CRIAÇÃO, MANEJO

E EXPERIMENTOS
COM ZEBRAFISH
Lívia Ramos Santiago
Maria Eduarda Jeunon de Oliveira
Orientadora: Rosy Iara Maciel de Azambuja
Ribeiro

Divinópolis, MG
2022
 Introdução
» Zebrafish (Danio rerio) é um pequeno peixe tropical de água doce;

» Popular na aquariofilia, incluindo sua tolerância a grandes variações

ambientais e a facilidade com que pode ser reproduzido e mantido em
cativeiro;

» O Zebrafish é um excelente modelo para a avaliação da toxicidade química

in vivo, triagem de eficácia, estimar a toxicidade e também avaliar a
segurança dos produtos químicos.
NAKAJIMA et al., 2021

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E M P R E S A D E O R G Â N I C O S
» As características do zebrafish os tornam ferramentas desejáveis ​para o
estudo também de patologias humanas.

» O zebrafish tem um genoma totalmente mapeado e uma estrutura

genética semelhante à dos humanos (70%).

» Sugerindo que numerosos genes envolvidos em doenças humanas podem

ser encontrados no genoma do zebrafish.
GOLDSMITH et al., 2012

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E M P R E S A D E O R G Â N I C O S
» O peixe adulto mede em torno de 4-5 cm e apresenta um corpo cilíndrico e
listras horizontais claras e escuras e possui coloração verde na região dorsal.
» Apresentam dimorfismo sexual: os machos são mais afilados e geralmente
dourados na região ventral, as fêmeas são mais prateadas e arredondadas,
principalmente na região ventral, o que é mais evidente no período próximo
da desova.

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 Biotério: Sistema do aquário

» O ciclo diário utilizado é o de 14 horas de luz e 10 horas de escuro.

» Os sistemas de alojamento para o zebrafish são formados por três

componentes principais: os tanques, as estantes e o sistema de tratamento
da água.

» A água utilizada nos aquários: Osmose reversa.

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 Biotério: Alimentação dos peixes

» Existem duas classes de alimentos

para peixes: vivos e processados.

» A alimentação normalmente é
realizada duas vezes ao dia:
- Ração
- Gema cozida (ovo de galinha)
- Artêmias

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Artêmias.
 Biotério: Manutenções e Controle
» Controle da água:

» Controle da temperatura:

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 Biotério: Manutenções e Controle
» Controle da alimentação:

» Manutenção diária:

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 Teste FET (Fish Embryo Acute Toxicity)

» Este teste é projetado para determinar a toxicidade aguda de produtos

químicos em estágios embrionários de peixes.

» O teste de embrião de peixe tem sido sugerido como uma abordagem

alternativa potencial para reduzir o número de testes usando peixes
adultos, uma vez que o embrião do peixe é considerado um estágio de vida.

OECD, 2013

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 Teste FET: Obtenção dos embriões
» Um dia antes do acasalamento é
necessário colocar os peixes em um
aquário de reprodução.

» O aquário para reprodução possui

uma divisória para separar a fêmea do
macho.

» Proporção 1 (fêmea) x 2 (machos)

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» No dia seguinte, antes de ligar a
luz retirar cuidadosamente (para
não estressar os peixes) a
divisória e posteriormente ligar a
luz.

» Aguardar 40 minutos. Durante

esse período, evitar entrar no
local que está o aquário.

» Após aguardar os 40 minutos,

observar no aquário se há a
presença de embriões.
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» Colocar a placa no microscópio invertido, com a objetiva 40x.
» Com o auxílio de uma pipeta de pasteur coletar os embriões viáveis para o
teste de toxicidade e colocá-los na tampa da placa de petri.
» Após a fertilização e o início do ensaio de toxicidade não deve exceder o
prazo de 3hs, se exceder os ovos não são mais viáveis para o teste.
» Para a seleção dos embriões: Período de clivagem do zebrafish

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 Teste FET: Preparação das placas
» É necessário uma placa de 24 poços:

- Controle negativo (água ISO);

- 25 ml da solução NaHCO3 0,75 mM; 25 ml da solução MgSO4 0,5 mM;
25 ml da solução KCl 0,07 mM; 25 ml da solução CaCl2 mM; 900 ml de água
destilada.
- Controle positivo (DCA 4mg/l);
- 3,4 dicloroanilina.
- Cada concentração do composto a ser testado;
- Controle do solvente (DMSO 0,01%).
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Teste FET: Preparação das placas

» Pipetar 1 ml em cada poço.

