Staphylococcus Antonio Carlos Pignatari

Staphylococcus
Dra. Elsa Masae Mamizuka

USP
Dr. Antônio Carlos Pignatari
Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia -
LEMC
Introdução a cocos Gram-positivos
Características do Gênero Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Enzimas Extracelulares
Testes de aglutinação rápida para coagulase
Padrões de Hemólise
Regulação de Fatores de Virulência
Staphylococcus epidermidis
Outras espécies de Staphylococcus
Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica
Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus
Staphylococcus saprophyticus
Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina
Resistência aos Antibióticos
Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA
Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina)
Resistência à Vancomicina
Detecção da VISA/VRSA
Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma
índice
Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um

grupo de grande importância clínica. São
responsáveis por inúmeras e variadas
afecções e síndromes.
Os CG+ anaeróbios facultativos de

importância clínica pertencem a uma de
duas famílias:
Micrococcaceae ou Streptococcaceae
Pesquisa de catalase na bactéria

A partir da caracterização da amostra como

CG+ através da coloração de Gram, a
determinação da família é feita pela prova da
catalase.
A prova da catalase consiste em colocar

uma amostra de bactéria em contato com o
peróxido de hidrogênio, e pesquisar a
formação de bolhas de oxigênio.
catalase
2H2O2 2H2O + O2
+ -
Micrococcaceae Streptococcaceae
As bactérias desta família são As bactérias desta família são
catalase POSITIVAS catalase NEGATIVAS
Características do Gênero
Staphylococcus
Esta estrutura
característica lembra
cachos de uva.
Staphylococcus
As sp mais importantes na clínica
S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis

S. schleiferi S. simulans S. capitis
S. sciuri S. cohnii S. warnei
S. lentus S. xylosus S.saccharolyt.
S. caseolyticus S. saprophyticus S. caprae
S. hyicus S. gallinarium S. hominis
S. chromogenes S. kloosii S. haemolyticus
S. intermedius S. equorum S. auricularis
S. delphini S. arlettae S. aureus
Staphylococcus
As mais importantes no laboratório clínico são:

S. lentus S. xylosus S.saccharolyt.
S. caseolyticus S. saprophyticus S. caprae
S. hyicus S. gallinarium S. hominis
S. chromogenes S. kloosii S. haemolyticus
S. intermedius S. equorum S. auricularis
S. delphini S. arlettae S. aureus
De todas as espécies do gênero, o S.

aureus é o mais importante. É responsável
pelo segundo maior número de infecções
em seres humanos.
O S.aureus está presente no trato

respiratório superior, especialmente nas
narinas, de aproximadamente 60% da
população em geral, e assim permanece
sem causar doença em condições normais.
Staphylococcus
O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies:

S. xylosus S.saccharolyt.
S. lentus
S. caprae
S. caseolyticus S. saprophyticus
S. hominis
S. hyicus S. gallinarium
S. haemolyticus
S. chromogenes S. kloosii
S. auricularis
S. intermedius S. equorum S. aureus
S. delphini S. arlettae
O nome “aureus” significa

“dourado” em latim, qualidade
atribuída ao pigmento amarelado
característico produzido pela
bactéria.
Enzimas Extracelulares
A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de

coagulase é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um
critério para a identificação de uma amostra como pertencente à
espécie.
coagulase
Fibrinogênio Fibrina
protrombina
Estafilotrombina
Causa coagulação
Fatores de Virulência do Staphylos
Staphylos não é o único que produz coagulase
No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A

bactéria em questão é inoculada num tubo com plasma de coelho.
Se o plasma coagular, a espécie é S. aureus.
Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

Proteína A (SpA)
Tem a habilidade de se ligar à porção
FC de IgG, impedindo, portanto que ela
sirva de fator de opsonização na
fagocitose. Fab Fab
IgG
Fc
SpA (Atn)
S. aureus
Testes de aglutinação rápida
para coagulase
• Testa a presença de proteina A e fator de coagulação

