células-tronco do ligamento periodontal tendo Smad5 como alvo
Doutorando: Arthur G. Schmidt
Orientadora: Profa. Dra. Denise Carleto Andia ncRNAs RNAs não-codificantes (ncRNA, non coding RNAs) são moléculas transcritas a partir do genoma e não traduzidas em polipeptídeos, permanecendo geralmente no núcleo da célula, onde exercem sua função principal de regulação da expressão gênica tanto transcricional como pós-transcricional.
A interferência por moléculas de RNAs não-codificantes que atuam
transcricionalmente é considerado um mecanismo epigenético, isto é, uma mudança estável e herdável da expressão gênica ou do fenótipo celular sem que haja alterações na sequência de bases do material genético. Bartel, David P. «MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function». Cell. 116 (2): 281-297. ISSN 0092-8674. PMID 14744438. 2004 ncRNAs Os NcRNAs podem ser divididos em três grandes grupos em função de seu tamanho. O microRNA (miRNA) e o RNA de interferência (siRNA, do inglês Small interfering RNA) correspondem a moléculas bem conservadas entre as espécies, com tamanhos entre aproximadamente 20 a 30 nucleotídeos. Os miRNA são tidos como produtos do genoma do próprio organismo. São pequenas moléculas endógenas de ácido ribonucleico (RNA), não codificantes, com cerca de 22 nucleotídeos que atuam como reguladores da expressão gênica em plantas e animais, ao nível pós- transcricional por meio da clivagem de um RNA mensageiro alvo (mRNA) ou da repressão da tradução. Goldberg, Aaron D.; C. David. «Epigenetics: a landscape takes shape». Cell. 128 (4): 635-638. ISSN 0092-8674. PMID 17320500. 2007 ncRNAs
Recentemente, foi estabelecido que microRNAs (miRNAs)
desempenhavam papel importante na osteogênese de células tronco mesenquimais (MSC). Novas populações de MSCs de tecidos dentais e craniofaciais, incluindo células-tronco do ligamento periodontal (PDLSCs) e outras células-tronco dentárias, têm sido propostas como fontes celulares adequadas para regeneração dentária e periodontal. A diferenciação das MSCs envolve uma série de vias complexas que são reguladas nos níveis transcricional e pós-transcricional ncRNAs Recentemente, foi revelado que miRNAs poderiam modular o potencial de diferenciação de células-tronco por fatores de transcrição pós-transcricional implicados na manutenção de células-tronco. Evidências crescentes também sugeriram que miRNAs também poderiam contribuir para a modulação da diferenciação osteogênica de vários tipos de células e formação óssea Descobriu-se que o microRNA-21 (miR-21) está superexpresso na maioria dos tecidos de câncer epitelial e constatou-se que sua inibição do suprime a proliferação e promove a apoptose de células cancerígenas; ainda que o miR-21 poderia regular negativamente a expressão de supostos genes supressores de tumor, tais como: PDCD4, fosfatase e tensina, maspin, NFIB , etc. Estudos prévios revelaram que o miR-21 aumentou a diferenciação osteogênica induzida por estiramento em células-tronco do ligamento periodontal humano (hPDLSCs) MiR-21 diminuiu durante a diferenciação osteogênica de hPDLSCs
A diferencição osteogênica de hPDLSCs foi induzida num meio de indução
