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Métodos de detecção de pirogênio:

Comparação entre ensaio com sangue


integral bovino (bWBA) e Teste de ativação
de monócitos (MAT)
Christian Wunderlich, Stephan Schumacher and Manfred Kietzmann

Ana Carolina Martins, Anne Schuler, Gabriel Calazans, Gabriela, Isabella


Sant’Anna, Jamille, Lívia Carvalho, Natália Baranda.

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HISTÓRICO
Importância da detecção de contaminação pirogênica:

Laboratórios
de
referência
Indústria Instituições
Farmacêutic de cuidados
a de saúde

Detecção
de
pirogênio
s

Segurança  Limiares de níveis críticos 2


Teste de pirogênio de coelho (RPT)
Baixa sensibilidade

Teste limulus amebocyte lysate Consumo


(LAL) de animais
(lisado do limulus amebócito) Conceito
Não detecta pirogênios
dos 3R
não-endotoxinas

Teste de ativação de Monócitos (MAT)

Farmacopeia Europeia (EP)


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Apesar das limitações...

mas...

MAT não satisfaz Desafio


necessidades da indústria logístic
farmacêutica o

Acesso ao sangue total humano fresc

Cryoblood  Quantidade e Qualida

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Teste de ativação de Monócitos (MAT)

Fatores influenciadores Fatores influenciadores


Padronizados (Farmacopeia que não podem ser
Europeia) padronizados

Estilo de vida

Fator genético

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Sangue de espécie de animal Limitações superadas
grande e raça designada

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OBJETIVOS

 Capacidade do sistema estabelecido de


detectar outras endotoxinas e
componentes da parede celular de gram
positivos

 Comparação do método com o PyroDetect System (MAT),


comercialmente disponível

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METODOLOGIA
Endotoxina de Escherichia coli 0127:B8;
Endotoxina padrão OMS de Escherichia coli 0113:H10:K;
 Estimulantes
Peptídeoglicano de Bacillus subtilis;
Ácido lipoteicoico de Staphylococcus aureus.

 LPS 0127:B: 0,039, 0,078, 0,156, 0,313, 0,625 e 1,25 UE/mL;

 LPS 0113:H10: 0,063, 0,125, 0,25, 0,5, 1 e 2 UE/mL;

 Peptidoglicano e o ácido lipoteicoico: 1, 10, 50,100 e 1000 μg / ml.


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 Coleta de sangue: punção venosa de bovinos saudáveis
em tubos com heparina de 7,5 mL
 Animais: vacas, não lactantes, alimentadas, entre 2,5 à 13
anos estabilizadas na Clínica de Bovinos da Universidade de
Medicina Veterinária de Hannover;
 Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de
acordo com a legislação alemã em matéria de bem-estar dos animais.

Ensaio in vitro com sangue periférico bovino

Estimulados por
225 μL de sangue
24h com solução
em heparina de
de pirogênio ou
lítio
veículo

-80°C Centrifugação Incubação à 37°C


e 5% de CO2
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Comparação com o sistema PyroDetect

 PyroDetect System: teste Método A


quantitativo

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RESULTADOS

Análise estatística: os dados foram verificados para a distribuição


normal por inspeção visual e o teste de Kolmogorov-Smirnov.

Alguns dados mostraram distribuição distanciada à esquerda e


falharam no teste de normalidade;

Um teste de permutação foi utilizado para calcular um bloco completo


aleatório, e valores de P menores que 0.05 foram considerados
significantes.

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LPS de E. coli LPS de E. coli 0113:H10
0127:B8

Figura 1: Concentração de prostaglandina E2 após a estimulação Figura 2: Concentração de Prostaglandina E2 após


com LPS de E. coli 0127:B8 em sangue bovino fresco (armazenado < estimulação com LPS em sangue fresco bovino (armazenado
2h). Box-plot com média e mínima até máxima margem em n = 9, < 2h). Box-plot com média e mínima até máxima margem
no teste de permutação, *p< 0,05, **p< 0.01 em comparação com em n = 5, teste de permutação, *p < 0,05, **p< 0,01
sangue não estimulado. O resultado é representativo de três comparado ao sangue não estimulado. Resultado é
experimentos independentes. representativo de três experimentos independentes.