(clamping factor)
• Fornece resultado + em 5 a 20 seg.
• Mostra correlação de 80% com mét.classico
• preço e mbalagem com 150un. U$116.00
• Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping

factor e protein A associado à Staphylococcus aureus
• Resultado em 60 seg
• Sensibilidade/especificidade: 99/92%
• Inclui partícula de latex , cartão p/teste, haste, e controles
positivo e negativo
• Preço: embalagem de 105 um. U$ 105.62
• Validade 18 meses
Padrões de Hemólise
esverdeado
Regulação de Fatores
de Virulência
Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são

expressados a toda hora, são dependentes da fase de crescimento
da bactéria.
 Proteína A  alimento
 adesinas
no de células  coagulase
Taxa estacionária
 hemolisinas
Toxinas
 Alimento em abundância
 Proteína A
 adesinas
 coagulase
 hemolisinas
 toxinas
tempo
A segunda espécie mais importante

do gênero Staphylococcus é o
Staphylococcus epidermidis.
O Staphylococcus epidermidis faz

parte da flora normal da pele e da
mucosa de seres humanos e
animais superiores.
Importante na infecção hospitalar

O Staphylococcus epidermidis é uma espécie bem menos

virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de
coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito
tímida de certas enzimas proteolíticas.
Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser

patogênico. Esta espécie tem muitos fatores de adesão e
forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que
fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses,
stents, etc.).
O Staphylococcus epidermidis é um risco para pacientes

imunocomprometidos e para usuários de drogas
intravenosas, podendo causar endocardite e infecções
generalizadas não-piogênicas.
Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia,

endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais
com prótese.
Outras espécies de
Staphylococcus
No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação

entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e
Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).
Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são

subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não
saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à
novobiocina.
Outras espécies de
Staphylococcus
No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre

Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e
Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).
Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são

subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não
saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.
Identificação simplificada dos cocos Gram
positivo de importância clínica
Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade

Estrito
Staphylococcus + neg + neg não não

Planococcus + + + neg + variável
Micrococcus + neg + + variável variável
Enterococcus neg variável + neg não não
Streptococcus neg neg variável neg não não
Aerococcus neg neg + neg não +
Stomatococcus * variável neg neg neg não variável
* aderente ao meio
Chave Geral para a
Identificação de Staphylococcus
Coco GRAM +
Streptococcaceae catalase
- +
Micrococcaceae
Sensível à
novobiocina? - DNAse
+
Staphylococcus sp.
+ Coagulase
Staphylococcus - Staphylococcus
+
não saprophyticus aureus
Staphylococcus grupo saprophyticus

Outras espécies de
Staphylococcus
No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação

entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus)
e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).
Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse

são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não
saprophyticus, baseado na sua sensibilidade à
novobiocina.
Chave Geral para a
Identificação de Staphylococcus
Espécies de Staphylococcus Espécies de Staphylococcus

do gruponão saprophyticus do grupo saprophyticus
(Grupo epidermidis)
S. epidermidis S. saprophyticus
S. haemolyticus S. cohnii
S. hominis S. xylosus
S. capitis
S. warneri
Staphylococcus saprophyticus
O Staphylococcus saprophyticus é de interesse clínico pois

frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente
em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e
pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.
As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico

causam infecções parecidas com o S. epidermidis, e o
tratamento é igual. Logo, o mais importante é discriminar o
Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do
Staphylococcus coagulase negativa.
Detecção de resistência
de Staphylococcus aureus
à oxacilina e ou vancomicina
A primeira vez que um

antibiótico foi usado,
clinicamente, foi contra uma
infecção por Staphylococcus
aureus.
Sir Alexander Fleming

A penicilina funcionou bem

contra infecções estafilocócicas
até os anos 60, quando
rapidamente começaram a surgir
cepas resistentes à penicilina.
Para contornar o problema, foi criado

o beta-lactâmico sintético meticilina,
que era resistente à ação das beta- Anel b-lactâmico
lactamases.
meticilina
A meticilina funcionou bem até os anos

