Universidade Federal do ABC

Transformaes Bioqu co micas

Experimento 1: Espectrofotometria

Grupo 3 Amadeus Folego da Silva Cec Liebort Nina lia Eduardo Luiz Kerchner Felipe Gobatto Weslei Rosante Lima Prof. Responsvel a Ji Boreck r y

31 de outubro de 2009

Sumrio a
Introduo ca Objetivo Parte experimental Arranjo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clculo dos reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a Resultados Dados do color metro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dados do espectrofotmetro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o Discusso a O mtodo do Biureto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e Ajuste do modelo de Beer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Espectro de absorbncia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a Concluses o Referncias Bibliogrcas e a 2 5 6 6 6 8 8 8 9 9 9 10 11 12

Introduo ca
de m e a prote nas tem fundamentalmente relevante O desenvolvimentoreaseriastodos para caracterizaco detanto na osticodesidocertas doencalimentos quanto para diversas a do conhecimento: favorecendo o diagn de as, permitindo o desenvolvimento de mat primas de maior qualidade area engenharia de na s ntese e puricao de prote ca nas em biotecnologia.

Espectrofotometria
So vrios os mtodos para determinao de concentrao de prote a a e ca ca nas, no entanto o mais utilizado e a espectrofotometria no Ultravioleta e no vis (UV-vis) (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998). Toda substncia vel a absorve e transmite energia luminosa em funo de sua estrutura molecular. H uma intr ca a nseca relao ca entre as concentraes das solues e a absorbncia. Atravs dessas caracter co co a e sticas e utilizando o instrumento fotomtrico, podem ser feitas anlises comparativas de solues. e a co H obviamente outros mtodos de anlise de concentrao de substncias, no entanto, em funo da a e a ca a ca estrutura das molculas de prote e na, que lhes confere atividade ptica, o mtodo de Espectrofotometria o e foi tido como o de melhor preciso para a anlise em questo (JUNIOR et al., 2007). No referido expea a a rimento nos utilizamos desses conhecimentos para quanticar a dosagem de prote nas em uma soluo ca de albumina bovina (BSA) e reagente de biureto, composta por CuSO4 0,15% (m/v), tartarato de Na e KOH 0,6% (m/v) e NaOH 0, 75 mol/L. Os dados puderam ser observados atravs da medio de diferentes solues (concentraes) de BSA e ca co co pelo instrumento de medio Color ca metro e a elaborao de um grco que determinou uma curva de ca a absorbncia de BSA a partir da anlise obtida no Espectofotmetro. a a o Dois aspectos foram muito importantes na execuo do experimento: a tara do color ca metro e a exatido no preparo das solues. A troca dos tubos de concentraes diferentes de BSA pode acarretar a co co um grande erro na elaborao da curva se no for observada no momento do experimento. J a tara ca a a e necessria para informar ao instrumento quais so os comprimentos de onda que queremos isolar. a a

Fundamentao terica ca o
E frequentemente utilizada para medir a relao entre a intensidade de luz emitida e a intensidade ca absorvida pela prote a grandeza denominada absorbncia. A absorbncia denida, sendo I1 a na a a e intensidade emitida e I2 a intensidade absorvida, da seguinte maneira: A = log I2 I1

Aps a obteno dos dados utilizamo-nos da Lei de Lambert-Beer para que pudssemos analisar de forma o ca e cr tica o experimento desenvolvido em laboratrio. o Lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert-Beer declara que a absorbncia proporcional ` concentrao, a e a ca sendo fatores de proporcionalidade o caminho tico percorrido na amostra e um fator emp o rico chamado absortividade.

