Bioprocessos utilizando

células imobilizadas

Iara Rebouças Pinheiro

Novembro de 2004
Definição:
Células Imobilizadas são aquelas que estão fisicamente
confinadas numa região definida do espaço, onde a célula está
associada a um suporte (matriz).

Vantagens:
 Obtenção de altas densidades celulares e altas produtividades;
 A reutilização ou utilização mais prolongada das células;
 Simplificação do “Downstrem”
 Provável obtenção de maiores fatores de conversão de substrato ao produto

 Desvantagens:
 Destruição da matriz provocada pelo crescimento celular;
 A membrana celular pode atuar como barreira de difusão;
 Métodos de Imobilização:
 Adsorção : consiste na união entre a molécula e um suporte
inerte através de ligações eletrostáticas

 Ligação Covalente: a célula é ligada ao suporte através de

ligações químicas covalentes

 Retenção celular (envolvimento): confinamento físico das

células em uma matriz polimérica formadora de um gel hidrofílico

 baixa toxidez, alta capacidade de retenção (76% dos

trabalhos estudados)
  Materiais utilizados na produção de suportes para imobilização
de células vivas
Polímeros naturais Polímeros sintéticos Materiais inorgânicos
Alginato Poliacrilamida Alumina
-carragenana Cloreto de polivinila Sílica
Agar Poliestireno Zircônica
Pectina Poliuretano Vidro
Celulose Polietileno glicol Diatomita
Dextrana Vermiculita
Colágeno

 Alginato de cálcio (43%)

- A formação do gel e a seletividade pela ligação dos cátions
irão depender da composição e da sequência desses monômeros

Estruturas do alginato - (A) ácido gulurônico, (B) ácido

manurônico (ZHANG et al., 1998).

  variáveis que interferem:
- Concentração de alginato;
- Concentração de CaCl2;
- Concentração celular;
- Diâmetro das esferas;
- Tempo de cura.

Sistema de imobilização
 Produção de antibióticos

Antibióticos Processos microbianos

Metabólitos não associados ao crescimento

Baixas velocidades específicas de crescimento

Células imobilizadas

 Alta concentração celular  Altas produtividades

 Reutilização das células em sistema com bateladas repetidas
 Antibióticos produzidos por células
imobilizadas de Streptomyces

Antibiótico Método Referência

Dalili e Chau, 1988

Actinomicina D Ca-alginato
- EUA

Poliacrilamida-hidrazida Freeman e Aharonowitz,

Cefalosporina 1981 - Israel
Sridevi e Sridhar, 1999
Cefamicina C Alginato/espuma - Índia

Ca-alginato/carragenana Mahmoud e Rehm, 1986 (Al)

Cloratetraciclina Gontier et al, 1997 (França)

Ca-alginato/Polivinil-alcool Takashima et al, 1987

Daunorrubicina - Japão

Neomicina Ca-alginato Snirivasulu at al, 2003

- Índia

Azevedo, 2004
Retamicina Ca-alginato/celite/espuma LEB-EPQI/USP

MENOR TOXICIDADE ÀS CÉLULAS

 Outras aplicações

- Produção de álcoois
- Produção de ácidos orgânicos
- Cultivos com células animais
Álcoois produzidos por células imobilizadas

Álcool Organismo Suporte Referência

Etanol levedura Polímero Lida et al. (1993)

Etanol levedura Alginato Kazuaki et al (1994)
Etanol Zymomonas mobilis Matriz fibrosa Castellar et al. (1994)
Etanol levedura Alginato Gelson et al. (1993)
Etanol Kluyveromyces Alginato Nolan et al (1994)
marxianus
Butanol Clostridium sp. Alginato Groot et al. (1987)
Glicerol S. cerevisiae Sintered glass Benito et al (1994)
Sorbitol Z. mobilis k-carragenana Jang et al. (1992)
 Objetivos
- Geral:
 O estudo da produção da retamicina a partir de
Streptomyces olindensis utilizando cultivos em
biorreatores do tipo cesta e fluidizado com as células
imobilizadas em gel de alginato, buscando-se uma
comparação do desempenho das células livres com as
imobilizadas.

- Específicos:
 Estabelecimento de condições adequadas de operação com células
imobilizadas em biorreator tipo cesta em processo com bateladas
repetidas e em processo contínuo;

 Estudo da influência de diferentes condições de transferência de

oxigênio com as células imobilizadas.
 Revisão Bibliográfica

 Streptomyces

 Bactérias da família dos actinomicetos.

