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Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu

Escherichia coli causador de diarria em humanos conhecido como DEC (Diarrheagenic E. coli) e dividido em 6 grupos:

STEC: E coli produtora de toxina Shiga ETEC: E coli enterotoxignica EPEC: E coli enteropatognica EIEC: E coli enteroinvasiva EAggEC: E coli enteroagregativa DAEC: E coli que se adere difusamente

As DECs tm mecanismos de virulncia diferentes: produo de toxinas, habilidade de invaso a clula alvo. A identificao desses 6 grupos de DECs muito complexa, demanda tempo, tem um alto custo e os laboratrios clnicos rotineiramente utilizam apenas a sorotipagem para o teste de identificao. Os genes relacionados a patogenicidade do DAEC ainda no foram identificados.

Dentre as vrias tcnicas de identificao desenvolvidas, o mais til o mPCR. Vrios estudos comprovaram o seu emprego em identificao de genes alvo, genes virulentos. Neste estudo, foi selecionado um conjunto de primers cujos amplicons poderiam ser identificados facilmente e em um tamanho adequado. 9 genes alvo: stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, STh gene, STp gene, LT gene e astA

At o momento no se conseguiu detectar os nove alvos e um nico ensaio de mPCR. Por isso, o estudo foi realizado em dois ensaios simultneos. No ensaio 1, foi usado um conjunto de 5 primers (stx 1, eaeA, invE, STp gene e astA) . No ensaio 2 conjunto de 4 primers (stx 2, aggR, STh gene e LT gene). Estes dois ensaios foram realizados simultaneamente em cada um dos 2 tubos de reao.

Cepa bacteriana e modelo de preparao de DNA

- Foi usado um total de 7 cepas controle (Tabela 1), todos foram incubados em Agar Kajiton a 37 C por 20 2 h e armazenado a 4 C.

Cepa bacteriana e modelo de preparao de DNA


Para a extrao de DNA, cada controle foi crecido em 30 mL de caldo de Luria-Bertani com agitao a 37 C overnight. 100 L da cultura de bactria foi suspenso em 900 L de tampo Tris-EDTA, fervido por 5 min e centrifugado a 10.000 x g por 5 min O sobrenadante foi usado como o modelo positivo do gene patognico para o mPCR.

Primers e amplificao do PCR


Os primers usados esto listados na tabela 2. Testou-se a progressiva incorporao dos primers correspondentes aos diferentes genes e vrias combinaes de temperatura de melting e concentrao de primers. Cada 25 L da mistura de reao continha: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM HCl, 1,5 - 2,0 mM MgCl2, 2,5 mM de deoxinucleotsideo trifosfato, 1,25 U de Taq DNA polimerase, 25 50 M de cada primer, e 2,5 Lde DNA modelo.

Primers e amplificao do PCR

Primers e amplificao do PCR


Denaturao 94C 1 min Anelamento 55C 1 min Extenso 72C 1 min Ao final, manteve-se a 72 C por mais 10 min. Separao por eletroforese (100 V, 40 min.) em gel de agarose Revelao com brometo de etdio.

Aplicao do mPCR em isolamento clnico de E. coli examinou-se pacientes ambulatoriais de hospitais privados entre Fevereiro de 2005 e Novembro de 2006 para:
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Salmonella enterica Shigella Yersinia Vibrio Campylobacter E. coli

Aplicao do mPCR em isolamento clnico de E. coli


Um total de 683 E. coli, como culturas puras foram isolados em placas de gar de sangue de carneiro 5% e sorotipadas com anti-soros O. Eles foram identificados pelo Enterotube II. Todas as cepas foram incubadas em gar Kajiton, guardada a 4 C antes do ensaio de mPCR.

As cepas controle foram analisadas por cada conjunto de primers para detectar os genes de virulncia (stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, ST gene, LT gene e astA); Com o uso de 8 primers simultaneamente no foi possvel detectar alguns genes; Dividiu-se os primers Conjunto de primers 1 (stx 1, eaeA, LT gene e astA) Conjunto de primers 2 (stx 2, invE, aggR e ST gene)

- O gene ST no pde ser detectado, ento o primer do gene ST foi dividido em STh gene e STp gene.

Todas as 683 amostras de pacientes com caso clnico de E.coli foram examinados por mPCR, e 51 DEC (EPEC, 21; EAggEC, 15; ETEC,9; STEC,6) e 38 E. coli positivo para astA foram detectados 5 das cepas de DEC eram O antgeno no sorotipvel (OUT) Todas as 683 cepas de E.coli foram analisados com um teste confirmatrio com os 9 primers individualmente e os resultados foram idnticos aos obtidos com o mPCR. Os 9 genes alvos e as 7 cepas controles foram detectadas por mPCR. A especificidade foi de 100% e a sensibilidade de 104 CFU/mL para todas as cepas

Para confirmar a suspeita de DEC, frequente usar o PCR comum. No entanto, isolar a cepa e identific-lo entre os 5 grupos muito trabalhoso e gasta-se muito tempo. Usando o mPCR com os 2 grupos de primers pode-se reduzir o tempo e o esforo na anlise de vrios fatores de virulncia. Nenhuma relao entre o sorotipo e a incluso entre um dos 5 grupos por mPCR. Portanto, o diagnstico apenas por sorotipagem pode ser incompleto. Este estudo provou a praticidade do emprego de mPCR pois ele detectou facilmente 9 genes responsveis pela virulncia de 5 categorias de DEC.