Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

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Não-tóxico.5 to 2%. Fácil de preparar.000 bp. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50. via eletroforese. Usada em concentrações de 0. .Gel: composto de agarose ou poliacrilamida Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.

Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos de menos de 500 bp. . Também usados para separação de proteínas. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.5 a 20%).Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro. São mais difíceis de preparar. Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó.

) e com cor para ver a amostra Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) •Brometo de Etídeo. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese •Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas •Tampão de eletroforese (corrida).Equipamento e reagentes para gel de agarose: •Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel. em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos. •Tampão de amostra material denso (glicerol por ex. Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico •Transiluminador (caixa de luz UV). usado para visualizar o DNA corado com EtBr Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV) . Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE).

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stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg .http://www.

Tampão de amostra .

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Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA (ou RNA) Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.wikipedia.VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio (EtBr).org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis . http://en.

.Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.SYBR Green > Molecular Probes 1995 > Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: .É muito menos mutagênico. Consegue-se ver picogramas de DNA. .

Eletroforese Vertical .

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VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE Coomassie Blue Coomassie Brilliant Blue R250.jpg .ca/2005/22772/22772049. É menos sensível que corar com a prata mas efetivo também.ulaval. se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. http://www.theses. além de ser fácil de corar.

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. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250.Método da Prata A maior vantagem é a sensibilidade sobre os outros métodos. Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e análise de amostra diluída. A prata pode detectar também ácidos nucléicos. glicoproteínas e lipoproteínas.

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