AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Preparação, caracterização e estudo antimicrobiano de hidrogel

impregnado com neomicina para tratamento de infecções tópicas

Discente: Angélica Tamião Zafalon

Orientadora: Duclerc Fernandes Parra

São Paulo
2018
1
• INTRODUÇÃO

• MATERIAIS E MÉTODOS
SERÃO
• RESULTADOS E DISCUSSÃO APRESENTADOS
JUNTOS

• TRABALHOS FUTUROS

• CONCLUSÃO

• REFERÊNCIAS

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INTRODUÇÃO
Infecções em feridas crônicas são consideradas um problema
de saúde pública e abrange pacientes do mundo todo.
• Baixa perfusão sanguinea
• Associação tratamento sistêmico e tópico
NOVAS ESTRATÉGIAS E
AGENTES ALTERNATIVOS
PARA O TRATAMENTO
DESSAS INFECÇÕES

ANTIBÓTICOS Biofilme
Resistência Bacteriana

Hidrogeis como um sistema de

liberação de drogas

3
INTRODUÇÃO
Hidrogel é uma estrutura tridimensional insolúvel, com
consistência elástica, formada por polímeros reticulados e
com alta capacidade de absorver água
RETICULAÇÃO DE POLÍMEROS
OBTIDOS POR VÁRIOS MÉTODOS,
ENTRE ELES:
Poli (N-vinil-2-pirrolidona) (PVP) é um
polímero sintético utilizado para obter
hidrogéis com características específicas,
principalmente para desenvolvimento de
sistema de liberação de drogas.

Emprego de hidrogel como curativo: liberação do

fármaco de forma localizada e controlada; Reduz
toxicidade; Diminui resistência bacteriana; Diminui
4
odor; Facilidade de aplicação
OBJETIVO / ORIGINALIDADE

Desenvolver e caracterizar uma membrana a base de PVP, polietilenoglicol

(PEG), ágar e neomicina por processo de radiação ionizante de fonte gama,
como um sistema de liberação de drogas para o tratamento tópico de
infecções
RDC 44/11:Dispõe sobre o controle de medicamentos à base
de substâncias classificadas como antimicrobianos, de uso
sob prescrição, isoladas ou em associação

• Sem induzir a lesão

TESTE “IN VIVO” • Facilidade de manejo
• Tratamento de
pododermatite

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MATERIAIS
Materiais
PVP
• PVP (Exodo científica),

• Polietilenoglicol PEG 300 (Oxiteno),

• Ágar (Oxoid),

• Água deionizada,

• Neomicina (Sigma Aldreich),

• Bacterias P. aeruginosa e S. aureus

• Meio de cultura Muller Hinton

• Modelo animal
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PREPARAÇÃO E SÍNTESE DAS MEMBRANAS

As membranas apresentaram-se
após o processo de irradiação,
estrutura tridimensional insolúvel,
(CTR); Doses de transparente, com elasticidade e
15, 20, 25, 30 e
40 kGy maciez adequados para a
aplicação em curativos.

Sendo assim, pode-se inferir que as

concentrações das matérias primas, a técnica
de preparo e a dose empregada foram
Hidrogel após irradiação
adequadas para a obtenção do hidrogel com as
características desejáveis.

7
RESULTADO DO INTUMESCIMENTO
As membranas apresentaram alta velocidade de
intumescimento nas 8 primeiras horas de imersão,
pois a água pode penetrar facilmente no retículo
do polímero. Após 24 horas de imersão em água,
as membranas apresentaram leve alteração no
Água destilada intumescimento. O maior intumescimento foi
alcançado com a dose de 15 kGy. O pico máximo
atingido em 72 h foi 19% maior em água marinha.
A água marinha foi utilizada para o teste de
intumescimento pois os testes “in vivo” do
hidrogel foram realizado com pinguins, animais
silvestre com hábito marinho.

