CRISTINE RODRIGUES

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA PRODUO DE CIDO CTRICO POR FERMENTAO NO ESTADO SLIDO UTILIZANDO POLPA CTRICA

Dissertao apresentada como requisito parcial para a obteno do grau de Mestre pelo Programa de Ps-Graduao em Processos Biotecnolgicos da Universidade Federal do Paran Orientador : profa Dra. Luciana P. S. Vandenberghe Co-orientador: prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol

Curitiba 2006

CRISTINE RODRIGUES

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA PRODUO DE CIDO CTRICO POR FERMENTAO NO ESTADO SLIDO UTILIZANDO POLPA CTRICA

Curitiba 2006

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Aos meus pais, exemplos de fora e honestidade, meu amor e admirao.

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AGRADECIMENTOS Professora Dra. Luciana Porto de Souza Vandenberghe por sua orientao, pacincia e apoio em todos os momentos na execuo deste trabalho. Ao Professor Dr. Carlos Ricardo Soccol pela co-orientao e apoio constantes. Ao Professor Dr. Willibaldo Schmidell Netto e Professora Dra. Adriane Bianchi Pedroni Medeiros, por to gentilmente aceitarem participar da banca de defesa desta dissertao. Mitiyo, Adriana e Juliana, pelo apoio e auxlio prestados durante os trabalhos realizados. Gisele, Michele, Cristina Beatriz, Clarice e Andra, pela amizade, risos, e apoio ao trabalho, obrigada. Aos colegas de trabalho e professores do Laboratrio de Processos Biotecnolgicos pela cooperao e auxlio. Aos meus familiares, em especial minha av Regina que rezou e, tenho certeza, ainda olha por mim, muita saudade. Aos Badenias pelo incentivo, descontrao e pacincia, muito obrigada. Ao Edgar pelo carinho, incentivo incondicional e infinita pacincia, todo meu amor. CAPES pelo suporte financeiro concedido durante o perodo de mestrado. UFPR e ao Programa de Ps-Graduao em Processos Biotecnolgicos pela estrutura necessria realizao deste trabalho.

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SUMRIO LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIAES RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUO 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVOS GERAIS 2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 3. REVISO BIBLIOGRFICA 3.1. POLPA CTRICA (PC) 3.2. CIDO CTRICO (AC) 3.2.1. APLICAO DO AC 3.2.2. PRODUO DO AC 3.2.2.1. Fermentao no Estado Slido (FES) 3.2.2.2. Aspectos da FES 3.3. MICRORGANISMO 3.3.1. Aspergillus niger 3.4. MUTAES 3.4.1. MUTAO INDUZIDA POR RADIAO 3.4.2. RADIAO ULTRAVIOLETA (UV) 3.4.3. MECANISMOS DE REPARO 3.4.4. CURVA DE SOBREVIVNCIA 3.5. FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUO DE AC 3.5.1. FONTE DE CARBONO 3.5.2. FONTE DE NITROGNIO 3.5.3. FONTE DE FSFORO 3.5.4. ELEMENTOS TRAOS 3.5.5. LCOOIS INFERIORES 3.5.6. pH 3.5.7. TEMPERATURA 3.5.8. AERAO 3.5.9. UMIDADE viii x xii Xiii xiv 1 4 4 4 5 6 9 10 13 15 18 20 21 22 24 25 26 27 27 28 29 29 30 30 31 31 32 33

3.5.10. GRANULOMETRIA DAS PARTCULAS DO SUBSTRATO 4. MATERIAIS E MTODOS 4.1. POLPA CTRICA 4.2. ATIVIDADE DE GUA 4.3. CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS 4.4. MICRORGANISMOS 4.4.1. RECUPERAO DE ESPOROS/PREPARO DE INCULO 4.4.2. CONTAGEM DE ESPOROS 4.4.3. CURVA DE ESPORULAO E VIABILIDADE EM PLACA 4.5. SELEO DE CEPAS PRODUTORAS DE AC 4.6. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE AC 4.7. OTIMIZAO DO PROCESSO DE PRODUO DE AC POR FES 4.7.1. pH E UMIDADE 4.7.2. FONTE DE CARBONO 4.7.3. GRANULOMETRIA DA PC 4.7.4. SAIS 4.7.5. FONTE DE NITROGNIO 4.7.6. LCOOIS INFERIORES AERAO FORADA 4.8.1. PREPARO DAS COLUNAS DE FERMENTAO 4.9. FERMENTAO EM BANDEJA PERFURADA 4.10. MUTAO INDUZIDA POR UV 4.10.1. PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA 4.10.1.1. MEIO MNIMO (MM) 4.10.1.2. MEIO COMPLETO (MC) 4.10.2. IRRADIAO POR UV FOSTER 4.10.4. FES DAS CEPAS OBTIDAS POR IRRADIAO DE UV 5. RESULTADOS E DISCUSSO SELEO DE CEPAS DE A. niger PRODUTORAS DE AC 5.1.1. ATIVIDADE DE GUA (aw) 5.1.2. CARBOIDRATOS 5.1.3. CARACTERIZAO FSICO-QUMICA DA PC

34 35 35 35 35 36 36 37 37 38 39 39 40 40 41 41 42 42

4.8. PRODUO DE AC EM BIORREATORES DO TIPO COLUNAS COM 42 45 45 46 46 46 47 47

4.10.3. TESTES DAS CEPAS OBTIDAS POR IRRADIAO DE UV EM MEIO 48 48 49

5.1. CARACTERIZAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DA PC E 49 49 49 50

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5.1.4. SELEO DE CEPAS PRODUTORAS DE AC DE PRODUO DE AC

51

5.2. OTIMIZAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS DO PROCESSO 53 5.2.1. CURVA DE ESPORULAO E VIABILIDADE CELULAR DO A. niger LPB 53 BC 5.2.2. pH E UMIDADE 5.2.3. FONTES DE CARBONO 5.2.4. GRANULOMETRIAS DA PC 5.2.5. ADIO DE SAIS 5.2.6. ADIO DE FONTES DE NITROGNIO 5.2.7. LCOOIS INFERIORES ERLENMEYER 5.2.9. COMPARAO DA PRODUO DE AC EM DIFERENTES MODELOS 71 DE BIORREATORES 5.2.9.1. FERMENTAO UTILIZANDO BANDEJA PERFURADA 5.2.9.2. FERMENTAO EM COLUNAS 5.2.9.3. PRODUO DE AC EM DIFERENTES MODELOS DE BIORREATORES SOBRE A CEPA A. niger LPB BC 5.3.1. FORMAO DE HALO DE PRODUO DE CIDO EM MEIO FOSTER 5.3.2. PRODUO DE AC EM FES COM AS CEPAS MUTANTES 6. CONCLUSES 7. SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS 8. REFERNCIAS 76 80 83 85 86 71 72 75 55 57 60 61 63 65

5.2.8. CINTICA FINAL EM FES COM AS CONDIES OTIMIZADAS EM 68

5.3. ESTUDO DA MUTAO INDUZIDA POR IRRADIAO DE RAIOS UV 76

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Tabela 8 Tabela 9 Tabela 10 Tabela 11 Tabela 12 Tabela 13 Tabela 14 Tabela 15 Tabela 16 Tabela 17 Tabela 18 Tabela 19 Tabela 20 Tabela 21 Tabela 22 - Propriedades do Farelo de PC - Exportao do Farelo de PC por Ano Safra - Utilizao do cido Ctrico Comparativos Entre Fermentao no Estado Slido Fermentao Submersa - Produo de AC por FES Utilizando Vrios Tipos de Substratos - Principais Fatores Qumicos que Influenciam a Produo de AC - Planejamento Estatstico para Estudo da Adio de Sais - Tempos de Reteno de Alguns Gases Monitorados por CPG PC Peletizada - Caractersticas Fsico-Qumicas da PC Crescimento das Colnias de Cepas de A. niger - Ensaios de Variao de pH e Umidade Inicial para Produo de 55 AC por FES Utilizando PC - Produo de AC com Adio de Fontes Diferentes de Carbono 58 Comerciais - Influncia da Adio de Diferentes Sais na Produo de AC Etanol ao Meio de Fermentao - Produo de AC com Diferentes Concentraes de Metanol com 67 Adio ou no de Mel de Cana a 108 g/L - Acompanhamento da Cintica Final de Produo de AC por FES 68 Utilizando PC com a Cepa A. niger LPB BC - Resultados da Produo de AC por FES em Colunas com 73 Aerao Forada - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 77 Tratamento da Placa A Oriundas do MC - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 77 Tratamento da Placa B Oriundas do MC - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 77 Tratamento da Placa C Oriundas do MC - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 78 62 - Resultados da Adio de Diferentes Concentraes de Metanol e 65 50 - Diferenas entre Halo de Produo de cido e Halo de 51 18 28 41 44 07 09 11 e 16

- Resultados da Quantificao de Acares Totais e Redutores na 50

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Tratamento da Placa D Oriundas do MC Tabela 23 Tabela 24 Tabela 25 Tabela 26 Tabela 27 Tabela 28 - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 78 Tratamento da Placa E Oriundas do MC - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 78 Tratamento da Placa A Oriundas do MM - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 79 Tratamento da Placa B Oriundas do MM - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 79 Tratamento da Placa D Oriundas do MM - Razo Entre DC e DH da Colnia Controle e das Colnias 79 Tratamento da Placa E Oriundas do MM - Produo de AC por FES das Cinco Cepas Mutantes aps dois 81 Meses de Conservao em PDA sob Refrigerao

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 - Representao das Partes Extradas Industrialmente da Laranja - Farelo de Polpa Ctrica Peletizado - Fluxograma da Extrao de Sub-Produtos da Laranja - Esquema Geral do Acmulo de AC no Ciclo de Kreb`s - Esporos de A. niger - Cmara de Neubauer - Crescimento do fungo A. niger em Meio Foster - Representao do Sistema de Fermentao em Colunas com Aereo Forada - Cintica da Produo de AC por FES Utilizando Diferentes Cepas de A. niger - Evoluo do Nmero de Esporos Durante o Crescimento do A. niger LPB BC - Cintica de Contagem em Colnias de A. niger LPB BC em Placas de Petri - Superfcie de Resposta dos Testes de Variao de pH e Umidade em FES - Diagrama de Pareto para Teste da Influncia do pH e da Umidade na Produo de AC por FES Utilizando PC - Produo de AC com Adio de Mel de Cana como Fonte de Carbono Suplementar - Diagrama de Pareto do Teste de Adio de Sais para a Produo de AC por FES Utilizando PC - Produo de AC por FES Utilizando a PC com a Adio de Fontes Suplemetares de Nitrognio - Produo de AC com Adio de Diferentes Concentraes de Mel de Cana Utilizando 6% de Metanol - Cintica de Consumo de Acares e Produo de AC - Produo de AC em FES Utilizando Bandeja Perfurada com Leito de 3 cm - Consumo de O2 e Produo de CO2 Durante FES de Produo de AC por A. niger LPB BC - FES das Cepas de A. niger Obtidas por Irradiao de Raios UV Sobre a Cepa A. niger LPB BC 81 74 70 72 66 64 62 60 57 56 54 54 52 06 07 08 14 23 37 38 43

Figura 22

- Cintica para Produo de AC por FES das Cepas A. niger LPB B3 e A. niger LPB B6

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LISTA DE ABREVIAES AC aw A. niger CA CP FES LPB MC MM PC SSF UFPR UV cido Ctrico Atividade de gua Aspergillus niger Ctric Acid Citric Pulp Fermentao no Estado Slido Laboratrio de Processos Biotecnolgicos Meio Completo Meio Mnimo Farelo de Polpa Ctrica Peletizado Solid State Fermentation Universidade Federal do Paran Ultra Violeta

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RESUMO O presente trabalho teve por principal objetivo a produo de um concentrado rico em cido ctrico (AC) por fermentao no estado slido (FES) a partir da polpa ctrica (PC). Quatro cepas do fungo A.niger (LPB 21, LPB 28, LPB 326, LPB 03) existentes no banco de cepas da Diviso de Engenharia de Bioprocessos e Biotcnologia da UFPR, e uma cepa de A. niger LPB BC isolada de bagao de cana-de-acar neste Laboratrio, foram selecionadas qualitativa e quantitativamente para produo de AC. O teste qualitativo consistiu na medida do halo de produo de cido em meio Foster. As cepas foram em seguida submetidas cintica de produo de AC em FES utilizando PC como substrato nas condies estudadas em trabalhos anteriores neste Laboratrio. A cepa A. niger LPB BC apresentou os melhores resultados (383 g de AC/Kg de PC seca) no 4o dia de fermentao. Realizou-se a otimizao dos parmetros fsico-qumicos da fermentao com a cepa A. niger LPB BC em frascos Erlenmeyer de 250mL, onde a melhor produo se deu a 65% de umidade e pH de 5.5. Nestas condies foram realizados estudos da influncia da adio de acares comerciais (glicose, frutose e sacarose). Os melhores resultados foram obtidos com adio de alta concentrao de sacarose (216 g/L) justificando a utilizao de fontes mais baratas como melao de soja e o mel de cana, onde obteve-se os melhores resultados com o mel de cana (108 g/L de acares totais 445,4g de AC/Kg de PC). Realizou-se, posteriormente testes com adio de fontes de nitrognio, sais e lcoois inferiores (metanol e etanol) sendo que nenhum deles apresentou efeito significativo no aumento da produo de AC. A granulometria da PC foi testada e os melhores resultados foram obtidos com PC moda sem peneiramento. Sendo assim, ficou definido que as melhores condies de produo de AC por FES utilizando A. niger LPB BC e a PC como substrato foram: pH 5,5, umidade 65%, mel de cana a 108 g/L de acares totais, metanol a 4% e PC apenas moda, onde se obteve um aumento de 17,5 % na produo de AC. Foram realizadas fermentaes em escala semi-piloto em colunas de vidro e em bandejas perfuradas onde os melhores resultados foram obtidos em bandejas perfuradas (410 g de AC/Kg de PC). A cepa A. niger LPB BC foi ento submetida induo de mutao por UV. Obteve-se duas cepas que apresentaram melhores resultados de produo de AC: A. niger LPB B3 (537,6 g/Kg de PC) e a A. niger LPB B6 (616,5 g/Kg de PC). Desta forma pretende-se transferir o processo para escala semi-piloto e piloto de forma a obter um produto rico em AC que possa ser utilizado em escala industrial para complemento em rao animal. Palavras-chave: FES, A. niger, cido ctrico, polpa ctrica, biorreatores tipo bandejas

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ABSTRACT The present work had for main objective the attainment of a rich concentrate in citric acid (CA). Four strains of fungus A.niger (LPB 21, LPB 28, LPB 326, LPB 03) available at bank of strains of the Biotechnological Processes Laboratory of the UFPR, and a isolated strain of A. niger LPB BC from sugar cane bagasse, had been selected qualitatively and quantitatively for CA production. The qualitative test consisted of measure of the halo of production of acid in Foster media. After that the strains had been submitted to kinetic of production of CA in SSF using CP as substrate in the conditions studied in previous works. The best results were achieved with the strain A. niger LPB BC (383 g of dry CA/Kg of CP) in fourth day of fermentation. The parameters physical-chemical of the fermentation were optimized using the strain A. niger LPB BC in 250 mL erlenmeyer flasks, where the best production was 65% of moisture and pH 5.5. In these conditions the influence of the addition of commercial sugars (glucose, fructose and sucrose) had been studied. The best ones results had been achieved with additions of high concentrations of sucrose (216 g/L) justifying the use of sources cheaper as soy molasses and the sugar cane honey, where it got the best ones resulted with the sugar cane honey (108g/L of total sugars 445.4g of CA/Kg of CP). Afterwards, tests with addition of nitrogen sources, salts and alcohols (methanol and ethanol) being that none of them presented significant effect in the increase of the AC production. Differents granulometries of the CP was tested and the best ones resulted had been obtained with CP grinded without sieve. Being thus he was defined that the best conditions of production of CA for SSF using A. niger LPB BC and CP as substrate were: pH 5.5, moisture 65%, sugar cane honey the 108 g/L of total sugars, methanol 4% and CP grinded without sieve, where an increase of 17.5 % had been obtained in the CA production. Semi-pilot scale fermentations were realized in glass columns and perforated trays where the best yield had been obtained in perforated trays (410 g of CA/Kg of CP). The A. niger LPB BC strain then was submitted induction of mutation by UV. Two strains showed the best results of CA production: A. niger LPB B3 (537.6 g/Kg of CP) and A. niger LPB B6 (616.5 g/Kg of CP). Of this form it is intended to transfer to the process to scale semipilot and pilot of form to get a rich product in CA that can be used in industrial scale for complement in animal feed. Key-words: SSF, A. niger, citric acid, citric pulp, bioreactors of perforated trays

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1. INTRODUO O cido ctrico (AC) um dos produtos de fermentao mais produzidos no mundo, devido, entre outras caractersticas, a sua baixa toxicidade quando comparado a outros acidulantes utilizados pelas indstrias farmacuticas e de alimentos. A produo mundial de AC em 2004 foi estimada em 1,4 milhes de toneladas pelo Business Communications Co. (BCC) em estudos recentes sobre fermentaes (GRAF, 2005). Alm disso, devido sua grande aplicao e baixos preos, espera-se que o consumo cresa significativamente at 2009, o que mostra a necessidade das indstrias buscarem novas alternativas em tecnologias e na reduo dos custos de produo do AC (VANDENBERGHE, 2000). O AC (cido 2-hidroxi-1,2,3-propanetricarboxilico) possui frmula molecular C6H8O7, tem boa solubilidade em gua, ponto de fuso de 1530C e peso molecular de 192,12. Quando aquecido comea a se decompor em outras substncias a 1750C. o principal constituinte das frutas ctricas constituindo um metablito normal do organismo humano sendo completamente metabolizado (ABOUT-ZEID e ASHY, 1984). O AC tem uso bastante variado. Cerca de 70% usado pela indstria de alimentos e bebidas, 12% pela indstria farmacutica e 18% por outras indstrias. Estudos recentes mostram que tm sido desenvolvidos vrios testes relacionados aos efeitos do uso de cidos orgnicos como complemento das raes para animais (BOLING, ANKENBACH et al.,2001; TSILOYIANNIS et al., 2001). Desta forma h um crescente interesse na procura de solues para produo em larga escala do AC. H trs diferentes processos para obteno de AC: extrao de frutas ctricas, sntese ou fermentao. Desde 1920, a fermentao o processo mais econmico e mais utilizado, representando mais de 90% da produo mundial de AC atravs do fungo Aspergillus niger. O processo de obteno de AC por fermentao apresenta como vantagens operaes simples, baixo consumo de energia e no requer um controle do sistema muito sofisticado (TIMEIS, 2000).

