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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Departamento de Cincias dos Alimentos Bacharelado em Qumica de Alimentos Disciplina de Seminrios

Mtodos rpidos de anlise microbiolgica

Jlia Coswig Goldbeck

Pelotas, 2008.

Jlia Coswig Goldbeck

Mtodos rpidos de anlise microbiolgica Trabalho acadmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Qumica de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial da disciplina de seminrios.

Orientadora: Josiane Chim Co-Orientadora: Carla Mendona

Pelotas, 2008.

Agradecimentos colaborao de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andria Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientao, confiana e oportunidade de crescimento pessoal e profissional. Profa. Dra. Miriam Galvo e Dra. Caroline Borges, pela orientao e conhecimentos transmitidos. s orientadoras da referente disciplina, Profa. Dra. Carla Mendona e Profa. Josiane Chim. Aos amigos, e ao apoio e compreenso do meu companheiro de todas as horas, Wilson Colvara. Ao rgo apoiador de minha graduao, CNPQ, pela concesso de bolsa Iniciao Cientfica.

A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e pensar no que ningum pensou. " ( Jonathan Swift )

GOLDBECK, Jlia C. Mtodos rpidos de anlise microbiolgica. 2008. 32f. Trabalho acadmico. Bacharelado em Qumica de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas. Resumo A necessidade de rapidez dos resultados de anlise, fez surgir os mtodos rpidos de anlise microbiolgica. Os mtodos rpidos possuem vrias vantagens, como diminuio de custos para a empresa, facilidade de leitura e interpretao dos resultados, bem como, simplificao de tarefas. Alguns desses mtodos j so aprovados pela AOAC, porm, resultados positivos devem ser apenas presuntivos, enquanto que resultados negativos so considerados confirmatrios. Sob viso geral, os mtodos so projetados especificamente para identificar um grupo ou espcie bacteriana. Quase todos os mtodos rpidos so projetados para identificar um nico alvo, o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. Os testes so similares no formato e desempenho e possuem de 90 99% de exatido quando comparados a mtodos convencionais, sendo que os resultados so obtidos em alguns minutos, segundos ou em algumas horas. Os mtodos rpidos so divididos em mtodos para avaliar a qualidade e mtodos para avaliar a inocuidade.

Lista de tabelas Tabela 1 Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimticos encontrados no mercado.................................................................................. 23

Lista de figuras Figura 1 Microscpio fluorognico, usado para contagem de microrganismos e conseqente formao de colnias........................................................................... Figura 2 Placas PetrifilmTM prontas para uso......................................................... Figura 3 Reao antgeno anticorpo que ocorre no Kit ELISA............................. Figura 4 Eletroforese em gel de agarose................................................................ Figura 5 Bax System, sistema automatizado de PCR real time........................... Figura 6 Riboprinter System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactrias de forma automatizada........................................................... 29 18 18 26 28 28

Sumrio
1 Introduo................................................................................................... 2 Mtodos rpidos........................................................................................ 2.1 Mtodos convencionais x mtodos rpidos........................................ 3 Tcnicas rpidas para a identificao de microrganismos................... 3.1 Mtodos para avaliar a qualidade......................................................... 3.1.1 Mtodos de contagem direta.............................................................. 3.1.1.1 Tcnica de membrana filtrante........................................................ 3.1.1.2 Tcnica de epifluorescncia direta................................................. 3.1.1.3 Tcnica fluorognica........................................................................ 3.1.1.4 Sistemas prontos para uso.............................................................. 3.1.2 Mtodos de contagem indireta........................................................... 3.1.2.1 Bioluminescncia............................................................................. 3.1.2.2 Impedncia/condutncia.................................................................. 3.1.2.3 Placas SIMPLATETM......................................................................... 3.2 Mtodos para avaliar a inocuidade....................................................... 3.2.1 Mtodos bioqumicos.......................................................................... 3.2.2 Mtodos imunolgicos........................................................................ 3.2.2.1 Ensaios imunoenzimticos.............................................................. 3.2.2.2 Imunocaptura.................................................................................... 3.2.2.3 Imunoimobilizao............................................................................ 3.2.2.4 Coaglutinao................................................................................... 3.2.2.5 ELISA................................................................................................ 3.2.3 Mtodos moleculares.......................................................................... 3.2.3.1 Sondas genticas............................................................................ 3.2.3.2 Reao de Polimerase em cadeia (PCR)........................................ 3.2.3.3 Bacterifagos com DNA modificado............................................... 3.2.3.4 Ribotipagem...................................................................................... 4 Concluses ................................................................................................ Referncias.................................................................................................... 10 12 13 15 15 15 15 16 17 18 19 20 21 21 22 22 22 22 23 24 24 24 26 26 26 28 28 30 32