Introduo ca

Experimento 1: Espectrofotometria

Ou seja, sendo A a absorbncia e C a concentraao da substncia temos que: a c a A= C onde o comprimento do caminho tico e a absortividade (este pode ser denominado coeciente de e o absoro ou ainda de extino). ca ca

Albumina Bovina
A Albumina a mais abundante prote presente no plasma de seres humanos e outros mam e na feros, possui peso molecular de aproximadamente 65kD e consiste de 584 aminocidos sem presena de carbohia c dratos. Esta prote essencial para a manuteno da presso osmtica, que necessria para a devida na e ca a o e a distribuio dos uidos corporais entre os compartimentos intravasculares e os tecidos corporais. Ela ca tambm age como portadora no plasma de diversos hormnios esterides hidrofbicos e como uma prote e o o o na de transporte para a hemina e cidos graxos. Quando associada ao metal cobre ela recebe atividade ptica a o que pode ser analisada por espectrofotometria. Sua estrutura nativa pode ser visualizada1 na gura 1.

Figura 1: Estrutura nativa da albumina bovina (BSA) J a Albumina Bovina2 (Bovine serum albumin em ingls, abreviada BSA) comumente utilizada em a e e procedimentos imunodiagnsticos, como reagente em qu o mica cl nica, em meio de cultivo de clulas, na e pesquisa em prote nas e em laboratrios de biologia molecular (usualmente para aprimorar suas proprieo dades proticas de ligao no espec e ca a cas).
1 Foi utilizado para a elaborao da gura 1 o software pyMol: DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System ca (2002) dispon vel em http://www.pymol.org 2 Sua sequncia de aminocidos pode ser obtida em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3336842?report=genpept e a

Introduo ca

Experimento 1: Espectrofotometria

Cap tulos
O presente trabalho divide-se em seis cap tulos, a seguir so descritos os prximos: a o Objetivos. A motivao e propsitos do trabalho. ca o Parte experimental. Descreve-se como montado o arranjo experimental e efetuado o experie mento. Resultados. So apresentados os dados obtidos pelo experimento. a Discusso. Os dados apresentados no cap a tulo anterior so analisados e discute-se o que pode ser a inferido a partir disso. Concluso. As concluses obtidas pelo grupo sobre a atividade feita. a o

Objetivos
ste relatrio refere-se ao primeiro experimento realizado em o o Eseutilizamosa as propriedades de isolamento das frequencias dalaboratrio: Espectrofotometria, noaqual luz, emitidas por um instrumento m de analisar absorbncia da Albumina Bovina. a Atravs da quanticao das concentraes das substncias analisadas no experimento, pretendeu-se e ca co a assimilar os estudos tericos sobre as prote o nas com o conhecimento sobre o mtodo de Espectrofotometria, e bem como as propriedades envolvidas na anlise e suas relaes com a Lei de Lambert-Beer. a co

Parte experimental
Arranjo experimental
O arranjo experimental foi formado pelas solues de BSA reagidas com uma soluo anal co ca tica de biureto, um espectrofotmetro calibrado para medir na faixa de 400-800 nm com passo de 10 nm e o um color metro calibrado para operar em 550 nm. A soluo de biureto e as amostras de BSA foram ca previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina. As amostras originais de BSA so solues com as seguintes concentraes: 0.125% (m/v), 0.25% a co co (m/v), 0.5% (m/v), 0.75% (m/v), 1% (m/v), 1.25% (m/v) e 1.75% (m/v).