Água marinha
8
RESULTADO DE FRAÇÃO GEL

Ebulição em água destilada por 6h

A fração gel é diretamente influenciada pela concentração do

polímero, dose de irradiação e presença de agente
plastificante
9
RESULTADO DA ANÁLISE DA NEOMICINA EM HPLC-MS/MS

• Solução de 1000 μg mL-1 de sulfato de neomicina foi

introduzida no sistema MS/MS
• Fase móvel: água, acetonitrila e ácido fórmico
• Fluxo 250 μg mL-1
• Tempo de retenção 3 min
• Varredura dos íons 250 a 620 m/z
Uma solução de 1000 μg mL−1 de
sulfato de neomicina foi introduzida
3,0x10
293 4 +MS (615.40) CE(20): Neomicina (Turbo Spray)
no sistema MS-MS no modo full
2,5x10
4 scan positivo para determinar a
fragmentação.
Inte ns idade

4
2,0x10
323
4
O pico de 612,3 m/z foi atribuído
1,5x10
como o íon precursor protonado
4
1,0x10 [M+H]+ e como íon fragmento
5,0x10 259 277
3
455 foram obtidos 5 picos: 259, 277,
0,0 293, 323 e 455 m/z.
240 300 360 420 480 540 600

m/z, Da
10
RESULTADO ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO GAMA NA
ESTABILIDADE DA NEOMICINA HPLC-MS/MS
Solução de neomicina
1000 μg mL-1

Não irradiada
Irradiada em pó
Álcool isopropílico
Manitol
PEG

As amostras de neomicina irradiadas em

solução aquosa na presença de PEG e álcool
isopropílico apresentaram uma redução da
intensidade de 9,01 e 16,17%,
respectivamente.

Esses resultados indicam que o PEG e o álcool apresentaram efeito protetor da

neomicina frente aos radicais livres produzidos pela radiação.
11
MATERIAIS E MÉTODOS
Termogravimetria
(TGA)
Amostras PVP, PEG, ágar,
neomicina, hidrogel.
Taxa de aquecimento 10 °C
min -1, de 25 a 600 °C, sob
fluxo de N2
Espectrometria de
infravermelho (FTIR)
Pastilhas de Brometo
de Potássio (KBr)
Faixa do espectro de
4000 a 400 cm-1
12
RESULTADOS Termicamente mais
resistente

TGA/DTG Perda de água

• Estabilidade térmica do
PVP
• 3 estágios de perda de
massa: perda de água,
decomposição do PEG
e ágar e degradação do
PVP
13
RESULTADO DO EFEITO DA RADIAÇÃO NA ESTABILIDADE TÉRMICA
DA NEOMICINA

DSC neomicina

Observa-se dois picos de fusão

Isômero C Isômero B
cristalina, ilustrando os isômeros
B e C.
Pode-se infrir que não houve
degradação estrutural da
neomicina depois da irradiação,
considerando que não houve
mudanças consideráveis nas Curva de DSC da neomicina irradiada e não
temperaturas de fusões. irradiada

14
RESULTADOS

TGA/DTG
Estável até
Perfis das curvas 185°C

de TGA/DTGA do
hidrogel, neomicina e
hidrogel/neomicina.
Observa-se no
hidrogel/neomicina que o
início do segundo evento
térmico foi deslocado
para a esquerda,
indicando a presença da
15
neomicina
RESULTADO FTIR

Atribuidos a
OH presentes
na neomicina,
PVP e
hidrogel.