O processo de fermentao submersa tem sido o mais utilizado atualmente na produo de larga escala. A fermentao no estado slido (FES) - processo Koji - inicialmente foi considerado para produes pequenas (YOKOYA, 1992), mas hoje em dia estuda-se como mais uma alternativa para a produo do AC (VANDENBERGHE, 2000). Uma grande variedade de substratos pode ser utilizada na produo de AC por FES, principalmente os sub-produtos e resduos da agroindstria. No cenrio nacional existem inmeras oportunidades para o estabelecimento de atividades industriais voltadas ao beneficiamento e/ou re-processamento de bioresduos, entre os quais podem ser citados como exemplo o bagao de cana, de mandioca e o farelo de polpa ctrica (PC) (KOLICHESKI, 1995, SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003). O uso de resduos agroindustriais como suporte na FES economicamente importante do ponto de vista ambiental, pois alm de reduzir o impacto que causa sobre a natureza valoriza os resduos agrcolas e agroindustriais. Visando maior produtividade e baixo custo na gerao de tecnologia de produo e aproveitamento de resduos, tm-se estudado algumas alternativas de utilizao dos subprodutos da agroindstria, seleo de microrganismos mais competitivos e adaptados a processos fermentativos para a fermentao ctrica. A PC um subproduto da indstria de sucos obtido por meio do tratamento de resduos slidos e lquidos remanescentes da extrao do suco de laranja. Entre esses resduos esto: cascas, sementes e polpas de laranjas, o que equivale a 50% do peso de cada fruta. Uma vez que estes resduos ctricos so ricos em carboidratos e outros nutrientes, apresentam-se como substrato vivel para produo de AC por FES. Sua exportao anual gira em torno de um milho de toneladas. bastante usada como complemento para a rao animal, principalmente na pecuria (ABECITRUS, 2006). Uma vez que a PC utilizada, assim como o AC, como complemento para a rao animal, justifica-se estudos para produo deste cido utilizando a PC como substrato em FES. O presente trabalho d continuidade a trs estudos j realizados: KOLICHESKI (1995) e VANDENBERGHE (2000), que desenvolveram em escala laboratorial a otimizao da produo de AC por FES a partir do resduo 2

da agroindstria da mandioca, o bagao de mandioca; e PRADO (2002), que produziu cido ctrico em escala semipiloto usando o mesmo resduo e dois tipos de biorreatores: bandejas e tambor horizontal. Desta forma, este trabalho visa desenvolver bioprocessos para a produo de um concentrado rico em AC por FES em escala laboratorial a partir do resduo agroindustrial PC com o fungo Aspergillus niger e sua aplicao em nutrio animal. Foram realizados estudos para a otimizao do processo fermentativo de produo de AC por FES em escala laboratorial e semipiloto a partir do resduo agroindustrial farelo de polpa ctrica com o fungo A.niger. Desta forma pretende-se estimular o desenvolvimento de processos que valorizem e agreguem valor aos produtos agrcolas produzidos no Brasil, especificamente s matrias-primas e subprodutos agroindustriais.

2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVOS GERAIS O presente projeto visa desenvolver bioprocesso para a produo de um concentrado rico em AC por FES em escala laboratorial e semipiloto a partir do resduo agroindustrial PC com o fungo A. niger e sua aplicao em nutrio animal. 2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Isolar e selecionar cepas do gnero Aspergillus produtoras de cido ctrico a partir de resduos slidos agrcolas e agroindustriais; Testar e selecionar cepas do gnero Aspergillus de bancos de cepas internacionais para a produo de cido ctrico; Caracterizar o substrato/suporte PC a ser utilizado atravs de anlises fsico-qumicas; Otimizar a produo de AC atravs do estudo da influncia de fatores qumicos e fsicos sobre os processos em escala laboratorial; Acompanhar o metabolismo dos microrganismos selecionados atravs do seu comportamento em estudo da cintica da produo do AC por FES, nas condies otimizadas (frascos de Erlenmeyer), com a PC; Realizar mutao por variabilidade induzida por UV da cepa que apresentar os melhores resultados de produo de AC; Realizar testes em escala semipiloto em biorreatores do tipo bandeja perfurada em condies otimizadas, como um estudo prvio para a transferncia de tecnologia para o setor produtivo; Todas as etapas foram realizadas nos laboratrios da Diviso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da UFPR.

3. REVISO BIBLIOGRFICA O Brasil possui uma das mais importantes economias baseadas na agricultura no mundo, por sua produo de caf, cana-de-acar, soja, frutas, entre outros. Praticamente todo produto exportado, tornando este fato uma definitiva contribuio para o desenvolvimento econmico (SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003). Os resduos de processos agrcolas, gerados em abundncia no Estado do Paran, causam graves problemas ambientais quando dispostos na natureza (SOCCOL, 1996a; PANDEY et al., 2000b). A aplicao destes resduos, alm de ser uma alternativa em termos de substrato em processos fermentativos, auxilia na reduo dos problemas de poluio ambiental (SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003). O uso do bagao de mandioca como suporte na FES economicamente importante, pois est diretamente relacionado com a valorizao dos resduos slidos da industrializao da mandioca (SOCCOL, 2001). O bagao de cana, resduo fibroso da indstria do acar, tambm tem sido utilizado como substrato em vrios processos que empregam a FES (PANDEY et al., 2000a). No Laboratrio de Processos Biotecnolgicos (UFPR) j foram desenvolvidos processos alternativos para a produo de AC produzido por FES a partir de bagao de mandioca (KOLICHESKI, 1995; SOCCOL et al., 1999; VANDENBERGHE, 2000; PRADO, 2002), enquanto KUMAR et al. (2002) produziram AC por FES usando como substrato o bagao de cana. No cenrio nacional existem inmeras oportunidades para o estabelecimento de atividades industriais voltadas ao beneficiamento e/ou reprocessamento de bioresduos, entre os quais podem ser citados como exemplo o bagao de cana e de mandioca, a casca do coco de babau, a palha de cereais, o bagao da laranja, a polpa da ma, o caule e o sabugo do milho, a serragem, diversos tipos de papis reciclveis e outros resduos de atividades florestais. Sendo o AC um dos produtos de fermentao mais produzidos no mundo, h um grande incentivo procura de solues para a sua produo. O uso de resduos em FES economicamente importante, pois fornece alternativa 5

biotecnolgica

para

valorizao

dos

resduos

slidos

agrcolas

agroindustriais. Para viabilizar qualquer processo produtivo industrial necessrio utilizar matrias primas baratas e baixar os custos da produo, sem prejuzo qualidade do produto final. 3.1. POLPA CTRICA (PC) O Brasil o maior produtor e exportador mundial de suco de laranja e seus subprodutos, disputando com os Estados Unidos a hegemonia nesse mercado. O Estado de So Paulo concentra 80% da produo de frutas e 90% da capacidade de processamento (SILVA et al., 1998; ABECITRUS, 2006). Atualmente, 10 indstrias afiliadas a ABECITRUS (Associao Brasileira dos Exportadores de Ctricos), respondem por 98% da produo mundial de suco de laranja concentrado (CETESB, 1990). Apesar do suco ser o principal produto da laranja, vrios subprodutos com valor comercial so obtidos durante o seu processo de fabricao. Entre esses esto os leos essenciais (leos volteis que so retirados da casca da laranja), limoneno (frao oleosa obtida da destilao dos resduos midos da laranja) e o farelo de polpa ctrica (obtido por meio do tratamento de resduos slidos e lquidos remanescentes da extrao do suco). Eles possuem diferentes aplicaes, as quais incluem a fabricao de produtos qumicos e solventes, aromas e fragrncias, tintas, cosmticos e complemento para rao animal (Figura 1). FIGURA 1 REPRESENTACO INDUSTRIALMENTE DA LARANJA. DAS PARTES EXTRADAS

FONTE: ABECITRUS, 2006.

O farelo de polpa ctrica peletizado (PC) ou farelo de casca de laranja (Figura 2) obtido por meio do tratamento de resduos slidos e lquidos remanescentes da extrao do suco (Figura 3). Entre esses resduos esto cascas, sementes e polpas de laranjas. Este material equivale a 50% do peso de cada fruta e tem uma umidade de aproximadamente 82%. Aps passar pelo processo de industrializao onde a polpa triturada e seca at chegar a 12% de umidade, o produto peletizado (ABECITRUS, 2006). FIGURA 2 - FARELO DE POLPA CTRICA PELETIZADO

FONTE: ABECITRUS, 2006. Devido suas caractersticas fsico-qumicas (tabela 1) e a grande quantidade produzida anualmente, a PC pode ser considerada como um substrato em potencial para utilizao em FES (KOLICHESKI, 1995; SOCCOL, 1996A; PANDEY et al., 2000; VANDENBERGHE, 2000). TABELA 1 - COMPOSIO DO FARELO DE PC.
PROPRIEDADES Umidade (mximo) Protena Bruta (mnimo) Extrato Etreo (mnimo) Fibra Bruta (mximo) Matria Mineral (mximo) Dioxinas/Furanos (mximo)

VALOR 12,0% 5,0% 1,5% 14,0% 8,0% 500 pg/kg I - TEQ

FONTE: ABECITRUS, 2006.

FIGURA 3 - FLUXOGRAMA DA EXTRAO DE SUB-PRODUTOS DA LARANJA

FONTE: CETESB, 2006.

A PC um resduo da agroindstria brasileira cuja exportao anual gira em torno de um milho de toneladas por ano (Tabela 2). utilizado principalmente como complemento para a rao animal, principalmente na pecuria. Tem boa aceitao como insumo na rao de rebanhos bovinos (leite e corte). Por tratar-se de um produto que absorve a umidade, muito importante que o farelo seja transportado e armazenado em locais muito secos, ventilados e totalmente cobertos. Do contrrio podem surgir microrganismos causadores de fermentao e bolor. Neste caso o produto no poder ser utilizado na composio da rao. Recomenda-se no armazenar este produto por mais de 60 dias. TABELA 2- EXPORTAO DO FARELO DE PC POR ANO SAFRA
Ano/Safra 2000/01 2001/02 2002/03 2003/04 2004/05 Quantidade exportada (em toneladas) 769.731 712.031 1.011.073 875.937 986.749

FONTE: Secex, 2005. 3.2. ACIDO CTRICO (AC) O AC um dos produtos de fermentao mais produzidos no mundo, principalmente por fermentao submersa de meios a base de sacarose ou amido, usando o fungo filamentoso Aspergillus niger. Recentemente observase na literatura um aumento no nmero de relatos do uso de processos de fermentao no estado slido (FES) como uma alternativa em relao fermentao submersa (VANDENBERGHE, 2000). O AC apresenta-se na forma de cristais translcidos brancos, possui sabor cido, no possui odor e levemente higroscpico (CARGILL, 2000). Est presente em todas as clulas vivas que necessitam de compostos de carbono como fonte de energia; um metablito normal no organismo humano

sendo quase completamente metabolizado quando consumido (ABOU-ZEID e ASHY, 1984). 3.2.1. APLICAES DO AC O AC considerado GRAS (geralmente reconhecido como um produto seguro) pela United States Food and Drug Administration e aditivo alimentcio seguro pelo Experts Committee de FAO/WHO, sem restries quantidade usada (CARGILL, 2000). Assim, alm da grande quantidade utilizada em alimentos, bebidas e frmacos, tambm empregado em uma vasta quantidade de processos industriais (NOTHENBERG, 1983; PANDEY et al., 2001, SOCCOL et al., 2003). Na indstria de alimentos utilizado em larga escala como acidulante por apresentar sabor agradvel, baixssima toxicidade e alta solubilidade (KAPOOR et al., 1982, SOCCOL et al., 2003). Alm disso, esse cido tem a capacidade de complexao com metais pesados como o ferro e o cobre. Essa propriedade tem conduzido crescente utilizao como estabilizante de leos e gorduras para reduzir a sua oxidao catalisada por esses metais. Tambm, essa propriedade aliada ao baixo grau de corrosividade a certos metais tem permitido seu uso na limpeza de caldeiras e instalaes especiais. O emprego de cido ctrico como desincrustador de equipamentos industriais, como caldeiras e trocadores de calor, conta com 4% do consumo, como tendncia a aumento na sua participao (NOTHEMBERG, 1983). Em alguns casos, o citrato substitui o fosfato nos detergentes para aumentar sua potncia. Essa propriedade usada no s para limpeza de metais, mas tambm para detergentes domsticos. Pelo fato de ser facilmente biodegradvel, o seu uso vem sendo ampliado em substituio aos polifosfatos. Na indstria farmacutica, o AC usado como estabilizante de cido ascrbico por causa de sua ao quelante. Nos anticidos e analgsicos efervescentes, o AC usado juntamente com carbonatos e bicarbonatos para gerar gs carbnico. ainda usado como aninios para preparo de medicamentos onde requerida a administrao de catinios especficos como ferro e clcio. Sais de citrato, como citrato trissdico e citrato tripotssico, so usados na medicina para evitar a coagulao do sangue e na indstria 10

alimentcia como emulsificante para fabricao de certos produtos como queijo. Sais sdicos de cido ctrico so tambm usados nas indstrias de alimentos, de produtos farmacuticos e de higiene para conferir o poder tampo. steres de AC, como trietil, tributil e acetildibutil, so usados como plastificante no txico nas pelculas plsticas de embalagem de alimentos. Monoestearil-citrato usado como antioxidante de leos e gorduras no lugar do cido ctrico por ser mais facilmente incorporado ao produto. O AC compete diretamente no mercado de acidulantes com o cido ltico, cido fumrico e cido fosfrico. O setor alimentcio responsvel pelo consumo de 22%, refrigerantes carbonatados, de 15% e bebidas em p, 10%. O setor de cosmticos responde por cerca de 8%. Outras utilidades do cido ctrico esto descritas na Tabela 3. TABELA 3 - UTILIZAO DO AC UTILIZAO Estabilizante de leos e gorduras e limpeza de caldeiras Melhora a disponibilidade de P para as plantas Condicionador qumico sobre a superfcie dental Possibilita avaliar o contedo de micronutrientes em fertilizantes Complexao de ctions na confeco de cermicas Extrator de metais pesados Complemento de rao animal PIRES et al., 2004 BOLING, ANKENBACH et al., 2001 Segundo HAYNES (1984), o solo pode adsorver cidos orgnicos com grande energia, ocupando os stios de adsoro de fosfato, aumentando a disponibilidade deste elemento para as plantas. Esses cidos podem tambm formar complexos organometlicos estveis com ferro e, ou, alumnio, em vrias faixas de pH (SPOSITO, 1989). O cido ctrico aplicado ao solo acarreta, ROCHA e MUCCILLO, 2001 ALCARDE e VALE, 2001 ANDRADE et al., 2003 NETO e GREGHI, 2003 REFERNCIA NOTHEMBERG, 1983

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de modo geral, diminuio da adsoro e conseqente aumento na concentrao de fsforo na soluo de equilbrio (ANDRADE et al., 2003). Sabe-se que a raspagem da superfcie dental pode deixar pequenos clculos, estes podem ser removidos por condicionamento qumico sobre a superfcie dental. O cido ctrico quando testado desmineralizou parcialmente um pequeno clculo sub-clnico deixado na raspagem, tendo se mostrado uma alternativa para este tipo de tratamento (NETO e GREGHI, 2003). Como uma alternativa para o teor total, que no um critrio adequado, do ponto de vista agronmico, para avaliar os micronutrientes contidos em fertilizantes, uma soluo de cido ctrico (20 g/L) mostrou-se como possibilidade de avaliar com mais segurana, o contedo de micronutrientes como B, Zn, Fe, Cu e Mn (ALCARDE e VALE 2001). Tambm o teor fitodisponvel de metais pesados presentes em solos tratados com lodo de esgoto foi avaliado com uma soluo extratora contendo cido ctrico (0,72 mol/L) apresentando correlaes significativas, indicando a eficincia do extrator (ROCHA e MUCCILLO, 2001). Este tipo de extrao fundamental na avaliao do risco de entrada de metais pesados, potencialmente txicos, na cadeia alimentar. Estudos recentes mostram que tm sido desenvolvidos vrios testes relacionados aos efeitos do uso de cidos orgnicos como complemento das raes para animais. BOLING, ANKENBACH et al., 2001 estudaram o efeito do cido ctrico na absoro de clcio e fsforo por frangos alimentados com rao a base de milho e soja. Os resultados mostraram que a adio de 6% do cido na rao no afetou significativamente a absoro de clcio pelos frangos, porm, o uso de 4-6% do cido apresentou as maiores respostas em termos de crescimento e aumentou a absoro de fsforo. SUGIURA et al. (1998) testaram os efeitos de alguns suplementos em raes para peixes. Os resultados mostraram um aumento na absoro de clcio, fsforo, magnsio, ferro, mangans e estrncio quando a rao foi suplementada com cido ctrico. TSILOYIANNIS et al. (2001) testaram o cido ctrico em leites, no controle da diarria ps-desmama. Seu uso, em concentrao de 1,5%, reduziu a incidncia e a intensidade da diarria. Estes efeitos foram associados reduo do pH estomacal, causado pela ingesto do cido ctrico, o qual inibiu a intensa proliferao de bactrias, mais especificamente a E. coli. 12

3.2.2. PRODUO DO AC A produo de AC atravs de processos fermentativos j conhecida h mais de cem anos, quando Wehmer em 1893 descobriu que linhagens de fungos Citromyces (hoje identificado como Penicillium sp.) e Mucor possuam a capacidade de acumular quantidades considerveis do cido durante o seu cultivo (RHR et al., 1983). Mas a sua transferncia para a escala industrial no teve sucesso principalmente por causa da contaminao j que o tempo de fermentao era muito longo (vrias semanas) e o pH de operao era prximo da neutralidade. Somente em 1917 foi construda a primeira planta de produo desse cido na Blgica, graas a estudos de Currie que estabeleceu algumas condies de produo. Esta fbrica j utilizava o fungo A. niger, cujo desenvolvimento se dava em pH 2,5 a 3,5, a produo do cido ocorria a pHs inferiores a 2,0. Isso possibilitou o controle mais simples da contaminao com um tempo de fermentao de 1 a 2 semanas. O trabalho pioneiro de Currie mostrou algumas bases para adequao do processo fermentativo tais como: necessidade de concentrao elevada de acar e a constatao de que as condies de melhor produo do cido coincidem com a restrio do crescimento micelial. Logo aps a fbrica da Blgica surgiram outras fbricas, nos Estados Unidos, Inglaterra, Checoslovquia, Unio Sovitica e Alemanha, que comearam a produzir cido ctrico por fermentao (YOKOYA, 1992). Com a descoberta da via glicoltica e do ciclo do cido tricarboxlico (TCA) na dcada de 50, foi possvel elucidar a biossntese bsica do cido ctrico a partir da glicose. A base bioqumica do processo envolve trs etapas: (a) quebra da glicose gerando piruvato e acetil-CoA atravs da gliclise, (b) formao de oxaloacetato a partir do piruvato e CO2 e (c) acmulo do AC no ciclo de Kreb`s (KUBICEK e RHR, 1986; PANDEY et al., 2001).

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FIGURA 4 - ESQUEMA GERAL DO ACMULO DE AC NO CICLO DE KREB`S

A glicose utilizada na sntese do AC quebrada atravs de duas vias: 80% pelas reaes de Embden Meyerhof Parnas (EMP), tambm chamada via glicoltica, e 20% pelas reaes da via monofosfato de hexose (HMP). Durante a fase de crescimento do fungo, a relao entre estas duas vias de 2:1, e durante a produo de AC esta proporo aumenta para 4:1 (YOKOYA, 1992; PANDEY et al., 2001). A via glicoltica tem duplo papel: degradao da glicose para gerao de ATP e fornecimento de elementos para biossnteses celulares. A velocidade da gliclise regulada para atender a essas duas necessidades. Desde 1920, a fermentao o processo mais econmico e mais utilizado na produo industrial de AC, representando mais de 90% da produo mundial. Este processo apresenta como vantagens operaes simples, baixo consumo de energia e no requer um controle do sistema muito sofisticado (TIMEIS, 2000). Industrialmente, h trs formas de conduzir a fermentao ctrica: processo submerso, processo de superfcie e processo em estado slido (ou processo Koji). Os processos Koji e de superfcie so os mais antigos e adequados para conduzir a fermentao em pequena e mdia escala (at 10 t/dia). J o processo submerso destinado produo em grande escala (YOKOYA, 1992).

