UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

Disciplina: 10.7042 A Bioqumica Industrial

Apresentao:

Aula: Cintica Enzimtica

Prof. Claudio Alberto Torres Suazo

So Carlos SP
abril - 2016

Cintica enzimtica
De um modo geral, enzimas so definidas como sendo estruturas proticas,
formadas por sequncias de aminocidos e que tm a funo de catalisar
(acelerar) reaes bioqumicas.
Exemplos: Duas enzimas da gliclise

Fosfohexose isomerase
(simples)

Fosfofrutocinase-1
(complexa, alostrica)

O aprofundamento do estudo de enzimas foi iniciado em 1897 quando, pela primeira

vez, Bchner extraiu enzimas ativas de clulas vivas. Seu trabalho proporcionou duas
grandes contribuies:
1. Mostrou que a catlise por meio de organismos vivos poderia funcionar
independentemente de qualquer processo vivo (fora da clula);
2. Iniciou esforos em isolar e purificar enzimas individuais.
A partir dessa descoberta, o nmero de enzimas conhecidas tem aumentado
rapidamente e atualmente o total excede 10.000.
11000

Numero de Enzimas conhecidas

10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

Ano

Aumento na descoberta de enzimas ao longo dos anos.

Fonte: http://www.metacyc.org/release-notes.shtml#2011

Quanto custam as enzimas? Depende do tipo de

bioprocesso (da conc. com que sai do biorrreator,
downstream processing caro)
id Diagnostic enzymes
Research and

Preo de venda no mercado internacional, US$/kg

Um catalisador uma substncia que aumenta a velocidade das

reaes sem passar por mudanas qumicas permanentes, ou
seja, sem afetar o equilbrio da reao (Ea muda, G no muda)

Para projetar e analisar sistemas reativos de forma racionalizada,

visando aplicaes prticas, se faz necessria a utilizao de uma
equao matemtica que relacione a velocidade da reao com a
composio, temperatura e presso da mistura reacional.
5

Observa-se frequentemente que as enzimas so mais ativas que os

catalisadores no-biolgicos. Em temperatura ambiente, as enzimas
possuem maior atividade, sendo capazes de catalisar reaes mais
rapidamente do que a maioria dos catalisadores sintticos.
Quando a temperatura da reao aumentada, no entanto,
catalisadores sintticos podem se tornar to ativos quanto s
enzimas. temperaturas maiores ou iguais a 80C a maioria das
enzimas apresenta uma atividade baixa ou nula.

Cintica enzimtica simples com um substrato

Partindo-se da reao genrica:

S P

Geralmente a reao acontece em fase lquida, sendo realizada a

temperatura e pH constante, onde S o substrato e P o produto, a
velocidade da reao V definida por:

-dS dP

dt
dt

Reator homogneo de lab com contro

de T e pH (usa tampo) para
levantamento cintico

Mistura reacional:
Soluo aq uosa: substrato + enzim

A unidade de V dada moles por unidade de volume e por tempo

(mol.(volume. tempo)-1). A velocidade da reao uma quantidade
de produto formado ou substrato consumido na mistura reacional por
unidade de tempo.
Por essa razo os estudos experimentais de cintica normalmente
so

realizados

em

reatores

bem

misturados

visando

uma

concentrao uniforme de substrato, enzima e produto durante a

reao.