1. Introduo impossvel determinar exatamente quando, na histria da humanidade, o homem tomou conhecimento da existncia de microrganismos e da sua importncia para os alimentos. Aps o perodo no qual o ser humano tinha a sua alimentao baseada apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar animais e produzir o seu prprio alimento. Com o surgimento de alimentos

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preparados, comearam a ocorrer os problemas relacionados com doenas transmitidas pelos alimentos e com a rpida deteriorao dos mesmos, principalmente pela conservao inadequada (FRANCO, 1999). Entre os vrios parmetros que determinam a qualidade de um produto, os mais importantes so, sem dvida, aqueles que diferem as suas caractersticas microbiolgicas. A avaliao microbiolgica do alimento fornece informaes que permitem avali-lo quanto s condies em relao sade da populao. Para que a anlise microbiolgica seja conduzida de forma que os resultados obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, necessrio que os critrios de avaliao sejam claramente estabelecidos. Esses critrios so definidos de modo a permitir uma avaliao segura e vlida. Os critrios de avaliao so estabelecidos pela legislao de cada pas, e em nvel internacional, por um programa conjunto FAO/WHO, da Organizao das Naes Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e atravs da comisso do Codex Alimentarius. No Brasil, padres microbiolgicos para alimentos so definidos em nvel federal, pelo Ministrio da Sade sob RDC n 12 de 02 de janeiro de 2001, devem ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Em nvel estadual, alguns estados de federao, como So Paulo, tm legislao prpria. Logo, a anlise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos esto presentes fundamental, no somente para conhecer as condies de higiene de determinado produto, como tambm para observar se os padres e especificaes microbiolgicos, nacionais ou internacionais, esto sendo atendidos adequadamente (FRANCO & LANDGRAF, 1996). Atualmente, a anlise microbiolgica de um alimento pode ser realizada atravs dos mtodos convencionais, aqueles desenvolvidos h muitos anos e que ainda vm sendo empregados como mtodos oficiais, ou mtodos rpidos, ao quais vm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade. Portanto, o objetivo do presente trabalho, foi conhecer as caractersticas, bem como as vantagens e desvantagens, em relao aos mtodos convencionais, de alguns mtodos rpidos empregados na anlise microbiolgica de alimentos.

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2. Mtodos rpidos Os mtodos rpidos surgiram a partir da dcada de 70, como conseqncia da necessidade de se abreviar o tempo necessrio para a obteno de resultados analticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL, 1998). So utilizados, geralmente, como tcnicas de seleo e a fim de garantir a segurana dos consumidores. Sob viso geral, a maioria desses mtodos consiste em um dispositivo descartvel que contm 15 a 30 meios ou carcaas, projetados

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especificamente para identificar um grupo ou uma espcie bacteriana. Os testes so similares no formato e no desempenho e possuem exatido de 90 99% quando comparados a mtodos convencionais (FUNG et al., 2000) A maioria dos testes so projetados para identificar/quantificar as bactrias entricas, como tambm Campylobacter, Listeria, bactrias anaerbias, gran negativas e gran positivas. Os mtodos rpidos mais encontrados no mercado so os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de bolores e leveduras, deteco de Salmonella spp. e Listeria, monocytogenes (HAJDENWURCEL, 1998). Quase todos os mtodos rpidos so projetados para detectar um nico alvo, o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar rapidamente um grande nmero de amostras contaminadas por um determinado patgeno (YUSTE, 2007). Os resultados com a utilizao dos mtodos rpidos podem se dar em alguns minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliaes dos mesmos, mostram que o bom desempenho desses mtodos est relacionado com o tipo de alimento. Isto pode ser atribudo, na maioria das vezes devido composio qumica do alimento, por isso, aconselhvel executar estudos comparativos para assegurar a eficincia da anlise (FRAQUEZA, 2002). Ainda so poucos os mtodos validados oficialmente para alimentos, porm, vrios mtodos alternativos de contagem tm sido proposto nos ltimos anos, tem se observado que a rea de mtodos rpidos desenvolve-se de forma espantosa. Porm, muitos dos chamados novos mtodos em microbiologia de alimentos nada tem de novos, so na verdade resultados da transposio de mtodos h muito tempo utilizados em outras reas da microbiologia. 2.1 Mtodos convencionais X mtodos rpidos Os mtodos convencionais recebem essa denominao porque foram desenvolvidos h muitos anos e desde ento vem sendo empregados como mtodos oficiais na maioria dos laboratrios de microbiologia de alimentos. Esses mtodos esto descritos aceitos em e publicaes consideradas pela American de referncia, Health internacionalmente recomendados Public