» É colocado 1 embrião em cada poço.

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» Depois de colocar os embriões é
necessário vedar toda a placa
com papel filme. Posteriormente,
colocá-la na estufa na
temperatura ideal de 26-28º C.

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Teste FET: Analisando as placas (Efeitos tóxicos)

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Teste FET: Analisando as placas (Normal)

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 Teste FET: Interpretação dos resultados

» Antes de realizar as análises estatísticas converter os resultados obtidos

para porcentagem (excel), para facilitar a visualização dos resultados e
também a análise estatísticas.

» Para as análises estatísticas é utilizado o software: GraphPad Prism 8.0.

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» Insira os seus dados:
» É necessário fazer um arquivo para cada alteração observada:

» As análises estatísticas é realizada em cada horário:

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» Vai abrir uma nova aba com os resultados:

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» Depois é só fazer um gráfico conforme a necessidade dos seus resultados:

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Efeito do extrato bruto da Xylopia aromatica no desenvolvimento e sobrevivência de
embriões de zebrafish

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Efeito do extrato bruto da Xylopia aromatica no desenvolvimento e sobrevivência de
embriões de zebrafish

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Efeito do extrato bruto da Tococa guianenses no desenvolvimento e sobrevivência de
embriões de zebrafish

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 Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)

» Principio do teste:

- Os peixes são expostos ao produto químico em estudo durante um

período de 96 horas, em condições estáticas, semi-estáticas ou em fluxo
contínuo. Mortalidades e anormalidades visíveis relacionadas à aparência e
comportamento são registradas. Sempre que possível, as concentrações para
matar 50% dos peixes (LC50) são determinadas.

OECD, 2019

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 Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)

1. Prepare os aquários, é necessário um aquário para cada concentração do

composto a ser testado e 1 aquário para o controle negativo. (água de
osmose reversa). Os aquários têm que ter um volume final de 7 litros.
Análise de O2 dissolvidos, pH, temperatura e amônia tóxica.
2. Após preparar os aquários, coloque os peixes, para cada aquário é
necessário colocar 7 peixes (1 peixe para cada litro).
3. Deixar os peixes no aquário (exposto ao composto numa determinada
concentração) por um período de 96 horas.
4. Durante todo o experimento é necessário observar os peixes 2x ao dia,
para verificar se houve mortalidade em alguns dos aquários.
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Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)

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 Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)

5. Após as 96hs:
- Recolha um pouco da água do controle negativo, a menor e maior
concentração desse composto e realize as análise de O2 dissolvidos, pH,
temperatura e amônia tóxica.
- Colete em um frasco estéril 30 ml da água de todas as concentrações
desse composto para futuras análises.
- Os peixes devem ser eutanasiados e sacrificados.
6. Interpretação dos resultados e análises histológicas.

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 Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)
» Eutanásia dos peixes: Histologia
1) Em um béquer de 500ml coloque 300ml de água destilada e coloque um
pouco de Benzocaína (100mg/ml). Posteriormente, coloque os animais
nesse béquer por um período de 10 minutos.

Fixador de Dietrich.

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 Avaliação de Toxicidade Aguda de compostos com Zebrafish (Adulto)
» Eutanásia dos peixes: Hematologia
1) Em um béquer de 500ml coloque 300ml de água destilada e coloque um
pouco de Benzocaína (100mg/ml). Posteriormente, coloque os animais
nesse béquer por um período de 10 minutos.

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 Resultados: Xylopia aromatica

» Durante a exposição de peixes adultos a X. aromatica em várias doses de 25,

50, 75 e 100 (μg/ml) por 96hs. Não houve mortalidade nem diferenças no
comportamento dos peixes. As análises comportamentais foram
semelhantes ao controle negativo.

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 Referências
» GOLDSMITH, J. R.; JOBIN, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of
Human Pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology, v. 2012, p.
817341, 2012.
» NAKAJIMA, R.; HAGIHARA, H.; MIYAKAWA, T. Similarities of
developmental gene expression changes in the brain between human and
experimental animals: rhesus monkey, mouse, Zebrafish, and Drosophila.
Molecular Brain, v. 14, p. 135, 7 set. 2021.
» OECD. Test No. No. 203: Fish, Acute Toxicity Testing. Paris: Organisation for
Economic Co-operation and Development, 2019.
» OECD. Test No. 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test. Paris:
Organisation for Economic Co-operation and Development, 2013.
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