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3.2.2.1. Fermentao no Estado Slido (FES) A fermentao no estado slido (FES) foi desenvolvida originalmente no Japo onde se utilizavam subprodutos como farelo de arroz e cascas de frutas. Neste processo o fungo se desenvolve na superfcie, como no processo de fermentao em superfcies, porm a base constituda de material slido com umidade em torno de 70%, dependendo do material. Aps esterilizao, o pH do substrato ajustado para 4,5-6,0 e o material inoculado, normalmente com esporos de A. niger, e transferido para o biorreator. Geralmente utilizamse bandejas para aumentar o espao de exposio ao ar. A temperatura de incubao de 28-30C, de acordo com o microrganismo utilizado. O tempo de fermentao varia de 4 a 6 dias (KUBICEK e RHR, 1986; YOKOYA, 1992; GREWAL e KALRA, 1995; SOCCOL et al., 2002). A FES uma alternativa interessante uma vez que os metablitos obtidos so mais concentrados e o processo de purificao menos oneroso (KOTWAL et al., 1998). O processo de FES pode ser definido como uma tcnica de crescimento de microrganismos sobre e no interior de partculas porosas midas (suporte ou matriz slida), onde o contedo de lquido contido nesta matriz deve ser mantido a um nvel correspondente atividade de gua. Assim, assegurado o conveniente crescimento do metabolismo celular que no exceda a capacidade mxima de reteno de gua na matriz. O suporte slido pode ser constitudo por um substrato naturalmente mido ou por uma matriz inerte capaz de absorver os nutrientes que se encontram em soluo reproduzindo as condies de baixa atividade de gua e alta transferncia de oxignio (OOJIKAAS et al., 2000; KOLICHESKI, 1995; VANDENBERGHE, et al., 2000, SOCCOL et al., 2002). A FES, que envolve o crescimento de microorganismos (tipicamente fungos), tem considervel potencial econmico na indstria produtora de alimentos, farmacuticos e agricultura em geral. Devido ao grande sucesso da escala industrial da fermentao submersa, a tcnica foi muito pouco explorada.

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No entanto, a FES nos ltimos anos, tem sido vista com interesse renovado uma vez que apresenta algumas vantagens sobre a fermentao submersa (OOJIKAAS, 2000; SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003). Vrios autores apresentam as vantagens e desvantagens da FES (SOCCOL, 1994; KOLICHESKI, 1995; VANDENBERGHE, 2000; SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003). Podem ser citadas algumas vantagens como: condies da cultura em FES prximas as que se desenvolvem em meios naturais; simplicidade no preparo do meio de cultura; diminuio de contaminaes; reduo dos efluentes lquidos a tratar; resduos slidos mais estveis aps a fermentao; produo concentrada de metablitos e eliminao da formao de espuma. Por outro lado, as limitaes da tcnica ainda impedem sua ampla utilizao industrial: dificuldade de remoo de calor devido baixa condutividade trmica da matria, tipos de substratos limitados e a dificuldade de se medir parmetros como pH, oxignio dissolvido, quantidade de gua e concentrao do substrato no estado slido. As diferenas bsicas entre a fermentao submersa e no estado-slido so a seguir apresentadas na Tabela 4: TABELA 4 - COMPARATIVOS ENTRE FERMENTAO NO ESTADOSLIDO E FERMENTAO SUBMERSA. Fermentao no Estado Slido Meio de cultura no flui livremente Profundidade do meio limitado Fermentao Submersa Meio de cultura sempre flui livremente Profundidade do meio varivel com o biorreator Grandes quantidades de consumo de Consumo limitado de gua, baixa aw, gua e descarte de efluentes calor Fcil aerao e grande rea de Aerao requere elevado fluxo. contato ar/substrato Substrato tampo Condies estticas Fcil controle de pH Boa homogenizao sem efluentes. Baixa capacidade de transferncia de Fcil controle de temperatura

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Equipamentos Industriais disponveis Inoculao de esporos, batelada crescimento lento Baixo consumo de energia equipamentos

Necessita projetos. Fcil inoculao, processo contnuo do cido ltico Elevado consumo energtico tecnolgico.

Risco de contaminao por fungos de Risco de contaminao por bactrias

Pequenos volumes e baixos custos de Grandes volumes e elevado custo

FONTE: HOLKER et al. 2004; RAIMBAULT, 1997; ROUSSOS et al., 2003. Algumas das limitaes para a utilizao da FES podem ser minimizadas com alguns procedimentos operacionais como, por exemplo, o aumento excessivo de temperatura do substrato fermentado pode ser controlado atravs do aumento na vazo de ar (em sistemas que utilizam aerao forada) ou revolvendo o material durante o perodo de maior aumento de temperatura (entre 24 e 72 horas de fermentao). A determinao da biomassa fngica, parmetro de maior dificuldade de se determinar em FES, pode ser estimada monitorando o consumo de oxignio durante o processo fermentativo. A asperso de gua no substrato evita o ressecamento durante a fermentao. Vrios tipos de fermentadores tm sido utilizados para FES em modelo contnuo ou em batelada. Uma caracterstica comum em quase todos esses modelos tem sido sua simplicidade no funcionamento. Estudos laboratoriais geralmente so conduzidos em frascos (reatores de vidro), bequers, placas de petri, jarros e colunas de vidro (SOCCOL et al., 2001). Frascos Enlenmeyers com abertura larga oferecem facilidade na manipulao e tm sido comumente empregados para processos de FES sem qualquer agitao e aerao. O inculo adicionado depois que o substrato autoclavado (SOCCOL et al., 2001). Apesar da antiga utilizao da FES, apenas recentemente a pesquisa cientfica se desenvolveu e se dedicou ao processo. Enquanto pases ocidentais tm desenvolvido o uso da fermentao submersa desde a ltima dcada de 40, o interesse pela fermentao slida foi revisada nas ltimas duas dcadas (BELLON-MARUEL et al., 2003). Alguns estudos de produo 17

de AC por FES utilizando diversos substratos podem ser observados na Tabela 5. TABELA 5 - PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO VRIOS TIPOS DE SUBSTRATOS Substrato Semente de alfarroba Bagao de mandioca Batata doce (alto teor de amido) Casca de caf Polpa de uva Resduo de abacaxi Abacaxi Cepa A. niger ATCC 9142 A. niger NRRL 2001 A. niger YANG no 2 A. niger CFTRI 30 A. niger NRRL 567 A. niger ACM 4942 A. niger ATCC 1015 Produo de ACem base seca 264 g/Kg 347 g/Kg 99 g/Kg 150 g/Kg 90 g/Kg 194 g/Kg 132g/Kg Referncia ROUKAS, 1999 VANDENBERGHE, 2000 LU, et al., 1997 SHANKARANAND e LONSANE, 1994 HANG e WOODAMS, 1985 TRAN et al., 1998 LIMA et al. 1995

3.2.2.2. Aspectos da FES Temperatura De acordo com BELLON-MARUEL et al. (2003), uma das grandes limitaes de contexto industrial se refere ao controle de temperatura e umidade, fatores crticos no escalonamento do processo. A baixa condutividade trmica do material e seu baixo teor de umidade reduz consideravelmente a transferncia de calor, que tambm dependente do tamanho das partculas da camada slida. Normalmente a temperatura medida na camada slida e no fluxo de gs de entrada e sada do biorreator. Teor de umidade e atividade de gua Na fermentao lquida o substrato est em suspenso dentro de uma fase aquosa, na qual este teor no limitante. Na fermentao no estado slido, o teor de umidade considerado timo na saturao do substrato que normalmente varia entre 30 e 85% dependendo do substrato, a quantidade mxima de gua, neste caso, no meio funo da capacidade de reteno do

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substrato. O lquido no seio da matriz no deve ser muito abundante para no reduzir a porosidade e, conseqentemente, limitar as trocas gasosas. No entanto, dever estar presente suficientemente para no limitar o crescimento dos microrganismos (SOCCOL, 1994). Ambientes muito midos so propcios ao desenvolvimento de microrganismos que, alm de consumir os nutrientes da PC, podem produzir substncias txicas ao consumo animal. A presena de gua no produto pode ser medida de diferentes formas, mas nem todos os mtodos indicam a disponibilidade da gua para os microrganismos, uma vez que nem toda gua est igualmente disponvel. Esta disponibilidade melhor representada pela atividade de gua (aw) que numericamente igual a umidade relativa, quando se estabelece o equilbrio (HALL, 1980; BROOKER et al., 1992). CHRISTENSEN e KAUFMANN (1974) estudaram a influncia da atividade de gua para diversos produtos de origem vegetal, no comportamento dos principais fungos e verificaram que, em geral, atividades de gua superiores a 0,70 so favorveis sobrevivncia e desenvolvimento de fungos do gnero Aspergillus sp. O teor de gua normalmente avaliado de modo gravimtrico, no diferencia a gua disponvel aos microrganismos caracterizada pela atividade de gua (aw) da gua de ligao ao substrato, no disponvel aos microrganismos. A umidade e a disponibilidade de gua (aw) constituem dois fatores essenciais para o crescimento dos microrganismos. Por exemplo, Rhizopus oligosporus necessita elevados teores de umidade para sintetizar proteases (BELLON-MARUEL et al. 2003; SOCCOL, 1994). pH A forma de gua nos substratos slidos sempre constituiu um obstculo para a medida satisfatria de pH. No processo de FES, no se utiliza um eletrodo para medio do pH, uma vez que mesmo pela definio do processo, falta gua livre. Alguns autores sugerem a suspenso de amostra slida em gua destilada, fato que no pode precisamente identificar o valor real de pH no meio slido. Na prtica, o pH de fermentaes slidas no controlado, entretanto, o poder tampo dos substratos e a mistura salina inicial permite que

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durante o crescimento, o pH no sofra bruscas alteraes (BELLON-MARUEL et al., 2003; SOCCOL, 1994). 3.3. MICRORGANISMO Os microrganismos provaram ser uma fonte excepcionalmente rica de produtos teis sendo que tais produtos variam enormemente em termos de sua atividade biolgica e complexidade estrutural. A maioria das reaes bioqumicas necessrias para sintetizar uma nova clula foi elucidada, ento o conhecimento do metabolismo primrio est quase completo. Adicionalmente a estas reaes essenciais, diretamente associadas ao crescimento celular balanceado, muitos microrganismos possuem capacidade de sintetizar uma grande variedade de compostos no essenciais, denominados de metablitos secundrios. Entretanto os microrganismos exerceram um papel muito importante como fonte de metablitos primrios conhecidos como aminocidos e vitaminas. O foco atual pela procura de novos compostos que so produtos do metabolismo secundrio. Os dois principais fatores que determinam a eficcia da seleo destes compostos so a avaliao do microrganismo produtor e o teste de seleo empregado. O microrganismo de interesse deve ser convenientemente isolado e selecionado para a produo do metablito desejado. Nesse sentido, muitas linhagens e espcies de fungos e bactrias foram patenteadas como produtoras industriais de AC, que essencialmente no diferiam umas das outras, a no ser quanto sua capacidade de acumular cido. Dentre estas esto: Arthrobacter paraffinens, Bacillus licheniformis e Corynebacterium ssp., Aspergillus niger, A. aculeatus, A. carbonarius, A. awamori, A. foetidus, A. fonsecaeus, A. phoenicis and Penicillium janthinellum; e leveduras como Candida tropicalis, C. oleophila, C. guilliermondii, C. citroformans, Hansenula anamola e Yarrowia lipolytica (GREWAL e KALRA, 1995; IKENO et al., 1975; KUBICEK e ROHR, 1986; PANDEY et al., 2001; VANDENBERGHE et al., 1999; YOKOYA, 1992). Somente poucas espcies demonstraram ser capazes de secretar ou excretar quantidades apreciveis de AC, o que esperado, pois este um composto intermedirio do metabolismo normal, e a sua excreo seria 20

condicionada situao peculiar de desequilbrio metablico (KUBICEK e RHR, 1986). Destas, apenas A. niger e Saccharomycopsis (Candida) so consideradas atualmente como importantes produtoras de AC. Atualmente, a fermentao industrial para produo do AC conduzida utilizando uma nica espcie de fungo, A. niger devido a sua maior produo de AC por unidade de tempo, quando comparado a outros microrganismos (YOKOYA, 1992; PAZOUKI et al., 2000; CROLLA e KENNEDY, 2001). 3.3.1. Aspergillus niger O A. niger (Figura 4) faz parte dos fungos filamentosos que constituem um grupo de microrganismos aerbios fisiologicamente diversos. Estes fungos podem se desenvolver em meios lquidos e slidos. Em seu ambiente natural so encontrados freqentemente em superfcie de lquidos e slidos de tal maneira que uma grande parte de suas hifas so areas. FIGURA 5 - ESPOROS DE Aspergillus niger

um fungo ascomiceto imperfeito (classe dos Deuteromicetos), e faz parte da famlia Aspergillaceae. Possui colorao preta (niger: preto em latim), tendo uma grande variedade de cepas e subespcies. Durante a vida de um fungo imperfeito existem quatro etapas fisiolgicas importantes que so a dormncia, a germinao, a multiplicao vegetativa e a conidiognese. Um esporo de A. niger em um meio favorvel deixa seu estado de dormncia e passa por uma etapa de germinao. Esta consiste em um conjunto de fenmenos morfolgicos e metablicos permitindo ao esporo germinar, se desenvolver formando hifas e, em seguida, o miclio. A germinao do esporo 21

no pode comear se a umidade ambiente for insuficiente. O esporo tambm deve encontrar no seu meio todos os elementos necessrios para o crescimento da hifa. Neste instante a atividade metablica intensa (sntese de constituintes celulares, cidos amnicos, nucleotdeos) quando comparado com o crescimento vegetativo. O A. niger apresenta como caractersticas particulares colnias brancas a amarelo plido, mas rapidamente forma milhares de esporos. Os condios (esporos) so esfricos, medem de 3 a 5 m e tornam-se rugosos ao atingir a maturao. Apresenta hifas finas, septadas e conidiforos com vesculas recobertas por condios negros (UCSF, 2000). As principais vantagens no uso do A. niger so a facilidade de manipulao, sua habilidade de fermentar uma grande variedade de matriasprimas de baixo custo e produzir rendimentos elevados de AC (YOKOYA, 1992). Alm disso, o A. niger considerado GRAS utilizando este microrganismo. O incremento na produtividade de AC tem sido feito atravs de mutao e seleo de cepas. Todos os seres vivos sofrem um certo nmero de mutaes como resultado de funes celulares normais ou interaes aleatrias com o ambiente. Tais mutaes so denominadas espontneas; a taxa de ocorrncia das mesmas caracterstica para um determinado organismo e constitui o chamado nvel basal. A ocorrncia de mutaes pode ser aumentada pelo tratamento com determinados compostos. Tais compostos so denominados agentes mutagnicos e as modificaes que eles causam mutaes induzidas. Muitos mutagnicos atuam diretamente no DNA devido a sua capacidade de atuar como uma determinada base ou de se incorporar cadeia polinucleotdica. O efeito de um dado mutagnico medido pelo grau que ele aumenta a taxa de mutao acima do nvel basal (PASSAGLIA, 1996). 3.4. MUTAES Segundo ALBERTS et al. (1994), mutao qualquer alterao no material gentico que possa ser transmitida aos seus descendentes, sejam estes novos indivduos ou linhagens celulares. Os mutagnicos mais 22 pela FAO, o que bastante importante na produo de AC para utilizao em rao animal

freqentemente utilizados so a radiao , radiao UV e os mutagnicos qumicos. Geralmente a combinao de UV e alguns mutagnicos qumicos podem gerar cepas hiper-produtoras de AC (KUBICEK e RHR, 1986; VANDENBERGHE et al., 1999; IKRAM-UL-HAQ et al., 2001; PANDEY et al., 2001). Um organismo que sofreu mutao denominado mutante, ou seja, todo organismo que exibe uma forma alterada como resultado da presena de uma mutao. Usado em um sentido amplo, o termo mutao se refere a qualquer modificao sbita e hereditria no conjunto gnico de um organismo que no explicvel pela recombinao da variabilidade gentica preexistente. Essas modificaes incluem mudanas no nmero cromossmico (euploidia e aneuploidia), mudanas grosseiras na estrutura dos cromossmicos (aberraes cromossmicas) e mudanas nos genes individuais. Atualmente, no entanto, o termo mutao utilizado em um sentido mais restrito, referindose apenas a alteraes detectadas em nvel de genes individuais (PASSAGLIA, 1996). Geralmente, os organismos portadores de uma mutao em um determinado gene apresentam problemas na sua sobrevivncia e acabam sendo eliminados por seleo natural. No entanto, nem toda mutao resulta em uma conseqncia deletria para o seu portador. Na verdade, a mutao a fonte bsica de toda a variabilidade gentica, fornecendo a matria prima para a evoluo. A recombinao apenas rearranja essa variabilidade em combinaes novas e a seleo natural (ou artificial) simplesmente preserva as combinaes mais bem adaptadas s condies ambientais existentes (ou desejadas). Sem a mutao, todos os genes existiriam apenas em uma forma, e os organismos no seriam capazes de evoluir e de se adaptar s condies ambientais. Obviamente, uma alta frequncia de mutaes desestabiliza totalmente a transmisso da informao gentica de uma gerao para a outra (PASSAGLIA, 1996). As mutaes podem alterar a estrutura e nmero dos cromossomos e, como conseqncia causando as mutaes cromossmicas e as numricas como as poliploidias. Ainda h a mutao de ponto ou gnica, a qual altera apenas um par ou poucos pares de nucleotdeos do DNA (AZEVEDO, 1998).

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Qualquer base do DNA pode ser mutada. Uma mutao de ponto envolve modificao em um nico par de base (substituio, adio ou deleo) e pode ser o resultado de um mau funcionamento do sistema celular que replica ou repara o DNA, inserindo uma base errada na cadeia polinucleotdica que est sendo sintetizada, ou de uma interferncia qumica diretamente sobre uma das bases do DNA (ZAHA, 1996). As mutaes devem normalmente causar alguma modificao detectvel para que a sua presena seja reconhecida. Tais modificaes podem ser ou to pequenas que podem ser identificadas apenas por tcnicas genticas e bioqumicas especiais, ou modificaes grosseiras na morfologia, ou modificaes letais. A maioria das mutaes teis para a anlise gentica de muitos processos biolgicos so mutaes letais condicionais (ZAHA, 1996). 3.4.1. MUTAO INDUZIDA POR RADIAO As taxas de mutao espontnea so muito baixas e suas freqncias so diferentes para os distintos genes, sendo em mdia, de uma mutao em cada 106 divises celulares. As mutaes espontneas so oriundas de erros durante a duplicao do material gentico, seguidos de falhas nos sistemas celulares de reparo do DNA (BOS e STADLER, 1996). Devido raridade dos eventos mutacionais, os programas de melhoramento gentico em fungos buscam a induo de mutaes para que a variabilidade natural seja aumentada, por meio de agentes mutagnicos fsicos e qumicos (VILAS-BOAS et al., 1992). Os mutagnicos fsicos podem ser radiaes ionizantes ou no-ionizantes. As radiaes ionizantes so os raios alfa, beta, gama e X, os quais so responsveis por ionizaes que provocam alteraes cromossmicas e formao de perxidos no interior das clulas, provocando uma reao com as bases nitrogenadas. A radiao no-ionizante representada pela luz ultravioleta (UV), cuja ao principal no DNA a formao de dmeros de pirimidina (AZEVEDO, 1998). As radiaes ionizantes tais como os raios X (de 0,1 a 1 nm), tm muita energia e, portanto, so teis para o diagnstico mdico, j que podem penetrar nos tecidos vivos. No processo de penetrao, estes raios de muita energia colidem com os tomos da matria e causam a liberao de eltrons, 24

deixando radicais livres positivamente carregados (ons). Estes ons, por sua vez, colidem com outras molculas, provocando a liberao de outros eltrons. O resultado final a formao de uma trilha de ons ao longo do caminho em que cada raio de alta energia passa atravs da matria ou tecido vivo. Esse processo de ionizao induzido por mquinas que produzem raios X, prtons e nutrons, assim como pela radiao alfa, beta e gama liberados pelos istopos radioativos dos elementos (por exemplo, 32P, 35S, rdio, 60Co, etc). Os raios ultravioleta (UV), que tm pouca energia, penetram apenas as camadas de clulas superficiais de plantas e animais superiores e no induzem ionizaes. Os raios UV dissipam sua energia para os tomos que eles encontram, elevando os eltrons de orbitais exteriores para nveis de alta energia, um estado referido como excitao. As molculas contendo tomos na forma inica ou no estado excitado so quimicamente mais reativas do que as que contm tomos no seu estado estvel normal. A reatividade aumentada dos tomos presentes nas molculas de DNA a base dos efeitos mutagnicos da luz UV e da radiao ionizante (ZAHA, 1996).

