOGNESE OU MBRIOGNESE - direta (sem passar pela fase de calos)

- indireta (com passagem pela fase de calos) Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo

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CULTURA DE PLANTAS HAPLIDES FASES

5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro

- alongamento das plantas - enraizamento - aclimatizao 6. OBTENO DE PLANTAS HAPLIDES OU DUPLO-HAPLIDES - duplicao cromossmica natural ou com utilizao de drogas antimitticas - drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )
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CULTURA DE PLANTAS HAPLIDES

Flor

Anteras

Micrsporo germinando

Aclimatizao

Multiplicao

Embriognese somtica 27

CULTURA DE PLANTAS HAPLIDES

Flor - Ovrio

vulos

Calos

Multiplicao

Obteno de plantas

Organognese somtica 28

CULTURA DE PROTOPLASTOS VEGETAIS

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CULTURA DE PROTOPLASTOS - Clulas vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas) Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas

- sensveis a modificao na osmolaridade do meio e a luz - meio mais concentrado - meio mais diludo protoplastos perdem gua para o meio

protoplastos absorvem gua do meio

meios geralmente entre 0,4 e 0,8M

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CULTURA DE PROTOPLASTOS - usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio

- A ausncia de parede celular possibilita a fuso de protoplastos

- Isolamento, purificao e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade

MEIOS Meios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)

Soluo de enzimas 0,4M Soluo de Polietileno glicol a 50% Agarose tipoVII (baixo ponto de fuso) - 1,2%
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MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989) Composio 1. CaCl2*2H2O 2. MgSO4*7H2O 3. KNO3 4. KH2PO4 5. KI mg/L 1.480 246 101 27,2 0,16

- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M) - ajustar o pH 6,0 - esterilizar SOLUES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L

A. CaCl2*2H2O
B. OUTROS SAIS

50x
100x

20 mL/L
10 mL/L

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CULTURA DE PROTOPLASTOS Material esterilizado

- placas de Petri
- peneiras com poros de 50 m - tubos 8 ml com tampa - pipetas Pasteur

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CULTURA DE PROTOPLASTOS
FASES 1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspenso celular, ptalas, anteras)

2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitao 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h.

3. PURIFICAO - peneiramento, centrifugao, retirada da soluo, lavagem com CPW 4. FUSO - adio de PEG ou eletrofuso 5. RETIRADA DO PEG 6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSO - meio MS 0,4M(2X) e agarose
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CULTURA DE PROTOPLASTOS

Explante

Protoplastos

Viabilidade de protoplastos

Fuso mltipla

Fuso

Fuso 35

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Primeira diviso

Microcalo

Microcolnia

Embrio germinando

Embrio somtico

Calos e embries somticos 36

CULTURA DE PROTOPLASTOS

Desenvolvimento das plantas e enraizamento

Placa com embries germinando

in vitro
Aclimatizao ao meio ambiente

Plantas

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