Clculo dos reagentes a

Foi preparada uma soluo anal ca tica de reagente de Biureto, composta por sulfato de cobre 0,15% (m/v), tartarato de sdio e potssio 0,6% (m/v) e hidrxido de sdio (NaOH) 0,75 mol/L. o a o o Para preparar 100 mL de tal soluo calcula-se a quantidade de cada reagente a ser adicionado: ca Sulfato de cobre Obtemos a massa de sulfato de cobre (CuSO4 ) adicionada ` soluo de Biureto: a ca O produto da massa molar de CuSO4 (249.68 g/mol) pela concentrao de CuSO4 na soluo de ca ca 100mL do Biureto (0,15 mol/L x 0,1 L = 0,015 mol). Logo, a massa de CuSO4 resultado do produto e de: (249.68 g/mol x 0,015 mol) que aproximadamente 3,75 g. e Tartarato de sdio e potssio o a Obtemos a massa de tartarato de sdio e potssio (KNaC4 H4 O6 4H2 O) adicionada ` soluo de o a a ca Biureto: O produto da massa molar de KNaC4 H4 O6 4H2 O (282.1 g/mol) por sua concentrao em 100mL de ca Biureto 0,6 mol/L x 0,1 L = 0,06 mol. Logo, a massa adicionada do produto : 282.1 g/mol x 0,06 mol e e que aproximadamente 16,93 g. e Hidrxido de sdio o o Obtemos a massa de hidrxido de sdio (NaOH) contida na soluo de Biureto calculando: o o ca O produto da massa molar de NaOH (39.9971 g/mol) pela concentrao de NaOH na soluo de ca ca 100mL do Biureto 0,75 mol/L x 0,1 L = 0,075 mol. Logo, a massa de NaOH adicionada : 39,9971 e e g/mol x 0,075mol = 3 g.

Amostras de BSA
A seguir apresentamos a quantidade de BSA em massa necessria para formar 100 mL de cada amostra a original. Relembrando que Concentrao = massa (g)/volume (L). ca Tubo 3 - Concentrao de 0,125% (m/v) ca 0,00125 g/L = m/0,001L m = 1, 25.106 g

Parte experimental

Experimento 1: Espectrofotometria

Tubo 2 - Concentrao de 0.25% (m/v) ca 0,0025 g/L = m/0,001L m = 2, 5.106 g Tubo 4 - Concentrao de 0.5% (m/v) ca 0,005 g/L = m/0,001L m = 5.106 g Tubo 5 - Concentrao de 0.75% (m/v) ca 0,0075 g/L = m/0,001L m = 7, 5.106 g Tubo 6 - Concentrao de 1% (m/v) ca 0,01 g/L = m/0,001L m = 1.105 g Tubo 7 - Concentrao de 1,25% (m/v) ca 0,0125 g/L = m/0,001L m = 1, 25.105 g Tubo 8 - Concentrao de 1,75% (m/v) ca 0,015 g/L = m/0,001L m = 1, 75.105 g

Procedimento
Antes de iniciar as reaes foi feita a identicao dos 9 tubos de ensaio utilizados no experimento, co ca cada tubo recebeu a identicao Xn, sendo n nmeros unicos de 1 ` 9. A identicao seqencial dos ca u a ca u tubos de ensaio seguiu a ordem de concentrao da soluo de BSA, da menor para a maior concentrao. ca ca ca Inicialmente, para determinar o pico de transmitncia com base no comprimento de onda foi adicioa nado a uma cubeta o contedo do tubo de ensaio X8 (soluo de biureto e BSA 1,75% (m/v) e levado u ca ao espectrofotmetro para varredura da faixa do espectro eletromagntico compreendido entre os como e primentos de onda 400nm a 800nm, a varredura foi realizada em passos de 10 em 10 nm. O pico de transmitncia foi alcanado no comprimento de onda 545 nm. a c Para obteno dos valores da curva-padro foram utilizados 8 tubos de ensaio com solues de biureto ca a co reagido com as solues de concentrao variada de BSA, alm de 1 tubo branco preparado com a adio co ca e ca de gua no lugar da amostra de BSA. Composio do tubo branco: 2 mL de H2O destilada. a ca Para a preparao e medio de todas as amostras foram realizados o seguintes passos: ca ca 1. Adicionado 0,5 mL da amostra de BSA e completado o volume com mais 1,5 mL de H2 O destilada. No caso do tubo branco foi utilizado apenas H2 O destilada. 2. Agitado a soluo de BSA e H2 O destilada em um agitador tipo vrtex por aproximadamente 5 ca o segundos 3. Aps completado os passos 1 e 2 os tubos foram deixados em repouso, na estante, por cinco minutos. o 4. Terminado o repouso, uma amostra de cada vez foi colocada em uma cubeta e submetida ao colorimetro para determinao da absorbncia das solues. Aps a medio a cubeta foi secada e ca a co o ca utilizada novamente para o prxima amostra. Os resultados das medies foram anotados. o co Houve um incidente com o tubo 5, acidentalmente foi adicionada a amostra BSA de concentrao ca 1.25% (m/v) ao invs de 0.75% (m/v), problema que foi solucionado refazendo-se o procedimento para e outro tubo, que foi rotulado X10.