3.4.2. RADIAO ULTRAVIOLETA (UV)

Os raios UV no possuem energia suficiente para induzir ionizaes. Eles so, entretanto, prontamente absorvidos por certas substncias tais como purinas e pirimidinas, as quais, por sua vez, ficam mais reativas ou no estado excitado. Nos organismos multicelulares, os raios UV atingem apenas a camada de clulas superficiais. Nos seres unicelulares, no entanto, os raios UV so um potente agente mutagnico. A absoro mxima de UV pelo DNA ocorre no comprimento de onda de 254 nm. A mutagenicidade mxima tambm ocorre a 254 nm, sugerindo que o processo de mutao induzida por UV mediado diretamente pela absoro de UV por purinas e pirimidinas. Os estudos in vitro mostram que as pirimidinas, especialmente a timina, absorvem ativamente em 254 nm e, como resultado, se tornam muito reativas. A relao entre a taxa de mutao e a dose de UV muito varivel, dependendo do tipo de mutao do organismo e das condies empregadas. A cintica de coliso nica ocasionalmente observada, em constante com a radiao ionizante (ZAHA, 1996).

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3.4.3. MECANISMOS DE REPARO Um mutante sobrevive quando a sua troca gentica no prejudicial ou, mais raramente, benfica. Mas a maioria das mutaes desvantajosa e as clulas no conseguiriam sobreviver se no possussem mecanismos enzimticos para reverter os efeitos de processos mutagnicos naturais ou artificiais. As bases do DNA podem ser alteradas ou perdidas, as ligaes fosfodister da cadeia podem ser quebradas e as fitas cruzadas podem se ligar covalentemente. Estas leses so produzidas por radiaes ionizantes, luz UV e uma variedade de compostos qumicos. Muitos dos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informao gentica preservada em ambas as fitas da dupla-hlice, de tal forma que a informao perdida em uma fita pode ser recuperada atravs da fita complementar. Os mecanismos existentes e conhecidos de reparo do DNA lesado so provavelmente universais, sendo, no entanto, melhor compreendidos e estudados em Escherichia coli. Um dos mais bem estudados mecanismos de reparo a remoo dos dmeros de pirimidina, os quais so formados pela exposio do DNA luz UV. Resduos de pirimidinas adjacentes podem se tornar covalentemente ligados sob estas condies. Este dmero no se encaixa bem na dupla-hlice e, assim, a replicao e a expresso gnica so bloqueadas at que a leso pode ser reparada de diferentes formas. A forma mais direta envolve enzimas que simplesmente revertem a modificao qumica que originou o dano. Dmeros de pirimidina so o alvo universal da enzima fotoliase, a qual se liga ao dmero e catalisa uma segunda reao fotoqumica, na presena da luz visvel, desfazendo o anel ciclobutnico formado pela luz UV, e refazendo as bases pirimdicas individuais. Este processo chamado de fotorreativao e envolve duas etapas: inicialmente, a enzima reconhece e se liga especificamente ao dmero no escuro; e, aps a absoro de luz, energia fornecida para converter o dmero ciclobutil em monmeros de pirimidina e a enzima dissociase do DNA.

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3.4.4. CURVA DE SOBREVIVNCIA Nem todas as clulas vivas tm a mesma sensibilidade radiao. As clulas que tem mais atividade so mais sensveis do que aquelas que no so, pois a diviso celular requer que o DNA seja corretamente reproduzido para que a nova clula possa sobreviver. Assim so, por exemplo as da pele, do revestimento intestinal ou dos rgos hematopoiticos. Uma interao direta da radiao pode resultar na morte ou mutao de tal clula, enquanto que em outra clula o efeito pode ter menor conseqncia (BRASIL, 2005). Para ocorrer a mutao induzida por radiao UV em fungos, o tempo de exposio aos raios UV depende do gnero e espcie do fungo. Para a determinao do tempo de exposio para o fungo Aspergillus niger, um estudo realizado para verificar a influncia do tempo de exposio na sobrevivncia do fungo. Uma curva de sobrevivncia construda plotando-se o tempo de exposio da soluo de esporos aos raios UV (em minutos) versus % de sobrevivncia do fungo. Com isso verificado qual o tempo de exposio para haver 5% de sobrevivncia do fungo. Pelo fato do fungo produzir esporos escuros e ter colorao escura, maior a proteo deste fungo contra raios UV, por este motivo o tempo de exposio deste fungo maior que o tempo de exposio de um fungo de colorao clara (AZEVEDO e COSTA, 1973; PIZZIRANI-KLEINER et al., 1998). 3.5. FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUO DE AC Para que a obteno do AC seja vivel comercialmente, vrios fatores devem ser levados em considerao no processo fermentativo, como por exemplo, os constituintes do meio de cultivo, o pH, a aerao, a temperatura e o microrganismo empregado (YOKOYA, 1992; KOLICHESKI, 1995; TIMEIS, 2000). Na tabela 6 apresentado um resumo das principais fontes de elementos que influenciam na produo de AC e suas concentraes usuais.

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TABELA 6 - PRINCIPAIS FATORES QUMICOS QUE INFLUENCIAM A PRODUO DE AC Elemento Fonte de carbono Principais fontes Sacarose, glicose, frutose, galactose, maltose, melao de cana-de-acar, melao de beterraba, sacarose bruta, caldo de cana, hidrolisado de amido Sulfato de amnio, uria, nitrato de amnio, peptona, extrato de malte Dihidrogeno fosfato de potssio Sulfato de ferro, sulfato de zinco, cloreto de ferro Metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, metilacetato leos e gorduras Compostos quaternrios de amnio e amino-oxinas Amido Concentrao tima 10-14%

Fonte de nitrognio Fonte de fsforo Elementos traos lcoois inferiores Outras substncias

0,1 a 0,4 g/L 0,5 e 5,0 g/L 1 a 5% 0,05-0,3% 20 mg/L 0,025-0,5%

3.5.1. FONTE DE CARBONO A natureza e concentrao da fonte de carbono so fatores primordiais no resultado da fermentao ctrica. Estudos mostraram que a concentrao inicial de glicose afeta tanto a taxa de produo de AC pelo A. niger quanto morfologia do microrganismo (XU et al., 1989; RANE e SIMS, 1993; PAPAGIANNI et al., 1999; VANDENBERGHE et al., 1999). Geralmente, melhores produes de AC so atingidas quando 10 14% de carboidratos so utilizados. Uma concentrao inicial de acar de cerca de 10% foi relatada como tima para a maltose, sacarose, manose e frutose, e 7,5% para a glicose. Em concentraes de acar inferiores a 2,5% no ocorre a produo de AC. (GREWAL e KALRA, 1995; VANDENBERGHE et al., 1999). A presena de carboidratos facilmente metabolizveis essencial para uma boa produo de AC. A sacarose a fonte de carbono mais favorvel, seguida da glicose, frutose e galactose (HOSSAIN et al., 1984; YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). A combinao de glicose e frutose produz mais AC do que se utilizados individualmente. Isto explica o comportamento da sacarose em relao glicose e frutose. Apesar da sacarose no ser quebrada pelo fungo, a sua hidrlise tem se mostrado desnecessria, pois parte deste

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carboidrato quebrada durante a esterilizao do meio nutritivo. Alm disso, o fungo possui uma invertase extracelular, ligada ao miclio, a qual ativada sob condies cidas e capaz de hidrolisar rapidamente a sacarose. A galactose contribui para o crescimento muito lento do fungo e no prov o acmulo de AC. Outras fontes como a celulose, etanol, manitol, sorbose, cidos ltico e mlico, permitem um crescimento limitado do fungo e mnima produo de AC (YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). 3.5.2 FONTE DE NITROGNIO A sntese do AC diretamente influenciada pela concentrao e natureza da fonte de nitrognio, que, na fermentao ctrica, normalmente fornecida ao meio de produo na forma de sulfato de amnio, uria, nitrato de amnio, peptona ou extrato de malte. VANDENBERGHE et al., 1999). A concentrao de nitrognio requerida na fermentao do AC deve estar em torno de 0,1 a 0,4 g/L. Uma concentrao elevada de nitrognio aumenta o crescimento do fungo e o consumo de acares, porm reduz a quantidade de AC produzido, ao contrrio, uma limitao no crescimento do fungo favorvel produo de AC (KUBICEK e RHR, 1986; YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). Dependendo da quantidade de nitrognio no meio, no incio da fermentao, possvel produzir ou somente AC ou uma mistura de outros cidos como o glucnico (SANKPAL et al., 2000). 3.5.3 FONTE DE FSFORO A presena de fosfato no meio afeta em grande parte a produo de AC, pois essencial para o crescimento e metabolismo do A. niger. O dihidrogeno fosfato de potssio mencionado como a melhor fonte de fsforo. O fungo necessita de concentraes de fsforo na soluo salina que variam entre 0,5 e 5,0 g/L para uma mxima produo do metablito. Baixas concentraes de fosfato favorecem a produo de AC, porm, a presena de excesso de fosfato pode aumentar a concentrao de acar-cido e reduzir a fixao do CO2 e o (GREWAL e KALRA, 1995;

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crescimento do fungo (KUBICEK e RHR, 1986; GREWAL e KALRA, 1995; VANDENBERGHE et al., 1999). 3.5.4 ELEMENTOS TRAOS A presena de elementos traos no meio, principalmente no processo submerso, provavelmente seja o fator de principal influncia na produo de AC. Estes elementos podem atuar tanto de forma positiva quanto negativa (ROUKAS e KOTZEKIDOU, 1987). Vrios metais divalentes tais como zinco, mangans, ferro, cobre e magnsio afetam a produo de AC pelo A. niger. Porm, deve-se levar em conta a interdependncia dos constituintes do meio na fermentao submersa e, provavelmente, na FES (VANDENBERGHE et al., 1999). 3.5.5 LCOOIS INFERIORES A adio de lcoois inferiores aumenta a produo de AC a partir de glicose comercial e outros carboidratos no processados. Foi verificado que a adio de 1 a 5% (v/v) de metanol, etanol, n-propanol, isopropanol ou metilacetato, neutralizava o efeito negativo dos metais na produo de AC. As concentraes timas de metanol e etanol dependem, sobretudo da cepa e da composio do meio. A adio de lcool em substratos puros causa inibio na produo do cido, mas em substratos brutos estimula sua produo (KUBICEK e RHR, 1983; GREWAL e KALRA, 1995; YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). Na produo do AC, geralmente utilizam-se quantidades de 1-4% de metanol, no entanto trabalhos tm mostrado que com at 6% de metanol h um aumento no rendimento do AC. Com o uso de 3% de metanol pode-se praticamente anular o efeito inibidor de metais como Fe2+, Zn2+ e Mn2+. Este lcool no assimilado pelo A. niger, mas auxilia no acondicionamento do miclio sem prejudicar o seu metabolismo (YOKOYA, 1992; GREWAL e KALRA, 1995). O efeito do metanol tambm foi testado em diferentes cepas produtoras de AC pelo A. niger, porm, reduziu a produo pela Cndida lipolytica (PAZOUKI et al., 2000). 30

3.5.6. pH O consumo de nitrognio causa abaixamento do pH do meio, favorecendo a formao do AC. Por outro lado, necessrio manter os valores de pH nos primeiros dias da fermentao para se garantir um bom crescimento da biomassa celular (VANDENBERGHE, 2000; VANDENBERGHE et al., 1999; YOKOYA, 1992). O pH de uma cultura pode variar em razo da atividade metablica dos microrganismos. O motivo mais bvio a secreo de cidos orgnicos, como o caso do ctrico, o qual ir causar um abaixamento no pH. As variaes de pH tambm dependem muito do microrganismo; no caso do Aspergillus sp., Penicillium sp. e Rhizopus sp., o pH pode cair muito rapidamente at um pH inferior a 3,0. Alm disso, a natureza do substrato tambm influencia na variao do pH, sendo que em FES valores de pH entre 6,0-7,5 so normalmente utilizados para produo de AC (KUBICEK e RHR, 1986; GREWAL e KALRA, 1995; YOKOYA, 1992; PANDEY et al., 2001). O valor timo de pH varia de acordo com a natureza do substrato devendo ser alto o suficiente durante o estgio inicial da fermentao de modo a facilitar a germinao dos esporos, havendo a diminuio do pH durante a fermentao pelo acmulo de AC, obtendo-se freqentemente um pH final entre 1,6 e 3,5 (MEERS e MILSOM, 1991). 3.5.7. TEMPERATURA A maioria dos processos biolgicos caracterizada pelo fato de se desenvolverem em uma faixa relativamente restrita de temperatura. Temperaturas inapropriadas podem levar desnaturao de protenas, inibio enzimtica, promoo ou inibio de produo de determinados metablitos, afetar a produo de esporos e causar morte celular, entre outros efeitos indesejados. A temperatura a ser empregada na produo de AC depende do tipo de microrganismo, da natureza do substrato e das condies de fermentao. Em geral so usadas temperaturas entre 25 e 35o C, porm, no caso do A. niger temperaturas em torno de 28-30oC so ideais. O processo fermentativo em 31

temperaturas mais elevadas rpido, ocorrendo abundante crescimento dos miclios, o que causa alta oxidao do acar a CO2 e, conseqentemente, baixo rendimento de AC (KOLICHESKI, 1995). Em FES, a liberao de calor produzido pelos microrganismos, durante as atividades metablicas, causa uma considervel elevao na temperatura no decorrer da fermentao. Baixa atividade de gua e baixa condutividade trmica prejudicam o desenvolvimento dos microrganismos por aumentarem a temperatura nos reatores (BRAND, 1999). 3.5.8. AERAO Sendo a fermentao ctrica um processo aerbico, o fornecimento de oxignio tem um efeito crucial na produo de AC. Interrupes no fornecimento de oxignio podem resultar na perda da capacidade de converso do acar em AC, embora a formao da biomassa celular seja pouco afetada (DAWSON et al., 1986; YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). Com relao demanda de oxignio, a FES necessita de quatro a cinco vezes menos que a fermentao submersa para a sntese de produtos, sendo, portanto adequadamente satisfeita com relativamente baixos nveis de aerao forada (biorreatores do tipo coluna, tambor rotativo e tambor horizontal) ou aerao por difuso, caso dos tambores do tipo bandeja. Estudos relataram que a aerao forada no incio da fermentao, em reatores tipo colunas para FES, propiciaram altas taxas metablicas e maior produtividade. Porm, importante levar em considerao o efeito adverso do stresse, causado por elevadas taxas de aerao, sobre o fungo filamentoso (LU et al., 1997). Outros estudos mostraram que, em fermentao submersa e de superfcie, a imobilizao dos miclios do fungo por adsoro em suportes celulsicos ou em gel de alginato de clcio, reduz as condies de estresse durante a operao em biorreatores convencionais com agitao e aerao (SANKPAL et al., 2001).

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3.5.9.UMIDADE O teor de umidade do substrato uma das principais variveis que influencia o sucesso de uma FES. A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o tipo de produto desejado so os principais fatores que determinam o grau de umidade que o substrato dever ter no incio e ao longo da fermentao. Em FES a quantidade mxima de gua presente no meio funo da capacidade de reteno do suporte, que varia de 30 a 80% de umidade. HANG e WOODAMS (1987), estudaram o teor de umidade para produo de cido ctrico em polpa de ma chegaram a concluso de que o ideal se apresenta entre 65 e 75% de umidade. VANDENBERGHE (2000) realizou um estudo de otimizao de fatores fsicos do processo de produo de AC por FES utilizando o resduo bagao de mandioca. A umidade tima inicial de 70% foi determinada em biorreatores com aerao por difuso. J em biorreatores com aerao forada a umidade inicial de 65% era ideal, pois havia passagem de ar saturado atravs do leito do biorreator. Um substrato apropriadamente umedecido deve ter um filme superficial de gua visando facilitar a dissoluo e a transferncia de massa de nutrientes e de oxignio. Porm, entre as partculas devem existir canais que permitam a difuso de gases e a dissipao de calor. Assim, se o nvel de umidade for elevado, implicar no decrscimo de porosidade do substrato e ir resultar em uma menor difuso de oxignio no interior do meio e conseqentemente decrscimo de trocas gasosas, alm de aumentar o risco de contaminao, principalmente a bacteriana. Para nveis de umidade menores que o necessitado, haver maior dificuldade na difuso de nutrientes, resultando em um crescimento de microrganismo menor do que o esperado e, conseqentemente, menor produtividade (SOCCOL, 1994; SAUCEDO-CASTAEDA, 1991).