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Association (APHA), pelo International Commission on Microbiological Specification for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA). O mtodo convencional de contagem de microrganismos consiste basicamente no plaqueamento de alquotas do produto homogeneizado e de suas diluies em meios de cultura slidos, adequadamente selecionados em funo do microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na superfcie do meio de cultura previamente distribudo em placas de Petri estreis (semeadura em superfcie), ou ento o meio de cultura pode ser adicionado aps a transferncia das alquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em profundidade). As placas so ento incubadas a uma combinao de tempo e temperatura adequada para a determinao a ser feita, durante a qual os microrganismos se multiplicam formando as colnias visveis, que podem ser enumeradas manualmente ou com o auxlio de contadores automticos (FRANCO, 1999). Apesar da aparente simplicidade dessa tcnica, ela bastante trabalhosa e sujeita a erros, levando em considerao que: os microrganismos esto arranjados em pares, ttrades, cadeias e cachos, conseqentemente, o nmero de colnias que aparece na placa no corresponde ao nmero de clulas individuais presentes, alm disso, quando muitas diluies precisam ser plaqueadas tambm pode haver erros, bem como algumas partculas de alimentos podem ser confundidas com colnias, levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difcil, pois pode variar de acordo com o analista, alm de ser cansativa e imprecisa, mesmo quando contadores automticos so empregados (SILVEIRA et al.,1997). Visando minimizar estes problemas, surgiram os mtodos alternativos (mtodos rpidos), que apresentam a convenincia de produzirem resultados mais rpidos, sensveis e especficos, se comparados s tcnicas convencionais. Tais mtodos tambm podem oferecer economia de espao e materiais, aumentando a produtividade laboratorial. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de anlises microbiolgicas, em face do alto volume de alimentos disposio do consumidor em curto espao de tempo (SILVA, 1996). Como vantagens dos mtodos rpidos, pode-se enumerar: Reduo do tempo de anlise; Menor tempo de reteno do produto na indstria;

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Diminuio de custos; Simplificao das tarefas envolvidos na anlise; Facilidade de leitura dos resultados; Especificidade; Maior sensibilidade de alguns mtodos quando comparados com os mtodos convencionais.

Contudo, ao se escolher e implantar os mtodos rpidos deve se levar em conta parmetros como preciso, custo, tempo de anlise, aceitabilidade pelos rgos oficiais, simplicidade de operao, assistncia tcnica dos fabricantes e disponibilidade de espao no laboratrio. Porm, segundo Feng (1995), os mtodos rpidos aprovados pelos rgos oficiais podem ser utilizados somente para controle, sendo que os resultados negativos so considerados como definitivos, mas resultados positivos so considerados presuntivos e devem ser confirmados por mtodos padres.

3. Tcnicas rpidas para a identificao de microrganismos Os mtodos rpidos podem ser divididos em dois grupos: mtodos para avaliar a qualidade e mtodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA, 2006). Os mtodos que avaliam a qualidade do alimento esto mais relacionados aos

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microrganismos deteriorantes, aqueles no patognicos, j os mtodos que avaliam a inocuidade, quantificam/identificam microrganismos patognicos. 3.1 Mtodos para avaliar a qualidade 3.1.1 Mtodos de contagem direta

