Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

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via eletroforese. Usada em concentrações de 0.5 to 2%. Não-tóxico. .000 bp.Gel: composto de agarose ou poliacrilamida Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50. Fácil de preparar.

Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3. . A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. São mais difíceis de preparar. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Também usados para separação de proteínas. Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos de menos de 500 bp.5 a 20%).

usado para visualizar o DNA corado com EtBr Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV) .Equipamento e reagentes para gel de agarose: •Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel. em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese •Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas •Tampão de eletroforese (corrida).) e com cor para ver a amostra Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) •Brometo de Etídeo. Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico •Transiluminador (caixa de luz UV). •Tampão de amostra material denso (glicerol por ex. Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE).

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edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg .http://www.stolaf.

Tampão de amostra .

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org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis . Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA (ou RNA) Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA. http://en.wikipedia.VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio (EtBr).

. . Consegue-se ver picogramas de DNA.É muito menos mutagênico.SYBR Green > Molecular Probes 1995 > Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA.Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: .

Eletroforese Vertical .

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ulaval. É menos sensível que corar com a prata mas efetivo também. se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas.jpg .VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE Coomassie Blue Coomassie Brilliant Blue R250.ca/2005/22772/22772049.theses. http://www. além de ser fácil de corar.

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glicoproteínas e lipoproteínas. .Método da Prata A maior vantagem é a sensibilidade sobre os outros métodos. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250. A prata pode detectar também ácidos nucléicos. Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e análise de amostra diluída.

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