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3.5.10. GRANULOMETRIA DAS PARTCULAS DO SUBSTRATO A questo do tamanho e forma das partculas que compem o substrato est intrinsicamente relacionada com a rea superficial do substrato vivel ao ataque FES. Os materiais slidos, utilizados em FES, so geralmente fragmentados e de natureza granular ou fibrosa que permite a reteno de gua por higroscopia ou capilaridade. Segundo o tipo de material utilizado, a quantidade de gua presente varia muito, os substratos amilceos so geralmente fermentados entre 25 e 60% de umidade inicial, no entanto, os substratos celulsicos permitem trabalhar com teores de umidade mais elevados, de 60 a 80% sem o aparecimento de gua livre (SOCCOL, 1994). Por exemplo, segundo estudo de PANDEY et al. (2001), partculas de farelo de trigo e farinha de milho (a uma proporo de 9:1) com dimetros entre 425-500 m e 500-600 m, respectivamente, resultaram em uma maior produo de amiloglicosidase, embora tenha sido notado que partculas de dimetro entre 180 m e 1,4 mm tenham apresentado rendimentos similares. J ELLAIAH et al. (2004), na otimizao de produo de neomicina com cepa de Streptomyces marinensis mutante, verificaram que dos trs tamanhos de partculas de farinha de trigo utilizadas (pequena, intermediria e grande), o melhor rendimento foi obtido com a maior granulometria. Para se obter uma adequada granulometria, muitos substratos em FES especialmente resduos agroindustriais necessitam de uma etapa de processamento e preparao prvia ao processo fermentativo, tais como esmagamento, quebra, moagem e peneiramento. enzimtico do microrganismo. Ambos so fatores fsicos interelacionados que influenciam diretamente o crescimento do organismo em

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4. MATERIAIS E MTODOS 4.1. POLPA CTRICA O substrato a ser utilizado em FES deve ter algumas caractersticas ideais que possibilitem o maior rendimento do processo. Porosidade, tamanho e forma das partculas, atividade de gua, teor de carbono e relao carbono/nitrognio do meio de fermentao devem ser adequados ao desenvolvimento do microrganismo. A PC utilizada neste estudo foi cedida pela empresa Cargil Agrcola S. A., So Paulo/SP estando peletizada e seca. A PC foi previamente triturada em moinho de disco e peneirada de forma a obter as granulometrias a serem estudadas em cada etapa (entre 0,8 e 2 mm, maior que 2 mm e apenas moda sem peneiramento). 4.2. ATIVIDADE DE GUA A atividade de gua (aw) pode ser medida usando diferentes mtodos e equipamentos, os quais, basicamente, mensuram a presso entre a mistura e a fase gasosa em equilbrio. Neste estudo a medida da atividade de gua da PC e do fermentado foi realizada em equipamento prprio a este fim da marca Aqua Lab modelo CX-2. 4.3. CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS As anlises das caractersticas fsico-qumicas da PC: umidade (termogravimtrico), cinzas (termogravimtrico), protenas (mtodo de Kjeldahl) e pH (potenciomtrico) foram realizadas conforme as Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz (SO PAULO, 1985). Para a quantificao dos acares fermentescveis mtodos. presentes na PC foram realizadas dosagens pelas metodologias de Somogyi-Nelson e Fehling para efeito de comparao entre os

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Para o fermentado foram realizadas anlises de umidade utilizando-se o mtodo termogravimtrico conforme as Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz (SO PAULO, 1985), sendo que o acompanhamento do consumo de acares foi determinado atravs de anlises pela metodologia de SomogyiNelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945). As medidas de pH foram realizadas com 5g do substrato/fermentado em suspenso em 50 mL de gua e agitado durante 15 minutos, com posterior medida do pH da suspenso formada pelo mtodo potenciomtrico. 4.4. MICRORGANISMOS As cepas de A. niger (LPB 03, LPB21, LPB 28, LPB 326 e LPB BC) foram obtidas do banco de cepas do Laboratrio de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Paran, sendo que a cepa de A. niger LPB BC foi isolada neste laboratrio a partir de bagao de cana-de-acar. Estas cepas foram conservadas em tubos contendo meio PDA (Potato Dextrose Agar) inclinado, no qual os microrganismos foram repicados. Cada cepa foi incubada a 28 C por seis dias e mantidas a 4 C por at dois meses. Os esporos foram produzidos em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio PDA. O meio de cultivo foi esterilizado a 121 C durante 15 min. Depois de resfriado (45-55o C) o meio foi inoculado em profundidade com uma suspenso de esporos. Esta suspenso foi obtida pela extrao dos esporos de um tubo com meio PDA inclinado onde foram adicionados 5 mL da gua destilada, 1 gota de Tween 80 e prolas de vidro previamente esterilizados. Cada Erlenmeyer contendo o meio de cultivo estril foi inoculado com 0,2 mL desta suspenso. A incubao foi realizada a 28o C durante sete dias. 4.4.1. RECUPERAO DE ESPOROS/PREPARO DO INCULO Os esporos foram recuperados da superfcie do meio utilizando-se 30 mL de soluo 0,01% de Tween 80 contendo prolas de vidro e uma barra magntica. Com o auxlio de um agitador magntico, a soluo adicionada

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sobre os esporos foi mantida sob agitao durante 15 minutos. A suspenso obtida foi armazenada a 4o C por no mximo sete dias. 4.4.2. CONTAGEM DE ESPOROS Foram realizadas diluies sucessivas da suspenso de esporos e a contagem de esporos foi realizada em cmara de Neubauer (Figura 6) usando um microscpio tico. A contagem de esporos vlida quando sua quantidade estiver entre 10 e 30 unidades por quadrculo (VANDENBERGHE, 2000). FIGURA 6 - CMARA DE NEUBAUER

Estimou-se a concentrao de esporos, expressa em nmeros de esporos por mL de suspenso, presentes na suspenso do tubo utilizando a seguinte expresso:

N = NE X 102 X 104
Onde: N = concentrao de esporos/mL NE = nmero de esporos contados nos quadrculos 102 = diluio utilizada para a suspenso de esporos (1:100) 104 = correo do volume de suspenso sobre os quadrculos

4.4.3. CURVA DE ESPORULAO E VIABILIDADE EM PLACA Em dez frascos Erlenmeyer de125 ml contendo 20ml de meio PDA, foi realizada semeadura em superfcie de 100l da suspenso de esporos obtida da cepa A. niger LPB BC. Retirou-se um frasco a cada perodo transcorrido de 24 horas. Os esporos foram coletados e contados como descrito previamente.

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Relacionando tempo e nmero de esporos, chegou-se a curva de esporulao. Para a viabilidade em placa, aproveitou-se as diluies obtidas para contagem, das quais foi retirado 100l e transferido para placas de petri contendo meio PDA. Aps 24 horas de incubao, consideram-se apenas contagens entre 30 a 300 colnias. Para o clculo, multiplicou-se a mdia aritmtica das placas pelo fator de diluio considerado, deixando o resultado em Unidades Formadoras de colnia / 1ml de suspenso de esporos (BANWART, 1982). 4.5. SELEO DE CEPAS PRODUTORAS DE AC Para a seleo das cepas foram realizados testes qualitativos e quantitativos. A escolha qualitativa foi realizada atravs de uma anlise comparativa entre as cepas onde se fez uma comparao da relao entre o tamanho do halo de produo de cido e do halo de crescimento da colnia em meio Foster (FOSTER e DAVID, 1949). Para o preparo do meio Foster, pesou-se 5 g de Glicose, 1 g de Peptona, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de Mg SO4, 15 g de gar, 65 ml de soluo de Verde de Bromocresol (0,5 g de Verde de Bromocresol em 7 ml de NaOH 0,1 N completado o volume com gua para 130 ml, armazenando-se em frasco escuro) e completou-se para 1000 ml com gua destilada. Ajustou-se o pH para 5,0 e autoclavou-se a 121C por 15 minutos. O meio assim preparado foi repassado para placa de Petri (15 mL) estril, que aps secagem, foi inoculada utilizando um palito estril com o qual foi coletado alguns esporos e colocados no centro da placa para que houvesse um crescimento radial de apenas uma colnia (Figura 7). FIGURA 7 - CRESCIMENTO DO FUNGO A. niger EM MEIO FOSTER

FONTE: A autora 38

O teste quantitativo envolveu a produo de AC em FES utilizando PC como substrato, sendo impregnada com soluo nutritiva contendo ZnSO4.7H2O (0,2 g/L), KH2PO4 (1 g/L) e metanol a 4% para se obter umidade inicial de 75%. O pH foi ajustado para 6.5. Aps homogeneizao, o suporte foi inoculado em frasco Erlenmeyer de 250mL com suspenso de esporos contendo 107 esporos/g de PC. O tempo de incubao foi de 7 dias a uma temperatura de 30 C. As condies de fermentao foram escolhidas com base em processos desenvolvidos em trabalhos anteriores (VANDENBERGHE, 2000). 4.6. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE AC A extrao do AC foi realizada com 5g de material fermentado, ao qual foi adicionado 50 mL de gua, agitado durante 15 minutos, filtrado vcuo em papel de filtro Whatman no 1. O pH da extrao foi medido em potencimetro sendo ento centrifugado a 4500 rpm por 20 minutos, filtrado atravs de membrana Millipore de 0.45 m, diludo 1:4 vezes e analisado por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com as seguintes caractersticas e condies de operao: - Bomba: Shimadzu DGU-2A; - Forno: Shimadzu RID-10A; - Integrador: Shimadzu CR-6A; - Coluna: AMINEX modelo HPX 87HI; - Fase mvel: H2SO4 5 mM degaseificada com hlio, vazo de 0,6 mL/min e temperatura de 60o C. 4.7. OTIMIZAO DO PROCESSO DE PRODUO DE AC POR FES Aps a seleo de cepas, foram realizadas otimizaes das variveis fsicas: pH, umidade e granulometria; variveis qumicas: fonte de carbono, de nitrognio, de micronutrientes e de lcoois inferiores para a produo de AC por FES utilizando a PC.

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4.7.1. pH E UMIDADE 10 g de PC (com granulometria entre 0,8 e 2 mm) foi utilizada em frasco de Erlenmeyer de 250 mL. O substrato foi impregnado com soluo salina contendo KH2PO4 - 1g/L, ZnSO4.7H2O - 0,2g/L e metanol a 4% de modo a obter uma umidade inicial de 65%, 75% ou 80%. Esta soluo foi anteriormente utilizada em estudos de produo de AC em PC desenvolvidos na Diviso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da UFPR. O pH foi ajustado para 5,5, 6,0 ou 7,0 dependendo do teste a ser realizado. Utilizou-se NaOH e HCl 0,1N para os ajustes de pH. O substrato ento foi inoculado com a soluo de esporos a uma taxa de 107 esporos/g de PC seca e, depois de homogeneizado, foi incubado em estufa a 300C durante 96 horas. 4.7.2. FONTE DE CARBONO

Utilizando as condies otimizadas no subitem 4.7.1. (pH 5,5, umidade de 65% , metanol a 4% e granulometria da PC entre 0,8 e 2 mm) realizaram-se testes com adio de diferentes fontes de carbono comerciais: glicose e frutose (30, 60 e 120 g/L) e sacarose (27, 54, 108 e 216 g/L), respeitando-se na escolha das concentraes, as respectivas massas molares. Aps os testes anteriores, foram analisadas novamente outras concentraes de glicose (60, 120 e 240 g/L) e sacarose (54, 108 e 216 g/L) para confirmao dos resultados. Posteriormente, foram testadas fontes de carbono alternativas e mais baratas: mel de cana (cedido pela empresa Ouro Fino Sade Animal, Rodovia Anhangera, So Paulo) contendo 540 g/L de acares totais, e melao de soja (cedido pela empresa IMCOPA Importao, Exportao e Indstria de leos LTDA., Av. das Araucrias, Araucria - Pr) que apresenta 423 g/L de acares totais, ambos utilizados a uma concentrao de 120 g/L de acares totais.

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4.7.3. GRANULOMETRIA DA PC Foram testadas trs granulometrias de PC diferentes em FES como descrito no item 4.7.1. A PC foi moda em moinho de disco e classificada a fim de obter a granulometria desejada a cada estudo. Estas granulometrias foram: entre 0,8 e 2 mm, maior que 2 mm e apenas modo sem peneiramento. Neste experimento foi utilizado o pH timo de 5,5 com umidade de 65%. 4.7.4. SAIS Com as condies otimizadas no subitem 4.7.3. (pH 5,5, umidade de 65% , metanol a 4% e granulometria obtida sem peneiramento) realizaram-se testes com adio de diferentes sais (NaCl 1g/L, KH2PO4 0,7709g/L, MgSO4.7H2O -0,18g/L, FeSO4.7H2O 0,0105g/L, ZnSO4.7H2O 0,1542g/L, CuSO4.5H2O -0,0005g/L) de forma a descobrir a influncia da ausncia ou presena destes sais na produo de AC por FES utilizando PC com a cepa A.niger LPB BC. Este ensaio foi realizado utilizando-se planejamento fatorial incompleto (27-3) com 7 fatores e 2 nveis ausncia ou presena do sal, nas condies indicadas acima (Tabela 7). TABELA 7 - PLANEJAMENTO ESTATSTICO PARA ESTUDO DA ADIO DE SAIS
ENSAIO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 NaCl +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 MnSO4.H2O +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 KH2PO4 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 MgSO4.7H2O +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 FeSO4.7H2O +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 ZnSO4.7H2O +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 CuSO4.5H2O +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1

Onde -1: ausncia do sal e +1: presena do sal

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4.7.5. FONTE DE NITROGNIO Utilizando as condies otimizadas no subitem 4.7.3. (pH 5,5, umidade de 65% , metanol a 4% e granulometria obtida sem peneiramento) realizaramse testes com adio de diferentes fontes de nitrognio (NH4Cl, NH4NO3,(NH4)2SO4 e uria) em concentraes correspondendo mesma concentrao de nitrognio: 1,8 g de nitrognio/L. Esta concentrao de nitrognio foi escolhida baseada em otimizao de produo de AC realizada por VANDENBERGHE (2000), onde se utilizou 2,93 g/L de uria. 4.7.6. LCOOIS INFERIORES Foram realizados testes com adio de metanol (2, 4 e 6%) e etanol (2, 4, 6%) de forma a definir a melhor condio de produo de AC nas condies de pH 5,5, umidade inicial de 65%, sem adio de nenhuma fonte de nitrognio, fonte de carbono ou sais durante 4 dias a 300C. Aps os resultados desta fermentao e definido o metanol como melhor fonte de lcool inferior a ser adicionada, foram realizados testes com 4, 5, 6 e 8% de metanol (utilizando pH de 5,5, umidade inicial de 65% obtida com adio de soluo de mel de cana 108 g/L). 4.8. PRODUO DE AC EM BIORREATORES DO TIPO COLUNAS COM AERAO FORADA Foi empregado um equipamento especfico para a FES em colunas de baixa capacidade, acoplado a um sistema de aerao e temperatura, semelhante ao desenvolvido por RAIMBAULT e ALAZARD (1980). Os biorreatores so constitudos por colunas de vidro de 4 cm de dimetro e 20 cm de comprimento, com volume til de aproximadamente 250 cm3. O equipamento (Figura 8) possui uma cuba de vidro a qual foi preenchida com gua, onde h controle de temperatura, que permite a instalao de 8 colunas, que podem ser retiradas individualmente, sem provocar perturbaes s outras colunas.

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FIGURA 8 REPRESENTAO DO SISTEMA DE FERMENTAO EM COLUNAS COM AEREO FORADA

Onde 1= Entrada de ar; 2 = Cuba de vidro com gua; 3 = Colunas de vidro contendo meio de fermentao; 4 = Colunas contendo slica gel; 5 = Vlvula multi-nvel ; 6 = Controle de injeo; 7 = Comatgrafo gasoso; 8 = Computador. O consumo de O2 e produo de CO2 durante a sntese de AC, foram medidas continuamente atravs da anlise dos gases em todo o perodo de fermentao com as condies otimizadas (pH 5,5, 65% de umidade, 4 dias a 300C). Esta anlise foi realizada com o fermentador esttico acoplado um cromatgrafo (SHIMADZU GC 8A) interligado com um computador (COMPAQ-XT386). Os dados foram armazenados pelo programa CHROMA, que um integrador de cromatogramas. Ele recebe os sinais analgicos do detector do cromatgrafo e os converte em sinais numricos. O cromatgrafo operou com um detector de condutividade trmica, um injetor automtico e uma coluna Alltech CTR 1, que consiste em uma coluna concntrica dupla, com parte externa formada de um filtro molecular de 5 A0 e a parte interna de uma mistura de polmeros porosos (Poropack). Esta coluna permite a separao de oxignio, nitrognio, ar, metano, dixido e monxido de carbono em diferentes tempos de reteno. O cromatgrafo gasoso operou nas seguintes condies: 43

Temperatura do detector Temperatura da coluna Fase gasosa Fluxo de Hlio Presso de Hlio Corrente do catarmetro Volume de injeo Gs para calibrao

600 C 600 C Hlio 60 mL/min 1 bar 120 mA 300 L Ar: CO2(0,0) / O2(21,0) / N2(79,0) Mistura1: CO2(5,0) / O2(5,0) / N2(90,0) Mistura2: CO2(10,0)/ O2(15,0)/ N2(75,0)

Os gases que saiam do incubador tipo coluna foram secos atravs da passagem em colunas contendo slica gel montadas em srie, e analisados por cromatografia gasosa para verificar o teor de O2 e CO2. Cada gs apresenta uma condutividade trmica diferente, assim necessrio calibrar o detector antes de proceder anlise dos gases a serem medidos (CO2, O2 e N2) no decorrer da fermentao. Nas condies utilizadas, o tempo de reteno de cada componente pode ser expresso como mostrado na Tabela 8. TABELA 8 TEMPOS MONITORADOS EM CPG. DE RETENO DE ALGUNS GASES,

Componente Ar CO2 O2 N2

Tempo de Reteno (min) 0,62 0,95 5,72 8,02

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4.8.1. PREPARO DAS COLUNAS DE FERMENTAO As colunas, bem como os borbulhadores de ar foram devidamente esterilizados a 1210C por 15 minutos. Cada coluna foi preenchida com 30 g de substrato mido (pH 5,5, 65% de umidade com soluo de mel de cana a 108 g/L de acares totais e 4% de metanol), que foi esterilizado separadamente em frascos erlenmeyer de 250 mL. A inoculao foi realizada no prprio frasco (107 esporos/g de meio) e aps homogeneizao, as colunas foram preenchidas assepticamente em cmara de fluxo laminar. Cada coluna foi pesada antes e aps preenchimento com o substrato. Aps preenchimento com o substrato, as colunas foram conectadas em borbulhadores de ar de 250 mL, contendo aproximadamente 150 mL de gua destilada, para umedecer o ar antes de sua passagem pelo incubador. As colunas foram introduzidas na cuba de vidro que continha gua com temperatura de 300C com auxlio de aquecedor e controlada por um termostato. Cada coluna foi ligada a uma vlvula que permitiu ajustar a vazo de ar ao valor de 60 mL/min, controlado atravs de um aermetro na sada de ar da coluna. 4.9. FERMENTAO EM BANDEJA PERFURADA Foi realizada fermentao em bandejas perfuradas de 90 cm por 50cm de largura utilizando-se 2 Kg (para 3 cm de profundidade) e 3 Kg (para 5 cm de profundidade) da PC moda com 65% de umidade, mel de cana a 108g/L de acares totais, 4% de metanol e pH inicial de 5,5, inoculada com suspenso de esporos de modo a obter 10
7

esporos/g de meio durante 4 dias mantida a

temperatura de 300C. A inoculao foi realizada em bandejas plsticas separadas, onde aps homogeneizao o meio foi espalhado sobre as bandejas perfuradas de forma que houvesse o mnimo de compactao possvel. Estas fermentaes foram realizadas em cmara fechada constituda de uma sala de 2m de largura por 3m de comprimento dispondo de umidificador

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com termostato, onde a umidade externa ao meio foi mantida acima de 90% e a temperatura da sala em 300 C. 4.10. MUTAO INDUZIDA POR UV Os experimentos de mutao induzida por UV foram realizados no Laboratrio de Gentica de Microrganismos do Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran. Os esporos da cepa de A.niger BC utilizada neste estudo foram coletados da superfcie do tubo de ensaio contendo a cepa crescida em meio PDA, com auxlio de ala de platina e colocados em soluo previamente preparada e estril contendo Tween 80 sendo esta homogeneizada. Realizouse a contagem de esporos em cmara de Neubauer. Diluiu-se a suspenso de esporos at 10-4, de forma a se alcanar 30 colnias por placa. Esta soluo foi denominada soluo me e repicada em placas contendo Meio Mnimo (MM) com auxlio de ala de Drigalsky. 4.10.1. PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura constituem uma mistura de nutrientes necessrios para o crescimento de microrganismos. Estes meios podem ser preparados no prprio laboratrio com ps-desidratados, ou adquiridos prontos no comrcio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Para se determinar necessidades nutricionais de um microrganismo so utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, dos quais se conhece a composio exata. Meios mnimos ou basais so meios onde somente so fornecidos elementos qumicos necessrios ao microrganismo, na forma de molculas ou frmulas inicas simples. Nesses meios somente so encontrados uma nica fonte de carbono (geralmente glicose), de nitrognio (sais de amnio ou nitratos), de fsforo, etc. e no so detectados fatores de crescimento, aminocidos ou cidos nuclicos. 4.10.1.1.Meio Mnimo (MM)

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O Meio Mnimo utilizado apresenta a seguinte formulao: NaNO3 6,0 g; KH2PO4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO4 . 7 H2O 0,5 g; FeSO4 0,01 g; ZnSO4 0,01 g; Glicose 10,0 g; 15,0 g de gar; completado para 1000 mL com gua destilada. 4.10.1.2. Meio Completo (MC) O Meio Completo utilizado apresenta a formulao idntica do meio mnimo, mais a adio dos seguintes ingredientes: Peptona 2,0 g; Extrato de levedura 2,0 g; Casena hidrolisada 1,5 g; Soluo de vitaminas 1,0 ml; gar 15,0 g; completar para 1000 ml com gua destilada. 4.10.2. IRRADIAO POR UV A suspenso de esporos foi transferida para uma placa de Petri, e com auxlio de lmpada UV, em ambiente escuro, irradiou-se a suspenso por 2 minutos, para a obteno de 5% de sobrevivncia da cepa. Para o estabelecimento dos 2 minutos de irradiao e para a estimativa de obteno de 5% de sobrevivncia, foi construda anteriormente uma curva de sobrevivncia de porcentagem de sobreviventes versus o tempo de exposio ao UV. Foi observado na curva que na faixa de 5% de sobrevivncia, existia uma maior concentrao de mutantes. Em ambiente escuro, diluiu-se a suspenso de esporos tratada na luz UV at atinjir a diluio de 10-3 de forma a se alcanar 30 colnias por placa. Coletou-se 0,1 ml da diluio 10-3 da cepa tratada com a luz UV e adicionou-se em 3 placas de Meio Mnimo (MM) e 2 placas de Meio Completo (MC). Espalhou-se com auxlio de ala de Drygalski. Todas as placas (contendo a suspenso me e a irradiada por UV tratamento) foram incubadas invertidas para evitar a contaminao pela disseminao dos esporos, a 28 oC por 48 horas, sendo que as placas com os esporos tratados com a luz UV foram acondicionadas em tubo de PVC fechado, para proteg-las da ao da luz.