3.1.1.1 Tcnica de membrana filtrante Utilizada h bastante tempo para enumerao de coliformes totais, fecais e Escherichia coli em gua, porm, seu uso em alimentos mais recente. A mistura alimento-diluente filtrada atravs de membranas filtrantes de acetato de celulose ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45m) para reteno dos microrganismos presentes nessa mistura. Em seguida as membranas so transferidas para a superfcie de placas contendo gar ou cartes absorventes saturados com meio de cultura. Aps o tempo de incubao adequado para cada microrganismo, faz-se a enumerao das colnias que surgiram na superfcie das membranas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas quadriculadas e pelo uso de contadores automticos. A tcnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens: Remove os componentes do alimento que podem interferir no crescimento microbiano (slidos em suspenso ou agentes antimicrobianos); Microrganismos presentes em pequeno nmero, por vezes no detectveis em outras tcnicas, podem ser concentrados pela filtrao de volume maior da amostra; Permite a contagem de 1 at 1,6x10-3 UFC por membrana, o que elimina a necessidade de diluio; As colnias so coradas para facilitar a visualizao. O uso de membranas Isogrid aprovado pela AOAC para enumerao de bactrias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella, sendo tambm aprovados diversos tratamentos enzimticos que podem ser utilizados em funo do tipo de alimento, para melhorar a filtrabilidade.

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Alm da aprovao oficial, as membranas podem ser tambm utilizadas para a pesquisa de Staphylococcus aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocoltica, C. perfringens, P. aeruginosa, bactrias gran negativas e estreptococus fecais. Sua aplicao em alimentos como leite, carne, condimentos, farinhas vegetais, frutos do mar e outros tm apresentado timos resultados (MACHADO, 2007). 3.1.1.2 Tcnica de epifluorescncia direta Tcnica rpida de contagem de microrganismos que no depende de seu cultivo e conseqente formao de colnias. Os microrganismos viveis e no viveis so enumerados por microscopia, sendo uma das tcnicas que oferece resultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com enzimas e tensoativos, se necessrio, filtrada atravs de uma membrana de policarbonato, que retm os microrganismos. Essa membrana ento corada com fluorocromo nucleoflico (alaranjado de acridina) e observada em um microscpio de fluorescncia. O corante permite a diferenciao das clulas viveis, pois o DNA e RNA corados apresentam fluorescncia de colorao diferente, em funo da fase de crescimento microbiano. As clulas viveis apresentam fluorescncia laranjaavermelhado, enquanto clulas mortas tm fluorescncia verde. A epifluorescncia direta tem boa sensibilidade, resultante da concentrao das clulas na superfcie da membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite. Essa tcnica, porm,apresenta algumas desvantagens: Tcnica muito cansativa; Injria de bactrias devido ao calor pode alterar a fluorescncia; O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes laboratrios (MACHADO, 2007). 3.1.1.3 Tcnica fluorognica Os testes baseados na adio de MUG (4-metil-umbeliferil--D-glicuronideo) a um caldo de cultura para deteco de Escherichia coli., so exemplos desta tcnica. A enzima -glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse microrganismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado

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sob luz ultravioleta de onda longa. A observao do nmero de tubos turvos, com gs e fluorescentes aps 24 ou 48h, permite o clculo do nmero mais provvel de E. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007). Este mtodo oferece como vantagens: - Rapidez e facilidade de usar; - Identificao direta e enumerao de Escherichia coli ou enterococos em 36 horas (em comparao com 3 ou 4 dias usando mtodos tradicionais); - Dispensa a preparao de meio de cultura; - Emprega microplacas estreis e prontas para uso; - Padronizao do preparo, incubao e tcnica de leitura para E. coli e Enterococcus; - Deteco da atividade de uma enzima especfica de cada bactria por microplaca; - Resultados confiveis; - Economia de tempo e material. A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscpio fluorognico, usado nesta tcnica para enumerar as clulas viveis no viveis.