Um experimento tpico para determinar a cintica enzimtica pode ser o

seguinte: no tempo zero, solues do substrato e de uma enzima
purificada apropriada so misturados em recipiente fechado isotrmico
(reator agitado) contendo uma soluo tampo para controlar o pH. O
substrato e/ou a concentrao dos produtos so monitorados em vrios
intervalos de tempo.
Frequentemente, na obteno de dados de cintica enzimtica, utilizase medidas de velocidade inicial de reao. Isso significa que uma
vez conhecidas as condies da reao, incluindo as concentraes de
enzima e substrato no tempo zero (t=0), a inclinao inicial (ou
velocidade inicial) da curva de concentrao de substrato ou produto em
funo do tempo estimada pelos dados:

dP
dt

t 0

dS

V t 0
dt t 0

Desta forma se evita a

interferncia de outras
molculas diferentes de S

Onde E = Eo , S = So , P = 0 principalmente de

P
9

ste grfico fica mais claro como medir velocidade inic

medida de velocidade
eita em t=o.

de-se utilizar suavizao dos dados com polinmios. H vrios softwares que faze
10

Na gerao de dados cinticos, normalmente a quantidade de

catalisador enzimtico dada em termos de unidades de atividade
cataltica e no como massa ou moles. Unidades de atividade
cataltica representam a quantidade de enzima que gera certa
quantidade de atividade cataltica sob uma srie de condies
padronizadas (temperatura, pH, fora inica, etc.) de uma enzima
em particular.

Como por exemplo, a hidrlise do amido, em que uma unidade

da enzima glicoamilase definida como a quantidade de enzima
que produz 1mol de glicose por minuto, numa soluo com 4% de
amido, a pH 4,5 e 60C.
11

A Cintica de Michaelis-Menten
Imagine-se como um qumico precisando de informaes cinticas de uma
reao enzimtica para poder projetar um sistema de produo utilizando
uma matria prima (substrato) que pode ser transformado enzimaticamente
num produto de interesse a custo baixo e ambientalmente correta. As
informaes cinticas, como comumente acontece na prtica, estariam
dadas como se mostra na Figura a seguir. Quais seriam suas primeiras
dedues com relao :
1. Velocidade de reao (V) a baixas concentraes de substrato. V
aumenta quase linearmente com o aumento de S?

12

2. Velocidade de reao (V) a altas concentraes de substrato. V

aumenta com S ou aproximadamente constante?
3. Como varia a velocidade com o aumento da concentrao de
enzima? V constante ou aumenta proporcionalmente?

13

Perguntas como essas foram respondidas por Henri, em 1902,que props

a seguinte equao para a velocidade:

Vmax S
Km S

onde, Vmax = .Eo

(1)

(2)

Embora Henri tenha dado uma explicao terica usando mecanismos

hipotticos de reao, Michaelis e Menten em 1913 propuseram um
modelo realmente cintico (equao) para a velocidade de reao.
Como ponto de partida, assumiu-se que a enzima E e o substrato S se
combinavam para formar o complexo ES, que se dissociava a seguir para
formar um produto P e liberar uma enzima E.
Veja a seguir
14

Modelo cintico de Michaelis-Menten

Hiptese: equilbrio rpido entre E e S formando um complexo ES

15

k1

S+E

ES

ES

k-1
k2

Hiptese:
Equilbrio

(3)

P +Reao
E
lenta (controladora)(4)

V k 2 ES

(5)

Alguns livros chamam de

um

difcil de medir
Henri,
k ou kMichaelis e Menten assumiram que a primeira reao
p

cat

equilbrio que, em conjunto com a lei de ao das massas

para a
cintica de eventos moleculares, d:
k 1 S E

k1
ES

(6)

E S
ES
Km

(7)

Km

Constante de dissociao onde S, E, ES so as concentraes de

substrato, enzima e complexo, respectivamente.

16

vidindo a equao 5 por Eo = E + ES

obtem-se:

onde:
Eo = concentrao total de enzima (ou inicial)
E = concentrao de enzima livre
ES = concentrao de enzima complexada

V
k ES
2
Eo
E ES

(8)

Substituindo a equao 5 na equao 7:

E S
V
Km

Eo E E S
Km
k2

(9)

V
k S
2
Eo K m S

(10)

Equao de
S
S
Michaelis-MentenV k 2 E o K S Vmax K S
m
m

(11)
17

Assim:

Velocidade de formao de P V

dP
S
Vmax
dt
Km S

(12)

Ao mesmo tempo em que a equao de Michaelis-Menten descreve

com sucesso a cintica de muitas reaes catalisadas por enzimas,
ela no universalmente vlida. H outras variantes cinticas presentes
nas clulas.