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4.10.3. TESTES DAS CEPAS OBTIDAS POR IRRADIAO DE UV EM MEIO FOSTER As colnias obtidas foram transferidas, com o auxlio de palito de madeira, para 10 placas contendo Meio Foster sendo que cada uma das placas continha 1 colnia controle (identificada com caneta) e 8 colnias tratamento. As colnias foram separadas sendo que cinco placas contendo meio Foster receberam as cepas crescidas em MM e cinco receberam as de MC. Incubaram-se as placas a 28oC por 48 horas Nas placas com o Meio Foster, mediram-se as colnias e os halos amarelos formados pelas colnias controle e tratamento. O meio Foster apresentou colorao inicial verde, devido presena da soluo de Verde de Bromocresol que por ser indicador de variao de pH, passou a amarelo com a formao de cido no meio. 4.10.4. FES DAS CEPAS OBTIDAS POR IRRADIAO DE UV Todas as cepas selecionadas pelo crescimento em meio Foster foram testadas em FES com a PC como substrato utilizando as condies fsicoqumicas do incio dos estudos com a cepa A.niger BC (75% de umidade obtida com a utilizao de soluo contendo KH2PO4 (1 g/L), ZnSO4 (0,2 g/L) e 4% de metanol, pH 6,5 em Erlenmeyer de 250 mL). As fermentaes foram realizadas por cinco dias a 300C, sendo retiradas amostras no 40 e 50 dias. A cintica em FES de 7 dias a 300 C com as cepas de A.niger que apresentaram os melhores resultados e as anlises dos fermentados, foram realizadas nas condies otimizadas para a cepa original A.niger BC (pH 5,5, adio de soluo aquosa de mel de cana a 108 g/L e metanol a 4% para obteno de umidade inicial de 65%), sendo as amostras retiradas e analisadas diariamente.

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5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1. CARACTERIZAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DA PC E SELEO DE CEPAS DE A. niger PRODUTORAS DE AC A caracterizao das propriedades fsico-qumicas da PC uma etapa importante no incio dos estudos de sua utilizao em FES para produo de AC por A. niger j que estas propriedades podem sofrer variaes devido origem e manuseio das laranjas utilizadas no processo de obteno da PC (Figura 3). Alm destes estudos a escolha da cepa de A. niger a ser utilizada na produo de AC tambm fator de grande importncia. Embora em geral todas as cepas de A. niger apresentem capacidade de produzir AC, cada cepa pode apresentar particularidades quanto ao tempo de produo e quantidade de AC produzido e adaptao ao meio de fermentao. Desta forma esta etapa do trabalho teve por objetivo caracterizar as propriedades fsico-qumicas da PC a ser utilizada como substrato na FES para produo de AC bem como selecionar a cepa de A. niger que melhor se adapte a este substrato com a maior produo de AC. 5.1.1. ATIVIDADE DE GUA (aW) Realizou-se anlise da aw da PC obtendo-se um valor mdio de 0,594 o que foi considerado satisfatrio j que a PC vai ser utilizada como substrato em FES utilizando o fungo Aspergillus niger como microrganismo produtor de AC. A aw da PC em estudo est abaixo do ideal para o desenvolvimento de microrganismos. Tal caracterstica ajuda a evitar contaminaes indesejveis durante a estocagem. No entanto, a umidade inicial dever ser ajustada para a fermentao do material. 5.1.2. CARBOIDRATOS A ttulo de comparao, foram realizadas anlises de acares totais e redutores atravs do mtodo de Somogyi-Nelson e Fehling (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945). Os resultados esto apresentados na Tabela 9. 49

TABELA 9 - RESULTADOS DA QUANTIFICAO DE ACARES TOTAIS E REDUTORES NA PC Acares (%) Totais Redutores Mtodo de SomogyiNelson 19,03 0,252 9,63 0,451 Mtodo de Fehling 16,71 0,324 10,67 0,503

Comparando os resultados obtidos com a utilizao das duas metodologias, observou-se que entre os mtodos de Fehling e Somogyi Nelson no houve diferena significativa. Desta forma optou-se pela metodologia do Somogyi Nelson para acompanhamento do consumo de acares das fermentaes a serem realizadas com a PC por se tratar de mtodo espectrofotomtrico onde h menos erros de leitura quando comparado ao mtodo de Fehling que titulomtrico. 5.1.3. CARACTERIZAO FSICO-QUMICA DA PC Os resultados obtidos nas anlises das caractersticas fsico-qumicas: umidade, cinzas, protenas e pH da PC, esto relacionados na Tabela 10. TABELA 10 - CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS DA PC. Umidade Cinzas % Protenas pH Acares aw % % Totais 10,80,185 5,470,012 5,360,179 5,420,075 19,030,252 0,5940,007 As anlises de umidade, cinzas e protenas demonstraram resultados condizentes com a literatura, onde os valores mximos permitidos so de 12,0% e 8.0% para umidade e cinzas respectivamente e de 5,0% como valor mnimo de protenas (ABECITRUS, 2006). O pH da PC de 5,42 est prximo ao utilizado normalmente para o processo de produo de AC em FES entre 5,0 e 6,0 de modo a evitar contaminaes com outros microrganismos (YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999). Para a correo de pH do substrato ser

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necessrio menor quantidade de cido e/ou base o que economicamente favorvel. 5.1.4. SELEO DE CEPAS PRODUTORAS DE AC Em meio Foster as cinco cepas de A. niger estudadas (LPB 03, LPB21, LPB 28, LPB 326 e LPB BC) apresentaram formao de halo significando a produo de cido. Os resultados da medida dos halos de produo de cido para as cinco cepas estudadas esto apresentados na Tabela 11. TABELA 11 - DIFERENAS ENTRE DIMETRO DO HALO DE PRODUO DE CIDO E DIMETRO DO HALO DE CRESCIMENTO DE COLNIAS DAS CEPAS DE A. niger Cepas LPB 03 LPB 21 LPB 28 LPB 326 LPB BC Halo da colnia (DC) em mm 24.2 23.7 28.1 25.5 20.5 Halo da produo de cido (DH) em mm 40.9 36.4 41.9 45.2 42.7 Relao entre DH/DC 1.69 1.54 1.49 1.77 2.08

Como a relao DH/DC no suficiente para a escolha da cepa visto que o halo amarelo formado conseqncia do abaixamento de pH pela produo de cido, no especificamente do AC, realizou-se um estudo cintico em FES utilizando PC como substrato para a produo de AC com todas as cinco cepas. A cepa A. niger LPB 03 produziu 330,2g de AC/Kg de PC em 5 dias de fermentao, A. niger LPB 28 produziu 349,7 g de AC/Kg de PC no 6o dia. Resultados no to promissores foram obtidos com as cepas A. niger LPB 21 (279,5 g de AC/Kg de PC no 6o dia de fermentao) e A. niger LPB 326 (185,9 g de AC por Kg de PC no 5o dia de fermentao). O melhor resultado foi alcanado com a cepa A. niger LPB BC que apresentou sua melhor produo no 4o dia, 383,5g de AC/Kg de PC (Figura 9).

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FIGURA 9 - CINTICA DA PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO DIFERENTES CEPAS DE A. niger.

450

Produo de AC (g/Kg de PC seca)

400 350 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7

LPB LPB LPB LPB LPB BC 28 03 326 21

Tempo de fermentao em dias

Os resultados com a cepa A.niger LPB BC so bastante promissores em comparao com as produes reportadas utilizando outros substratos em FES com cepas de A. niger (Tabela 4). Desta forma estudos para otimizao das caractersticas da fermentao apresentam-se como alternativa para aumentar a quantidade de AC produzida por esta cepa.

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5.2. OTIMIZAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS DO PROCESSO DE PRODUO DE AC Cada um dos aspectos fsico-qumicos da fermentao afeta

significativamente a produo de AC e devem ser estudados como forma de otimizar a fermentao e, conseqentemente, aumentar a produo de AC. Neste trabalho foram estudados os fatores fsicos de variao de pH e umidade e a granulometria da PC a ser utilizada. Os fatores qumicos como fonte de carbono, fonte de nitrognio e micronutrientes adicionados na forma de sais ao meio de fermentao tambm foram estudados, devido importncia em diversos mecanismos de crescimento do A. niger e formao de AC. Outros fatores que auxiliam na excreo de AC so os lcoois inferiores, pois interferem na permeabilidade das membranas celulares do A. niger, alm de diminuir a inibio causada por metais pesados que possam estar presentes no meio de fermentao (YOKOYA, 1992). Um parmetro tambm importante, estudado neste trabalho, foi a viabilidade celular da cepa A. niger LPB BC para escolha do tempo de crescimento mais apropriado para esta cepa, onde se obteve a maior quantidade de esporos viveis. Aps a otimizao dos parmetros do processo testou-se a transferncia destas condies para fermentao em colunas de Raimbault e, escala semipiloto, em bandejas perfuradas para que se pudesse iniciar um estudo mais efetivo da produo de AC em grande escala. Assim, esta etapa do trabalho teve como objetivo realizar a otimizao das caractersticas fsico-qumicas da produo de AC por FES utilizando a cepa A. niger LPB BC, visando o aumento da produo de AC e sua passagem para escala semipiloto. 5.2.1. CURVA DE ESPORULAO E VIABILIDADE CELULAR DO A. niger LPB BC Os resultados do estudo da curva de esporulao do A. niger LPB BC e viabilidade celular esto representados respectivamente nos grficos das Figuras 10 e 11. 53

FIGURA 10 - EVOLUO DO NMERO DE ESPOROS DURANTE O CRESCIMENTO DO A. niger LPB BC.

1,00E+09

Contagem de esporos

1,00E+08

1,00E+07 1,00E+06

1,00E+05

1,00E+04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Dias de crescimento em erlenmeyer

A Figura 10 apresenta a evoluo do nmero de esporos durante o crescimento do A. niger LPB BC durante dez dias. O nmero de esporos aumentou exponencialmente at o 30 dia. Aps este perodo houve uma estabilizao do nmero de esporos a partir do 5o dia de crescimento. Com relao viabilidade celular (Figura 11), observa-se um comportamento semelhante. O nmero de clulas viveis apresenta-se maior no 50 dia, antes de entrar na fase estacionria, onde o nmero de clulas viveis difere levemente em funo de pequenas variaes relativas ao crescimento e morte celular. FIGURA 11 CINTICA DE CONTAGEM DE CLULAS FORMADORAS DE COLNIAS DE A. niger LPB BC.
1,00E+12 1,00E+11 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Contagem de clulas formadoras de colnias

Dias de crescimento em placa

54

Atravs da anlise, tanto do crescimento quanto da viabilidade celular do A. niger LPB BC, pode-se escolher como o melhor dia para obteno da suspenso de esporos da cepa A. niger LPB BC o 50 dia de crescimento em meio PDA, j que foi o menor tempo onde se observou a maior quantidade de esporos viveis produzidos. 5.2.2. pH E UMIDADE Neste estudo foram utilizados 3 nveis de pH (5,5, 6,5 e 7,5) e 3 nveis de umidade inicial diferentes (65%, 75% e 80%) obtida pela adio de soluo salina contendo KH2PO4 - 1g/L, ZnSO4.7H2O - 0,2g/L e metanol a 4% durante 4 dias a 300C, onde os testes foram realizados em duplicatas variando os valores de pH e umidade para cada ensaio segundo o planejamento da Tabela 12. TABELA 12 ENSAIOS DE VARIAO DO pH E UMIDADE INICIAL PARA PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO PC. Ensaio Umidade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 65% 75% 80% 65% 75% 80% 65% 75% 80% pH 5,5 5,5 5,5 6,5 6,5 6,5 7,5 7,5 7,5 Produo de AC(g/Kg de PC seca) mdia 367,6 304,8 214,3 350,3 311,9 258,5 388,5 314,1 247,4

Os resultados obtidos com os testes de variao de pH e umidade foram submetidos anlise estatstica com 3 nveis e 2 fatores onde estes foram plotados em grfico de superfcie de resposta (Figura 12) com p < 0,05 (confiabilidade de 95%). O modelo estatstico obtido para este estudo apresenta a seguinte equao:

55

AC

1507,3986111107

15,466666666663*x

,58333333333305*x^2 +52,80499999999*y-0,40833333333326*y^2 Onde x representa os valores de pH, e y os valores de umidade iniciais. O valor obtido para R2 foi de 0,91. FIGURA 12 - SUPERFCIE DE RESPOSTA DOS TESTES DE VARIAO DE pH E UMIDADE EM FES

201,2 218,279 235,359 252,438 269,518 286,597 303,677 320,756 337,835 354,915 above

Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se umidade inicial de 65% onde a maior produo de AC foi observada com pH 5,5 (367,6 g de AC/Kg de PC) e com pH 7,5 (388,5 g de AC/Kg de PC), sendo que com o aumento na umidade inicial houve queda bastante significativa na produo de AC (Tabela 12). Os resultados sugerem que variaes nos valores de pH no apresentaram efeito significativo para produo de AC utilizando PC em FES, j a umidade inicial demonstrou ser um fator importante. Este efeito foi comprovado pela anlise do diagrama de Pareto (Figura 13), onde apenas a umidade inicial aparece acima da linha de significncia.

56

FIGURA 13 - DIAGRAMA DE PARETO PARA TESTE DA INFLUNCIA DO pH E DA UMIDADE NA PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO PC
p=,05

(2)UMIDADE(L)

-11,2452

UMIDADE(Q)

2,71037

(1)PH(L)

1,845914

PH(Q)

,0788602

-2

10

12

14

Segundo estas anlises pode-se observar que o processo de produo de AC pela cepa A. niger LPB BC em PC mais efetivo quando nveis mais baixos de umidade inicial so utilizados. O pH inicial apresentou pouca influncia sobre a produo de AC. Desta forma, optou-se pela utilizao das seguintes condies: pH 5,5 e 65% de umidade inicial. Este valor de umidade relativamente baixo (o que garante as trocas gasosas no meio) foi o suficiente para garantir a difuso de nutrientes no meio de fermentao. Tais condies alm de melhorarem a produo do AC, tambm so vantajosas do ponto de vista operacional e econmico, pois no so necessrios ajustes de pH j que 5,5 um valor muito prximo do obtido para a PC seca onde o pH 5,42 (item 5.1.3.) e menos gua ser gasto no processo sem perdas na produo. 5.2.3. FONTES DE CARBONO O rendimento de um produto em estudos cinticos est baseado no consumo da fonte de carbono. O tipo e a concentrao dos acares tm efeitos muito significativos na produo de AC. Enquanto as concentraes timas de metais traos, fosfato e nitrognio esto inter-relacionadas, a concentrao e tipo de acar no podem ser influenciados pela manipulao 57

apropriada das outras fontes. Os fundamentos bioqumicos deste efeito aparecem como um desvio da regulao glicoltica, causada principalmente por mecanismos de controle perfeitos. Portanto, salienta-se que a produo de AC altamente dependente da regulao glicoltica (RHR et al., 1983; GREWAL e KALRA, 1995). Neste estudo primeiramente foram adicionados ao meio de fermentao acares comerciais como fonte de carbono: glicose e frutose (30, 60 e 120 g/L) e sacarose (27, 54 e 108 g/L) para fermentao de 4 dias a 300C, pH 5,5 e umidade inicial de 65% com adio de soluo salina e metanol a 4%. Os melhores resultados de produo de AC foram observados para glicose a 120 g/L (427,7 g de AC/Kg de PC) e para sacarose a 108 g/L (405,6 g de AC/Kg de PC) sendo que com a adio de frutose o melhor resultado foi com a concentrao de 120 g/L chegando-se a uma produo de 371,9 g de AC por Kg de PC. Posteriormente estes testes foram repetidos utilizando-se apenas glicose (60, 120 e 240 g/L) e sacarose (54, 108 e 216 g/L). Os resultados foram mais significativos para o aumento na concentrao de sacarose (Tabela 13), o que j era esperado devido ao fato da maior produo de AC ocorrer aps crescimento micelial e o fungo possuir uma invertase extracelular ligada ao miclio, o que quebra a sacarose produzindo energia justamente na fase em que se observa o aumento na produo do AC. TABELA 13 - PRODUO DE AC COM ADIO DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO COMERCIAIS. ACAR PRODUO DE AC (g /Kg de PC) Glicose (60g/L) 387,3 Glicose (120g/L) 432,4 Glicose (240g/L) 426,7 Sacarose (54g/L) 371,3 Sacarose (108g/L) 410,5 Sacarose (216g/L) 476,1 BRANCO 373,2 BRANCO = sem adio de fonte suplementar de carbono Estes resultados foram bastante significativos, pois na prtica, o AC produzido a partir de carboidrato purificado ou de fonte de carboidrato bruto, de preo mais conveniente, como melao de cana-de-acar, melao de

58

beterraba, sacarose bruta, caldo de cana e hidrolisado de amido. A maioria destas fontes apresenta acares na forma de mono, di e oligossacardeos, alm de outras impurezas (YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE, 2000). Como estas fontes brutas tm uma maior concentrao de sacarose em sua formulao e houve acrscimo significativo de produo de AC com aumento na concentrao de sacarose (o que no ocorreu para a glicose), foram realizados testes com duas fontes de carbono brutas: mel de cana e melao de soja. Para o mel de cana e o melao de soja foi utilizada a concentrao de 108 g/L em acares totais. Obtivemos um abaixamento na produo de AC com a utilizao de melao de soja (277,9 g de AC/Kg de PC) quando comparado ao controle no adicionado de fonte suplementar de carbono (363,7g de AC/Kg de PC). J com a adio de mel de cana houve um aumento significativo na produo (420,3 g de AC/Kg de PC). Estes resultados podem ser justificados devido presena de outros tipos de acares alm de glicose e frutose (estaquiose e melibiose) no melao de soja compondo os acares redutores que no so metabolizados facilmente para produo de AC pela cepa A. niger LPB BC, o que no acontece com o mel de cana que basicamente composto de glicose e sacarose que j demonstraram ser fontes de carbono bastante acessveis cepa para produo do AC. Desta forma foram realizados testes em duplicatas com vrias concentraes de mel de cana a fim de encontrar a concentrao tima a ser adicionada a PC de forma a aumentar a produo de AC. Estes resultados esto representados no grfico da Figura 14.