Figura 1 Microscpio fluorognico, usado para contagem de microrganismos. Fonte: Google imagens (Epifluorescncia direta), 2008. 3.1.1.4 Sistemas prontos para uso Existem diferentes sistemas disponveis comercialmente, com princpios distintos, nos quais os meios de cultura j vm prontos para uso, muitas vezes j na prpria placa de petri. Entre esses, destacam-se as Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos gares adicionados de substratos cromognicos ou fluorognicos. As placas PetrifilmTM so produzidas e comercializadas pela 3M, so filmes de papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados e gis hidrossolveis a frio. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno,

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que na face voltada para o filme inferior revestido por gis hidrossolveis a frio e um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio TTC), com exceo daquelas usadas para contagem de fungos. As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8C, antes do uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposio das mesmas a temperaturas superiores a 25C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu desempenho. As placas Petrifilm so prontas para uso, isto , basta erguer o filme superior e inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posio inicial e aplicar um difusor plstico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, atravs de leve presso manual. Os agentes gelificantes so solveis em gua e a frio. A gua de diluio contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a hidratao dos nutrientes e a geleificao da mistura. Aps a geleificao (1 min) as placas so incubadas na temperatura e tempo adequados, fazendo-se em seguida a enumerao de colnias. As colnias apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo microrganismo passa de incolor para vermelho. A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumerao de: bactrias aerbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactrias, leveduras e bolores e ainda bactrias lticas. Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos, necessrio incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados, sendo a incubao pelo perodo de 3-5 dias a 25C (SANTANA; CONCEIO; AZEREDO, 2002). Entre as vantagens desse sistema, tem-se: Ser um sistema pronto para uso; Execuo fcil e rpida, que dispensa a necessidade de preparo de meios de cultura, do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais; Custo baixo; Obteno rpida dos resultados. A Fig. 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um filme superior respectivamente, de polipropileno e, como observado o resultado final,

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Figura 2. Placas PetrifilmTM prontas para uso. Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm), 2008. 3.1.2 Mtodos de contagem indireta Alm das tcnicas diretas os analistas tm a seu dispor diversas tcnicas alternativas indiretas, baseadas na medio da atividade metablica dos microrganismos nos alimentos. Nestas tcnicas os microrganismos presentes so quantificados atravs da dosagem de determinados produtos metablicos, que produzem quando se multiplicam nos alimentos ou, ainda, atravs de medidas de alteraes fsicas ocorridas durante este processo. Estas tcnicas exigem a construo de curvas-padro, nas quais se faz a correlao entre os parmetros medidos e o nmero de clulas viveis presentes. O princpio bsico quanto maior o nmero de microrganismos presentes mais intenso o fenmeno medido, desta maneira quanto maior for o nvel de contaminao de um produto, menor o tempo de reteno. Atravs destas tcnicas, teoricamente, possvel detectar a presena de at uma clula vivel na amostra em teste (FRANCO et al., 1992). 3.1.2.1 Bioluminescncia

Esta tcnica est baseada no princpio de que a quantidade de Adenosina Trifosfato (ATP) presente em um sistema est relacionada ao numero de clulas metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. Uma das formas mais simples de se medir a quantidade de ATP atravs do sistema luciferina-luciferase, inicialmente obtido da cauda de vagalumes ou extrado de peixes e, mais recentemente, obtido

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por manipulao gentica de microrganismos. ATP reage com a enzima luciferase, na presena de luciferina e ons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxignio, sofre uma descarboxilao, com emisso simultnea de luz. A luz emitida pode ser medida em luminmetro, um fluormetro ou em um espectrofotmetro de cintilao lquida, podendo ser expressa atravs da seguinte reao: Mg+2 E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP + O2 E - LH2 - AMP + PP oxiluciferina + CO2 + AMP + luz

E = enzima luciferase, LH2 = luciferina , E - LH2 - AMP = complexo luciferaseluciferina-AMP Equao 1. Reaes que ocorrem durante o ensaio de bioluminescncia. Uma das grandes aplicaes dessa tcnica o monitoramento da eficincia de procedimentos de limpeza e higienizao em plantas processadoras de alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Esta tcnica bastante conveniente no monitoramento de programas de APPCC (anlise de perigos e pontos crticos de controle). Apresenta como vantagens: Fcil leitura, com valores mximos e mnimos; Resultados em minutos; Sistema porttil, fcil transporte; Fcil utilizao, qualquer pessoa pode usar; Capacidade de armazenamento de dados (memria); No necessita adio de solues; Medio exata da quantidade de ATP.

