Universidade Federal de Viosa

Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular

BQI 650-Estruturas e Funes de Protenas

HCTOR HERNNDEZ
ISADORA RIBEIRO
WALMIR SILVA

Introduo
Funo de enzimas determinada pela sequncia de aminocidos.
Estrutura terciaria estabilizada por interaes hidrofbicas,
eletrostticas, de van der Waals e pontes de hidrognio.
Podem catalisar diferentes reaes para a obteno de compostos
a escala industrial.
Estabilidade da enzima em determinadas condies crucial para
seu desempenho.
Numerosos esforos tm sido realizados para que as enzimas
continuarem ativas em altas temperaturas, na presena de
solventes orgnicos e condies de pH extremo.

Evoluo

Estabilidade uma
propriedade que
determina o fitness
biolgico da protena.

Tcnicas
computacionais
utilizadas para
aumentar a
estabilidade proteica

Precursor em
comum
Estabilidade de protenas
um indicador de
tolerncia s mutaes e
habilidade para evoluir.

Seleo de posies
(hotspots)

Livrarias de mutantes

Substituies, eliminaes e
inseres na cadeia de
aminocidos.

A maioria das
mutaes so
desestabilizadoras
Alinhamentos de estrutura e
sequncia.
Anlise da rvore filogentica.
Avaliao
da
geometria
macromolecular.
Abordagens de aprendizagem
automtica.
Minerao de banco de dados.

Bioinformtica
aplicao de tcnicas computacionais para organizar e analisar sequncias,
informaes funcionais e estruturais associadas a macromolculas
biolgicas baseadas em dois conceitos principais.

Comparao
agrupamento
dados.

e
de

Analisar um tipo de dado para

inferir, entender ou modificar
propriedades de outros tipos de
dados.

1. Abordagens estocsticas.
2. Estratgias de desenho racional
emprico.
3. Mtodos de desenho
racional
sistemtico.
4. Concepo de protenas quimricas.

Abordagens estocsticas
Estes mtodos so comumente referidos evoluo dirigida. Eles imitam o processo
Darwiniano e misturam mutagneses aleatrias com mapeamento e seleo do
fentipo desejado.
A aplicao do mtodo completamente aleatrio apresenta a desvantagem de uma
alta frequncia de mutaes prejudiciais e uma baixa frequncia de mutaes
funcionalmente benficas.

ProSAR

um processo iterativo de diversa

gerao
acompanhada
de
mapeamento e anlise estatstica.

Revela mutaes
benficas

Mutagnese de saturao iterativa e

anlise estrutural.
Aminocidos so escolhidos como
hotspots para mutagnese se
apresentarem um valor de fator-B alto.

Fator B um parmetro de
deslocamento
atmico
correspondente a movimentos
trmicos e flexibilidade.
Dmitry Suplatov et al. 2014

Abordagem de consenso e mtodos de

mutao ancestral
Consideram alinhamentos de sequncia
mltipla para dirigir a gerao de
variantes.
Abordagem de consenso
Os aminocidos que se apresentarem
mais frequentemente so identificados
em cada coluna de um alinhamento
mltiplo.
Vantagem:
Faz possvel
produzir
enzimas mais
estveis.

Desvantagem:
No
ajuda ao entendimento
dos
mecanismos
moleculares
relacionados
com
estabilidade proteica.

Dmitry Suplatov et al. 2014

Mtodos de mutao ancestral

Mtodo de parcimnia
Minimiza
o
custo
das
mudanas
evolucionarias ao longo de cada rama da
rvore.

Mtodo de mxima probabilidade

Incorpora um modelo probabilstico explicito
e uma hiptese matemtica descrevendo
como a sequncia ancestral se tem envolvido
dentro das sequncia contemporneas.

Dmitry Suplatov et al. 2014

Desenho Racional Emprico

Ferramentas
Computacionais

Inspeo da sequencia de
aa;
Dados estruturais;
Comparao entre
homlogos (>< estveis);

Anlises
Estruturais

Introduo
de
novas
interaes para estabilizao
da protena enovelada

Desenhos de
Enzimas

Desenho Racional Emprico

Perl et al 2000
Cold Shock proteins

Mutaes stio-dirigida
2 resduos na superfcie: Arg3- interaes
eletrostticas e Leu66- interaes
hidrofbicas

Diferenas na termoestabilidade
Inviabilidade de aplicao em protenas maiores!