59

FIGURA 14 - PRODUO DE AC COM ADIO DE MEL DE CANA

SMC = sem adio de mel de cana

Desta forma a fonte de carbono escolhida para suplementar a PC utilizada para produo de AC por FES foi o mel de cana a 108 g/L de concentrao com produo mdia de 445,4 g de AC/Kg de PC seca. 5.2.4. GRANULOMETRIA DA PC Em geral considera-se que quanto menores so as partculas de um determinado substrato, melhores sero as condies do processo fermentativo. No entanto, h srias restries para tal regra. Se por um lado uma menor granulometria do substrato significa uma maior superfcie de contato e, conseqentemente, um melhor grau de transformao que proporcionaria melhores condies para aumento de transferncia de massa; por outro lado, uma excessiva granulometria pode provocar compactao do substrato, dificultando a circulao de ar por entre a massa e reduzindo a dissipao dos gases e calor produzidos, fatores estes que ocasionaro prejuzos ao rendimento do processo. Os resultados obtidos com os testes de diferentes granulometrias da polpa ctrica para produo de AC por FES indicaram que a melhor

60

granulometria empregada foi a obtida com a moagem sem peneiramento. Nestas condies onde a produo foi 388,7 g de AC/Kg de PC sendo esta produo superior obtida com a granulometria entre 0,8 e 2mm (368,4 g de AC/Kg de PC) e com granulometria superior a 2mm (299,3 g de AC/Kg de PC). Com esta granulometria (PC apenas moda) obteve-se um meio de fermentao sem muita compactao facilitando as trocas gasosas e ao mesmo tempo com boa superfcie de contato o que economicamente vantajoso para o processo de produo do AC por FES j que alm de aumentar a produo, elimina uma operao (peneiramento) durante o processo. 5.2.5. ADIO DE SAIS Os micronutrientes presentes no meio de fermentao tm grande importncia no acmulo de AC por A. niger. Vrios deles tm sido estudados, como por exemplo o zinco adicionado juntamente com o KH2PO4, favorecendo a produo de AC, alm de ter um papel importante no controle das fases de crescimento celular e de produo do cido. O esgotamento do Zn no meio de produo faz com que o fungo passe da fase de crescimento para a fase de produo de AC. A presena de mangans, ferro e zinco (em concentraes elevadas) pode causar a reduo da produo de AC somente em meios sem fosfato (YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE et al., 1999) A presena de ons ferro no meio afeta negativamente o acmulo de AC na fermentao submersa. Porm, a adio de sais de cobre (0,1-500 ppm) no incio da fermentao neutraliza esse efeito. As concentraes timas dos metais variam de um meio para outro e dependem de outros constituintes metlicos do meio (YOKOYA, 1992). Neste estudo os seguintes sais: NaCl 1g/L, KH2PO4 0,7709g/L, MgSO4.7H2O -0,18g/L, FeSO4.7H2O 0,0105g/L, ZnSO4.7H2O 0,1542g/L, CuSO4.5H2O -0,0005g/L, escolhidos por se tratar dos sais mais estudados (ABOU-ZEID, 1984; SHANKARANAND e LONSANE, 1994; LIMA et al., 1995; PINTADO et al., 1998; VANDENBERGHE, 2000), foram adicionados ao meio de fermentao seguindo o planejamento estatstico 27-4 descrito na Tabela 14.

61

A fermentao foi realizada a 300C durante 4 dias com pH inicial de 5,5 e umidade de 65% com adio de 4% de metanol sem adio de mel de cana. TABELA 14 INFLUNCIA DA ADIO DE DIFERENTES SAIS NA PRODUO DE AC.
ENSAIO NaCl MnSO4.H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O Produo de AC mdia (g/Kg de PC)

1 2 3 4 5 6 7 8

+1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1

+1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1

+1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1

+1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1

+1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1

+1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

+1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1

321,1 332,1 318,2 335,3 302,8 311,9 336,3 318,5

Onde: +1: presena do sal e -1: ausncia do sal Os resultados dos testes da adio de sais ao meio de fermentao em duplicatas foram submetidos a anlise estatstica onde foram plotados em diagrama de Pareto (Figura 15) com p < 0,05 (confiabilidade de 95%). O valor obtido para R2 foi de 0,76 considerado satisfatrio para processos de fermentao em estado slido e bioprocessos em geral. FIGURA 15- DIAGRAMA DE PARETO DO TESTE DE ADIO DE SAIS PARA PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO PC.

p=,05

MnSO4 MgSO4 NaCl FeSO4 CuSO4 ZnSO4 KH2PO4

-2,27174

2,24255

2,098058

-2,06084

1,84775

-1,17637

-1,07712

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

62

No se observa nenhum dos sais estudados acima da linha de significncia, embora os sais MnSO4.H2O e MgSO4.7H2O tenham apresentado um resultado muito prximo do que se poderia levar em considerao, sendo que a fonte de Mn apresentou-se com possvel significncia negativa para a fermentao e a fonte de Mg apresentou-se positiva. Os resultados para estes dois sais so justificados uma vez que a presena de alta concentrao de mangans no meio inibe o acmulo de AC, aumenta o crescimento celular e reduz o consumo de acar. Assim, a deficincia do on essencial para se obter alto rendimento de AC. Esta deficincia reprime as enzimas do ciclo anaerbio e de Kreb`s, com exceo da sintetase citrato, conduzindo superproduo de AC (RHR et al., 1983; VANDENBERGHE et al., 1999). Mesmo com estes dois sais apresentando valores prximos linha de significncia estes resultados sugerem que nenhum dos sais utilizados neste estudo foi significativo para o aumento da produo de AC por FES utilizando a PC o que pode indicar que a quantidade necessria de micronutrientes necessrios maior produo de AC pela cepa A.niger LPB BC devem estar presentes na prpria PC utilizada neste estudo. Alm disso quanto menos espcies qumicas dissolvidas no meio maior concentrao de oxignio ser dissolvido e conseqentemente aproveitado pelo microrganismo. 5.2.6. ADIO DE FONTES DE NITROGNIO Nitrognio um dos componentes mais importantes para formulao de um meio de cultura em FES, pois est envolvido no crescimento do microrganismo e, normalmente, necessita ser determinado para obteno mxima de biomassa. No caso da produo de AC, a concentrao de nitrognio necessria est ligada produo de uma certa concentrao de biomassa, para garantir a produo de AC e manuteno do fungo. Esta etapa foi realizada paralelamente ao estudo da adio de sais descrito no item 6.1.5. utilizando as mesmas condies. Foi realizado em duplicata onde foi adicionado diferentes fontes de nitrognio (NH4Cl, NH4NO3,(NH4)2SO4 e uria) em concentraes que garantissem a mesma concentrao de nitrognio: 1,8 g de nitrognio/L (VANDENBERGHE, 2000).

63

Os resultados das mdias das produes de AC esto apresentados no grfico da Figura 16. FIGURA 16 - PRODUO DE AC COM ADIO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGNIO.

SN = sem adio de fonte de nitrognio

Microrganismos que necessitam altas quantidades de nitrognio e fsforo no so ideais em FES devido baixa taxa de difuso de nutrientes e metablitos que ocorrem em processos com baixa atividade de gua. (KUBICEK e RHR, 1986; YOKOYA, 1992; GREWAL e KALRA, 1995). Neste estudo a fonte de nitrognio com a qual se obteve a melhor produo de AC foi o NH4Cl (334,6 g/Kg), no entanto esta produo foi inferior ao obtido sem adio de nenhuma das fontes de nitrognio estudadas (377,6 g de AC/Kg de PC). Desta forma optou-se pela no adio de fonte de nitrognio complementar ao meio de fermentao, pois a quantidade de nitrognio necessria a um crescimento micelial suficiente do A. niger LPB BC para a produo de AC, j deve estar presente na PC utilizada (aproximadamente 5% - item 5.3.3). A produo de AC ocorre sob limitao do crescimento (VANDENBERGHE, 2000).

64

5.2.7. LCOOIS INFERIORES A sntese do citrato a etapa final da biossntese do AC nas mitocndrias do A. niger antes de ser transferido para o citoplasma e ento para o meio. Quando o nvel de AC nas clulas estiver elevado, o cido ser excretado. O acmulo extracelular de AC pode estar associado maior ou menor facilidade de transporte do produto atravs da membrana celular e da mitocndria (YOKOYA, 1992; GREWAL e KALRA, 1995). A adio de lcoois inferiores diminui a inibio causada por metais pesados que podem estar presentes no meio de fermentao alm de facilitar a permeabilidade do AC pela membrana celular do A. niger. Foram realizados testes com adio de trs concentraes diferentes de metanol e de etanol (2, 4 e 6%) sem a adio de mel de cana com pH 5,5, 65% de umidade em fermentao de 4 dias a 30 C. Os resultados obtidos esto apresentados na Tabela 15. TABELA 15 RESULTADOS DA ADIO DE DIFERENTES CONCENTRAES DE METANOL E ETANOL, SEM ADIO DE MEL DE CANA. LCOOL Metanol 2% Metanol 4% Metanol 6% Etanol 2% Etanol 4% Etanol 6% BRANCO
BRANCO = sem adio de lcool

PRODUO DE AC (g/Kg de PC seca) MDIA 282,2 366,0 438,4 296,4 290,7 348,5 250,3

Observou-se que entre os dois lcoois estudados (metanol e etanol), o que apresenta os melhores resultados de produo de AC (438,4 g/Kg de PC seca) nestas condies de fermentao foi o metanol e que a melhor concentrao de metanol a ser utilizada foi a de 6%. 65

A partir destes resultados foram realizados testes com adio de diferentes concentraes de mel de cana (67, 108 e 135 g/L de acares totais) utilizando pH 5,5, 65% de umidade e 6% de metanol durante 4 dias a 30 C em duplicata. Tal estudo foi realizado para que se pudesse avaliar o efeito desta concentrao de metanol com a presena de mel de cana. As mdias dos resultados obtidos so apresentados no grfico da Figura 17. FIGURA 17 - PRODUO DE AC COM ADIO DE DIFERENTES CONCENTRAES DE MEL DE CANA UTILIZANDO 6% DE METANOL

SMC = sem adio de mel de cana

No houve variao significativa no aumento da produo de AC (estando em torno de 408 g/Kg de PC seca) utilizando diferentes concentraes de mel de cana com 6% de metanol, tal qual havia sido observado para a utilizao de 4% de metanol, onde atingiu-se um aumento de 16% com a utilizao de mel de cana a 108 g/L (Figura 14 do item 6.1.3.). Desta forma foram realizados novos testes com diferentes concentraes de metanol (4, 5, 6 e 8%) utilizando a melhor concentrao de mel de cana (108 g/L) com a qual se conseguiu a maior produo de AC (pH 5,5, 65% de

66

umidade, durante 4 dias a 30C). Os resultados esto representados na Tabela 16. TABELA 16 PRODUO DE AC COM DIFERENTES CONCENTRAES DE METANOL COM ADIO OU NO DE MEL DE CANA A 108 g/L Metanol 4% SMC 4% MC 5% SMC 5% MC 6% SMC 6% MC 8% SMC 8% MC BRANCO Produo de AC (g/Kg de PC seca) mdia 380,9 457,9 418,3 419,9 425,1 420,8 308,7 266,1 261,2

SMC = sem adio de mel cana; MC = com adio de 108 g/L de mel de cana; BRANCO = sem adio de mel de cana e sem adio de metanol.

Observa-se que com a utilizao de 5% e 6% de metanol sem adio de mel de cana, a produo de AC foi maior que a 4%, 380,9 e 418,3 g de AC/ kg PC seco, respectivamente. No entanto, quando adicionado mel de cana a 108 g/L, a produo de AC com adio de 5% e 6% (419,9 e 420,8 g /Kg de PC respectivamente) no foi to elevada quanto com a utilizao de 4% de metanol (457,9 g/Kg de PC). A 8% de metanol a produo de AC no foi significativa, com ou sem adio de mel de cana, demonstrando que esta concentrao de fonte de carbono j limitante para produo de AC. Assim foi escolhida a concentrao de 4% de metanol com adio de mel de cana a 108 g/L de acares totais para produo de AC por FES utilizando PC como substrato.

67

5.2.8. CINTICA FINAL EM FES COM AS CONDIES OTIMIZADAS EM ERLENMEYER Aps otimizao dos parmetros fsicos e qumicos do processo de produo de AC, definiu-se o 50 dia como o melhor tempo de crescimento para a cepa A. niger LPB BC depois, utilizando as condies estudadas anteriormente por VANDENBERGHE (2000) (adio de soluo salina contendo KH2PO4 - 1g/L, ZnSO4.7H2O - 0,2g/L e metanol a 4%), realizou-se estudo para escolha do pH e umidade inicias AC com relao as condies iniciais). Em seguida realizou-se estudo da influncia de sais adicionados ao meio de fermentao (NaCl - 1g/L, KH2PO4 - 0,7709g/L, MgSO4.7H2O 0,18g/L, FeSO4.7H2O - 0,0105g/L, ZnSO4.7H2O - 0,1542g/L, CuSO4.5H2O 0,0005g/L) utilizando pH 5,5, metanol 4% e umidade de 65% durante 4 dias a 300C, onde no se observou aumento na produo de AC com a adio de nenhum dos sais estudados. Paralelamente a este estudo, realizou-se fermentaes com adio de diferentes fontes de nitrognio (NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4 e uria) utilizando pH 5,5, metanol a 4% e umidade inicial de 65% com adio de KH2PO4 - 1g/L, ZnSO4.7H2O - 0,2g/L, onde tambm no se obteve nenhum aumento na produo de AC. Aps testes com diferentes granulometrias de PC moda (entre 0,8 e 2 mm, maior que 2 mm e apenas moda) onde se obteve aumento na produo de AC de 5,5% com utilizao de PC apenas moda sem peneiramento, quando comparado ao utilizado at ento (granulometria entre 0,8 e 2 mm), foi realizado testes de suplementao de fonte de carbono sendo escolhido a adio de mel de cana a 108 g/L de acares totais com a utilizao de pH 5,5, metanol 4% e umidade inicial de 65% sem adio de sais ou fonte de nitrognio onde obteve-se um aumento de 19,2% na produo de AC quando comparado ao meio sem adio de mel de cana. Com estes resultados foram realizados testes da adio de lcoois inferiores onde no se obteve melhores resultados. Assim realizou-se um estudo da cintica da produo de AC durante 7 dias a 300C em duplicata com as condies otimizadas: pH 5,5, umidade inicial 68 obtendo-se os melhores resultados para pH 5,5 e umidade de 65% (aumento de 17,8% na produo de

de 65% obtida com a adio de soluo contendo mel de cana (108 g/L de acares totais) e 4% de metanol. Os resultados do acompanhamento deste estudo esto apresentados na Tabela 17. TABELA 17 EVOLUO DA CINTICA FINAL DE PRODUO DE AC POR FES UTILIZANDO PC COM A CEPA A. niger LPB BC. Tempo de fermentao Horas 0 24 48 72 96 120 144 168 pH Aw/T0C Acares totais % 32,0 31,9 24,6 7,98 4,79 3,08 3,13 2,76 Umidade % 64 63 64 64,6 65,5 65,3 65,5 64,9 Produo de AC (g/Kg de PC seca) mdia NP NP 93,12 369,63 441,05 395,19 408,96 376,35

5,41 5,34 3,48 2,64 2,70 3,21 3,28 3,26

0,952/27,4 0,953/27,3 0,947/27,6 0,951/27,5 0,946/27,6 0,942/25,2 0,947/25,9 0,951/26,5

NP = no houve produo de AC

Pode-se observar um abaixamento acentuado no pH do meio de fermentao a partir do 20dia justificado pelo incio do acmulo de AC no meio de fermentao, sendo que os menores valores de pH (2,64 e 2,7) foram observados nos dias de maior aumento na produo de AC. O 40 dia de fermentao apresentou a maior produo de AC (441,05 g/Kg de PC seca), a partir deste ponto os valores de pH subiram um pouco estabilizando em aproximadamente 3,2 devido ao abaixamento na quantidade de cido presente no meio. Em trabalho desenvolvido por CASTRO et al. (2002), maiores produes de biomassa foram observadas quando valores de atividade de gua mais altos foram utilizados. A atividade de gua durante a cintica de produo de AC da cepa A. niger LPB BC manteve-se com valores acima de 0,94 durante todo o processo fermentativo o que bastante importante para o desenvolvimento do microrganismo.

69

FIGURA 18 - CINTICA DE CONSUMO DE ACARES E PRODUO DE AC.

Com a anlise do grfico da Figura 18 pode-se perceber um estgio de adaptao do fungo ao meio de fermentao nas primeiras 24 horas, quando ento se inicia o consumo de acares e produo de AC. A formao micelial observada em 48 horas o que acarreta o consumo de acares redutores presentes no meio. Tal fato devido ao A. niger no possuir capacidade de hidrolisar a sacarose no incio de seu crescimento, somente aps a formao dos miclios que juntamente com estes formada a enzima invertase extracelular, capaz de hidrolisar sacarose em meio cido. Assim, a maior produo de AC se deu em 96 horas (441,05 g de AC/Kg de PC seca) quando j havia sido formada biomassa suficiente e todo o acar necessrio estava disponvel ao metabolismo e produo do AC. A partir de ento a quantidade de acar presente comea a cair mais rapidamente estabilizando-se em 3% de acares totais, o que provavelmente uma quantidade limitante para a sobrevivncia do fungo que assim, pode comear a utilizar outras fontes de carbono como o prprio AC para sua manuteno. Este fato foi observado com a queda de 17,2% na quantidade de AC aps 144 horas de fermentao.

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5.2.9. COMPARAO DA PRODUO DE AC EM DIFERENTES MODELOS DE BIORREATORES Quanto ao tipo de aerao, na produo de AC foram utilizados dois sistemas diferentes de fermentao: a aerao por difuso ou aerao natural, com a qual foram realizadas fermentaes em frascos Erlenmeyer (cujos resultados esto descritos nos itens anteriores) e fermentao em bandejas perfuradas, e aerao forada utilizada nas fermentaes em colunas de vidro. Desta forma foi possvel uma comparao entre diferentes modelos de biorreatores utilizando as duas formas de aerao. 5.2.9.1. FERMENTAO UTILIZANDO BANDEJA PERFURADA A fermentao em bandejas perfuradas foi realizada utilizando-se 3 cm de profundidade do meio (leito) onde inicialmente foram observados problemas operacionais com relao secagem do meio de fermentao j que a exposio ao ar muito maior devido ao aumento da superfcie de contato. Apesar da umidade do ar na cmara ser mantida em torno de 95%, observouse que no decorrer da fermentao a superfcie do substrato ressecava (passando de 65% inicial a 54% de umidade) e, conseqentemente, havia uma rpida esporulao do microrganismo, o que alm de ser um problema para a passagem para escala industrial tambm limita a produo de AC. Desta forma foram realizadas asperses peridicas de gua sobre o meio de fermentao, onde se conseguiu uma melhor produo de AC (400 g/Kg de PC seca) embora ainda no to alta quanto obtida em frascos Erlenmeyer (450 g/kg de PC seca) onde a umidade tende a aumentar, pois quase no h perdas de umidade para o meio externo. Desta forma realizou-se um estudo da influncia da altura de meio de fermentao na produo de AC com o objetivo de encontrar a altura ideal de leito que melhor favorecesse a produo de AC e limitasse a esporulao, onde a compactao no fosse excessiva (o que limitaria as trocas gasosas). Por outro lado, uma altura muito pequena pode limitar o aproveitamento da rea disponvel. Assim foi escolhida a altura de 3 cm e 5 cm do leito de fermentao, onde se observou que o melhor resultado foi obtido utilizando 3 71

cm de profundidade do leito com uma produo de AC 11,6% maior (410 g/Kg de PC seca) que a obtida com 5 cm de profundidade (362,44 g/Kg de PC seca). Embora utilizando-se 3 cm de profundidade do leito (Figura 19) se obtenha um menor aproveitamento da rea disponvel da bandeja, a diferena na quantidade de AC produzida considerada significativa para se manter esta quantidade de meio por bandeja em estudos posteriores. Acima de 3 cm a compactao do meio compromete a difuso de ar e outros componentes, levando a menor produo. FIGURA 19 PRODUO DE AC EM FES UTILIZANDO BANDEJA PERFURADA COM LEITO DE 3 cm.

