CENTRO UNIVERSITÁRIO ESTÁCIO DE

BELO HORIZONTE-FLORESTA

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Profª: Valéria dos Santos Carvalho

E-mail: valeria.dsantos@estacio.br
Princípios das Técnicas Analíticas

- Fotometria.
- Espectrometria.
- Eletroforese
- Turbidimetria.
Princípios das Técnicas Analíticas

• Conhecimento das técnicas e seus princípios

(fundamentos), funcionamento dos equipamentos;
• Resolução de problemas e melhor interpretação dos
dados.
• Todos os laboratórios tem o mesmo tipo de
aparelho???
 FOTOMETRIA
A fotometria depende da medição da luz por um fotodetector.
• A luz pode ser absorvida por uma substância dissolvida em solução (absorção), é a
forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução.

Substâncias absorvem luz em determinados comprimentos de onda.

• Muitas determinações realizadas no laboratório clínico são baseadas em fotometria.

FOTOMETRIA
 FOTOMETRIA
Pode ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a
concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada
pelos diversos comprimentos de onda (λ, expressos em µm ou nm) e que apresenta a propriedade
de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera
dos átomos constituintes das moléculas.
 LEIS DA FOTOMETRIA
A Lei de Lambert-Beer:
A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o
comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores.
 LEIS DA FOTOMETRIA

Quantidade de Luz absorvida pela amostra! Está é proporcional a concentração de solutos

dissolvidos na amostra.
 LEIS DA FOTOMETRIA

Quantidade de Luz transmitida (passou pela amostra)

 FOTOMETRIA
LUZ ABSORVIDA
(0-1)

Se aumento a transmitância eu diminuo a absorbância

Se aumento a absorbância eu diminuo a Transmitância
 FOTOMETRIA
LUZ ABSORVIDA

Se a luz passar por uma solução onde não há absorção nenhuma a absorbância será zero.
 LEIS DA FOTOMETRIA

2 fatores que irão interferir na quantidade de luz que irá passar:

1- Espessura da solução (cubeta) e
2-Concentração/ intensidade da cor
 FOTOMETRIA
Concentração

Menos Mais
Concentrada Concentrada
 FOTOMETRIA
Concentração
 FOTOMETRIA
Espessura da solução (cubeta)
FOTOMETRIA
Um fotômetro isola um comprimento de onda
específico de luz usando filtros.

Comprimento de onda 365 nm / 450 nm /

595 nm

340-1000nm
Na Lei de Lambert-Beer:
a) ( ) A absorbância é proporcional à concentração da espécie química
absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura
atravessada pelo feixe luminoso.
b) ( ) Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e
concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e
concentração.
c) ( ) A absorbância é proporcional ao comprimento de onda.
d) ( ) a e b estão corretas.
e) ( ) Nenhuma das alternativas está correta
 ESPECTROMETRIA
A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de
onda entre o ultravioleta e o infravermelho;
• As substâncias químicas possuem absorção de luz específica;
 ESPECTROMETRIA
• A luz se propaga na forma de ondas e a diferença entre dois intervalos de
ondas é chamado de comprimento de onda .
Ultravioleta Infravermelho
 ESPECTROMETRIA
• RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA: é a radiação de freqüência mais alta do que a da luz violeta. Seu
comprimento de onda é inferior a 380 nm. NÃO É VISÍVEL a olho nú !
• RADIAÇÃO INFRAVERMELHA: é a radiação que conhecemos como calor, tem uma
freqüência mais baixa e um comprimento de onda maior do que a luz vermelha. Seu
comprimento de onda é maior do que 780 nm. NÃO É VISÍVEL a olho nú !
• RADIAÇÃO VISÍVEL: é aquela que os nossos olhos enxergam, ou seja, corresponde a
radiação eletromagnética com comprimentos de onda no intervalo de 380 à 780 nm.
Medidas espectro. É VISÍVEL a olho nú
 ESPECTROMETRIA
• Quando a reação é colorimétrica existe a formação
de “cor”!
 ESPECTROMETRIA
• Cada região equivale uma a cor de luz absorvida e uma cor de luz
resultante.
Mistura de todas as cores é uma luz branca !