18

Modelo cintico de Briggs-Haldane:

Assume estado estacionrio da concentrao do complexo ES

19

Modelo reacional (o mesmo de M-M):

k1

S+E

ES

ES

(3)

P+E

(4)

k-1
k2

Novamente a reao lenta V

: k 2 ES

(5)

ra obter perfis de concentrao de forma exata:

dES

Hiptese:
Estado estacionrio
dt

k 1E S k 1ES k 2 ES 0 (6)

tendo ES a partir desta equao resulta em:

k1 E S
E S
ES

k 1 k 2
K BH

Note que:

K BH

k k
1 2
k1

(7)
20

nservao da massa de enzima permite obter a rela

E E 0 ES

indo a equao 5 por esta expresso e substituindo a

esso de ES :

E S
k2
V
K BH

Eo E E S
K BH
Simplificando fica assim:

V
S
k2
Eo
K BH S

21

Arrumando a equao:

V k 2 Eo

S
K BH S

Deixando de forma padronizada:

V Vmax

Modelo de Briggs-Haldan

K BH S

22

Validade da hiptese de estado estacionrio:

d ES
0
dt

Neste grfico as curvas

representam a soluo
numrica das equaes
diferenciais sem assumir
estado estacionrio, ou seja,
a soluo exata dessas
equaes.

Pode-se perceber neste grfico que,

d ES
0
de fato,
dt
23

Comparao dos dois modelos cinticos:

Hiptese:

Michaelis-Menten

Briggs-Haldane

k1 E S k 1 S

d[ES]/dt
0

Vm S
Equao: V
Km S
Velocidade
mxima de
reao:
Constante:

Vm k 2 E o
k
K m 1
k1

Quando k2 << k-1,

Vm S
V '
K BH S

Vm k 2 E o
K

'
BH

k 1 k 2

k1

K m K BH '
24

Estimativa de parmetros cinticos

25

denadas Lineweaver-Burk (grfico dos inversos)

Vm S
V
Km S

nearizando na forma de duplos recprocos:

1
1
Km 1

V
Vm
Vm S
26

Coordenadas de Lineweaver-Burk

- O coeficiente angular igual a Km/Vm

- O coeficiente linear igual a 1/Vm.
-1/V se aproxima a infinito para S diminuindo
- D peso indevido a medidas inexatas a baixo valor
de S
- D peso insuficiente a medidas acuradas a altos
valores de S.
27

Coordenadas de Hanes-Woolf (Langmuir)

S Km
1

S
V Vm Vm

- O coeficiente angular igual a 1/Vm

- O coeficiente linear igual a Km/Vm
- D o melhor ajuste dos trs
28

Coordenadas de Eadie-Hofstee

V Vm K m

v
S

- O coeficiente angular igual a Km

- O coeficiente linear igual a Vm.
- Esta sujeito a grande erro porque ambas
coordenadas tm V
- H pouco desvio a baixos valores de S

29

Inibidores reversveis

30

Anlise do efeito modulador reversvel em cintica enzimtica

Inibio competitiva
Uma grande contribuio da aproximao de Michaelis-Menten
para a cintica enzimtica a contagem quantitativa da
influncia dos moduladores. Para comear a anlise, devemos
assumir que a sequncia seguinte aproxima-se razoavelmente
das interaes de um inibidor competitivo e de um substrato
com a enzima. Aqui E e S tm o significado usual e I denotado
como inibidor. Alm disso, EI um complexo enzima-inibidor.
Etapas da reao em Eequilbrio:
+ S
E + I

Etapa lenta:

ES

KS

EI

Ki

ES E +P

Usando o equilbrio indicado e um balano global de massa para a enzima,

temos:

E + ES + EI = Eo
31

Inibio competitiva:

32

Podemos escrever a velocidade da reao em termos de Vmax e das concentraes

do substrato e do inibidor livres (S e I, respectivamente):

Vmax S
S K s 1 I K i

Comparando isto com a forma original de Michaelis-Menten, temos que Vmx no

afetada, mas a constante aparente de Michaelis ( K app
) aumentada pela presena
m
do inibidor competitivo:

K app

K
1

m
s
K
i

Inibio no competitiva

Podemos obter um modelo til para a inibio no-competitiva pela ad

seguintes etapas de equilbrio na sequncia de reaes de inibio co
EI + S EIS
ES + I EIS

Ks
Ki

(i)
(j)

33

Inibio no competitiva:

34

E + S

ES

KS

E + I

EI

Ki

EI + S EIS
ES + I EIS

Ks
Ki

Usando o procedimento de escrever as concentraes em termos de Eo, S e I,

obtemos a seguinte expresso de velocidade:

Vmax
S
I
(1
)
Ki
V
S Ks
Fazer este exerccio em casa
35

esumo dos casos de inibio reversvel

Lineweaver-Burk

Hanes-Woolf

Eadie-Hofstee

36

ssificao simplificada de inibidores reversveis

Tipo

Resultado
Descrio

Ia

IIb

Totalmente

Inibidor

adsorve

competitivo

ligao do substrato

aparente de Km

Parcialmente

Inibidor e substrato combinam

Aumento no valor

competitivo

com diferentes grupos; ligao do

aparente de Km

inibidor

afeta

no

stio

ligao

de

Aumento no valor

do

substrato.
IIa

No-competitivo

Ligao do inibidor no afeta a

No muda Km,

afinidade ES, mas o complexo

diminui Vmx

ternrio EIS no se decompe

em produtos.

IIb

No-competitivo

O mesmo que IIa, exceto que EIS

No muda Km,

se decompe em produto a uma

diminui Vmax

velocidade finita diferente de ES

III

Inibidor misto

Afeta
Vmax

Km

e
37

stem outros tipos de

oduladores da atividade
zimtica:
amos um exemplo ilustrativo

modelos cinticos destes

sos so mais complexos

38

Influncias de outros fatores na atividade enzimtica

Muitos outros fatores podem influenciar a atividade cataltica
das enzimas,
provavelmente por afetarem o estado estrutural ou qumico da
enzima. Como fatores mais importantes esto:
1) pH;
2) Temperatura;
3) Foras no fluido (foras hidrodinmicas, presso hidrosttica
e tenso superficial);
4) Agentes qumicos (tais como lcool, ureia e perxido
de hidrognio);
5) Irradiao (luz, som e radiao ionizante).

Devido maior importncia, somente sero comentado

os itens
1 e 2.
39

1. O efeito do pH
As protenas, como visto anteriormente na seo 2.3 da
Unidade 2, so construdas a partir de aminocidos. Estas
unidades bioqumicas possuem grupos bsicos, neutros e
cidos.
Consequentemente, a enzima intacta pode conter ambos os
grupos carregados positiva ou negativamente a um dado pH.
Deste modo, grupos ionizveis so aparentemente, muitas
vezes parte do stio ativo, visto que a ao cataltica de
cidos e bases est ligada a vrios mecanismos
enzimticos. Alm disso, variaes do pH podem alterar a
estrutura tridimensional das enzimas.
40

Deste modo, grupos ionizveis so aparentemente,

muitas vezes parte do stio ativo, visto que a ao
cataltica de cidos e bases est ligada a vrios
mecanismos enzimticos. Alm disso, variaes do pH
podem alterar a estrutura tridimensional das enzimas.
Exemplo:

41

O efeito da temperatura
A velocidade das reaes catalisadas por enzimas
cresce at um certo limite. Acima de uma determinada
temperatura, a atividade da enzima diminui devido
sua desnaturao. A Figura a seguir mostra a variao
da atividade de uma enzima com a temperatura,
mostrando um ponto timo de operao. A parte
ascendente da curva conhecida como ativao pela
temperatura, ou ativao trmica. Nesta regio, a
velocidade da reao varia de acordo com a equao
de Arrhenius: V = k2 . [E0]
onde: k2 = A . e-Ea/RT

42

A parte descendente da curva da Figura conhecida como

desativao pela temperatura ou desnaturao trmica. A
cintica da desnaturao trmica pode ser expressa por:

dE

kd . E
dt

E E0 . e

kd t

k d Ad e

Ed
R T

de kd a constante de desnaturao, Eo a concentrao in

substrato, Ed a energia de desativao.
43

Exerccio Resolvido
Um engenheiro recebeu um relatrio de laboratrio
sobre a presena de um pesticida na gua
consumida por uma indstria de uma regio suspeita
de contaminao. Sabendo que o pesticida suspeito
inibe a atividade de uma enzima conhecida, esta foi
utilizada para confirmar a presena do pesticida
obtendo-se os resultados a seguir:

V (molL-1min-1) 106

S (molL-1)

Sem inibidor

Com 10-5 M de inibidor

3,310-4

56

37

510-4

71

47

6,710-4

88

61

1,6510-3

129

103

2,2110-3

149

125

44

Com os dados da Tabela foram elaborados os

grficos de Lineweaver-Burk como se mostra a
seguir:
30000
f(x) = 7.46x + 5169.01
25000

20000
f(x) = 4.32x + 5003.35
1/v

15000

Com inibidor
Linear (Com
inibidor)

10000

Sem inibidor
Linear (Sem
inibidor)

5000

0
0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1/S

45

Resposta:
Pode-se observar neste grfico que as duas
retas coincidem no eixo de inverso da
velocidade. Isto significa que as duas reaes
apresentam aproximadamente o mesmo valor
de Vmax. Como o coeficiente angular Km/vmax das
duas retas bem diferente significa que o
valor de Km das duas reaes diferente.
De acordo com o material o inibidor
totalmente competitivo Ia modifica o valor de
Km e no altera o valor de Vmax. Pode-se notar
que o valor de Vmax o mesmo para a reao
inibida e no inibida e o Km diferente, o que
caracteriza uma inibio competitiva.
46

Enzima imobilizada
Porque imobilizar enzimas?

47

compostos qumicos de alto valor agregado, a utilizao de

as em processos industriais as enzimas s pode ser viabiliza
o a enzima produzida em larga escala e quando reu
vezes no processo cataltico. A medida que o N de reuso
nta o custo do processo diminui.

Tipos de
imobilizao:
a) adsoro
b) ligao covalente
c) aprisionamento
d) confinamento com
membrana

Sistemas com enzima imobilizada. (a) enzima

adsorvida no covalentemente a uma partcula
insolvel; (b) enzima covalentemente aderida uma
partcula insolvel; (c) enzima aprisionada dentro de
uma partcula insolvel por um polmero com ligaes
cruzadas; (d) enzima confinada entro de uma

50

Reatores enzimticos

Matria de EB2

51

Reator de batelada

Reatores ideais: hipteses?

Hiptese: perfeitamente agitado

T=ct
e
pH=c
te

Funciona no transiente
(descontnuo)
52

Reator de mistura ou Continuous Stirred Tank

Reactor - CSTR

T=cte
pH=ct
e

ptese: perfeitamente agitado

Funciona em estado
estacionrio (contnuo)
53

Reator tubular:
Reatores ideais: hipteses?
Hiptese: Fluxo pistonado

tese: velocidade no varia radialmente

T=cte
pH=cte

Reator tubular- o mais usado

Funciona em estado
estacionrio (contnuo)

54

tores para estudos cinticos com enzima imobilizada

55

FIM

56