FONTE: A autora. 5.2.9.2. FERMENTAO EM COLUNAS Na produo de AC biorreatores do tipo colunas com aerao forada, realizada em duplicata, observou-se que o fermentado manteve melhor a umidade do que em bandejas perfuradas o que devido a passagem de ar saturado atravs das colunas, o que evita a secagem do meio. Paralelamente foi realizado estudo com atraso do incio da aerao em 24 horas de forma a tentar diminuir o crescimento de biomassa (VANDENBERGHE, 2000). Os resultados para fermentao em colunas esto representados na Tabela 18.

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TABELA 18 RESULTADOS DE PRODUO DE AC POR FES EM COLUNAS COM AERAO FORADA Aerao forada Iniciada aps 24h de fermentao Iniciada em 0 h de fermentao Umidade (%) 63,7 64,5 Produo de AC (g/Kg de PC seca) 370,31 1,95 379,34 3,44

Os resultados obtidos nesse modelo de biorreator foram inferiores (379,34 g AC/ kg PC seco) ao observado em frascos Erlenmeyer e em bandeja perfurada. A diferena na produo de AC com o atraso no incio da aerao foi pequena provavelmente devido ao fato do A. niger LPB BC nas primeiras 24 horas ainda estar em fase de adaptao ao substrato. Quanto esporulao, esta s foi visvel no 30 dia de fermentao, sendo muito mais intensa que a observada em frascos Erlenmeyer o que era esperado, pois a aerao estimula o crescimento e, portanto, a esporulao tambm. Quanto maior o crescimento maior a esporulao. No processo de produo de AC deve-se limitar o crescimento do microrganismo (YOKOYA, 1992; VANDENBERGHE, 2000). Alm disso, espera-se obter um produto com baixa produo de esporos que poder ser aplicado diretamente em rao animal. No decorrer do estudo foi avaliado o metabolismo respiratrio do microrganismo, processo que est intimamente ligado ao crescimento do microrganismo (Figura 20). A biomassa celular um parmetro fundamental na caracterizao do crescimento microbiano. Porm, em FES, o parmetro mais difcil de se estimar. As hifas do fungo filamentoso penetram e se ligam fortemente ao substrato, dificultando sua separao do material e. conseqentemente, a determinao direta da biomassa. A biomassa celular pode ser estimada indiretamente atravs de medidas metablicas. O consumo de O2 e a produo de CO2 so resultado da respirao do fungo e esto associadas ao crescimento (RAIMBAULT, 1997).

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FIGURA 20 CONSUMO DE O2 E PRODUO DE CO2 DURANTE FES DE PRODUO DE AC POR A. niger LPB BC.
5 25

20

CO2 %

15

10

0 101 104 107 111 114

Tempo (horas)
CO2 CO2 2 O2 O2 2

CO2 e O2 = colunas com incio de aerao em 0 h de fermentao CO2 2 e O2 2 = colunas com inicio de aerao aps 24h de fermentao

Apenas a partir de 30 horas de fermentao observa-se o incio de uma respirao celular mais acentuada devido ao fato do microrganismo j estar adaptado ao meio e comear a se desenvolver e formar biomassa. As maiores taxas de respirao (consumo de O2 e produo de CO2) foram observadas em 48 horas de fermentao o que deve estar relacionado maior produo de biomassa pelo microrganismo. Aps 50 horas de fermentao ocorre uma queda brusca na produo de CO2 no meio e o coeficiente de respirao permanece baixo at aproximadamente 92 horas de fermentao, quando ento sofre um pequeno aumento at ficar constante. Estes resultados esto de acordo com o fato da maior produo de AC ocorrer em aproximadamente 96 horas de fermentao, onde se verifica que taxas de respirao mais baixas so necessrias para a produo de altas concentraes de AC. As colunas com aerao forada desde o incio da fermentao apresentaram maior produo de CO2 no incio, entretanto, em 96 horas, quando a produo de AC maior, a produo de CO2 foi mais baixa do que a observada para as colunas cuja aerao forada foi iniciada apenas aps 24 74

117

24

27

31

34

37

41

44

47

51

54

57

61

64

67

71

74

77

81

84

87

91

94

97

O2%

horas de fermentao. Este fato est de acordo com a produo de AC um pouco mais elevada para as colunas com aerao forada desde o incio da fermentao. 5.2.9.3. PRODUO DE AC EM DIFERENTES MODELOS DE

BIORREATORES Os melhores resultados para produo de AC por FES neste trabalho foram alcanados utilizando-se frascos Erlenmeyer (450 g/Kg de PC) seguido dos resultados em bandejas perfuradas (410 g/Kg de PC) e, por fim, em colunas de vidro com aerao forada (377,75 g/Kg de PC). Este estudo revelou a importncia de se ter uma atmosfera rica em CO2. A limitao do crescimento do fungo um fator importante na produo do cido. Estudos comprovaram que a limitao no crescimento provocada pela alta concentrao de CO2 conduz a um elevado acmulo de AC (VANDENBERGHE, 2000). A elevada presso parcial do CO2 provavelmente retarda a liberao de esporos pelo fungo filamentoso, favorecendo a sntese do AC, o que foi observado em frascos Erlenmeyer, onde a esporulao foi visvel a partir do 30 dia de fermentao, enquanto que em bandejas perfuradas onde o sistema aberto no havendo saturao de CO2, a esporulao foi visvel j em 48 h de fermentao. Alm disso, a umidade durante a fermentao em bandejas perfuradas diminui em comparao com a observada em frascos Erlenmeyer, o que tambm pode justificar a menor produo de AC observada em bandejas perfuradas do que em Erlenmeyer. Com relao aos menores valores de produo de AC em fermentao em colunas de vidro, pode-se perceber que mesmo o sistema mantendo a umidade mais efetivamente que em bandejas perfuradas, a aerao forada no possibilitou o acmulo de CO2, no havendo assim a limitao necessria no crescimento do fungo o que resultou em menor produo de AC, quando comparado fermentao em frascos Erlenmeyer e em bandejas perfuradas.

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5.3. ESTUDO DA MUTAO INDUZIDA POR IRRADIAO DE RAIOS UV SOBRE A CEPA A. niger LPB BC Neste estudo foi realizada a induo de mutao da cepa A. niger LPB BC atravs de irradiao de raios UV j que esta apresentou timos resultados na produo de AC aps otimizao das caractersticas da FES. Desta forma pretende-se conseguir uma cepa mutante com maior capacidade de produo de AC por FES utilizando PC como substrato do que a A. niger LPB BC. Alm disso, foi monitorada a produo de AC das cepas mutantes obtidas que apresentaram os melhores resultados durante alguns meses, para analisar a possibilidade de mecanismos de reparo reconstiturem a gentica original da cepa fazendo com que volte ao seu estado original. Aps realizao da induo de mutao por UV (conforme item 4.8) da cepa A. niger LPB BC, foram realizados testes qualitativos e quantitativos de produo de AC nas cepas de A. niger mutantes obtidas. 5.3.1. FORMAO DE HALO DE PRODUO DE CIDO EM MEIO FOSTER Este teste foi realizado atravs da observao de formao de halo de colorao amarela em meio Foster revelado pela degradao da glicose presente no meio e conseqente abaixamento de pH, sendo obtidos resultados em placas. Foram repicadas as 72 cepas obtidas separadas em 9 placas sendo 5 contendo as cepas obtidas em meio completo (MC) e 4 placas contendo as cepas obtidas em meio mnimo (MM). Os resultados para a produo de cido em meio Foster esto apresentados nas Tabelas de 19 a 27. As tabelas apresentam a relao entre o dimetro do halo de formao de cido (DH) e o dimetro da colnia (DC) de crescimento do fungo.

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TABELA 19 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA A ORIUNDAS DO MC
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 1,70 1,62 1,55 1,87 NFHA NFHA 1,60 1,35 1,54

TABELA 20 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA B, ORIUNDAS DO MC
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 2,02 NFHA NFHA 1,86 1,45 NFHA NFHA 1,82 NFHA

TABELA 21 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA C, ORIUNDAS DO MC
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 2,02 1,98 NFHA NFHA 1,69 NFHA 1,81 NFHA NFHA

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TABELA 22 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA D, ORIUNDAS DO MC
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 2,22 1,68 1,68 1,72 1,88 1,41 NFHA 1,48 NFHA

TABELA 23 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA E, ORIUNDAS DO MC
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 2,04 1,41 1,65 NFHA NFHA NFHA NFHA NFHA 1,96

Das 40 colnias tratamento repicadas em MC, 21 apresentaram formao de halo de colorao amarelada evidenciando produo de cido o que representa 52,5% do total. Contudo apenas uma destas colnias tratamento (Tabela 19, placa A) apresentou razo DH/DC (1,87) superior a relao apresentada pela colnia controle (1,70) indicando uma maior capacidade de produo de cido quando comparada a cepa de origem. TABELA 24 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA A, ORIUNDAS DO MM
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Razo DH/DC 2,01 NFHA 1,85 1,91 2,09 NFHA

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Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido

1,73 1,74 1,43

TABELA 25 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA B, ORIUNDAS DO MM
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 1,51 NFHA NFHA 1,97 1,74 NFHA 1,70 1,62 1,57

TABELA 26 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA D, ORIUNDAS DO MM
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 1,91 1,78 1,82 1,70 1,59 1,56 1,59 NFHA NFHA

TABELA 27 RAZO ENTRE DC E DH DA COLNIA CONTROLE E DAS COLNIAS TRATAMENTO DA PLACA E, ORIUNDAS DO MM
Colnia Controle Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Tratamento 6 Tratamento 7 Tratamento 8 NFHA = no houve formao de halo de cido Razo DH/DC 1,72 2,12 NFHA 1,78 1,93 NFHA 1,59 1,90 NFHA

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De acordo com as Tabelas 24, 25, 26 e 27 do total de colnias tratamento (40) semeadas em meio Foster oriundas de MM, 23 (71,88%) apresentaram formao de halo de colorao amarela evidenciando formao de cido. Destas foram obtidas 10 colnias tratamento (47,83%) que apresentaram razo DH/DC superior em comparao com a razo DH/DC da cepa controle. Segundo AZEVEDO (1998), um microrganismo selvagem pode crescer em MC, em que todos os nutrientes lhe so fornecidos, bem como em um MM, onde encontra-se apenas uma fonte de carbono, uma fonte de nitrognio, alguns sais minerais e poucos suplementos nutricionais. Um fungo que tenha uma mutao auxotrfica somente poder crescer em MC, j que no produz todos os nutrientes necessrios para a sobrevivncia em MM. Desta forma, como as cepas de A. niger sobreviventes a irradiao de UV obtidos neste estudo cresceram tambm em MM, no devem ser mutantes auxotrficos cuja mutao envolveria a via metablica de substncias indispensveis sua sobrevivncia. Assim podem ter sofrido alguma alterao bioqumica que aumente a produo de metablitos secundrios como o AC. 5.3.2. PRODUO DE AC EM FES COM AS CEPAS MUTANTES Todas as 11 cepas que apresentaram melhores resultados em meio Foster foram testadas em FES nas condies originais dos estudos com a cepa A.niger LPB BC utilizando PC como substrato (item 6.2.3.). Estas cepas foram designadas como A.niger LPB A3MC, A.niger LPB A4, A.niger LPB B3, A.niger LPB B4, A.niger LPB B6, A.niger LPB B7, A.niger LPB B8, A.niger LPB D1, A.niger LPB D3, A.niger LPB D4, A.niger LPB D7. Os resultados destas fermentaes para o 40 e 50 dias esto representados no grfico da Figura 21.

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FIGURA 21 - FES DAS CEPAS DE A.niger OBTIDAS A PARTIR DE IRRADIAO DE UV SOBRE A CEPA A.niger LPB BC.

As cinco cepas que apresentaram os melhores resultados de produo de AC quando comparadas a cepa controle A.niger LPB BC (LPB B3, LPB B6, LPB B8, LPB D3 e LPB D7) foram novamente submetidas a FES nas mesmas condies anteriores aps dois meses de armazenamento em PDA sob refrigerao. Desta forma pode-se testar a possibilidade de mecanismos de reparo reverterem as cepas a sua origem gentica. Os resultados de produo de AC no quarto dia de fermentao esto representados na Tabela 28. TABELA 28 - PRODUO DE AC POR FES DAS CINCO CEPAS MUTANTES APS DOIS MESES DE CONSERVAO EM PDA SOB REFRIGERAO. Cepas A.niger LPB B3 A.niger LPB B6 A.niger LPB B8 A.niger LPB D3 A.niger LPB D7 A.niger LPB BC Produo de AC (g/Kg de PC) 258,4 285,9 238,96 242,21 255,3 298,3

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Todas as cepas apresentaram queda na produo de AC aps dois meses de ocorrida a mutao. Decidiu-se reservar duas cepas: A.niger LPB B3 e A.niger LPB B6 que apresentaram os melhores resultados, sendo ento realizada cintica de 7 dias nas condies anteriormente otimizadas para a cepa A.niger LPB BC (65% de umidade conseguida pela adio de soluo de mel de cana a 108 g/L de acares totais, metanol a 4%, pH 5,5 e temperatura de 300C) para estas duas cepas. Os resultados podem ser observados no grfico da Figura 22. FIGURA 22 EVOLUO DA CINTICA DE PRODUO DE AC POR FES DAS CEPAS A.niger LPB B3 E A.niger LPB B6.

As duas cepas apresentaram timos resultados, se comparadas a cepa BC em condies otimizadas (450 g/Kg de PC), sendo que a A.niger LPB B6 propiciou uma produo de 537,6 g de AC/Kg de PC no 60dia de fermentao e a A.niger LPB B3 com 616,5 g de AC/Kg de PC no 40dia de fermentao.

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6. CONCLUSES Os resultados das anlises fsico-qumicas da PC indicaram que esta se apresenta como boa fonte de nitrognio e carbono para a produo de AC, o que bastante vantajoso para sua utilizao em FES j que a produo do cido est diretamente relacionada com a disponibilidade de carbono e da relao carbono/nitrognio no substrato de fermentao. Alm disso, a PC utilizada neste estudo estocada na forma de pellet com umidade menor que 12% e aw de 0,594, inferior ao considerado ideal para desenvolvimento de microrganismos (mnima de 0,7 para fungos, enquanto que para as leveduras o valor situa-se em 0,8 e para as bactrias, 0,9) o que evita contaminaes durante o tempo de estocagem. A comparao entre os mtodos de dosagem de carboidratos possibilitou a escolha do mtodo de Somogyi Nelson como o melhor mtodo a ser utilizado para acompanhamento do consumo de acares durante as fermentaes com PC. Principalmente por se tratar de mtodo colorimtrico com leitura em espectrofotmetro, o que diminui problemas com erros de leitura quando comparado ao mtodo de Fehling, que titulomtrico e est sujeito a variaes nas leituras dos resultados. Desta forma, a PC apresenta-se como substrato promissor para a produo de AC por FES, pois alm de apresentar caractersticas fsicoqumicas favorveis sua utilizao, um subproduto da agroindstria brasileira produzido em grande quantidade, j utilizado em rao animal, e que se disposto na natureza poderia causar graves problemas ambientais. Na seleo da cepa de A. niger a ser utilizada, a cepa designada LPB BC apresentou os melhores resultados tanto nos estudos qualitativos em meio Foster (maior relao entre o halo de produo de cido e o halo do crescimento da colnia: 2,08) quanto em FES para produo de AC utilizando a PC como substrato (383,5 g de AC/Kg de PC seca). Para uma aplicao direta em nutrio animal ou extrao necessrio que sejam produzidas acima de 300 g de AC/kg de matria seca. Desta forma estes resultados so bastante promissores, pois a cepa A. niger LPB BC j apresenta timos resultados mesmo antes da otimizao dos parmetros fsico-qumicos do processo. 83

Com a otimizao dos parmetros fsico-qumicos do processo obtevese um aumento na produo de AC de 17,5%, de 383,5 g de AC/Kg de PC seca para 450 g de AC/Kg de PC seca, o que foi considerado bastante significativo, definindo-se assim como melhor condio o pH de 5,5, 65% de umidade obtida com a adio de soluo a 108 g/L de acares totais e metanol a 4% durante 4 dias a 30C. Utilizando as condies otimizadas podese fazer uma comparao entre a produo de AC em colunas com aerao forada e em bandejas perfuradas. Os melhores resultados foram obtidos em bandejas perfuradas com 3 cm de profundidade do meio de fermentao (410 g de AC/Kg de PC seca). J com a utilizao de biorreatores do tipo colunas de vidro (produo de 379,34 g de AC/Kg de PC seca). Posteriormente foi realizada a mutao induzida por UV da cepa A. niger LPB BC como tentativa de obteno de uma cepa mutante com capacidade produtiva de AC maior que a original, onde obtivemos duas cepas, A. niger LPB B3 e A. niger LPB B6, que mesmo no mantendo o potencial de produo aps dois meses de acondicionamento em meio PDA sob refrigerao, foram escolhidas para realizao de cintica de FES utilizando PC como substrato com as condies otimizadas para a cepa de origem A.niger LPB BC. Os resultados obtidos foram bastante promissores para ambas as cepas (A.niger LPB B3 produo de 537,6 g de AC/Kg de PC no 60dia de fermentao e a A.niger LPB B6 com 616,5 g de AC/Kg de PC no 40dia de fermentao) quando comparadas produo obtida com a cepa original A.niger LPB BC que produziu 450g de AC/Kg de PC. Desta forma espera-se otimizar o processo de FES para estas duas cepas com submetidas a UV a utilizao de PC como substrato alternativo de forma a conseguir um produto rico em AC e que possa ser adicionado em rao animal substituindo o AC comercial usualmente utilizado. Os resultados alcanados durante o desenvolvimento do presente trabalho sero transferidos ao setor produtivo, onde o AC poder ser produzido em escala industrial. Assim espera-se contribuir para a utilizao de resduos da agroindstria brasileira como produto de valor comercial e minimizar os problemas ambientais causados pela deposio destes resduos na natureza.

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7. SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS Baseando-se nos resultados obtidos no presente trabalho, podem ser sugeridos ainda alguns experimentos a serem desenvolvidos futuramente: Otimizar outras condies de fermentao em bandejas perfuradas como a limitao na oxigenao, de forma a obter um produto rico em AC que apresente menor esporulao; Analisar a presena e atividade de enzimas que possam estar sendo produzidas juntamente com o AC durante a fermentao; Otimizar os parmetros fsico-qumicos de fermentao para as duas cepas mutantes obtidas por induo por UV (A.niger LPB B3 e A.niger LPB B6); Testar o substrato fermentado seco como complemento de rao animal, passando assim o processo para escala industrial.

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