70, quando começaram a surgir as
cepas resistentes a meticilina (MRSA).
meticilina
Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da

parede celular chamadas PBPs (Proteínas Ligadoras de Penicilina). O MRSA
desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP é
plenamente funcional mas não tem afinidade por beta-lactâmicos.
penicilina
PBP2a
Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são

resistentes não só à penicilina, mas a todos os antibióticos beta-
lactâmicos!
No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a

todos os beta lactâmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas às
vezes são suscetíveis = ocorre apenas “in vitro”) quando a amostra for
MRSA mesmo quando são sensíveis a alguns beta lactâmicos in
vitro.
A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num

elemento genético móvel chamado de Cassete Cromossômico
Estafilocócico mec (SCCmec).
resistente à oxacilina-ORSA
CIM meticilina
Nivel de Freq de
Modalidade mecA PBP2a bla
expressão Maioria Subp-R Subp-R
Borderline-
Baixo - - +++ 8 - -
BORSA
MOD-SA Baxo - PBP 1,3,4 + 8 - -
Heterogênea Baixo + + + 1,5-3 200 107
Heterogênea Medio + + + 6-12 400 10-5
Heterogênea Alto + + + 10-200 800 103
Homogênea Alto + + +/- 800 800 1
b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente.

Métodos laboratoriais
para a detecção da resistência à
oxaclina ( meticilina)
Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar a

técnica de disco difusão em ágar (Kirby-Bauer).
Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de

oxacilina que é ágar Müller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentração de
oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colônias
indica resistência a oxacilina.
Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método

de macrodiluição em caldo deve ser feito com caldo Müller-Hinton com uma
concentração final de 4% de NaCl.
Métodos laboratoriais
para a detecção da resistência à
oxacilina ( meticilina)
O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina é uma
alternativa válida em casos de dúvida, com uma eficácia diagnóstica
praticamente similar ao do método de referência de dilução em ágar hiper
salino, a concentração crítica de 6 µg/ml de oxacilina (NCCLS,1997).
Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem

sensibilidade, especificidade e eficácia suficientes para a detecção deste
tipo de cepas, quando comparado aos métodos de referência (Sánchez,
1998),
Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável

em rotina, é a detecção do gene mecA, por métodos de amplificação por
PCR (Murakami et al., 1991). Este método teria a vantagem de não estar
sujeito às condições do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em
grande número de isolados, empregado em casos de dúvida com valores
de CIM próximo do limite.
O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcus aureus

ainda não foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre
em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.
Em S. aureus, ocorrem fenômenos bizarros e pouco ortodoxos em

relação à resistência à vancomicina. Primeiramente, a morfologia das
colônias de VRSA é heterogênea, dando a impressão de contaminação.
VSSA VRSA VRSA

VSSA
VRSA
VRSA
Em 1997, foi relatada no Japão, a primeira

cepa clínica de Staphylococcus aureus
resistente à vancomicina (VRSA), pelo
Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade
Juntendo em Tóquio.
Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus

resistentes à vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referência de
queimados.
Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001.
ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS

WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN
Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm;
Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu,
Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD
Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and
Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and
Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui,
and Hiramatsu)
Outro fenômeno comum à oxacilina e a vancomincina é a ocorrência

da resistência heterogênea (hetero-resistência) de S. aureus a estes
antibióticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de
vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo
consideradas sensíveis por métodos tradicionais de avaliação
sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas
podem conter subpopulações de células que apresentam um MIC 
8g/mL, numa freqüência de 1:106 células. Estas células não são
detectadas por métodos tradicionais (antibiograma e MIC).
A única forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA é através de uma

análise de populações, onde se inocula diferentes diluições de uma
suspensão bacteriana em meio de cultura sóilido adicionado de
concentrações crescentes de vancomicina.
Quando o resultado é plotado num gráfico obtém-se três

possibilidades distintas de curva:
VRSA
hetero-
VRSA
VSSA
Sensível à Vancomicina
Observou-se também, por morfometria, que enquanto as cepas sensíveis à

vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA
apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA
e VSSA
Parece portanto, que a resistência à vancomicina está ligada a uma

exacerbação da síntese da parede celular, em que inúmeros genes
regulatórios estariam envolvidos.
Até agora, todavia, ninguém parece saber por certo quais genes
estão envolvidos e até que ponto. Uma das grandes limitações no
estudo do mecanismo de resistência à vancomicina em S. aureus é
que a emergência da resistência é um fenômeno ainda raro. Existem
ainda poucas cepas no Mundo atualmente
Pelo laboratório
de referência
Resistência a Macrolídeos
Os macrolídeos são antibióticos de primeira escolha só para Streptococcus

pneumoniae, dentre os Gram positivos.
Os macrolídeos utilizados na clínica são:
•Eritromicina Único macrolídeo

