High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
Objetivos
Princpios, Definies e tipos de Cromatografia
HPLC
Funcionamento do equipamento,
Tipos de coluna e fundamentos tericos da separao,
tipos de detectores
Tempo de Reteno e identificao do composto
qumico
Quantificao dos compostos
Metodologia adotada no Laboratrio para anlise de
neurotransmissores e metablitos
Princpios e Definies da Cromatografia
Cromatografia um mtodo fsico-qumico de
separao.

Ela est fundamentada na migrao diferencial dos

componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase
mvel e a fase estacionria.

A grande variedade de combinaes entre fases mveis e

estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil
e de grande aplicao.
Fundamento da Separao
 Origem da Cromatografia
O termo cromatografia foi primeiramente
empregado em 1906 e sua utilizao atribuda
a um botnico russo Mikhail Tswett ao
descrever suas experincias na separao dos
componentes de extratos de folhas.

Nesse estudo, a passagem de ter de petrleo

(fase mvel) atravs de uma coluna de vidro
preenchida com carbonato de clcio (fase
estacionria), qual se adicionou o extrato,
levou separao dos componentes em faixas
coloridas.
 Este provavelmente o motivo pelo qual a tcnica
conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie =
escrita), podendo levar errnea idia de que o processo
seja dependente da cor.

Separao das cores da

tinta da caneta no papel
(fase estacionria) usando
etanol/H2O como fase
mvel
Evoluo das Tcnicas Cromatogrficas
1906- Tswett- Cromatografia em coluna
Izmailov e Shraiber- Cromatografia em Camada
Delgada (CCD; TLC) separao de extratos vegetais
com placa de vidro recoberta com alumina.
Era da Cromatografia Moderna- Prmios Nobel-
1937,1938 e 1939.
Martin e Singe 1942- Cromatografia Gasosa (CG,GC)
Mantin e James 1952- Cromatografia Gasosa (CG,GC)
Dcadas de 1960/1970
Karr, Jentoft, Gouwn, Huber, Hulsman, Snyder
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA
(CLAE, HPLC)
Cromatografia planar
Estrutura da coluna-slica/silanol
 Tempo de Reteno (TR)- tempo decorrido da injeo da amostra
at a chegada da molcula no detector/fotomultiplicadora/registro
A partir do TR podemos identificar os compostos e verificar a
qualidade das separaes (resoluo)
 DETECTORES

UV-Visvel Analitos que absorvem a radiao

eletromagntica dentro destas faixas de comprimentos de
onda () (UV= 200 a 380 nm) e (Visvel=380 a 800nm)

Grande vantagem: Barato

Universal (254nm:60% dos compostos orgnicos absorvem nesta
faixa)-vantagem ou desvantagem ???

Grande desvantagem: Baixa sensibilidade e interferncias (maior

probabilidade de molculas da fase mvel e/ou do preparado
da amostra com mesmo TR dos analitos dando sinal).
As molculas que absorvem na faixa do UV possuem duplas
ligaes entre carbonos.
Eletroqumico
 Detector utilizado
Fluorescncia- O analito absorve a radiao em um
menor (maior energia) e emite em um maior.
Ex.: excitao em 345 nm e de emisso em 485nm
Vantagens: 10x a 1000x mais sensvel do que UV-Vis e
especificidade (cerca de 15% compostos so fluorescentes).
Quando o analito no tem a propriedade da fluorescncia,
pode ser feita uma reao de derivatizao (modificao), a
fim de torn-lo fluorescncia.
NEUROTRANSMISSORES E METABLITOS
 Dopamine 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)
Homovanillic acid

3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)

Serotonin hydrochloride 5-Hydroxyindole-3-acetic acid (5-HIAA) -Aminobutyric acid (GABA)

Acetylcholine chloride
Reaes de Derivatizao
Cromatograma obtido de uma mistura de padres em relao ao branco
L-Dopa: TR=11,8min
DOPAC:TR=13min Epinefrina
Dopamina: TR=15,6 min
NE(norepinefrina) :TR=29 min
E(epinefrina):TR=41,5min

Dopamina

Norepinefrina

L-Dopa Dopac
Curvas de calibrao de uma mistura de padres

Dopamina

Norepinefrina

Dopac
L-Dopa
 Mtodo Quantitativo
Relao entre rea do pico e concentrao dos padres.
Construo de curva de calibrao.
Uma mistura de padres de neurotransmissores e
metablitos de interesse para cada ponto da curva.
 Conceitos Importantes

Limite de deteco ::

Limite de deteco
 Metodologia empregada
Tcnica cromatogrfica:HPLC
Condies cromatogrficas:
Coluna: C 18
Fase Mvel (FM): Tampo Acetato 20mM + EDTA
0,5mM + Acetonitrila (gradiente tampo/ACN)
Fluxo FM: 0,1mL/min