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Escherichia coli causador de diarria em humanos conhecido como DEC (Diarrheagenic E. coli) e dividido em 6 grupos:
STEC: E coli produtora de toxina Shiga ETEC: E coli enterotoxignica EPEC: E coli enteropatognica EIEC: E coli enteroinvasiva EAggEC: E coli enteroagregativa DAEC: E coli que se adere difusamente
As DECs tm mecanismos de virulncia diferentes: produo de toxinas, habilidade de invaso a clula alvo. A identificao desses 6 grupos de DECs muito complexa, demanda tempo, tem um alto custo e os laboratrios clnicos rotineiramente utilizam apenas a sorotipagem para o teste de identificao. Os genes relacionados a patogenicidade do DAEC ainda no foram identificados.
Dentre as vrias tcnicas de identificao desenvolvidas, o mais til o mPCR. Vrios estudos comprovaram o seu emprego em identificao de genes alvo, genes virulentos. Neste estudo, foi selecionado um conjunto de primers cujos amplicons poderiam ser identificados facilmente e em um tamanho adequado. 9 genes alvo: stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, STh gene, STp gene, LT gene e astA
At o momento no se conseguiu detectar os nove alvos e um nico ensaio de mPCR. Por isso, o estudo foi realizado em dois ensaios simultneos. No ensaio 1, foi usado um conjunto de 5 primers (stx 1, eaeA, invE, STp gene e astA) . No ensaio 2 conjunto de 4 primers (stx 2, aggR, STh gene e LT gene). Estes dois ensaios foram realizados simultaneamente em cada um dos 2 tubos de reao.
- Foi usado um total de 7 cepas controle (Tabela 1), todos foram incubados em Agar Kajiton a 37 C por 20 2 h e armazenado a 4 C.
Denaturao 94C 1 min Anelamento 55C 1 min Extenso 72C 1 min Ao final, manteve-se a 72 C por mais 10 min. Separao por eletroforese (100 V, 40 min.) em gel de agarose Revelao com brometo de etdio.
Aplicao do mPCR em isolamento clnico de E. coli examinou-se pacientes ambulatoriais de hospitais privados entre Fevereiro de 2005 e Novembro de 2006 para:
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As cepas controle foram analisadas por cada conjunto de primers para detectar os genes de virulncia (stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, ST gene, LT gene e astA); Com o uso de 8 primers simultaneamente no foi possvel detectar alguns genes; Dividiu-se os primers Conjunto de primers 1 (stx 1, eaeA, LT gene e astA) Conjunto de primers 2 (stx 2, invE, aggR e ST gene)
- O gene ST no pde ser detectado, ento o primer do gene ST foi dividido em STh gene e STp gene.
Todas as 683 amostras de pacientes com caso clnico de E.coli foram examinados por mPCR, e 51 DEC (EPEC, 21; EAggEC, 15; ETEC,9; STEC,6) e 38 E. coli positivo para astA foram detectados 5 das cepas de DEC eram O antgeno no sorotipvel (OUT) Todas as 683 cepas de E.coli foram analisados com um teste confirmatrio com os 9 primers individualmente e os resultados foram idnticos aos obtidos com o mPCR. Os 9 genes alvos e as 7 cepas controles foram detectadas por mPCR. A especificidade foi de 100% e a sensibilidade de 104 CFU/mL para todas as cepas
Para confirmar a suspeita de DEC, frequente usar o PCR comum. No entanto, isolar a cepa e identific-lo entre os 5 grupos muito trabalhoso e gasta-se muito tempo. Usando o mPCR com os 2 grupos de primers pode-se reduzir o tempo e o esforo na anlise de vrios fatores de virulncia. Nenhuma relao entre o sorotipo e a incluso entre um dos 5 grupos por mPCR. Portanto, o diagnstico apenas por sorotipagem pode ser incompleto. Este estudo provou a praticidade do emprego de mPCR pois ele detectou facilmente 9 genes responsveis pela virulncia de 5 categorias de DEC.