• Claritromicina disponível por 40
• Azitromicina anos!!
O lançamento dos novos macrolídeos recentemente aumentou o uso

destas drogas.
Os macrolídeos são
inibidores da síntese
protéica bacteriana. Os
ribossomos bacterianos
têm duas subunidades:
30S e 50S.
aa
Os macrolídeos têm
afinidade pela
subunidade 50S do
mRNA ribossoma bacteriano.
tRNA ribossoma
Os macrolídeos interferem na síntese de proteínas por bloquear o

sítio ativo do ribossoma por impedimento estérico.
A resistência aos macrolídeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A

bactéria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macrolídeos. A metilação
é feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene é denominado erm
[Erythomycin Ribosome Methilation].
Os genes erm geralmente estão localizados em elementos genéticos

móveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns
destes transposons residem em plasmídios.
Os genes erm muitas vezes estão associados à presença de genes que

conferem resistência à tetraciclina (genes tet).
As lincosamidas (clindamicina)
e as estreptograminas têm o mesmo alvo (50S
rRNA) que é modificado pelos genes erm.
Estes antibióticos são denominados como pertencentes ao grupo MLS

Os genes erm conferem resistência tanto à eritromicina quanto à

clindamicina. Mas a resistência à clindamicina só é detectada in vitro com
a indução por eritromicina. Eritromicina
(bom indutor)
Clindamicina
(mal indutor)
erm- erm+
Achatamento
do Halo
Relação de drogas testadas para
Staphylococcus aureus e relatadas no
antibiograma
• Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, não

testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso
resultados sensíveis podem ocorrer.
• S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e não precisam ser testados

pois dificilmente apresentam resistência à SMXTMP, quinolonas e
nitrofurantoína, (drogas de escolha).
• Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensíveis à penicilina são

sensíveis a todos os beta-lactâmicos. Testar pelo disco de penicilina e não
de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimétrico,
iodométrico ou da cefalosporina cromogênica(nitrocefin) considerar resistente
a ampicilina e penicilina.
• Staphylococcus resistente a penicilina é produtor de penicilinase e é

resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e
ticarcilina. A associação de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato
e tazobactam só terão atividade para os estafilococos oxacilina-sensíveis.
Relação de drogas testadas para
Staphylococcus aureus e relatadas no
antibiograma
• Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes

oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina
com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem
inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem
inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4ª , Aztreonam( droga sem atividade
contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e
ertapenem)
• Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem

testes de
aglutinação específicos para detectar este gene.
• Staphylococcus spp podem desenvolver resistência durante a terapia com

quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e não
repetir o antibiograma anterior.
• Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se

testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratório de referência.
Prevalência de resistência
Prevalência de resistência

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Dra. Elsa Masae Mamizuka

Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um

Os CG+ anaeróbios facultativos de

Pesquisa de catalase na bactéria

A partir da caracterização da amostra como

A prova da catalase consiste em colocar

As sp mais importantes na clínica

S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis

As mais importantes no laboratório clínico são:

S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis

De todas as espécies do gênero, o S.

O S.aureus está presente no trato

O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies:

S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis

O nome “aureus” significa

A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de

No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A

Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

• Testa a presença de proteina A e fator de coagulação

• Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping

Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são

A segunda espécie mais importante

O Staphylococcus epidermidis faz

Importante na infecção hospitalar

O Staphylococcus epidermidis é uma espécie bem menos

Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser

O Staphylococcus epidermidis é um risco para pacientes

Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia,

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são

Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade

Staphylococcus + neg + neg não não

Staphylococcus grupo saprophyticus

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse

Espécies de Staphylococcus Espécies de Staphylococcus

O Staphylococcus saprophyticus é de interesse clínico pois

As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico

A primeira vez que um

Sir Alexander Fleming

A penicilina funcionou bem

Para contornar o problema, foi criado

A meticilina funcionou bem até os anos

Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da

Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são

No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a

A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num

MOD-SA Baxo - PBP 1,3,4 + 8 - -

Heterogênea Baixo + + + 1,5-3 200 107

Heterogênea Medio + + + 6-12 400 10-5

Heterogênea Alto + + + 10-200 800 103

Homogênea Alto + + +/- 800 800 1

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente.

Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar a

Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de

Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método

Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem

Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável

O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcus aureus