3.1.2.2 Impedncia/Condutncia So baseadas na propriedade que os microrganismos tm de alterar a transmisso da corrente eltrica atravs de um meio de cultura. Essas alteraes ocorrem como conseqncia da mudana da composio qumica desse meio

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devido

atividade

metablica

dos

microrganismos

presentes.

Durante

multiplicao microbiana, molculas grandes (protenas, lipdeos, carboidratos) so transformadas em molculas menores (aminocidos, cidos graxos, cidos orgnicos), quimicamente mais ativas; o acmulo desses metablitos finais resulta em alteraes mensurveis na condutncia e impedncia eltrica do meio (SILVEIRA, 2006). So exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMurieux), RABIT (Don Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments). 3.1.2.3 Placas SIMPLATETM Tcnica alternativa para a enumerao de bactrias totais, coliformes, Escherichia coli, bolores e leveduras em alimentos. As placas so plsticas e apresentam 84 ou 198 cmaras, s quais se adicionam alquotas da amostra em anlise e o meio de cultura Simplate. As placas so incubadas a 35C por 24 horas. A contagem de bolores e leveduras e bactrias mesfilas so realizadas enumerando-se as cmaras que apresentam fluorescncia sob luz UV. Colorao prpura indica presena de coliformes totais e fluorescncia sob luz UV presena de Escherichia coli. O nmero de microrganismos determinado atravs de uma tabela, expressando-se o NMP.g-1 ou mL-1 de alimento analisado (SILVA; GALLO, 2003).

3.2 Mtodos para avaliar a inocuidade 3.2.1 Mtodos Bioqumicos So baseados na avaliao da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metablitos. Existem no mercado diversos kits, na maioria miniaturizados, onde os testes so executados com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram na forma desidratada ou liofilizada, e so reidratados pela adio de pequeno volume da

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amostra a ser testada. Aps a incubao faz-se a leitura dos resultados, normalmente atravs de uma combinao de nmeros obtida de acordo com o resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. Cada combinao de nmeros corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO, 2007). 3.2.2 Mtodos Imunolgicos Esses mtodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e, em funo disso, vm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de alimentos. So baseados em reaes especficas entre antgenos e anticorpos, os quais podem ser poli ou monoclonais. Os principais mtodos imunolgicos so descritos abaixo (SILVEIRA, 2006). 3.2.2.1 Ensaios imunoenzimticos Nesses ensaios um dos reagentes, antgeno ou anticorpo, fica adsorvido a superfcie de uma matriz slida (esferas de poliestireno, placas de microtitulao, partculas metlicas revestidas de policarbonato e outras). A reao baseada na ligao no covalente e reversvel do antgeno com o anticorpo especfico, no qual um desses reagentes marcado com uma enzima, normalmente cromognica, ou seja, que age em reaes que resultam no desenvolvimento de cor. A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotmetro. Dois tipos de ensaios imunoenzimticos so mais comumente utilizados: competitivo e no competitivo. O tipo no competitivo, tambm conhecido como tipo Sanduche, o mais utilizado nos sistemas de triagem de microrganismos patognicos em alimentos (SILVEIRA, 2006). Existe no mercado um grande nmero de sistemas comerciais baseados em tcnicas imunoenzimticas, conforme a Tab. 1, a seguir. Tabela 1 Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimticos encontrados no mercado

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SISTEMA Salmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck Listeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureusVia Unique Salmonella, Unique Listeria ECOLI Listeria Rapid Test REVEAL Listeria, Salmonella e E. coli Vip E. coli VIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E. aureus Fonte: MACHADO, 2007. 3.2.2.2 Imunocaptura

FABRICANTE Organon Teknika Tecra Tecra Difcro Oxoid Neogen Biocontrol bioMuriex

Tambm chamada de imunoseparao magntica, nessa tcnica os anticorpos ficam ligados a partculas metlicas recobertas com policarbonato. Aps a ligao com o antgeno especfico, as partculas metlicas so atradas por um im, permitindo que o restante do material seja removido. Aps a retirada do im, obtm-se um produto concentrado que pode, ento, ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa tcnica, quando aplicada diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de pr-enriquecimento, sempre necessria quando se pretende investigar a presena de microrganismos patognicos em alimentos por mtodos convencionais (SILVA, 1996).