Resultados
dados obtidos a o entre a conA seguir capresentamos aosncia medida das no experimento: primeiramenteo uma correlacdados fornecido centrao e a absorb a amostras de BSA e logo aps, conjunto de o pelo espectrofotmetro interpolado linearmente. o Foi adicionado em cada tubo 0, 5 mL de amostra original de BSA. Como o volume nal no tubo de e 3,5 mL, devemos multiplicar o valor da concentrao de cada amostra original de BSA por 1/7. Dessa ca maneira temos a concentrao real de BSA das amostras utilizadas no espectrofotmetro e color ca o metro.

Dados do color metro

Rtulo o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentrao Ci [%(m/v)] ca N/A 0.0357 0.0179 0.0714 0.1071 0.1429 0.1786 0.2500 N/A 0.1071 Absorbncia Ai [u.a] a N/A 0.10 0.05 0.21 0.53 0.31 0.46 0.53 0.17 0.26 Comentrio a Branco A. corrompida A. desconhecida A. refeita

Dados do espectrofotmetro o
O espectro de absorbncia medido pelo espectrofotmetro pode ser visto na gura 2. a o
0.6 0.5 0.4

Absorbancia [u.a.]

0.3 0.2 0.1 0 0.1 400

450

500

550

600

650

700

750

800

Comprimento de onda [nm]

Figura 2: Curva de absorbncia para BSA em 0.25% (m/v) a

Discusso a
O mtodo do Biureto e
Muitos mtodos espectrofotomtricos, ao longo dos anos, tm sido propostos para a determinao de e e e ca prote nas totais3 , no existe nenhuma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Um a dos mtodos mais utilizados o do Biureto, que se baseia no reativo Biureto, constitu de uma mistura e e do de cobre e de hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza esse metal em soluo, sendo o o o ca tartarato de sdio recomendado por (GORNALL; BARDAWILL; DAVID, 1951). O cobre, em meio alcalino, o reage com prote nas formando um complexo quadrado planar com a ligao pept ca dica. O produto da reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. ca ca Apesar de a banda na regio dos 270 nm aumentar seis vezes a sensibilidade do mtodo, a regio de a e a 540 nm mais utilizada para ns anal e ticos, porque diversas substncias normalmente presente nos meios a utilizados absorvem na regio dos 270 nm, causando muita interferncia na resposta espectral do mtodo a e e (JUNIOR et al., 2007). Segundo (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998) no h ainda um procedimento tido como denitivo para especa a trofotometria entre os diversos propostos, geralmente utiliza-se o mais empregado, isso se deve principalmente ` falta de trabalhos que mostrem uma comparao entre os diversos mtodos dispon a ca e veis.

Ajuste do modelo de Beer

Estamos interessados em analisar a relao entre a absorbncia Ai e concentrao Ci de BSA de cada ca a ca amostra, logo podemos aplicar a lei de Lambert-Beer (INGLE, 1988) da seguinte maneira: Ai = bsa c Ci onde bsa a absortividade da Albumina Bovina e e
c

(1)