Desenho Racional Emprico

Estudos comparativos de sequencias e estrutura de protenas permitiram determinar que:
Favorecem a Termoestabilidade:
Alto contedo de Prolina, Arginina e
Tirosina;
Maioria das estruturas em alfahlice;
Maior numero de pontes salinas e
pontes de hidrognio;
E Menor contedo de cistena e
serina

Adaptao a pH alcalino est correlacionado :

Diminuio no nmero de aa
negativamente carregados e lisina;
Aumento no numero de arginina,
glutamina, asparagina e histidina;
Aumento no nmero de pontes salinas;

Estudos empricos permitiram o desenvolvimento mais racional de formas de

estabilizao de estruturas desenhadas, mas a escolha dos hotspots para mutao ainda
muito subjetiva;
Ainda um processo difcil de ser reproduzvel;

Desenho Racional Sistemtico

Analises de
bioinformtica

Funo e
estabilidade
proteica

Famlia de
protenas
Decifrar os
padres de
mutao natural

Mtodos
Sistmicos
utilizam
procedimentos
de
bioinformtica
reprodutveis e evita seleo de
hotspots
subjetivamente
e/ou
manualmente para desenhos de
enzimas mais estveis!

Desenho Racional Sistemtico

Posies conservadas entre protenas de

uma mesma famlia so ocupados por um
tipo de resduo ou resduos com
propriedades fsico-qumica similares

Vrios mtodos estatsticos e de bioinformtica

tem sido desenvolvidos para conhecer os mltiplos
nveis de conservao:
Conceito de estrutura guiada por resduos
conservados (SGC)
Selecionar mutaes benficas baseado
no grau de conservao da sequencia e
anlises de geometria macromolecular
Multiplos
alinhament
os

Aplicados
alguns
critrios

Posio do hotspot para mutao:

No deve estar localizado prxima ao sitio ativo;
No deve participar de pontes de hidrognio ou
salina;
No deve estar envolvido na estabilizao de
estrutura secundria

Desenho Racional Sistemtico

Posies especficas em subfamlia (SSPs)

Identificao dessas regies baseada na entropia da
distribuio dos resduos de aa de uma subfamlia;
Sequencia de aa, informao estrutural, propriedades
fsico-qumicas das cadeias laterais dos aa;
Ranking dos hotsposts significantes;
Escolha das subfamlias pode ser obtidas de anotaes
funcionais;
SSPs so preferencialmente associadas com stios
catalticos e regulatrios das enzimas;
Promiscuidade cataltica;
Aumenta a estabilidade da enzima;

Desenho Racional Sistemtico

Posies de co-evoluo
Ocorrncia de mutaes em uma regio e compensada
por mutao em outra regio para manter interaes
energeticamente favorveis;
Usado para destacar pares de resduos estruturalmente
importantes;
Mltiplos alinhamentos, coeficiente de correlao e
medidas de entalpia entre os resduos;
Mutaes nestas regies altamente correlacionadas
levam a perda da estabilidade com alterao da
conformao funcional da protena

Concepo de protenas quimricas

Modificaes estruturais globais como uma ferramenta para a criao de protenas com
propriedades requeridas.

Associao do /-Barril de uma

lcool desidrogenase com sua
homologa termoestvel de
Pyrococcus furiosus.

 Passo limitante da tcnica: Reconhecer as regies estruturais especficas

onde pode haver recombinao, sem que ocorra perda de de estrutura e
funcionalidade.
Novas abordagens:
- SCHEMA: prever as posies de cruzamento mais favorveis entre
domnios de protenas, afim de cria uma biblioteca de protenas
termoestveis.
Aumenta a probabilidade de que uma quimera se dobrar corretamente.
- Celobiohidrolases de fungos recombinadas
quimeras.

6561 maneira, 48

os

 Correlacionar a funo e a sequncia com base no processo de

Gaussian
Capaz de identificar as trocas de informaes de blocos de
aminocidos contnuos.
No explica o papel de cada bloco e os mecanismos moleculares.
Enzimas do citocromo P450

261 sequncias quimricas.

Discusses e consideraes finais

Estabilidade
Biocatalizadores naturais

Adaptabilidade e evoluo

Bioinformtica como ferramenta para melhorar a estabilidade :

termoestabilidade, resistencia a pH cidos ou alcalinos e a solventes.
Deve-se considerar:
- Reconstruo ancestral (evoluo das funes)
- Posies conservadas
- Posies especificas das subfamlias e co-evoluo.

 Falta de informaes funcionais na entrada de banco de dados.

ALTERNATIVA: Entrar com a sequncia e a estrutura, busca de
similaridade para recuperar homlogos.
- Protenas de evoluo remota e estudo de grande subfamlias
funcionalmente diferentes.
- Requer um grande conhecimento de bioinformtica.

Banco de Dados

Novos padres para a construo de

alinhamento.
Superposio espacial parentes evolutivos remotos
Alinhamento de sequncias Homlogos.

 A estabilidade continua sendo um dificil problema no estudo de

protenas e biocatalizadores.
A bioinformtica tem o poder de descobrir o cdigo evolutivo e
tornar-se fundamental para o concepo de protenas mais estveis e
funcionais.
A analise de grandes superfamlias pode ser aplicada para prever
mudanas especficas em uma estrutura de protena que aumenta a
sua estabilidade.

OBRIGADO!