3.2.2.3 Imunoimobilizao Nessa tcnica, bactrias mveis cultivadas em meio semi-slido tm sua mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares especficos. H formao de uma banda de precipitao visvel na interface anticorpo-bactria. 3.2.2.4 Coaglutinao

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Essa tcnica baseada na aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas com anticorpos antitoxinas. Tambm so conhecidas como reaes de aglutinao de ltex ou aglutinao passiva reversa. 3.2.2.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) um teste imunoenzimtico que permite a deteco de anticorpos especficos no soro. Este teste usado no diagnstico de vrias doenas infecciosas uma vez que vrios agentes patolgicos induzem a produo de anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfcitos B do sistema imunolgico humoral humano. Este o teste de primeira linha no diagnstico da infeco pelo HIV vrus da SIDA/AIDS, estes testes at a sua terceira gerao s detectavam a presena de anticorpos (IgG e IgM) trs ou quatro semanas aps o contato, no entanto, os testes de quarta gerao j detectam tanto anticorpos como um dos antgenos do HIV - a protena p24 - fato esse que diminuiu sensivelmente o perodo de janela imunolgica, podendo chegar a apenas duas semanas. Um resultado positivo num teste de ELISA sempre confirmado por outros testes especficos como o caso do Western blot, que detecta protenas do vrus, e do PCR, que detecta os cidos nucleicos virais. O teste ELISA tambm pode ser utilizado de diversas outras formas. Utilizando-se de um mtodo semelhante ao mtodo de Imunoradioensaio, pode-se transformar muitas outras substncias em antgeno e obter um anticorpo do mesmo. Assim, possvel utilizar o teste para se detectar outras substncias de interesse como, por exemplo, hormnios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, o teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata. O mtodo utilizado para realizar o teste se baseia na interao anticorpoantgeno. Normalmente usada uma placa de superfcie inerte com poos onde sero adsorvidas as protenas de interesse. Depois realizada uma lavagem com uma protena inespecfica para que esta ocupe os poos livres. A superfcie ento tratada com soluo de anticorpo primrio, sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a protena, especfico para a protena de interesse e este vai se ligar a ela. A superfcie lavada novamente para retirar os anticorpos primrios que no foram incorporados em nenhuma protena. Em seguida o produto

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tratado com anticorpos secundrios que possuem uma enzima acoplada que ir produzir uma substncia corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primrio. A superfcie lavada novamente para a retirada do anticorpo secundrio que no se ligou ao anticorpo primrio. Adiciona-se o substrato de ligao para a enzima produzir a substncia corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfcie, pode-se quantificar e verificar a presena de alguma substncia de interesse (SIMERSKY,2000). A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reao especfica entre o antgeno e o anticorpo.

Figura 3. Reao antgeno e anticorpo que ocorre no Kit ELISA. Fonte: Google Imagens (ELISA), 2008. A figura acima, mostra como possvel estabelecer a concentrao do analito em questo, ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima cromognica, menor a concentrao do analito, uma vez que, a enzima cromognica liga-se enzima conjugada. A concentrao obtida atravs de uma curva de calibrao (Absorbancia x concentrao), sendo porm inversamente proporcional a quantidade do analito. 3.2.3 Mtodos Moleculares 3.2.3.1 Sondas genticas

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Nessa tcnica necessrio submeter os microrganismos a um tratamento em que seu material gentico liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida, adicionam-se sondas, que so fragmentos de DNA ou RNA especficos para o patgeno alvo, marcadas com enzimas, normalmente cromognicas e, quando h hibridizao com a sonda, h desenvolvimento de cor e, portanto, a presena do microrganismo investigado detectada (MACHADO, 2007). 3.2.3.2 Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) uma tcnica muito utilizada em microbiologia para amplificao do material gentico de microrganismos. A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) um mtodo muito sensvel de anlise e por isso realizada com muito cuidado para evitar contaminaes que possam inviabilizar ou tornar errneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material gentico da clula ou outro material a ser estudado sem danific-lo. Normalmente o material extrado o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que um desdobramento da PCR e possui outras aplicaes (FUNG, 2002). Depois de extrado o DNA, a este adicionada uma mistura (tambm conhecida como pr-mix) que contm os dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatos), que so as bases nitrogenadas ligadas com trs fosfato, os primers tambm chamados de oligonucleotdeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma soluo tampo. Toda esta mistura colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pr-estabelecidos com tempos exatos especficos para cada reao (fragmento a ser amplificado). Na primeira etapa do ciclo a temperatura elevada de 94 a 96C, por pouco tempo, para que haja a separao da dupla cadeia de DNA (Desnaturao). Na segunda etapa, a temperatura reduzida entre 50 a 60C, dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na ltima etapa do ciclo a temperatura elevada a 72C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molcula (extenso), em seguida um novo ciclo iniciado. Normalmente so realizados de 25 a 40 ciclos para cada reao na qual a taxa de replicao