 Encontram-se no solo, filamentosas e Gram-positivas

 Ciclo de vida complexo alternando a formação de esporos e micélio

Ciclo de vida de Streptomyces

 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

 Antibióticos antitumorais
 As antraciclinas são os medicamentos antineoplásicos (quimioterápicos) mais
utilizados na medicina.
retamicina
 Complexo que apresenta-se como uma
A fração da mistura de glicosídeos e antraciclinonas
aglicona é (Lima et al., 1969)
responsável pela
ligação da droga
ao DNA  Possui menor toxicidade que outras
antraciclinas atualmente comercializadas,
mas apresentou efeitos colaterais como
A fração glicosídica é arritmias (Furlan, 2002; Lima et al., 1992)
essencial para que
apresente atividade
biológica  Apresentou altos percentuais
apoptogênicos e capacidade de intercalação no
DNA (Furlan et al., 2002)
Figura 3: Estrutura de um dos maiores
constituintes do complexo retamicina,
derivado da -rodomicinona
Metodologia de imobilização
(Azevedo, J. G. W.)

Cultivos de pré-imobilização

Imobilização

Envolvimento Adsorção

1h
 Porcentagem de retenção dos suportes Alginato,
espuma e celite (Azevedo, J. G. W.)
160%

140%

120%

100% 96%
% de retenção

80%

60% 55%
52%
46% 48%
46%

40%

20% 16%
9% 9%

0%
2 4 6
concentração celular nominal

alginato espuma celite

Conclusões (Azevedo, J.G.W.)
 Celite
baixa capacidade de retenção celular

 Espuma de poliuretano
boa retenção celular porém
alto índice de células livres
 Alginato
maior retenção de células e
pouco desprendimento celular
Melhores condições de imobilização:
- Concentração de alginato: 3%
- Concentração celular: 2%
- Diâmetro das esferas: 3 mm
Condições: 30 ºC/ 1 v.v.m/ pH = 7,0/ F. agit. 300 e 500 rpm
Vol. Útil : 2,4 L ( 0,6 L gel/1,8 L meio)
 Ensaios Realizados
SI - 500 - células imobilizadas
- freq. de agitação= 500 rpm; T = 30 ºC, aeração = 1 vvm

SL - 500 - células livres

- freq. de agitação= 500 rpm; T = 30 ºC, aeração = 1

SI - 300 - células imobilizadas

- freq. de agitação= 300 rpm; T = 30 ºC, aeração = 1
 SI-500 SL-500

Xlivres(2) Ximob(2) S(2) Xlivres(1) X S ABS

S(1) Ximob(1) ABS(2) ABS(1)
26 1,2 12 1,6
24
1,4
10
Xlivres (g/L), Ximob (g/Lgel),

22 1
20 1,2
18 0,8 8

ABS(547nm)
16 1,0
S(g/L)

14
0,6 6 0,8
12
10 0,6
8 0,4 4
6 0,4
4 0,2 2
0,2
2
0 0 0 0,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tem po (horas) Tem po (horas)

Yx/s Yp/s
Mip (h-1) Mix máx (h-1)
(gsub./gret)
(gsbs/gcel)
Imobilizado 0,56 0,29 0,011 0,09
Livres 0,53 0,40 0,018 0,013
 X (SI-300-gel) X (SI-300-meio)
X (SI-500-gel) X (SI-500-meio)

20

15 SI-500
X (g/L)
10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo (horas)

S (SI-300) S (SI-500) ABS (SI-300) ABS (SI-500)

12 1,2

10 1
SI-300

ABS (547nm)
8 0,8
S (g/L)

6 0,6

4 0,4

2 0,2

0 0
0 20 40 60 80 100
Tempo (horas)
 SI-300
100 20

90
SI-300 18
OD
80 16
X
70 14

60 12

X (g/L gel)
OD (%)

50 10

40 8

30 6

20 4

10 2

0 0
0 20 40 60 80 100

Tempo (horas)
 Conclusões Parciais

- Comparando-se os ensaio com células livres e

imobilizadas, obteve-se maiores valores de produção em
retamicina no ensaio com células livres, porém deve-se
lembrar da possibilidade de realização em bateladas
repetidas com as células imobilizadas;

- Comparando-se os ensaios com diferentes freqüências de

agitação observou-se que possivelmente a menor freqüência
de agitação levou a uma menor transferência de oxigênio no
meio e por isso, provavelmente, a produção foi afetada.