O branco é a mistura de todas as frequências. Para comprovar, basta focalizar

fachos de luz coloridos sobre um mesmo ponto, numa folha branca.
ESPECTROMETRIA
 ESPECTROMETRIA
Mistura de Todas: Branco
Mistura de todas menos azul: AMARELO

Resultante

Lembre-se :
tinta não é o mesmo
que um facho de luz. A cor-luz
ou cor-energia é toda cor
formada pela emissão direta
de luz.

A LUZ QUE ELA ABSORVE É A COR

COMPLEMENTAR A ELA
Glicose (505nm)

Cálcio (570nm)

Albumina (630nm)
ESPECTROMETRIA

Um
comprimento
de onda
especifico
ESPECTROMETRIA
ESPECTROMETRIA

Espectrofotômetros são diferentes de fotômetros,

pois estes permitem a medição no espectro de todos
os comprimentos de onda de luz visíveis e não
apenas ondas pré-especificadas
 Em espectrofotometria na região do visível deve-se operar com
filtros cuja cor seja:

a) Igual a da solução colorida a ser analisada.

b) Complementar da solução colorida a ser analisada.
c) A que gere o menor valor para a absortividade do cromóforo.
d) Proporcional à intensidade luminosa da fonte.
e) Proporcional à concentração do cromóforo e ao caminho ótico.
 TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA
• A Turbidimetria e a Nefolometria são métodos analíticos inversos mas que
são utilizados juntos.
-Dependendo da concentração e da turbidez da amostra, parte da luz que é
incidida é dispersada.

TURDIBIMETRIA NEFELOMETRIA
Mensurar a luz dispersada
Mensurar a luz incidida
 TURBIDEZ
TURBIDEZ: Redução da transparência de uma amostra devido a presença de
partículas em suspensão que interferem a passagem de luz pelo fluido.

Quanto mais turva é a amostra mais concentrada é esta.

Existe uma “Turvação” visual que pode ser mensurada pelo método de
TURBIDIMETRIA
 TURBIDEZ
O QUE CAUSOU ESSA TURVAÇÃO NESTA
AMOSTRA ??

Partículas sólidas em suspensão. Quando a luz atravessa o meio ela

acaba sendo desviada pelas partículas em suspensão, presentes .

É necessário mensurar a turbidez e a luz dispensada (nefelometria).

 NTU
NTU (unidade de turbidez nefelométrica) é a unidade de medição, que
caracteriza a turbidez.
Quanto mais turva for a amostra, maior será seu NTU

(Potável)

turbidímetro.
 TURBIDIMETRIA
• Mede a luz não dispersada (a luz que passou) determinando a turbidez da
amostra.
• É um método bem sensível e pode medir a absorbância.

Luz que consegue

atravessar a
cubeta para
detecção

Fonte luminosa incidida

sobre a amostra
Quanto menor a incidência da
Partículas em suspensão luz (luz que atravessou) maior
(ex: proteína). a concentração/turvação da
minha análise.
 NEFELOMETRIA

• É um método bem mais sensível pois mede a luz dispersada (inverso da

turbidimetria) em ângulos entre 45 a 90 graus.

Luz dispersada

Quanto maior a dispersão

maior a
Luz dispensada
concentração/turvação da
minha análise.
 Turbidimetria X Nefelometria

Aumenta a
sensibilidade do
método
 IMPORTANTE

• A intensidade de luz emitida e captada varia de acordo com o número,

tamanho e forma das partículas da amostra.
• É utilizada uma solução padrão de formazina (zera o aparelho e gera
curva de calibração).
 IMPORTANTE

• Curvas de calibração: é necessário que o aparelho seja calibrado e

preparado antes de ser utilizado para que não ocorra erros analíticos.
• As curvas oferecem valores de referência para serem analisados e
comparados.
 Aplicações

- Dosagem de proteínas em fluidos;

- Proteína C reativa;
- Imunoglobulinas (proteínas que compõe o plasma);
- Antígeno-Anticorpo (Imunoturbidimetria)
- Apolipoproteínas (diagnóstico/lipidograma-risco cardíaco);.