Ministrio da Educao

Universidade Federal Rural da Amaznia

Western blot
Componentes:
Jos Luiz Boaretto
Laz Galvo e Silva de Moura
Carlos Csar Rodrigues de Oliveira
Cryslene Caroline R. Lameira
Gleycianne Silva dos Anjos
Luane Lopes Pinheiro
Analia Costa de Oliveira Neta

Introduo:
Western Blot uma tcnica usada para
detectar protenas de uma determinada
amostra e serve como teste
confirmatrio dos resultados obtidos em
testes imunoenzimaticos. Pode ser
usada para detectar protenas dos
anticorpos do vrus do HIV, doena da
Vaca Louca, doena de Lyme,
Saccharomyces serevisiae e etc.

Mtodo de execuo de
Western Blot
1. Preparao do tecido;
2. Eletroforese em gel;
3. Transferncia;
4. Bloqueio;
5. Deteco;

Mtodo de dois passos:

a) Anticorpo primrio;
b) Anticorpo secundrio.
Mtodo de um passo;

6. Deteco

Deteco colorimtrica;
Quimioluminescncia;

Preparao do tecido
Amostra : Tecido Biolgico e/ou cultura de clulas.
Elas so esfriadas ou aquecidas rapidamente.
So homogeneizadas por sonicao (quebra das clulas

por
alta freqncia sonora) ou por fora mecnica a qual
resultar em uma mistura homognea dos componentes das
clulas.
Aps esse passo o tecido pode ser usado como esta ou
sujeito a uma centrifugao onde passar por uma serie de
passos para a isolar o material do citozico (material do
interior da clula externo ao seu ncleo).
Fervura das amostras : carentes eltricas, composto
sulfuroso e DSS*
DSS*= Dodecil sulfato de sdio.

Eletroforese em gel
Gis

A separao feita de acordo com o peso molecular.

feita por aplicao de cargas eltricas a qual vai
fazer com
que as protenas caminhem em uma nica direo ao
longo
do gel. As amostras so carregadas lado-a-lado em
valas
feitas no gel. As protenas so ento separadas por
massa em
bandas dentro de cada raia formada a partir da vala.
Uma raia reservada para um marcador ladder que
uma
protena de peso molecular conhecido.

Gel 2-D

As protenas so separadas em
duas dimenses .
As protenas so separadas na
primeira dimenso de acordo com
o seu ponto isoeltrico: pH com
uma carga total igual a zero.
As protenas separadas na
segunda dimenso de acordo
com seus pesos moleculares.

Transferncia

As protenas acessveis deteco dos

anticorpos tm que
ser removidas do gel e posto em uma membrana
de
nitrocelulose ou PVDF. Para tal mecanismo
preciso a
aplicao de uma corrente eltrica. Seu resultado
uma fina
camada da protena para sua deteco.
Ambas as variedades de membranas so
escolhidas porque elas tem a capacidade de ligar-se a protenas

Bloqueio
O boquei usado para impedir as
interaes no especficas entre a
membrana e os anticorpos usados
para a deteco da protena alvo.
Soluo diluda de uma protenatipicamente albina de soro
bovino(BSA).
Leite seco desnatado com uma
pequena quantidade de detergente:
Tween 20 ou carbono coloidal.

Deteco

Mtodo de um passo

Rapidez no processo;
Menos material consumido;
Anticorpo sonda: Marca a protena de interesse e uma

marcao detectvel(freqncias proticas conhecidas);

A sonda primaria incubada com a membrana de forma
similar ao mtodo de dois passos. Ela pode ento ser
detectada de forma direta aps varias lavagens.
Mtodo de dois passos
A membrana ser testada com os anticorpos da protena

de interesse, ligadas por enzimas reveladoras.(muda a

cor)
Anticorpos primrios: Liga-se direto protena.
Anticorpos secundrios: So ligados onde os anticorpos
primrios no se ligaram.

Deteco
Deteco colorimtrica;
Quimioluminescncia;
Deteco radioativa;
Deteco fluorescente.

Analise
Aps a realizao de toda a

tcnica, as protenas alvo esto

prontas para serem estudadas e
na analise que isso ser feito.
A analise feita nas partes em
que as sondas so marcadas e
ligadas as protenas e as que no
forem ligadas a esta so retiradas.

Sondagem secundaria
A sondagem secundaria como se fosse uma
continuao da transferncia. So usados tanto a
membrana de nitrocelulose quanto o PVDF.
Esse passo responsvel pela identificao dos
anticorpos e pode tambm ser reutilizado para
sondagens subseqentes.
Atualmente a mais utilizada a M. de N. do que a
PVDF. Esta por sua vez muito mais cara e
permite uma revelao muito mais fcil e pode
ser reutilizada muito mais vezes.

Aplicao em
diagnsticos mdicos
A tcnica western blot tem sua
aplicao muito
importante em diagnsticos
mdicos, o qual ajuda na
deteco dos anticorpos,
produzidos por ns, de varias
doenas, como por exemplo a
AIDS, a doena da Vaca Louca

Concluso
Neste trabalho explanamos sobre o tema

Western Blot, que um exame mais

especifico para a deteco de protenas
virais.
Esse mtodo utiliza eletroforese em gel
para obter o resultado esperado.
Ele muito utilizado em testes
imunoenzimticos.
Tambm exames confirmatrios de
doenas, como a doena da vaca louca e
doena de Lyme.
A tcnica Western Blot foi e para a