PVP
• 1652 cm-1 estiramento C=O
• 1286 cm -1 estiramento
Neomicina
• 3240 cm-1 estiramento O-H conjugado com estiramento N-N e
estiramento C-H aromático.
• 2017 cm-1 derivado do NH3+
• 1341 cm-1 estiramento C-N,
• 1075 cm-1 estiramento C-O
• 1530 cm-1 estiramento –C-C

J. Appl. Sol. Chem. Model , 2, 136-144, 2013.

16
MATERIAIS E MÉTODOS

Liberação do fármaco

37 °C sob agitação de 80 rpm Liberação de neomicina “in vitro”

17
RESULTADO ESTUDO DA LIBERAÇÃO DE NEOMICINA “IN VITRO”

• Rápida liberação de
neomicina nas
primeiras 8 horas de
experimento, atingindo
o máximo em 8 horas
e permanecendo
estável até 48 horas.
• Para o hidrogel ser utilizado como um sistema de liberação controlada, a
concentração do fármaco precisa ficar constante no decorrer do tempo e
assim evitar a troca diária do curativo.
18
RESULTADO DE CITOTOXICIDADE

Os testes foram realizados

“in vitro” empregando-se o
método de incorporação do
vermelho neutro, de acordo
com o método proposto nas
normas ISO 10993-1, 10993-
5 e Rogero, 2003.

A curva de viabilidade celular

do hidrogel apresentou
comportamento semelhante a curva de controle (-), não causando a morte ou
prejuízo as células, caracterizando como atóxico quando em contato com a
cultura de células, 19
RESULTADOS DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS

O controle negativo (hidrogel sem neomicina) não exibiu halo de inibição,

indicando que a formulação de hidrogel não possui efeito bactericida. O
hidrogel obteve um halo contra S. aureus de 16 ± 2 mm, enquanto o diâmetro
contra P. aeruginosa foi um pouco maior, com valor de 21 ± 1 mm

20
 RESULTADOS DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS

S. aureus

A capacidade de liberação controlada por

hidrogel foi testada por halo de inibição. Os
discos de hidrogeis foram removidos a cada 24
h e transferidos para novas placas de Petri
contendo P. aeruginosa e S. aureus.
P. aeruginosa

Os diâmetros de halos de inibição foram fotografados e estão descritos na Fig.

12 e 13. O diâmetro da halo de inibição na placa com P. aeruginosa diminuiu
30% após a terceira mudança e não foi obeservado halo pós a quarta placa. O
teste realizado contra S. aureus apresentou halo apenas na primeira placa.

21
RESULTADO CURVA DE MORTE

As cinéticas das curvas de mortes foram acompanhadas por 24h e a atividade

bactericida do hidrogel/neomicina contra as espécies bacterianas apresentou
evidente redução de 3 log em 2 horas de teste. O hidrogel sem neomicina foi
utilizado como controle positivo, indicando mais uma vez que a formulação não
possui efeito biocida. 22
 RESULTADOS DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS

A formação de biofilmes ocorreu nas lâminas de interface ar-líquido, em diferentes

estágios, que inclui desde a célula de inserção iniciada até a maturação e
crescimento do biofilme da comunidade dimensional. O processo de fixação e
formação de biofilme aumentou com o tempo. Pode observar uma densidade de
biomassa moderada após 48 horas de incubação, seguido pela intensa produção de
23
biofilme às 72h.
 RESULTADO TRATAMENTO DO BIOFILME
A técnica de placas de 96 poços foi empregada para avaliar a eficácia do tratamento do
biofilme pela neomicina liberada do hidrogel. O biofilme foi tratado com 100 μl da solução
de neomicina por 24 h e a DO a 540 nm foi mensurada e descrita da TAB.4.
Cepas Sem tratamento Após tratamento
P. ae ruginosa 1,530 ± 0,015 0,189 ± 0,02
S . aure us 1,342 ± 0,025 0,094 ± 0,018

a) biofilme não b) biofilme tratado c) controle negativo

tratado com hidrogel;