convencional de osteoblastos, sendo que o fenótipo osteoblástico foi evidenciado por atividade aumentada de fosfatase alcalina (ALP) (Fig. 1B, C) e mineralização de matriz como confirmado via coloração com Alizarina Red S (Fig. 1B, D). Verificou-se que o miR-21 é regulado negativamente (down-regulated) de maneira dependente do tempo após a indução da diferenciação osteogênica em hPDLSCs (Fig. 1A ). Os miRNAs foram preparados no dia 0, 1, 3, 5, 7, 10 e 14 após a indução e utilizados imediatamente para análise de PCR em tempo real. Na figura 1A o nível de miR-21 foi suprimido em hPDLSCs osteoblasticamente diferenciadas. A superexpressão do miR-21 diminuiu a diferenciação osteogênica das hPDLSCs Para avaliar o papel do miR-21 na diferenciação osteogênica de hPDLSCs, hPDLSCs foi transfectado com uma construção lentiviral pGC-LV-pre-miR-21-GFP projetada para estimular a produção de miR- 21. Uma construção semelhante excluindo a sequência miR-21, pGC-LV-miR-NC-GFP, foi utilizada como um controle. A superexpressão do miR-21 inibiu a diferenciação osteogênica das hPDLSCs. A figura A monstra a análise microscópica de fluorescência de hPDLSCs transfectadas, demostrando nenhuma diferença óbvia em sua morfologia (200x). A superexpressão do miR-21 diminuiu a diferenciação osteogênica das hPDLSCs Para elucidar o efeito da superexpressão de miR-21 na eficiência da diferenciação de hPDLSC, as hPDLSCs transfectadas foram induzidas a se diferenciarem ao longo de linhagens osteogênicas, seguido pela medição da atividade de ALP (marcador precoce da diferenciação osteo- dentinogênica), uma semana após a indução. Mostrou-se que o nível de atividade de ALP era muito menor nos miR-21 superexpressando hPDLSCs em comparação com o LV-NC e as células não infectadas (Fig. 2B, C). Para determinar se efeitos semelhantes poderiam também ser encontrados in vivo , as partículas de suspensão celular e de hidroxiapatite / fosfato tricálcico (HA / TCP) foram misturadas em conjunto e implantadas subcutaneamente na superfície dorsal de ratinhos nus. Os resultados foram os mesmos. A inibição do miR-21 estimulou a diferenciação osteogênica de hPDLSCs A regulação negativa do miR-21 em grupo miR-21 knockdown resultou em uma série de mudanças moleculares e funcionais que foram antagônicas ao que foi observado quando a superexpressão de miR-21 foi induzida, incluindo a atividade de ALP elevada (Fig. 3B, C ) e uma maior extensão da mineralização (Fig. 3B, D ) Consistente com essas resultados, a análise qRT-PCR mostrou que os níveis de mRNA de ALP, BSP, Runx2 e OSX foram drasticamente maiores no grupo knockdown do que no grupo LV-anti-NC ou em células não transfetadas após a indução (Fig. 3E-H ). Experimentos de implantação in vivo também demonstraram que os hPDLSCs com miR-21 knockdown geraram mais tecidos mineralizados do tipo osso / dentina do que as células que foram transfectadas com pGC-LV-anti-miR-NC-GFP ou não infectadas (Fig. 3I ) . MiR-21 inibiu a diferenciação osteogênica em PDLSCs através de Smad5 Para explorar o mecanismo molecular pelo qual o miR-21 inibiu a diferenciação osteogênica em PDLSCs, foram realizadas análises de bioinformática no miRGen 2.0 (www.targetscan.org, www.microrna.org , http://pictar.bio.nyu.edu ) para pesquisar seus potenciais genes alvo downstream, sendo um dos resultados a proteína Smad5. O Western blot confirmou que a Smad5 foi regulada positivamente durante a diferenciação osteoblástica de hPDLSCs não infectadas (Fig. 4A ). Após 7 dias de indução osteogênica, a expressão de Smad5 foi diminuída em hPDLSCs superexpressando miR-21 em comparação àqueles que foram transfectados com pGC-LV-miR-NC-GFP ou não infectados, mas aumentaram em as células nas quais a expressão de miR-21 foi artificialmente suprimida. Efeitos do Smad5 na diferenciação osteogênica de hPDLSCs Para determinar o papel de Smad5 na diferenciação osteogênica de PDLSCs, o Smad5 foi duprimido usando siRNA. A eficiência de knockdown foi verificada por PCR em tempo real e Western Blot. A avaliação da atividade da ALP e da coloração com Alizarina Red S mostrou que o nível de atividade da ALP foi muito menor (Fig. 5C, D) e a mineralização da matriz diminuiu