= 1 cm o comprimento da cubeta utilizada. e

Ajustamos o fator bsa do modelo aos dados experimentais. Para isso foi utilizado o mtodo de otie mizao por m ca nimos quadrados4 , o resultado obtido foi bsa = 2, 303 0, 237 cm1 . Podemos agora prever a concentraao de BSA da amostra desconhecida utilizando a equao 1: c ca A9 = 0.0738 8, 5.103 E vis que, apesar de uma ligeira disperso dos dados experimentais estes aderem bem ` reta calcuvel a a lada. Isso signica que a lei de Lambert-Beer pode ser aplicada conavelmente como modelo para nosso experimento. Devem ser levadas em considerao tambm as condies do experimento, pois pode variar com a ca e co temperatura, pH (JUNIOR et al., 2007), etc... No entanto, acreditamos que a amostra no tenha sofrido a mudanas bruscas destas condies, o que implica que sob condies prximas `s do experimento realizado c co co o a sua reproduo deve fornecer dados relativos ` absortividade prximos aos da medida. ca a o
3 Entre 4 Foi

eles, o mtodo de Bradford, o de Lowry e o de Smith (ou resumidamente BCA) e utilizado para a elaborao das guras 2, 3 e 4; e tambm para otimizao, o software Matlab. ca e ca

Discusso a

Experimento 1: Espectrofotometria

0,53 Absorbancia [u.a.] 0,46

Amostra desconhecida

0,31 0,26 0,21 0,17 0,1 0,05 0,0179 0,0357 0,0714 0,1071 0,1429 Concentracao de BSA [%(m/v)] 0,1786

Ajuste ao Modelo Faixa de erro Dados Experimentais

0,25

Figura 3: Grco apresentando os dados obtidos pelo color a metro e o ajuste do modelo de Lambert-Beer

Espectro de absorbncia a
Os dados experimentais evidenciam que o mximo de absorbncia na faixa de 400-800 nm da albua a mina bovina obtido em 545 5 nm. Alm disso, mostram que a localizao do mximo independe da e e ca a concentrao da amostra, como mostra a gura 4. ca

Procedimento 1 Procedimento 2 Procedimento 3 Procedimento 4 Procedimento 5 Procedimento 6 Procedimento 7 Procedimento 8 Procedimento 9

Absorbancia normalizada [u.a.]

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 400 450 500 550 600 650 700

750

800

Comprimento de onda [nm]

Figura 4: Curvas de absorbncia normalizadas de BSA para diversas concentraes a co Portanto justica-se a calibrao dos color ca metros em 550 nm: a absorbncia maior neste compria e mento de onda, o que permite uma resoluo tima. E verica-se o proposto por (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, ca o 1998).

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Concluses o
trabalho introduziu novos desde m e a Este queaos alunosconhecimento conceitos` cientcos aoe grupo,prcientemtodos de redaco e pesquisa bibliogrca at e relativo a bioqu mica pesquisa ca. Especicamente, o trabalho exigiu reconhecessem a interface entre teoria e atica pesquisa e fossem capazes de compreender o que signica cada proposio envolvida. ca Desta forma o grupo conclui que o experimento foi deveras proveitoso para todos, impressionando positivamente todos os integrantes com relao ` colaborao e competncia dos envolvidos. ca a ca e

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Referncias Bibliogrcas e a
GORNALL, A. G.; BARDAWILL, C. J.; DAVID, M. M. Determination of serum proteins with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem, v. 193, p. 265271, 1951. INGLE, J. D. Spectrochemical Analysis. 1. ed. [S.l.]: Prentice Hall, 1988. JUNIOR, J. B. S. et al. Interferncia do ph, concentrao de bsa e de tampo fosfato sobre a resposta e ca a na determinao de prote total pelo mtodo do biureto. Exacta, So Paulo, v. 5, n. 2, p. 335341, ca na e a jul./dez. 2007. ISSN 1983-9308. Revista Online. ZAIA, D. A. M.; ZAIA, B. V.; LICHTIG, J. Determinao de prote ca nas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qu Nova, So Paulo, v. 21, n. 6, Nov./Dec. 1998. e m. a ISSN 0100-4042. Dispon no acervo Scielo. vel

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