O hidrogel diminuiu a formação de biofilmes formado por P. aeruginosa em 87,6%,

enquanto que o biofilme de S. aureus foi mais sensível, com redução de 92,0%
24
RESULTADO PENETRAÇÃO MICROBIANA
O Hidrogel foi testado quanto a sua capacidade de prevenir a penetração
microbiana. Os resultados indicam que não houve turbidez nos tubos de ensaio
selados com hidrogel e mantidos em ambiente aberto durante 30 dias, enquanto
que foi observada alta turbidez no controle positivo como resultado da
contaminação microbiana.
Penetração microbiana
Tempo de Hidrogel Controle positivo Controle negativo
incubação (dias)
1 0,069 ± 0,003 0,066 ± 0,003 Límpido
2 0,068 ± 0,001 0,123 ± 0,003 Límpido
3 0,067 ± 0,003 turbidez Límpido
7 0,068 ± 0,002 turbidez Límpido
10 0,067 ± 0,002 turbidez Límpido
20 0,067 ± 0,001 turbidez Límpido
30 0,065 ± 0,006 turbidez Límpido

Esse teste demonstrou outra vantagem do uso do hidrogel como curativo para
feridas, pois atua como uma barreira contra microorganismos e evita infecções
secundárias que podem retardar o processo de cicatrização

25
RESULTADO DO TESTE “IN VIVO”

• Observou-se a evolução do
tratamento da lesão após 5 dias
de tratamento, as bordas da
lesão apresentaram diminuição
da úlcera e ausência de
reinfecção.
• O hidrogel foi trocado após 5
dias,
• Pode-se observar um alteração
na coloração do hidrogel devido a
absorção de exudato da lesão e
também líquidos provenientes do
ambiente aquático.
26
CONCLUSÃO
• A cinética de intumescimento em água do mar foi importante para
elucidar a capacidade de absorver água e manter sua integridade
quando o hidrogel fosse utilizado em pinguins no teste “in vivo”.
• As análises térmicas indicaram que a neomicina possui estabilidade
térmica quando irradiada em pó e os componentes da formulação
atuaram como radioprotetores do fármaco durante o processo de
irradiação. As curvas obtidas pelo espectroscopia no infravermelho
sinalizaram os picos característicos do PVP e neomicina.
• O hidrogel/neomicina foi classificado como atóxico, sendo assim,
podem ser utilizados ‘in vivo’ como um curativo de liberação tópica de
fármacos sem por em risco a saúde do paciente.

27
 CONCLUSÃO

• A liberação do antibiótico ocorreu de forma rápida nas primeiras

horas e permaneceu constante por 48h. Esse resultado é de
extrema importância para o uso do hidrogel como sistema de
liberação prolongada.
• Os resultados microbiológicos indicaram efeito biocida contra
as bactérias P. aeruginosa e S. aureus.
• Hidrogel/neomicina foi capaz de reduzir o crescimento
microbiológico mesmo quando ele se expressa embebido em
matriz polissacarídica. A ação sobre o biofilme faz do
hidrogel/neomicina uma ferramenta a mais disponível para o
tratamento de feridas crônicas. 28
CONCLUSÃO
• O estudo "in vivo" foi realizado em aves silvestres com o auxílio dos
veterinários dos aquários. Com os resultados apresentados, pode-se
inferir que o hidrogel foi efetivo no tratamento de pododermatite
em pinguins. As lesões regrediram, não houve sinais de
recontaminação das lesões por fezes e urina, fato que contribui para
acelerar o processo de cicatrização. O hidrogel permaneceu
íntegro durante o tempo de aplicação do curativo, sendo
resistente a água e ao peso do animal.
• Por todos os resultados alcançados, o hidrogel com neomicina
pode ser uma alternativa terapêutica para o tratamento de
infecções tópicas e pododermatites..

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TRABALHOS FUTUROS

• Análise de microscopia eletrônica de

varredura (MEV) para verificar lesões nas
membranas das bactérias
• Revisão bibliográfica para elaboração da tese
• Publicação dos resultados

30
 AGRADECIMENTOS
• CAPES
• FAPESP
• CTR
• ICB – Prof. Nilton Lincopan
• Laboratório CEMSA
• Tuskegee University
• Aquários de São Paulo, Santos, Ubatuba e
Santo André.
31