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Peptideogicano de B. Ácido lipoteicoico de S.
subtilis aureus

Figura 3: Concentração de prostaglandina E2 após a estimulação com Figura 4: Concentração de prostaglandina E2 após a
PGN em sangue fresco bovino (armazenado < 2h). Box-plot com estimulação com LTA em sangue fresco bovino (armazenado <
média e mínina até máxima margem em n = 5, teste de permutação, 2h). Box-plot com média e mínina até máxima margem em n =
**p < 0,001 comparado com sangue não estimulado. Resultado é 5, teste de permutação, **p < 0,001 comparado com sangue
representativo de três experimentos independentes. não estimulado. Resultado é representativo de três
experimentos independentes.

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LPS de E. coli 0113:H10

 PyroDetect System
também conseguiu detectar
todos os outros pirogênios
em todas as concentrações
utilizadas;

 A reação colorimétrica do
ELISA foi tão intensa que não
permitiu quantificação.

Figura 5: Curva de calibração do PyroDetect System utilizando


endotoxina padrão da OMS em relação à densidade óptica da
concentração de LPS. Média com sangue humano cropreservado em
quatro medidas.
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Tabela 1: Limites de detecção de diferentes estimulantes.

Experimen Experiment Experiment PyroDetect


to 1 o2 o3 System
Poolblood
n = 6-9 n=6 n=5
LPS E. coli 0.08 EU/mL 0.04 EU/mL 0.08 EU/mL 0.04 EU/mL*
0127:B8
LPS E. coli Não testado 0.5 EU/mL 0.25 EU/mL 0.25 EU/mL
0113:H10
Peptideoglican 10 µg/mL 50 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL*
o B. subtilis
Ácido 10 µg/mL 10 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL*
lipoteicoico de
S. aureus
Diferentes animais foram utilizados, teste de permutação, comparados ao sangue não estimulado. Experimento 3 foi a comparação com o
PyroDetect System. *menor concentração testada
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DISCUSSÃO
 Estudos anteiores mostram que o LPS 011:B4 de E. Coli pode ser
detectado usando o estudo com sangue integral bovino e PGE2.

 Receptor TLR: semelhante em humanos e bovinos.

Detecção de LPS

LPS 0127:B8 LPS 0113:H10

3-6 vezes mais sensível Detectada pelo


PyroDetect
0.04 – 0.08 EU/mL 0.25 – 0.5 EU/mL
 A detecção de LPS 0113:H10 ainda obedeceu às especificações do MAT e
a sensibilidade requerida de testes de pirogênio de 0.5 EU/mL. 16
Detecção de PNG

 Detecção de 10 – 50
µg/mL.
 PNG agonista TLR2

sentido pelas proteínas com domínio de ligação à nucleotídeos e


oligomerização (NOD) 1 e 2.

 PNG comercial: contaminada com endotoxina

Purificada: incapaz de estimular liberação de citocinas no sangue


humano.

PNG Invivogen: 1 unidade de endotoxina


por mg
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Detecção de LTA
 Detecção de 10 microgramas por micro litro de LTA (ácido
lipoteicóico).

formação de complexo de LTA


em altas concentrações:
interações intermoleculares das
moléculas de LTA;
 aumento da ligação pelo
receptor scavanger tipo 1 dos
bovinos, que tem habilidade de
interagir com ou ligar, por
Figura 4 exemplo, pirogênios.

 Concentrações acima de 100 µ: improváveis em produtos


medicinais;
 Análogo de endotoxinas em gram negativas;
 Contaminação similar ao Invivogen
PNG
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Comparação do MAT e
bWBA
 Mesmo nível de detecção de Endotoxina padrão OMS de E. coli
0113:H10:K de endotoxina padrão, 0,25 EU/mL: dentro do nível permitido
de 0,5 EU / ml em produtos farmacêuticos.
 PGN, LTA e LPS 0127:B8: PyroDetect System foi capaz de identificar a
presença de 1 μg/mL PGN ou LTA (as menores concentrações utilizadas nos
experimentos).

 Outros estudos sugerem que o MAT pode detectar concentrações tão


baixas quanto 100 ng/mL de LTA.

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CONCLUSÃO

Reduction
 Objetivo 3R Refinemen Redução do uso
t Detecção de de RPT e LAL
Limites de Robustez
detecção ReplacemePirogênios usando
 Introdução do nt sangue total de
MAT MAT não é amplamente
bovino
utilizado
Detecção de
Funcionalidad Melhorias outros
e do método pirogênios

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