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exponencial 2ciclo. O resultado analisado atravs de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida (figura 4).

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose. Fonte: Google Imagens (PCR), 2008. Atualmente existem outras tcnicas mais rpidas que a PCR, como por exemplo o Bax Sisten o qual um sistema automatizado de PCR real-time, baseado em DNA para anlises microbiolgicas de Salmonella, E.Coli 0157:H7, Listeria Monocytogenes, Listeria.sp, Enterobacter.sakazakii, Campylobacter jejuni/coli, Bolores e Leveduras. Roda de uma a noventa e seis anlises por vez, com resultados disponveis em cerca de 3 horas e meia. Essa tcnica avalia a caracterstica gentica da bactria, o que aumenta a capacidade e a estabilidade do mtodo de uma forma nica, pois as variaes do meio, flora acompanhante e outras variveis tm as suas influncias reduzidas a praticamente zero (YUSTE; FUNG, 2007). A Fig. 5 mostra, ilustrativamente, a tcnica acima citada, onde a leitura feita diretamente na tela do aparelho, ou seja no h a necessidade de realizar uma eletroforese, como na tcnica de Reao de Polimerase em Cadeia (PCR).

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Figura 5. Bax System, sistema automatizado de PCR real time Fonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem), 2008. 3.2.3.3 Bacterifagos com DNA modificado Esses bacterifagos carregam informao gentica para a sntese de protenas especiais, responsveis pela formao de cristais de gelo, quando a amostra resfriada adequadamente. Esse princpio utilizado em um teste para Salmonella e, quando esse microrganismo est presente na amostra, os bacterifagos se ligam a Salmonella e o material gentico introduzido na bactria, que passa a sintetizar protenas especiais. A formao dos cristais de gelo provoca alterao na colorao do meio, facilmente observada a olho nu (MACHADO, 2007). 3.2.3.4 Ribotipagem feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual bactrias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nvel de espcie. Virtualmente qualquer bactria pode ser identificada por esse mtodo. Como exemplo pode-se citar o Riboprinter System da DuPont Qualicon a nica tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactrias de forma automatizada, alm de criar um banco de dados digital. O processo se baseia na ribotipagem, ou seja, na anlise e comparao de DNA-RNA oferecendo assim, um alto poder discriminatrio pela diferenciao em nvel gentico. A Fig. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter System da DuPont Qualicon.

Figura 6. Riboprinter System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactrias de forma automatizada. Fonte: Google imagens (Ribotipagem), 2008.

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Com este equipamento possvel realizar a rastreabilidade completa do microrganismo em questo, identificando a fonte e causa da contaminao de uma maneira direta e indubitvel, pois fornece um perfil gentico de cada uma das bactrias implicadas, permitindo que as bactrias com o ribogrupo coincidente sejam identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al, 1996).

4. Concluses
A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurana da qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados indstria alimentar. Logo, devido necessidade de rapidez de resultados, hoje, j so encontrados no mercado varias tcnicas que possibilitam resultados muito rpidos, essas tcnicas so conhecidas por mtodos rpidos de anlise microbiolgica, os

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mais usados na rea da pesquisa so PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas simplate. Os mtodos rpidos possuem muitas vantagens, como boa exatido, alm de minimizar os custos de uma empresa, sendo de rpida e fcil leitura, porm, possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas tcnicas e mesmo aqueles j aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda no so considerados confirmatrios. No entanto, torna-se imprescindvel, no s aos microbiologistas, mas a todos da rea de alimentos, estarem interados com essas novas tcnicas, pois estas vm crescendo, substituindo, em parte, os mtodos convencionais aplicados na maioria dos laboratrios de microbiologia de alimentos.

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