nas hPDLSCs silenciando Smad5 em comparação às células não transfectadas com Si-controle (Fig. 5C, E). O silenciamento de Smad5 inibiu a expressão gênica de ALP, BSP, Runx2 e OSX após 7 dias de indução osteogênica (Fig. 5F-I ). Além disso, a expressão de Runx2 foi regulada negativamente (down-regulated) nas células Smad5-knockdown (Fig. 5J ) e verificou-se ainda que o Smad5 é um regulador upstream do Runx2, levando a níveis elevados de genes osteoblásticos, incluindo o Runx2. Foi demonstrado que a inibição do miR-21 que promove a diferenciação osteoblástica pode ser atribuída ao estímulo da via de sinalização Smad5-Runx2 (Fig. 5K ). ( K ) Ilustração esquemática da hipotética via regulatória por meio da qual o miR-21 modula a diferenciação osteogênica da hPDLSC via Smad5. DISCUSSÃO Os autores encontraram um nível de expressão diminuído de miR-21 em hPDLSC osteoblasticamente diferenciadas, implicando seu papel como um inibidor da osteogênese das MSC. De acordo com este achado, vários genes osteogênicos, incluindo ALP, Runx2, BSP e OSX, foram regulados negativamente em hPDLSCs superexpressando o miR-21. Resultados opostos foram obtidos quando a expressão de miR-21 foi suprimida. Os resultados experimentais não foram consistentes com os mencionados no estudo de Meng, que sugeriu o miR-21 como um estimulador da diferenciação osteogênica em MSCs do cordão umbilical humano. É muito provável que a função reguladora exata do miR-21 possa variar de acordo com o tipo de célula-tronco usada e as condições fisiológicas aplicadas. DISCUSSÃO O Smad5 mostrou-se um regulador upstream, promovendo a expressão de Runx2 e vários outros genes marcadores osteogênicos, como ALP, OSX e OCN. O nível desta proteína foi regulado negativamente pela superexpressão de miR-21 sete dias após as hPDLSCs serem induzidas a se diferenciarem. Por outro lado, a inibição do miR-21 aumentou a expressão de Smad5 e inibiu a tendência de hPDLSCs para a diferenciação osteogênica. Vale destacar que o ensaio da luciferase sugeriu que o miR-21 mediou os efeitos de diferenciação osteogênica direcionando diretamente Smad5. Esses dados, combinados com os experimentos com animais, sugeriram fortemente que o Smad5 é um alvo a downstream do miR-21 endógeno e serve como um regulador chave para a diferenciação osteogênica em hPDLSCs. DISCUSSÃO O nível de miR-21 aumentou após o knockdown de Smad5. Enquanto a expressão de genes marcadores osteogênicos como ALP, BSP, Runx2 e OSX diminuiu. Assim, a supressão de Smad5 mimetiza os efeitos da superexpressão do miR-21. O Runx2 deveria ser upstream regulated mas agiu como um efetuador downstream do Smad5 e assim, o nível de proteína Runx2 diminuiu no grupo inibidor de Smad5. Dessa forma, especulou-se que a via de sinalização Smad5-Runx2 poderia constituir um componente crítico subjacente ao mecanismo regulador miR-21 na diferenciação osteoblástica de hPDLSCs, conforme ilustrado esquematicamente na Figura. DISCUSSÃO Existem evidências crescentes de que outros miRNAs podem desempenhar importantes papéis regulatórios na diferenciação osteogênica de diferentes tipos de células-tronco. Por exemplo, a inibição da atividade do miR-26a promoveu a diferenciação osteogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo humano (hADSCs) via Smad1 . Descobriu-se que o miR-135b inibe a diferenciação osteogênica de MSCs humanas suprimindo a expressão de Smad5. Estes achados são consistentes com a teoria amplamente aceita de que os miRNAs, seus mRNAs e outros RNAs não-codificantes formam uma rede reguladora extremamente intricada, na qual um miRNA pode ter múltiplos mRNAs e diferentes miRNAs podem modular o mesmo mRNA. Obrigado!